Abrus Precatorius lapų ekstraktas sumažina aloksano / nikotinamido sukeltą diabetą žiurkėms, taikydamas hormoninį (insulino, GLP{0}} ir gliukagono) ir fermentinį (-amilazės/-gliukozidazės) moduliavimą. 1 dalis

Prašau susisiektioscar.xiao@wecistanche.comDaugiau informacijos

Fonas

Abrus precatorius naudojamas liaudies medicinoje visose Afro-Azijos pasaulio regionuose. Ankstesnis Abrus precatoriaus lapų ekstrakto (APLE) gliukozės kiekį mažinantis ir kasą saugantis poveikis buvo patvirtintas eksperimentiškai su STZ/nikotinamido indukuotomis diabetu sergančiomis žiurkėmis; tačiau pagrindinis antidiabetinio poveikio ir kasos apsaugos mechanizmas liko nežinomas. Tikslas. Šis tyrimas išaiškino antidiabetinius mechanizmus ir APLE apsauginį poveikį diabetu sergantiems žiurkėms. Medžiagos ir metodai. APLE buvo paruoštas etanolio / Soksleto ekstrahavimo metodu. Bendras fenolių ir flavonoidų kiekis buvo kiekybiškai įvertintas kalorimetriškai po pirminio fitocheminio patikrinimo. Cukrinis diabetas (DM) buvo nustatytas suaugusioms abiejų lyčių Sprague-Dawley žiurkėms (sveriančioms 120-180 g) kasdien nuosekliai sušvirkščiant nikotinamido (48 mg/kg; ip) irAloksanas(120 mg/kg; ip) per 7 dienas. Išskyrus kontrolines žiurkes, kurių gliukozės kiekis kraujyje (GG) nevalgius buvo 4,60 mmol/l, žiurkėms, kurių GGG (16-21 mmol/L) buvo stabilus 7 d.po nikotinamido/Aloksanasinjekcijos buvo laikomos sergančiomis diabetu ir buvo atsitiktinai priskirtos vienai iš šių grupių (modelis, APLE (atitinkamai 100, 200 ir 400 mg/kg; PO) ir metforminas (300 mg/kg; PO)) ir buvo gydomi kasdien 18 dienų. . Kūno svoris ir FBG buvo matuojami kas 72 valandas 18 dienų. 18 dieną žiurkės pasiaukojo giliaianestezija; organai (inkstai, kepenys, kasa ir blužnis) buvo išskirti ir pasverti. Kraujas buvo paimtas, siekiant įvertinti insulino, gliukagono ir (LP-1) kiekį serume, naudojant žiurkėms skirtą ELSA rinkinį. Kasa buvo apdorota, padalinta ir nudažyta H&E, kad būtų atliktas histologinis tyrimas. APLE poveikisfermentinisbuvo įvertintas alfa (a)-amilazės ir gliukozidazės aktyvumas. APLE antioksidacinės ir laisvųjų radikalų šalinimo savybės buvo įvertintos standartiniais metodais. Rezultatai. APLE, priklausomai nuo dozės, sumažino pradinį FBG 68,67 proc., 31,07 proc. ir 4,39 proc., palyginti su modeliu (4,34 proc.) ir metforminu (43,63 proc.). Gydymas APLE (100 mg/kg) atkūrė svorio netekimą, palyginti su modeliu. APLE padidino serumo insulino ir GLP{14}}, bet sumažino gliukagono kiekį serume, palyginti su modeliu. APLE padidino kasos salelių skaičių ir vidutinį skerspjūvio plotą (×10 laipsnių um'), palyginti su modeliu. APLE sukėlė nuo koncentracijos priklausomą -amilazės ir -gliukozidazės slopinimą akarbozės atžvilgiu. APLE, priklausomai nuo koncentracijos, pašalino DPPH ir azoto oksido (NO) radikalus ir parodė didesnį geležies redukcinį antioksidacinį pajėgumą (FRAC), palyginti su standartais. Išvada. Antidiabetinį APLE poveikį lemia insulino ir GLP{21}} moduliavimas atvirkščiai su gliukagonu, nekonkurencinis c-amilazės ir gliukozidazės slopinimas, laisvųjų radikalų pašalinimas ir pažeistų / nekroapoptozės kasos ląstelių atkūrimas.

Norėdami sužinoti daugiau, spustelėkite čia

1. Įvadas

Cukrinis diabetas (DM) yra vienas iš metabolinių sindromų, kuriam būdinga lėtinė hiperglikemija, kurios kulminacija yra sutrikęs gliukozės metabolizmas, atsirandantis dėl kasos ląstelių funkcijos defektų [1]. Patologiškai DM yra gliukozės metabolizmo klaidų, atsirandančių dėl kasos ląstelių funkcijos defektų, rezultatas, dėl kurio atsiranda insulino nepakankamumas (1 tipo DM) arba atsparumas insulinui (2 tipo DM). Dažni DM simptomai yra polifagija, polidipsija, neryškus matymas, lėtinis kūno svorio netekimas, gastroparezė ir poliurija [2]. Laikui bėgant, neišspręsta hiperglikemija padidina DM mikrovaskulinių komplikacijų, tokių kaip diabetinė nefropatija, diabetinė retinopatija ir diabetinė neuropatija, riziką [2]. Šios komplikacijos atsiranda dėl didelio oksidacinio streso ir lipidųperoksidacijakurie yra šalutiniai reakcijos tarp gliukozės ir biologinių molekulių produktai [3]. Dėl intensyvaus biologinių molekulių, tokių kaip DNR, baltymų ir lipidų, glikozilinimo susidaro nestabilūs biocheminiai tarpiniai produktai, kurie yra reaktyviųjų deguonies rūšių (ROS) ir azoto rūšių (RNS) šaltiniai. ROS ir RNS yra pagrindiniai oksidacinių ir peroksidacinių reakcijų varikliai. įvairiose ląstelėse ir audiniuose [3].

Epidemiologiškai pranešama, kad DM serga daugiau nei 387 milijonai žmonių visame pasaulyje [4]. Numatoma, kad šis preliminarus įvertinimas iki 2035 m. padidės iki 592 mln. [5]. Iš pradžių buvo manoma, kad cukrinis diabetas pasireiškia suaugusiems, tačiau dabar įrodyta, kad DM nepriklauso nuo amžiaus, o tai aiškiai rodo, kad grėsmė yra didžiulė. DM pasaulinei sveikatai.

Cistanche gali pagerinti imunitetą

Įprastai DM (1 ir 2 tipo) gydymas apima antidiabetinių preparatų, sugrupuotų į neinsulinus (įskaitant biguanidus (pvz., metforminą), sulfonilkarbamido darinius (pvz., gliburidą), SGLT-2 inhibitorius (pvz., dapagliflozinas), tulžies rūgščių sekvestrantai (pvz., kolesevelamas), amilino mimetikas (pvz., pramlintidas), dopamino -2 agonistas (pvz., bromokriptinas), DPP-4 inhibitoriai (pvz., sitagliptinas), GLP{{5} }}RA (pvz., eksenatido), tiazolidindiono (pvz., roziglitazono) ir gliukozidazės inhibitorių (pvz., akarbozė ir voglibozė)) ir insulino (pvz., žmogaus insulino ir jo analogų) terapija [6]. Įrodyta, kad įprastiniai antidiabetiniai gydymo būdai yra veiksmingi, nepaisant to, kad kai kurių iš jų naudojimas yra brangus ir gali būti susijęs su rimtu šalutiniu poveikiu[7]. Kaina, šalutinis poveikis ir bendras įsitikinimas, kad tradiciniai vaistai yra sintetiniai ir nesaugūs, palyginti su augaliniais vaistais, kurie, kaip manoma, yra „natūralūs“ ir gana saugūs, prisidėjo prie atsinaujinusio susidomėjimo vaistažolių ir žolelių naudojimu. produktai, skirti žmonių ligoms, įskaitant DM, gydyti ir valdyti[8,9]. Ši paradigma yra gana paplitusi skurdesnėse atogrąžų pasaulio šalyse, kur dauguma žmonių pirminės sveikatos priežiūros poreikiams patenkinti pasikliauja augaliniais vaistais [8]. Be to, tai tikriausiai gali patvirtinti įprastą teiginį, kad vaistažolės buvo naudojamos anksčiau nei šiuolaikinė medicina ir kad natūralūs produktai ir toliau naudojami kaip šablonai naujų vaistų [10], įskaitant vaistus nuo diabeto, farmacinės sintezės. Svarbu tai, kad šios žolės ir iš žolelių gautos terapijos yra naudojamos kaip papildoma terapija, atspindinčios daugumos vietinių bendruomenių Afro Azijos regionuose tikėjimo sistemas ir etnobotaninį paveldą. Pavyzdžiui, daugelis vaistinių augalų, turinčių etnobotaninių teiginių cukriniam diabetui gydyti, pvz., Chrysobalanus orbicularis[11], Spondias mombin ir Mangifera indica[12], Sesamum indicum [13] ir Bryophyllum pinnatum [14], visi turi amilazės ir - gliukozidazę slopinantis poveikis, kuris laikomas gyvybiškai svarbiu glikemijos kontrolei. Pasaulio sveikatos organizacija (PSO) kartu su kitomis interesų grupėmis rekomendavo įtraukti vietines gydymo sistemas, ypač vaistažoles, į šį atnaujintą susidomėjimą žolelių ir žolelių produktų naudojimu kaip pagalbinę ar alternatyvią terapiją. skurdesnių šalių sveikatos priežiūros sistemos [15]. Dėl šios rekomendacijos reikėjo patikrinti teiginius apie vaistinių augalų, kuriuos vietos gyventojai dažniausiai naudoja žmonių ligoms gydyti, sveikatingumą[16,17]. Įdomu tai, kad Abrus pre-catorius, paprastai vadinamas „žirniu žirniu“, yra vaistinis augalas, plačiai naudojamas daugelio kultūrų liaudies medicinoje Afro-Azijos pasaulio regionuose žmonių ligoms gydyti[18-20]. Keletas pranešimų pabrėžė tradicinį Abrus precatoriaus lapų naudojimą gydant ir gydant diabetą[21-23]. Pažymėtina, kad Abrus precatorius lapų ekstraktai buvo veiksmingi kovojant su cukriniu diabetu [1] ir krūties vėžiu [24] – dviem žmonių ligomis, kurios labai prisidėjo prie pasaulinės ligų naštos [25]. Daugelis tyrimų pateisino Abrus precatoriaus etnofarmakologinį naudojimą ir kitus medicininius teiginius, eksperimentiškai įrodydami jo biologines savybes, įskaitant laisvųjų radikalų šalinimą [26], apsaugą nuo reno [27], apsaugą nuo neuronų [28], imunomoduliacinį[19], priešuždegiminį poveikį. [29], antilipotoksiškumas [30] ir antitrombocitų agregacija [31], tik pavyzdžiu.

Anksčiau APLE gliukozės kiekį mažinantis ir kasą saugantis poveikis buvo eksperimentiškai įrodytas STZ/nikotinamido sukeltoms diabetinėms žiurkėms, siekiant patvirtinti, kad vietiniai Ganos vakarinio regiono gyventojai jį naudoja kaip liaudies mediciną nuo diabeto [1]. Tačiau mechanizmas, kuriuo grindžiamas APLE gliukozės kiekį mažinantis ir kasą saugantis poveikis, liko menkai išaiškintas. Šiuo metu mechanizmai, kuriais grindžiamas gliukozės kiekį mažinantis ir kasą saugantis APLE poveikis, pvz., insulino, gliukagono ir GLP{8}} moduliavimas, -amilazės ir -gliukozidazės fermentinio aktyvumo slopinimas, laisvųjų radikalų pašalinimas ir atsigavimas. kasos ląstelių pažeidimas ir nekroapoptozė buvo įrodyta in vivo ir in vitro.

2. Medžiagos ir metodai

2.1. Narkotikai ir chemikalai. Aloksano monohidratas (Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO, JAV), nikotinamidas (Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO, JAV), akarbozė (LGM Pharma, JAV), metforminas (Bristol laboratories Ltd.) , galo rūgštis (Merck KGaA, JAV), rutinas (Acros Organics, JAV), askorbo rūgštis (Carl Roth, Vokietija), kvercetinas (Alfa Aesar, JK), p-nitrofenilo gliukopiranozidas (pNPG) (BBI Biotech, Kinija), žiurkė Tyrime buvo naudojamas insulino ELISA rinkinys, žiurkės gliukagono-ELISA rinkinys ir žiurkės GLP{6}} ELSA rinkinys (Wuxi Donglin Sci & Tech Development Co.Ltd, Kinija). Visi kiti tyrime naudojami tirpikliai ir cheminės medžiagos buvo analitinės kokybės.

2.2. Abrus precatoriaus lapų rinkimas, identifikavimas ir autentifikavimas. Švieži A. precatoriaus lapai buvo surinkti iš nedirbamos žemės ūkio paskirties žemės Sefwi Asawinso'A' (Bibiani-Ahwiaso-Bekwai rajonas, Vakarų regionas, Gana). Lapus identifikavo ir patvirtino kvalifikuotas botanikas Herbariumo padalinyje, Biologijos mokslų mokykloje, Keip Pakrantės universitete, kur buvo deponuotas kvito pavyzdys (CC3366), kaip buvo pranešta anksčiau [1].

2.3.Abrus precatorius lapų ekstrakto (APLE) paruošimas. APLE buvo paruoštas pagal ankstesnį metodą [1]. Trumpai tariant, pavėsyje džiovinti A. precatoriaus lapai buvo mechaniškai sumalti į smulkius miltelius. Miltelių pavidalo lapai prieš naudojimą buvo laikomi sandariuose plastikiniuose induose. 120 g miltelių susmulkintų lapų 48 valandas mirkoma 700 ml etanolio ir uždengiama marle. Mišinys maišomas bent 3 kartus per dieną. Antrą dieną mišinys filtruojamas per filtravimo popierių, įtaisytą į Buchner piltuvą. Filtratas buvo atskirtas naudojant sukamąjį garintuvą, sumontuotą vandens vonioje. Išėmus etanolį naudojant sukamąjį garintuvą, gautas tamsiai žalias sirupo pavidalo skystis keletą savaičių džiovinamas eksikatoriuje, paliekant tamsiai žalią kietą ekstraktą. Prieš naudojimą ekstraktas buvo paženklintas ir laikomas eksikatoriuje. APLE buvo nuolat ruošiamas, kad būtų gauta pakankamai kiekių visiems eksperimentams.

2.4.Fitocheminis APLE patikrinimas.APLE buvo patikrinta, ar nėra fitojunginių, kaip buvo pranešta anksčiau [1]. 2.5. Bendrojo fenolio kiekio (TPC) nustatymas APLE. Bendras fenolio kiekis APLE buvo nustatytas naudojant Folin Ciocalteu reagento metodą, kaip aprašyta anksčiau [32] su nedideliais pakeitimais. Praskiesta APLE koncentracija (250 μl 1 mg/mL) buvo sumaišyta su 750 μL Folin Ciocalteu reagento (1:10 skiedimų vandeniu) ir 750 μL 7 procentų Na, CO. kambario temperatūroje 2 valandas, kad susidarytų spalva. Tada sugertis buvo išmatuota esant 765 nm, naudojant spektrofotometrą (UV-vis, T70 PG Instruments). Paruošus standartinę galio rūgšties (0-300 ug/mL) kreivę, TPC APLE buvo ekstrapoliuotas iš galios rūgšties kalibravimo kreivės ir išreikštas galo rūgšties ekvivalentu (GAE). Visi eksperimentai buvo atlikti trimis egzemplioriais.

2.6. Bendrojo flavonoidų kiekio (TFC) nustatymas APLE. Bendras flavonoidų kiekis APLE buvo matuojamas pagal anksčiau aprašytą metodą [33] su keliais pakeitimais. Trumpai tariant, 500 μL Abrus precatorius augalo ekstrakto (1 mg/mL), paruošto 50 procentų etanolyje, buvo sumaišyta su 500 μL 10 procentų aliuminio chlorido (AlCl,.6H,O) ir 1500 μL 10 procentų natrio acetato, ONAC. ,.3H,O). Reakcijos mišinys buvo inkubuojamas kambario temperatūroje 40 minučių, o absorbcija buvo matuojama esant 415 nm, naudojant spektrofotometrą (UV-vis, T70 PG Instruments). Paruošus standartinę rutino (0-250 ug/mL) kalibravimo kreivę, TFC APLE buvo ekstrapoliuotas iš rutino kalibravimo kreivės ir išreikštas rutino ekvivalentu (RE). Visi eksperimentai buvo atlikti trimis egzemplioriais.

2.7. Etinis patvirtinimas. Visus protokolus, susijusius su gyvūnais, iš pradžių peržiūrėjo ir patvirtino Kwame Nkrumah mokslo ir technologijos universiteto (KNUST) Institucinė eksperimentų su gyvūnais taryba (FPPS/PCOL/006/2019). Taip pat eksperimentai su žiurkėmis buvo atlikti pagal Europos Sąjungos direktyvas (2010/63/ES) dėl gyvūnų naudojimo ir priežiūros moksliniuose eksperimentuose. Gyvūnų kančios ir gyvūnų skaičius buvo kiek įmanoma sumažintas, kad būtų laikomasi 3R (Refinement, Replacement, and Reduction) rekomendacijų [34] reikalavimų.

2.8. Eksperimentinių gyvūnų įsigijimas ir priežiūra. Sveikos 7-8-savaičių amžiaus suaugusios abiejų lyčių Sprague-Dawley žiurkės (sveriančios nuo 120 iki 180 g) buvo įsigytos iš Ganos universiteto Noguchi medicinos tyrimų instituto (NMRI). Vėliau žiurkės buvo pervežtos į Keip Pakrantės universiteto Biomedicinos mokslų katedros gyvūnų namus, Gana. Žiurkės buvo laikomos nerūdijančio plieno narveliuose (34 cm × 47 cm × 18 cm) su sausomis medžio drožlėmis kaip pakratai, šeriamos įprastu graužikų maitinimu (GAFCO, TEMA) ir turėjo neribotą prieigą prie vandens. Žiurkės buvo laikomos temperatūros, drėgmės ir įprasto tamsos / šviesos ciklo aplinkos sąlygomis. Tačiau šios sąlygos buvo įvairios, kad atitiktų konkrečius kai kurių eksperimentų reikalavimus. Žiurkėms buvo leista priprasti prie šių aplinkos ir laboratorinių sąlygų daugiau nei dvi savaites prieš jas naudojant eksperimentams.

2.9.Aloksano/nikotinamido sukelto cukrinio diabeto nustatymas žiurkėms. Eksperimentinis cukrinis diabetas buvo nustatytas per naktį nevalgiusioms suaugusioms Sprague-Dawley žiurkėms, turinčioms normoglikemiją, pagal anksčiau aprašytą metodą [1, 35] su tam tikrais pakeitimais. Trumpai tariant, žiurkėms paeiliui buvo švirkščiamas nikotinamidas (48 mg/kg; IP), ištirpintas normaliame druskos tirpale ir laikomas ant ledo; tada po 15 minučių žiurkėms kasdien 7 dienas buvo duodama aloksano (120 mg/kg; ip) 100 mM citrato buferio (pH4,5) tirpale. Vėliau žiurkėms buvo duodama 5 procentų gliukozės (5 ml/kg; PO) tirpalo kasdien 7 dienas. Siekiant patvirtinti, kad žiurkėms atsirado hiperglikemija, kraujas buvo paimtas iš per naktį nevalgiusių žiurkių 3-7 dienų po aloksano/nikotinamido vartojimo. ir 5 procentų gliukozės gydymas naudojant uodegos galiuko amputacijos metodą. Žiurkių uodegos pirmiausia buvo nuvalytos sterilia medvilne, pamirkyta 10 procentų etanolyje. Gliukozės kiekis kraujyje nevalgius (FBG) buvo matuojamas naudojant URIT G26 gliukometrą (URIT Medical Electronic Co., Ltd.).

2.10.Experimental Design. A curative rather than prophylactic treatment approach was adopted in this study, where after the establishment of experimental diabetes mellitus in rats, diabetic rats were subjected to various treatments. Figure 1 shows an outline of experiments carried out in this study. Rats having consistent FBG(11.1 mmol/L or >250mg/dL), atlikus daugkartinius matavimus, buvo manoma, kad serga cukriniu diabetu (hiperglikemija)[1,35]. Patvirtintos diabetinės žiurkės buvo atsitiktinai suskirstytos į penkias grupes. Kontrolinės žiurkės nebuvo veikiamos Alloxan; vietoj to jiems buvo duodamas normalus fiziologinis tirpalas. Visos grupės buvo gydomos 18 dienų, kaip parodyta žemiau:

Kontrolė: normalus fiziologinis tirpalas (5 ml/žiurkei per dieną; po) plius graužikų maistas ir vanduo

Modelis: nikotinamidas (48mg/kg ip) ir aloksanas (120mg/kg;ip) plius graužikų maistas ir vanduo

Metforminas: nikotinamidas (48 mg/kg; ip) ir aloksanas (120 mg/kg; ip) ir metforminas (300 mg/kg; po) ir graužikų maistas ir vanduo

APLE (100 mg/kg): nikotinamidas (48 mg/kg; ip) ir aloksanas (120 mg/kg; ip) plius APLE (100 mg/kg; po) plius graužikų maistas ir vanduo

APLE (200 mg/kg): nikotinamidas (48 mg/kg; ip) ir aloksanas (120 mg/kg; ip) plius APLE (200 mg/kg; po) plius graužikų maistas ir vanduo

APLE (400 mg/kg): nikotinamidas (48 mg/kg; ip) plius Aloksanas (120 mg/kg; ip) plius APLE (400 mg/kg po) plius graužikų maistas ir vanduo

2.11. Kūno svorio matavimas.Žiurkių kūno svoris buvo matuojamas prieš pradedant visus eksperimentus su gyvūnais. Vėliau visų grupių žiurkių kūno svoris buvo matuojamas kas 3 dienas per 18 dienų. Dozės buvo koreguojamos, kad atspindėtų kūno svorio pokyčius kas 3 dienas. Galiausiai visų grupių žiurkių kūno svoris buvo išmatuotas prieš jas numarinant.

2.12. Kraujo paėmimas, serumų paruošimas ir organų išskyrimas.Pasvėrus žiurkes 18 dieną, žiurkės buvo numarintos taikant gilią chloroformo anesteziją. Kraujo mėginiai buvo paimti per širdies punkciją ir išpilstyti į paženklintus tuščius vakuuminio mėgintuvėlius. Reprezentatyvūs kiekvienos grupės kraujo mėginiai buvo centrifuguojami 3000 aps./min (Eppendorfo centrifuga 5702,4 laipsnių) 5 minutes. Norint gauti serumą, supernatantas buvo surinktas į atitinkamai paženklintus mėginių mėgintuvėlius. Kepenys, inkstų blužnis ir kasa buvo paimti, ką tik pasverti ir fiksuoti 10 procentų formalinu.

2.13. Serumo insulino, gliukagono ir GLP matavimas-1.Insulino, gliukagono ir GLP{0}} lygiai serume buvo išmatuoti atitinkamai naudojant žiurkės insulino ELISA (Wuxi Donglin Sci &Tech Development Co. Ltd, Kinija), žiurkės gliukagono ELISA (Wuxi Donglin Sci & Tech Development Co.Ltd. , Kinija) ir žiurkių GLP-1 ELISA (Wuxi Donglin Sci & Tech Development Co.Ltd., Kinija) griežtai pagal gamintojo instrukcijas.

2.14. Langerhanso kasos salelių medianos ploto nustatymas.Po reprezentatyvios kasos histologinio apdorojimo gautos atitinkamų grupių mikrofotografijos buvo nuskaitytos naudojant Amscope MD35 okuliaro kamerą, kaip aprašyta anksčiau [1]. Kiekviena mikrofotografija buvo įkelta į „Adobe Photoshop CS6“ ir vėliau uždėta ant stereologinio tinklelio. Suskaičiuotas sankryžų, esančių virš kasos salelių stromos, skaičius. Reprezentatyvios kasos Langerhanso kasos salelių skerspjūvio plotas buvo nustatytas Cavalieri metodu ir taškų skaičiavimu [36]. Skerspjūvio plotas buvo nustatytas pagal formulę:

kur

A reiškia Langerhanso kasos salelių skerspjūvio plotą

XP reiškia bendrą sankryžų, esančių virš kasos salelių stromos, skaičių

a/p reiškia plotą vienam stereologinio tinklelio taškui M reiškia tiesinį padidinimą.

2.15. Amilazės ekstrahavimas iš jūrų kiaulyčių kasos.Po 20 valandų badavimo jūrų kiaulytė buvo paaukota taikant gilią anesteziją, o kasa pašalinta chirurginiu būdu. Kasa buvo apipjaustyta be riebalų ir kitų audinių ir nedelsiant nuplaunama natrio fosfato buferiu (pH 7,4). Pasvėrus kasą, ji buvo laikoma šaldytuve 4 laipsnių temperatūroje. Tada sušaldyta kasa buvo homogenizuota (1 g kasos: 5 ml buferio) su lediniu 0,1 M natrio fosfato buferiu (pH 7,4), naudojant homogenizatorių (WiseTis HG-15D homogenizatorių) ir centrifuguojama. esant 4400 aps./min. 30 minučių 4 laipsnių temperatūroje. Supernatantas buvo pipete supilamas į atskirus mikrofugos mėgintuvėlius ir laikomas šaldytuve -20 laipsnių temperatūroje. Norint patvirtinti ekstrahuotą fermentą (-amilazę), komerciškai prieinama amilazė buvo lyginama su ekstrahuotu fermentu (-amilaze), naudojant krakmolą ir jodą. Mėlynos-juodos spalvos silpnumas arba išnykimas, laikomas amilazės aktyvumo požymiu, buvo lyginamas su kontroliniu režimu (be fermento plius krakmolas ir jodas), kai buvo tamsiai mėlynai juoda spalva.

2.16. APLE poveikis -amilazės fermentiniam aktyvumui.Alfa ( )-amilazės fermentinio aktyvumo slopinimas buvo tiriamas pagal ankstesnį metodą [37] su tam tikrais pakeitimais. Trumpai tariant, APLE (125 uL) arba akarbozė didėjančios koncentracijos (100-1500 ug/mL) buvo pridėta į paženklintų mėgintuvėlių rinkinį, kuriame yra 125 uL -amilazės tirpalo 20 mM natrio fosfato buferyje (pH 6,9). APLE arba akarbozės / amilazės mišinys buvo iš anksto inkubuotas 25 laipsnių temperatūroje 10 minučių. Vėliau pasirinktais laiko intervalais buvo pridėta 125 ul 1 procento krakmolo (paruošto 20 mM fosfatiniame buferyje, pH =6,9). Reakcijos mišinys kiekvienu atveju buvo inkubuojamas 25 laipsnių temperatūroje 10 minučių. Kiekviena reakcija buvo nutraukta tam tikrais intervalais, pridedant 250 uL 3,5-dinitrosalicilo rūgšties (DNSA) reagento ir toliau kaitinama vandens vonioje 100 °C temperatūroje 5 minutes, po to leidžiama atvėsti iki kambario temperatūros. Kiekviena reakcija buvo padidinta iki 2,5 ml distiliuotu vandeniu, o absorbcija buvo matuojama esant 540 nm, naudojant spektrofotometrą (UV-vis, T70 PG Instruments). Kontrolinė sistema buvo paruošta naudojant tą pačią procedūrą, išskyrus tai, kad -amilazė buvo iš anksto inkubuota su distiliuotu vandeniu, o ne APLE. Alfa()-amilazę slopinantis aktyvumas buvo apskaičiuotas taip:

2.17. APLE -amilazės fermentinio aktyvumo slopinimo būdas.APLE -amilazės fermentinio aktyvumo slopinimo būdas buvo atliktas pagal ankstesnį metodą [38] su tam tikrais pakeitimais. Trumpai tariant, 125 μL APLE (5 mg/mL) pirmą kartą buvo iš anksto inkubuojami su 125 ul -amilazės tirpalu 20 mM fosfate 25 laipsnių temperatūroje 10 minučių pažymėtuose mėgintuvėliuose. Po to į reakcijos mišinius buvo pridėta 125 uL krakmolo tirpalo skirtingomis koncentracijomis (03-5 mg/mL).

pradėti reakciją. Tada reakcijos mišinys buvo inkubuojamas 25 laipsnių temperatūroje 10 minučių, prieš pridedant 250 uL 3,5-dinitrosalicilo rūgšties (DNSA) reagento, kad reakcija sustabdytų. Susidariusio produkto kiekis buvo ištirtas išmatuojant absorbciją esant 540 nm bangos ilgiui, naudojant spektrofotometrą (UV-vis, T70 PG Instruments). Procedūra buvo pakartota kontrolei, nustatytai iš anksto inkubuojant -amilazę su buferiu, o ne APLE. Lineweaver-Burk brėžinys iš Michaeles-Menten sklypo buvo atliktas naudojant Graph-Pad prizmės 8 versiją (Graph Pad Software, San Diego, CA, JAV) Km ir Vmax įvertinimui. APLE -amilazės fermentinio aktyvumo slopinimo būdas buvo nustatytas iš apskaičiuotų Km ir Vmax.

2.18. Gliukozidazės ekstrahavimas iš jūrų kiaulyčių plonųjų žarnų.Gliukozidazės ekstrahavimas iš jūrų kiaulyčių žarnyno buvo atliktas pagal ankstesnį metodą [39] su tam tikrais pakeitimais. Trumpai tariant, jūrų kiaulytės pirmiausia buvo badomos 2 0 valandas, o po to paaukotos taikant gilią anesteziją. Plonoji žarna, esanti tiesiai virš aklosios žarnos ir iškart po dvylikapirštės žarnos, buvo chirurginiu būdu pašalinta ir kruopščiai nuplaunama lediniu 0, 02 M natrio fosfato buferiu (pH 6, 9), prieš panardinant į naują buferinį tirpalą. Išskirta žarna buvo homogenizuota (WiseTis HG-15D homogenizatorius, Vokietija) esant 1 g žarnyno-ne proporcijai: 5 ml buferio, esant 4400 aps./min., 10 minučių, 2 minutes su pertrūkiais sustojus ant ledo. Homogenatas buvo centrifuguojamas (Eppendorf 5430R centrifuga) 30 minučių 4 laipsnių temperatūroje, o supernatantas švelniai nuimamas. Alikvotinės dalys buvo sudėtos į 2 ml kriomėgintuvėlius ir laikomos -20 laipsnių temperatūroje, kad būtų galima nedelsiant panaudoti eksperimentams. Norint patvirtinti ekstrahuotą fermentą (-gliukozidazę), komerciškai prieinama gliukozidazė buvo lyginama su ekstrahuotu fermentu (a-gliukozidaze), inkubuojant 50 μL 3 mM p-nitrofenilgliukopiranozido (pNPG) su 25 μL komerciškai prieinamo arba -25kosidazės. μl ekstrahuoto fermento (a-gliukozidazės) 25 laipsnių temperatūroje. Geltonojo p-nitrofenolio produkto stebėjimas kiekvienu atveju po 5 minučių buvo laikomas -gliukozidazės aktyvumo patvirtinimu.

2.19. APLE poveikis -gliukozidazės fermentiniam aktyvumui.Slopinamasis APLE ir akarbozės (standartinis gliukozidazės inhibitorius) poveikis buvo įvertintas taikant ankstesnį metodą [40] su tam tikrais pakeitimais. Trumpai tariant, fosfatinis buferis (20 mM; pH=6,9) buvo naudojamas p-nitrofenilgliukopiranozei (pNPG) (-gliukozidazės substratui) paruošti. Atskiruose eksperimentuose a-gliukozidazė (50 μL) buvo iš anksto inkubuojama su didėjančia APLE koncentracija (kiekvienu atveju 25 μL), akarbozės arba buferio kiekvienu atveju 10 minučių. Po to į APLE/a-gliukozidazės arba akarbozės/a-gliukozidazės mišinį buvo pridėta 25 uL 3 mM p-nitrofenilgliukopiranozido, kad prasidėtų reakcija. Reakcijos mišinys kiekvienu atveju buvo inkubuojamas 25 laipsnių temperatūroje 20 minučių. Po 20 minučių inkubacijos reakcija buvo sustabdyta pridedant 0,1 M Na,CO (1 ml). Kontrolė buvo paruošta naudojant tą pačią procedūrą, išskyrus tai, kad -gliukozidazė buvo iš anksto inkubuota su buferiu, o ne APLE arba akarboze. Reakcijos produktas (gelsvos spalvos p-nitrofenolis) pasibaigus reakcijai buvo matuojamas spektrofotometru (UV-vis, T70 PG Instruments) esant 405 nm a-gliukozidazės aktyvumui nustatyti. Rezultatai buvo išreikšti kontrolinės grupės procentais. Kiekvienu atveju eksperimentai buvo kartojami tris kartus. Gliukozidazės aktyvumo slopinimo procentas (procentais) buvo įvertintas pagal formulę:

2.20. APLE gliukozidazės slopinimo būdas.APLE -gliukozidazės fermentinio aktyvumo slopinimo būdas buvo atliktas pagal ankstesnę procedūrą [41] su tam tikrais pakeitimais. Trumpai tariant, viename mėgintuvėlių rinkinyje tiksliai 25 μL 5 mg/mL APLE buvo iš anksto inkubuota su gliukozidazės tirpalu (50 μL) 25 laipsnių temperatūroje 1 0 minutes. Antrame mėgintuvėlių rinkinyje -gliukozidazė buvo iš anksto inkubuota su 50 μL 20 mM fosfatinio buferio (pH=6,9). Tada į abu mėgintuvėlių rinkinius buvo įpilta 25 uL p-nitrofenilgliukopiranozido (PNP) skirtingomis koncentracijomis (03-3,0 mg/mL), kad prasidėtų reakcija. Tada reakcijos mišiniai buvo inkubuojami 25 laipsnių temperatūroje 20 minučių, po to buvo pridėta Na, CO (1000 μL), kad reakcija būtų nutraukta. Išsiskyrusio produkto kiekis buvo matuojamas spektrofotometriškai, naudojant standartinę p-nitrofenolio kreivę, ir konvertuojamas į reakcijos greitį (v). Buvo sudarytas dvigubas abipusis grafikas (1/v prieš 1/S), kur S yra substrato koncentracija. Gliukozidazės aktyvumo slopinimo būdas APLE buvo nustatytas analizuojant Linijos Weaver-Burk diagramą.

2.21. 2,2-difenil-1-pikrilhidrazio(DPPH)radikalų šalinimo aktyvumo įvertinimas.DPPH radikalų šalinimo aktyvumas buvo atliktas pagal ankstesnį metodą [42] su tam tikrais pakeitimais. Trumpai tariant, 2 ml reakcijos mišinys buvo paruoštas sumaišius DPPH (1.0 ml 0,135 mM), paruošto metanolyje ir 10 ml įvairios koncentracijos APLE (40,80,120,160). ir 200 ug/mL) arba askorbo rūgšties. Reakcijos mišinys buvo stipriai suplaktas ir paliktas tamsoje kambario temperatūroje 30 minučių. Absorbcija buvo išmatuota (UV-vis, T70 PG Instruments) esant 517 nm, lyginant su tuščiuoju mėginiu. Visi bandymai buvo atlikti trimis egzemplioriais. Kontrolei buvo naudojamas vienodas metanolio ir DPPH tirpalo kiekis. DPPH radikalų šalinimo aktyvumas buvo įvertintas naudojant formulę:

2.22.Azoto oksido (NO) radikalų pašalinimo tyrimas.APLE ir standartų radikalų pašalinimo aktyvumas nebuvo įvertintas naudojant Griess Illosvory reakciją, kaip aprašyta anksčiau [43] su keliais pakeitimais. Trumpai tariant, Griess Ilosvory reagentas naudojo 0,1 % (m/v) naftiletilendiamino dihidrochlorido, o ne 5 % 1-naftilamino. Įvairios koncentracijos

({{{{10}}}} ug/mL) tiek APLE, tiek etalonų (galo rūgšties ir askorbo rūgšties), paruoštų ir paruoštų iki 167 uL, įdėta į paženklintus mėgintuvėlius, o po to 667 uL Pridėta 10 mM natrio nitroprusido. Tada buvo pridėta natrio fosfato buferio (167 uL, pH 7,4) ir mišinys inkubuojamas 25 laipsnių temperatūroje 150 minučių. Po to buvo pridėta 2000 μl sulfanilo rūgšties reagento (0,33 proc. 20 proc. ledinėje acto rūgštyje) ir leista pastovėti 5 minutes, kad baigtųsi diazotizacijos reakcija. Galiausiai buvo pridėta dar 2000 μl 0,1 procento naftiletilendiamino dihidrochlorido, sumaišoma ir leista pastovėti 30 minučių 25 laipsnių temperatūroje. Nitritų koncentracija buvo išmatuota (UV-vis, T70 PG Instruments) esant 546 nm ir buvo apskaičiuota naudojant kontrolinį nitrato tirpalą, kuriame nebuvo APPLE / arba etalonų, bet buvo visi kiti reakcijos mišinio komponentai. Natrio fosfato buferis buvo naudojamas kaip tuščias tirpalas. Procentas (procentai ) APLE ir standartų pašalinimo gebėjimas buvo apskaičiuotas naudojant formulę:

čia Ac yra kontrolinės medžiagos absorbcija, o At yra bandymo absorbcija (APLE / standartas).

2.23. Geležies redukcinio antioksidacinio pajėgumo (FRAC) tyrimas.FRAC buvo tiriamas pagal ankstesnį metodą [44] su keliais pakeitimais. Trumpai tariant, reakciją sudarė 250uL APLE/standartinis skirtingos koncentracijos tirpalas (125-200ug/mL), 625 uL natrio fosfato buferio (0.2M, kai pH 6,6). ) ir 625 ul 1 procento kalio geležies cianido [K,Fe(CN)] į įvairius mėgintuvėlius. Reakcijai užbaigti jie buvo inkubuojami 20 minučių 50 laipsnių temperatūroje. Tada į mėgintuvėlius įpilama 625 uL 10 procentų trichloracto rūgšties (TCA) tirpalo. Visas mišinys buvo centrifuguojamas 3000 aps./min. greičiu 10 minučių, po to buvo paimta 1800 uL supernatanto ir sumaišoma su 1800 μL distiliuoto vandens. Po to buvo pridėta 360 μl 0,1 procento geležies chlorido (FeCl) tirpalo ir gerai išmaišoma. Tirpalo absorbcija buvo matuojama esant 700 nm, naudojant spektrofotometrą (UV-vis, T70 PG Instruments), palyginti su reakcijos tuščiuoju mėginiu. Tipiškas tuščiasis tirpalas, turintis tą patį tirpalo mišinį be APLE / arba kvercetino, buvo inkubuojamas panašiomis sąlygomis. Padidėjusi reakcijos mišinio absorbcija rodo padidėjusį redukcinį pajėgumą. Eksperimentas buvo pakartotas tris kartus kiekvienai koncentracijai. FRAC buvo matuojamas kaip kvercetino ekvivalentas (QE).

2.24. IC ir EC įvertinimas0 Siekiant nustatyti IC ir ECsoof APLE su atitinkamais antioksidaciniais, laisvųjų radikalų pašalinimo ir slopinamaisiais efektais amilazės ir gliukozidazės fermentiniam aktyvumui, buvo išbandyta eilė didėjančių APLE koncentracijų, palyginti su atitinkamais. veikla. Konvertavus koncentracijas į atsijungimą, horizontalioje ašyje buvo pavaizduotas maksimalaus aktyvumo procentas (antioksidantas, laisvųjų radikalų pašalinimas ir slopinamasis poveikis -amilazės ir a-gliukozidazės fermentiniam aktyvumui) vertikalioje ašyje. APLE koncentracija, kuri sukuria 50 procentų maksimalios veiklos (antioksidantas,

laisvųjų radikalų pašalinimas ir slopinamasis poveikis -amilazės ir a-gliukozidazės fermentiniam aktyvumui) buvo nustatytas grafiškai, naudojant GraphPad prizmės 8 versiją.

2.25. Statistinė analizė.Gauti duomenys buvo pateikti kaip vidurkis ± SD. Statistinė analizė atlikta naudojant Graph Pad Prism Version 8 for Windows (Graph Pad Software, San Diego, CA, USA). Vidutinis grupių palyginimas buvo atliktas naudojant vienpusę dispersijos analizę (ANOVA), po kurios buvo atlikti keli Tukey palyginimo testai. P mažesnis arba lygus 0,05 visose analizėse buvo laikomas statistiškai reikšmingu.

Šis straipsnis yra ištrauktas iš Hindawi BioMed Research International Volume 2021, straipsnio ID 9920826, 17 puslapių https://doi.org/10.1155/2021/9920826