Akteozidas kaip galimas pirminės kepenų ląstelių karcinomos gydymo būdas: ikiklinikinis tyrimas

Kontaktai: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 El. paštas:audrey.hu@wecistanche.com

Di Ma, Juanas Wangas, Lu Liu, Meiqi Chen ir Zhiyong Wang

Abstraktus

Pagrindiniai faktai: Kepenų ląstelių karcinoma (HCC) yra dažnas piktybinis navikas, kuriam būdinga bloga prognozė, didelis sergamumas ir mirtingumas visame pasaulyje. Visų pirma, pažengusiems HCC pacientams yra prieinamos tik kelios sisteminio gydymo galimybės, įskaitant sorafenibą ir neseniai aprašytą atezolizumabo ir bevacizumabo režimą, kaip galimą pirmosios eilės gydymą. Čia siūlome akteozidą, feniletanoidinį glikozidą, plačiai paplitusį daugelyje vaistinių augalų, kaip potencialų kandidatą prieš pažengusią HCC.

Metodai: Ląstelių proliferacija, kolonijų susidarymas ir migracija buvo analizuojami trijose žmogaus HCC ląstelių linijose BEL7404, HLF ir JHH-7. Angiogenezės tyrimas buvo atliktas naudojant HUVES. BEL7404 arba JHH-7 ksenografinių nuogų pelių modelis buvo sukurtas siekiant išanalizuoti galimą priešnavikinį akteozido poveikį. qRT-PGR ir Western blot buvo naudojami galimiems akteozido priešnavikiniams mechanizmams atskleisti.

Rezultatai:Akteozidas iš cistancheslopino ląstelių proliferaciją, kolonijų susidarymą ir migraciją visose trijose žmogaus HCC ląstelių linijose BEL7404, HLF ir JHH-7. Akteozido angiogenezės draudimas buvo atskleistas slopinant HUVEC vamzdelių susidarymą ir ląstelių migraciją. Akteozido ir sorafenibo derinys stipriau slopino ląstelių kolonijų susidarymą ir HCC ląstelių migraciją, taip pat HUVEC angiogenezę. Akteozido priešnavikinis veiksmingumas in vivo buvo toliau įrodytas naudojant BEL7404 arba JHH-7 ksenografinių nuogų pelių modelį, o kartu su sorafenibu jis sustiprino JHH-7 ksenografo augimo slopinimą. Tolesnis JHH-7 ląstelių gydymas akteozidu parodė, kad padidėjo naviką slopinančio baltymo p53 lygis, taip pat sumažėjo su kallikreinu susijusios peptidazės (KLK1, 2, 4, 9 ir 10) geno lygis, tačiau reikšmingo poveikio nebuvo. likusių KLK1–15 genų pokyčiai.

Išvados:Akteozidas iš cistanchesukelia priešnavikinį poveikį, galbūt padidindamas p53 lygį, taip pat slopindamas KLK ekspresiją ir angiogenezę. Akteozidas gali būti naudingas kaip papildoma priemonė gydant pažengusią HCC klinikoje.

Raktiniai žodžiai: akteozidas, kepenų ląstelių karcinoma, sorafenibas, ksenografas, p53, kalikreinas

Fonas

Hepatoceliulinė karcinoma (HCC) yra dažnas piktybinis navikas, kuriam būdinga bloga prognozė ir didelis sergamumas bei mirtingumas visame pasaulyje [1, 2]. Nustatyta, kad prie HCC atsiradimo ir progresavimo prisideda įvairūs veiksniai, įskaitant hepatito B arba C viruso sukeltą infekciją, naviką slopinančių genų, tokių kaip p53, inaktyvavimą, nenormalų onkogenų, pvz., K-ras, aktyvavimą ir kai kurias signalines molekules. pvz., PI3K, ERK/MAPK ir Wnt/-kateninas, taip pat šeimininko imuninės sistemos vengimas [3, 4]. Gydant HCC, rezekcija, kepenų transplantacija ir radijo dažnio abliacija yra ankstyvos stadijos HCC pacientams, kuriems būdingas didelis pasikartojimo ir metastazių dažnis [3, 5, 6]. Be to, pažengusiems HCC pacientams yra prieinamos tik kelios sisteminio gydymo galimybės, įskaitant sorafenibą ir neseniai aprašytą atezolizumabo ir bevacizumabo režimą, kaip galimą pirmosios eilės gydymą [7]. Šiame kontekste svarbu ir svarbu sukurti naujus agentus, nukreiptus į kelis molekulinius taikinius, arba sukurti naują strategiją, pvz., Kombinuotosios terapijos taikymą gydant pažengusią HCC.

Akteozidas iš cistancheyra feniletanoido glikozidas, plačiai paplitęs daugelyje vaistinių augalų, įskaitant Ligustrum purpurascens [8], Rehmannia glutinosa [9] ir Ligustrum purpurascens [10]. Daugėja įrodymų, kad akteozidas gali turėti įvairią biologinę veiklą, įskaitant priešnavikinį aktyvumą. Pavyzdžiui, akteozidas parodė stiprų antiproliferacinį poveikį prostatos vėžio ląstelėms [11]. Intraperitoninis akteozido įvedimas slopino naviko augimą pelės melanomos modelyje, galbūt slopindamas proteinkinazę C [12]. Be to, akteozidas sustiprino gaubtinės ir tiesiosios žarnos vėžio ląstelių jautrinimą 5- fluorouracilui, nukreipdamas PI3K/Akt signalizaciją [13]. Mūsų ankstesni duomenys taip pat parodė, kad B16 melanomos ląstelėse akteozidas slopina melanogenezę [14]. Nepaisant to, yra mažai informacijos apie galimą akteozido veiksmingumą gydant HCC ir galimus pagrindinius mechanizmus.

Šiame tyrime mes tai parodėmeAkteozidas iš cistancheslopina ląstelių proliferaciją, kolonijų susidarymą ir migraciją visose trijose žmogaus HCC ląstelių linijose BEL7404, HLF ir JHH7. Angiogenezė taip pat slopinama po gydymo akteozidu, kaip rodo HUVEC vamzdelių susidarymo ir ląstelių migracijos slopinimas. Akteozido priešnavikinis veiksmingumas in vivo toliau įrodytas naudojant BEL7404 arba JHH-7 ksenografinių nuogų pelių modelį, o kartu su sorafenibu jis sustiprina JHH-7 ksenografo augimo slopinimą. Akteozido priešnavikinis poveikis gali būti siejamas su jo p53 reguliavimu, taip pat KLK ir angiogenezės slopinimu.

Metodai

Ląstelių kultūros

Žmogaus hepatoceliulinės karcinomos (HCC) ląstelių linijos BEL7404, HLF ir JHH7 buvo gautos iš Amerikos tipo kultūrų kolekcijos ir buvo reguliariai kultivuojamos DMEM terpėje, kurioje yra 10 procentų galvijų vaisiaus serumo, papildyto 100 vienetų/ml penicilino G ir 100 ug/ml streptomicino. sudrėkintame inkubatoriuje 37 laipsnių temperatūroje su 5 procentais anglies dioksido. Žmogaus bambos venų endotelio ląstelės (HUVEC) buvo išskirtos iš žmogaus virkštelės venų (pateikiamos ScienCell Research Laboratories, San Diego, JAV) ir laikomos endotelio ląstelių terpėje, kaip aprašyta anksčiau [15].

ReagentaiAkteozidas iš cistanche (A01) buvo įsigytas iš Jiangsu Yongjian Medicine Technology Co., Ltd. (Taizhou, Kinija; partijos Nr. 100581; grynumas didesnis arba lygus 99 proc. pagal HPLC). Sorafenibas buvo gautas iš Selleck Chemicals (Hjustonas, JAV). Akteozidą ištirpinome 0,9 procento fiziologiniame tirpale. Pradinis sorafenibo tirpalas buvo paruoštas dimetilsulfokside (DMSO; 10 mM), padalytas į alikvotas ir laikomas –20 laipsnių temperatūroje.

Gyvūnai

Tyrime buvo naudojami BALB/c (Nu/Nu) pelių patinai (18-20 g, 6–8 sav. gavimo metu) (Shanghai Slac Laboratory Animal Co. Ltd., Šanchajus, Kinija). Gyvūnai buvo laikomi individualiai vėdinamuose polisulfoniniuose narvuose kontroliuojamoje temperatūra ir šviesa (12 h šviesos- 12 h tamsos ciklas, apšvietimas įjungiamas 7:00 val.) su laisva prieiga prie maisto ir vandens. . Visus eksperimentinius protokolus patvirtino Institucinis gyvūnų priežiūros ir naudojimo komitetas ir jie buvo atlikti pagal Tarptautinės skausmo tyrimo asociacijos gaires dėl laboratorinių gyvūnų naudojimo.

Ląstelių proliferacijos tyrimas Antiproliferacinis aktyvumas buvo atliktas naudojant MTT tyrimą. Trumpai tariant, ląstelės buvo padengtos 4–5 × 103 ląstelių tankiu 96- šulinėlių plokštelėse. Pritvirtinus per naktį, ląstelės buvo apdorotos akteozido koncentracijos serija. Nurodytu laiku atlikus gydymą vaistais, ląstelės buvo inkubuojamos su 3-(4,5- dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolio bromidu (MTT). Roche Diagnostic Corporation, Indianapolis, IN, JAV. Galutinė koncentracija: 5 ug/ml) 3–4 valandas 37 laipsnių temperatūroje. Formazano produktas buvo ištirpintas DMSO kiekybiniam įvertinimui esant 570 nm bangos ilgiui.

Colony formation assay Cells were seeded in 24-well plates at a density of 200 cells per well and allowed to attach to the bottom of the well overnight. Cells were then treated with indicated drugs at the given concentration. The culture medium was replaced every 3 days until colonies were visible on day 12 post-culturing. For colonies counting, the cells were fixed with 4% paraformaldehyde and stained with 0.1% crystal violet. Colonies>10 ląstelių buvo suskaičiuota šviesos mikroskopu (x 100 padidinimas; Olympus, Tokijas, Japonija).

Žaizdų gijimo testas Ląstelės buvo pasėtos į {{0}} šulinių plokšteles (1 × 105 ląstelių viename duobutėje) ir kultivuojamos iki 90 procentų susiliejimo. Ląstelių sluoksnis buvo subraižytas steriliu 200 ul pipetės antgaliu, kad susidarytų žaizdos tarpas. Ląstelių migracija į sužeistą vietą buvo vizualizuota nurodytais laiko momentais (0, 10 ir 24 val.) apverstos šviesos mikroskopu, padidinant × 100. Kiekvienas eksperimentas buvo atliktas trimis egzemplioriais.

Vamzdžių susidarymo tyrimas HUVEC buvo kultivuojami, kaip aprašyta anksčiau [15]. Trumpai tariant, 96-šulinėlių plokštelės buvo padengtos Matrigel (BD Biosciences, Franklin Lakes, JAV) pagal gamintojo instrukcijas ir grąžintos į inkubatorių polimerizuotis 30–40 min. Tada HUVEC buvo sėjami 2 × 105 ląstelių / ml tankiu ir 8 valandas apdoroti įvairiais vaistais. Vamzdžių susidarymas buvo nufotografuotas apverstu mikroskopu nurodytais laiko momentais ir analizuojamas naudojant „ImageJ“ programinę įrangą.

Western blot analizė

Visi ląstelių lizatai buvo paruošti naudojant radioimunoprecipitacijos tyrimo buferį (RIPA) (50 mM Tris HCl, esant pH 8.0, 150 mM NaCl, 1 proc. NP40, 1 proc. natrio deoksicholato, 0,1 proc. SDS, 10). ug/ml leupeptino, 10 ug/ml aprotinino ir 2 mM PMSF). Baltymų mėginiai vienodais kiekiais (20 µg / juostoje) buvo atskirti SDS-PAGE gelyje ir perkelti į PVDF membranas (Bio-Rad, Hercules, CA). Membranos buvo inkubuojamos per naktį su p53 antikūnu (Cell Signaling Technology, Boston, MA). Pakrovimo kontrolei membranos buvo nuplaunamos pašalinimo buferiu ir pakartotinai patikrintos su -aktino antikūnu (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA). Baltymai buvo aptikti naudojant ECL aptikimo sistemą (Perkin Elmer Life Sciences, Bostonas, JAV).

qRT-PGR

Bendra RNR buvo išskirta iš ląstelių linijų naudojant Trizol reagentą (Invitrogen, JAV) ir buvo atlikta atvirkštinės transkripcijos-polimerazės grandininė reakcija (RT-PCR), siekiant susintetinti cDNR, naudojant komerciškai prieinamą rinkinį. Realaus laiko qRT-PGR naudojant 2xSYBR žalią qPCR Supermix buvo atlikta Stratagene Mx3000P PRC mašina (Agilent Technologies, JAV). Pradmenų sekos parodytos žemiau: sensorinė 5′-CACCATGTGG TTCCTGGTTC-3′ ir antisensinė 5′-CAAACAAGTT GTGGCGACCC-3′ KLK1; jutimas 5′-GTGTACAGTC ATGGATGGGC-3′ ir antisensis 5′-CCCAGAATCA CCCCCACAAG-3′ skirtas KLK2; jutimas 5′- CCACACCC GCTCTACGATATGA-3′ ir priešprasminis 5′-CCC AGA ATCACCCGAGCAG-3′ skirtas KLK3; jutimo 5′-CGCACA CTGTTTCCAGAACTC-3′ ir priešprasminė 5′- GTTG CAGGAGTCCTTCTGGT-3′ skirta KLK4; jutimo 5′-CCTG CACCCACATCTTTCTCT-3′ ir priešprasminė 5′- GGTAAGCATCCTCGCACCTT-3′ skirta KLK5; jutimas 5′- CTCTCTCCTGGGGACACAGA-3′ ir priešprasminis 5′- TCCGCCATGCACCAACTTAT-3′ skirtas KLK6; jutimas 5′- TTTTGGAGCCCAGCTGTGTG-3′ ir priešprasminis 5′- GTCACCATTGCAGGCGTTTT-3′ skirtas KLK7; jutimas 5′- CTGGGCAGGACACTCCAG-3′ ir priešprasminis 5′- ACACCGCCACAGAGTAGTTG-3′ skirtas KLK8; jutimas 5′- GTAGGGGGTTCTCGTAGGGT-3′ ir priešprasminis 5′- CGGTGACGTCATAGAGACGG-3′ skirtas KLK9; jutimo 5′-CAGGAGTGCCAGCCTCAC-3′ ir priešprasminė 5′-CTGGGGAGGAAGAGGATGGA-3′ skirta KLK10; jutimo 5′-CCCACCCCTTGGATTCTGTCT-3′ ir priešprasminė 5′-GTGAACTATGTAGCGGGGCT-3′ skirta KLK11; jutimas 5′-TGTTCTTGGTGAGTTCTCCCG-3′ ir priešprasminis 5′-GGATCCAGTCCACATACTTGC-3′ skirtas KLK12; jutimo 5′-CCTGAACCACGACCATGACA-3′ ir priešprasminė 5′-GCAGGGTTTGGATGTAGCCT-3′ skirta KLK13; jutimo 5′-CCCAACTACAACTCCCGGAC-3′ ir priešprasminė 5′-CCTGAAGCAACTGCTCGTGA-3′ skirta KLK14; jutimo 5′-AGTTGCTGGAAGGTGACGAG- 3′ ir priešprasminė 5′-TGGCTAACATCTGGGCCTTG- 3′ skirta KLK15; 5′-GACAGTCAGCCGCATCTT CT-3′ ir antisensinis 5′- GCGCCCAATACGACCAAA TC-3′ skirtas GAPDH. Kiekvieno KLK geno ciklo slenksčio (Ct) vertės buvo normalizuotos iki GAPDH ir analizuojamos naudojant MxPro programinę įrangą.

In vivo priešnavikinis A01 aktyvumas atskirai arba kartu su sorafenibu. Buvo paruoštos BEL7404 ląstelių suspensijos (3 × 106 ląstelės) ir sušvirkštos po oda į dešinįjį kūno šoną. bekrūčio nuogos pelės. Praėjus dešimčiai dienų po inokuliacijos, pelės, turinčios naviką (kūno svoris (g): 22–26; vidurkis ± SEM: 23,8 ± 0,14), buvo atrinktos atsitiktinai suskirstyti į 7 gydymo grupes, atsižvelgiant į naviko tūrį ({ {12}} mm3). Iš viso 38 pelės buvo priskirtos skirtingoms gydymo grupėms (n=5 vienoje grupėje, išskyrus modelio grupę (n=8)). Gyvūnai buvo gydomi per burną zondu su acteozidu (A01; 12,5, 25 ir 50 mg/kg), vien sorafenibu (50 mg/kg) arba kartu su A01 (50 mg/kg) vieną kartą per parą 14 dienų. Be to, 20 mg/kg A01 dozė taip pat buvo švirkščiama į veną. Dozės buvo parinktos remiantis ankstesniais tyrimais ir mūsų preliminariais duomenimis [15]. Auglio augimas buvo stebimas kas 3 ar 4 dienas naudojant elektroninį suportą, kurio tūris buvo skaičiuojamas kaip 0,5 x ilgis x plotis (mm3). Be to, buvo įtrauktas lygiagretus eksperimentas, naudojant JHH-7 inokuliaciją. Praėjus septynioms dienoms po inokuliacijos, pelės, turinčios naviką (kūno svoris (g): 20–26; vidurkis ± SEM: 24,0 ± 0,20), buvo atrinktos atsitiktinai suskirstyti į gydymo grupes pagal naviko tūrį (80-130 mm3). ). Iš viso 23 pelės buvo priskirtos 4 gydymo grupėms (n=5 vienoje grupėje, išskyrus pavyzdinę grupę (n=8)). Tada gyvūnai vieną kartą per parą 14 dienų iš eilės gavo A01 (20 mg/kg, į veną), vieną sorafenibą (50 mg/kg, ig) arba kartu su A01 (20 mg/kg, iv). Visos pelės buvo anestezuotos chloro hidratu (350 mg/kg) ir stebėjimo laikotarpio pabaigoje numarintos išniriant kaklą. O naviko masė buvo pašalinta ir nufotografuota skaitmeniniu fotoaparatu.

Statistinė analizė

Visi duomenys išreiškiami kaip vidurkis ± standartinis nuokrypis (SD). Jei nenurodyta kitaip, statistinė analizė buvo atlikta naudojant dispersijos analizę (ANOVA), po kurios buvo atliktas posthoc Tukey testas. Naviko tūrio reikšmės rodomos kaip vidurkis ± standartinė vidurkio paklaida (SEM). Dviejų krypčių ANOVA ir Tukey testai buvo naudojami naviko tūrio duomenims analizuoti. Statistinei analizei buvo naudojama programinė įranga GraphPad Prism. Vertė p < 0,05="" buvo="" laikoma="" statistiškai="">

Rezultatai

A01 poveikis HCC proliferacijai ir kolonijų susidarymui in vitro

Ląstelių proliferacijos tyrimui buvo naudojamos trys HCC ląstelių linijos (BEL7404, HLF ir JHH7). Kaip parodyta 1 pav., MTT tyrimas atskleidė, kad A01 slopina visų trijų HCC ląstelių proliferaciją. Norint toliau paklausti, ar A01 antiproliferacinis aktyvumas atsirado dėl jo gebėjimo slopinti ląstelių klonogeniškumą, buvo atliktas kolonijų susidarymo tyrimas. A01 esant 100 μM rodė stiprų kolonijų susidarymo slopinimą BEL7404 ląstelėse (2a ir b pav.). Derinant su sorafenibu (2 μM), slopinimo potencija buvo stipresnė nei vien A01 arba sorafenibo. Panašūs rezultatai buvo pastebėti ir kitose dviejose HCC ląstelėse – HLF ir JHH-7 (2c ir d pav.).

A01 poveikis atskirai arba kartu su sorafenibu HCC ląstelių migracijai in vitro

Toliau įvertinome ląstelių migraciją, naudodami įbrėžimų žaizdų tyrimą. Kaip parodyta 3 pav., A01 (100 arba 500 μM) ir sorafenibo (10 μM) derinys reikšmingai užkirto kelią žaizdų gijimui visose trijose HCC ląstelėse, palyginti su kontroline grupe. BEL7404 ląstelėms tiek A01 (100 arba 500 μM), tiek sorafenibas (10 μM) sukėlė tik žaizdų gijimo prevencijos tendenciją, bet statistiškai nereikšminga (3a ir d pav.). HLF ląstelėms A01 esant 500 μM ir sorafenibas 10 μM slopino žaizdų gijimą. Visų pirma, A01 (500 μM) kartu su sorafenibu (10 μM) stipriau slopino žaizdų gijimą nei vienas sorafenibas (3b ir e pav.). JHH ląstelėms žaizdų gijimą neleido A01 (500 μM) ir sorafenibas (10 μM). A01 (100 μM) ir sorafenibo (10 μM) derinys stipriau slopino žaizdų gijimą nei A01 (100 μM) arba sorafenibas (10 μM). Be to, A01 esant 500 μM kartu su sorafenibu (10 μM) rodė stipresnį žaizdų gijimo slopinimą nei A01 (500 μM) arba sorafenibas (10 μM) atskirai (3c ir f pav.).

Vieno A01 arba kartu su sorafenibu poveikis angiogenezei in vitro

Angiogenezė yra glaudžiai susijusi su naviko augimu, progresavimu ir metastazėmis [16], todėl laikoma vienu iš tarpinių vėžio gydymo tikslų. Pirmiausia atlikome mėgintuvėlio formavimo tyrimą, kad galėtume analizuoti galimą angiogenezę in vitro. Kaip parodyta 4 pav., 3 val. gydymas vien sorafenibu (10 μM) arba A01 (100 ir 500 μM) ir sorafenibo (10 μM) deriniu pradėjo slopinti į kraujagysles panašių struktūrų susidarymą, t. HUVEC pailgėjimas ir išlyginimas (4a ir c pav.). Po 8 valandų gydymo A01 (100 ir 500 μM), sorafenibas (10 μM), taip pat A01 ir sorafenibo derinys reikšmingai slopino į kraujagysles panašių struktūrų susidarymą, o A01 ir sorafenibo derinys slopino stipriau nei A01 arba vien sorafenibas (4a ir c pav.). Be to, HUVEC ląstelių migracija yra pagrindinis žingsnis formuojant naujus kraujagysles angiogenezės metu, todėl ji yra tiriama. Kaip parodyta 4b ir d pav., A01 (500 μM), sorafenibas (10 μM), taip pat A01 (100 ir 500 μM) ir sorafenibo (10 μM) derinys reikšmingai slopino HUVEC ląstelių migraciją. A01 (500 μM) kartu su sorafenibu (10 μM) sukėlė stipresnį slopinimą nei vien A01 (500 μM) arba sorafenibas (10 μM).

Vieno A01 arba kartu su sorafenibu poveikis BEL7404 ir JHH-7 HCC ksenografų auglio augimui in vivo

Norėdami toliau įvertinti vien A01 arba derinio su sorafenibu veiksmingumą HCC auglio augimui in vivo, sukūrėme poodinės ksenografinės nuogos pelės modelį, naudojant BEL7404 arba JHH-7 ląstelės. Kaip parodyta 5 pav., naviko tūris labai sumažėjo po gydymo A01 (25 ir 50 mg/kg, per burną zondą; 20 mg/kg, per uodegos veną; visi p < 0,01,="" palyginti="" su="" modelio="" grupe)="" arba="" vien="" sorafenibu="" (50="" mg/kg,="" per="" burną="" zondą;="" p="">< 0,01,="" palyginti="" su="" modelio="" grupe)="" (5a="" ir="" b="" pav.).="" a01="" (50="" mg/kg)="" ir="" sorafenibo="" (50="" mg/kg)="" derinys="" parodė="" stipresnį="" naviko="" augimo="" slopinimą,="" lyginant="" su="" vienu="" sorafenibu="" (p="">< 0,01),="" bet="" sukėlė="" panašų="" poveikį="" kaip="" ir="" vien="" a01="" (5a="" ir="" c="" pav.).="" ).="" toliau="" naudojome="" jhh-7="" ksenografinių="" nuogų="" pelių="" modelį,="" kad="" toliau="" išbandytume="" galimą="" a01="" priešnavikinį="" veiksmingumą.="" kaip="" parodyta="" 6="" pav.,="" gydymas="" a01="" (20="" mg/kg,="" iv)="" arba="" sorafenibu="" (50="" mg/kg,="" ig)="" reikšmingai="" slopino="" jhh-7="" ksenografo="" naviko="" augimą="" (p="">< 0,01,="" palyginti="" su="" modelio="" grupe).="" ),="" su="" didesniu="" slopinimu,="" kai="" jie="" derinami="" kartu="" (6a="" ir="" b="" pav.;="" p="">< 0,01,="" palyginti="" su="" a01="" arba="" atskirai="" sorafenibo="">

Galimas su kallikreinu susijusios peptidazės ir p53 moduliavimasAkteozidas iš cistanche

Su kallikreinu susijusi peptidazė (KLK) buvo pasiūlyta kaip vėžio biomarkeris diagnozuojant ir prognozuojant įvairias vėžio formas, įskaitant kepenų ląstelių karcinomą dėl nereguliuojamos ekspresijos [17–19]. Pagal šį scenarijų mes aptikome KLK1–15 geno ekspresiją HCC JHH-7 ląstelių linijoje. Kaip parodyta 7 pav., gydymas akteozidu reikšmingai slopino KLK1, 2, 4, 9 ir 10 mRNR lygius (7a–e pav.), o likusios KLK1–15 dalys reikšmingų pokyčių nepakito (duomenys nerodomi). ). Be to, mes taip pat nustatėme naviką slopinančio baltymo p53 lygį ir padidinome gydymą akteozidu (7f pav.).

Diskusija

Pažengusio HCC valdymas ilgą laiką buvo sudėtingas dėl to, kad ankstesnėse stadijose nepavyko diagnozuoti ir naviko cheminio atsparumo [5, 6]. Sorafenibas, multikinazės inhibitorius, kuris, kaip pranešta, slopina ląstelių proliferaciją ir angiogenezę, kartu su kitu geriamuoju kelių kinazių inhibitoriumi lenvatinibu tapo standartiniu pažengusios HCC gydymu [3, 5, 20, 21]. Tačiau bendras išgyvenamumas yra nedidelis, atsižvelgiant į mažą atsako dažnį ir netinkamumą klinikinėms aplinkybėms [3, 22]. Neseniai atliktas tyrimas parodė, kad atezolizumabas ir bevacizumabas davė geresnių klinikinių rezultatų nei sorafenibas pacientams, sergantiems neoperuojamu HCC, todėl šis derinys gali būti naujas pirmos eilės gydymo būdas pažengusiems HCC [7]. Šiame kontekste mes nustatėme, kad feniletanoido glikozidas,Akteozidas iš cistancheslopino ląstelių proliferaciją, kolonijų susidarymą ir migraciją trijose žmogaus HCC ląstelių linijose BEL7404, HLF ir JHH-7, taip pat uždraudė HUVEC angiogenezę. Akteozido ir sorafenibo derinys stipriau slopino ląstelių kolonijų susidarymą ir HCC ląstelių migraciją, taip pat HUVEC angiogenezę. Akteozidas parodė priešnavikinį veiksmingumą BEL7404 arba JHH-7 ksenografinių nuogų pelių modelyje, o kartu su sorafenibu sustiprino JHH-7 ksenografo augimo slopinimą. Tolesnė analizė atskleidė p53 padidėjimą ir kai kurių KLK genų sumažėjimą. Atitinkamai, reikėtų apsvarstyti galimybę naudoti akteozidą kaip pagalbinę priemonę pažengusiam HCC gydymui klinikoje.

Didėjantys įrodymai parodė priešnavikinį poveikįAkteozidas iš cistancheįvairiose navikinėse ląstelėse, tokiose kaip B16 melanomos ląstelės, glioblastomos ląstelės, gaubtinės ir tiesiosios žarnos vėžio ląstelės, burnos plokščiųjų ląstelių karcinomos ląstelės, prostatos vėžio ląstelės ir žmogaus krūties adenokarcinomos ląstelės [11–13, 23–25] arba gyvūnai, turintys navikų [12]. Nepaisant to, keli tyrimai buvo skirti akteozido poveikiui HCC in vitro arba in vivo, išskyrus vieną tyrimą, kuriame dietilnitrozaminas buvo naudojamas kaip kancerogenas, skatinantis žiurkių hepatokarcinogenezę ir atskleidžiama chemoprevencija akteozidu [26]. Šiame tyrime mes parodėme, kad akteozidas slopina ląstelių proliferaciją, kolonijų susidarymą ir migraciją HCC ląstelių linijose, taip pat naviko augimą pelėse, turinčiose HCC ląstelių linijos ksenografus, taip tiesiogiai parodydami priešnavikinį akteozido poveikį HCC. Be to, akteozido ir sorafenibo derinys sukėlė dar stipresnį priešnavikinį poveikį. Kartu su įrodymais, kad akteozidas apsaugo nuo kepenų pažeidimų [27–29], nesukelia toksinio poveikio gyvūnams ir nesukelia mutageniškumo [30], atrodo, kad ateityje būtų įmanoma taikyti kombinuotą akteozido ir sorafenibo gydymą pacientams, sergantiems pažengusia liga. HCC klinikoje.

Žmogaus kallikreino šeimą sudaro 15 homologinių, vienos grandinės, išskiriamų į tripsiną arba chimotripsiną panašių serino proteazių (KLK1–15), kuri yra susijusi su naviko augimo, neoplastinio progresavimo, angiogenezės ir metastazių reguliavimu [18, 31]. Visų pirma, KLK buvo pasiūlyta kaip vėžio biomarkeris diagnozuojant ir prognozuojant įvairius vėžio atvejus, įskaitant kepenų ląstelių karcinomą dėl jos nereguliuojamos ekspresijos [17–19]. Pavyzdžiui, KLK1 siūlomas kaip skrandžio vėžio biomarkeris dėl padidėjusio KLK1 koncentracijos skrandžio neoplazmoje ir skrandžio vėžio naviko augimo prevencijos, slopinant KLK1 aktyvumą kallikreiną rišančiu baltymu (KBP) [32]. Pagal šį scenarijų mes pastebėjome reikšmingą KLK mRNR lygio slopinimą akteozidu (KLK1, 2, 4, 9 ir 10). Buvo pranešta, kad KBP, kuris specifiškai jungiasi prie audinių kallikreino ir slopina kallikreino aktyvumą, naudojimas slopina HCC augimą pelėse, galbūt dėl ​​jo antiangiogeninio aktyvumo [33], o tai rodo galimą KLK dalyvavimą HCC progresavime. Be to, naviko slopinimo baltymas p53 gali sukelti senėjimą, apoptozę ir ląstelių ciklo sustabdymą. Padidėjusi p53 ekspresija padidina vėžio ląstelių cheminį jautrumą [34]. Šiuo atžvilgiu mūsų vakarietiški rezultatai parodė, kad po gydymo akteozidu padidėjo p53 lygis. Apibendrinant galima daryti išvadą, kad akteozidas daro priešnavikinį poveikį HCC, galbūt dėl ​​to, kad jis padidina p53 reguliavimą, taip pat slopina KLK ir angiogenezę.

Reikėtų pažymėti, kad tiesioginis molekulinis taikinys, į kurįAkteozidas iš cistanchegali tiesiogiai susieti, vis dar neaišku. Mūsų preliminarūs duomenys, naudojant molekulinį prijungimą, atskleidė tiesioginį akteozido susiejimą su kallikreinu (duomenys nerodomi). Norint išaiškinti šią prielaidą, reikėtų atlikti tolesnius eksperimentus. Be to, kalbant apie tyrime ląstelių tyrimui naudotas akteozido dozes, 10–50 kartus didesnes nei sorafenibo (10 μM), pirmiausia pasirinkome tas akteozido dozes pagal dozės ir atsako santykis MTT tyrime. Antra, mūsų naudotos dozės (100, 500 μM) buvo panašios į ankstesnius tyrimus [35], kuriuose akteozidas (100 μM) slopino gaubtinės ir tiesiosios žarnos vėžio ląstelių proliferaciją. Galiausiai, nepaisant didesnės dozės ląstelių tyrime, akteozidas sukėlė ryškų naviko augimo slopinimą HCC ksenografinių nuogų pelių modelyje mūsų tyrime (25 ir 50 mg/kg), o poveikis buvo panašus į sorafenibo (50 mg/kg). Mūsų tyrime sorafenibas buvo naudojamas 10 μM doze ląstelių lygiu. Ši dozė yra panaši į ankstesnius tyrimus, kuriuose nustatyta, kad PLC/PRF/5 ir HepG2 ląstelių HCC ląstelių linijose sorafenibas slopina ląstelių gyvybingumą, kai IC50 yra 4,0–6,5 μM. Priešingai, sorafenibo dozė, naudojama HCC ksenografų augimui slopinti SCID pelių patelėms, buvo 30 mg/kg (po zondu) [36]. Klinikoje rekomenduojama sorafenibo dozė pacientui yra 400 mg per kartą (2*0,2 g), du kartus per parą (iš viso 800 mg per parą). Ši klinikoje vartojamo sorafenibo dozė skiriasi nuo naudojamos ląstelių tyrime (IC50 vertė μM lygiu), galbūt dėl ​​to, kad in vivo sąlygomis jis blogas absorbuojamas. Akteozido, remiantis jo doze pelėms (50 mg/kg, ig), jo ekvivalentinė dozė žmonėms (60 kg KM) yra apie 250 mg. Ši dozė yra panaši į klinikoje vartojamo sorafenibo dozę ir turėtų būti priimtina pacientams.

Išvados Apibendrinant,Akteozidas iš cistanchegali turėti priešnavikinį poveikį HCC ląstelių linijose ir nuogos pelėse, turinčiose HCC ląstelių linijos ksenografus, galbūt padidindamas p53 lygį, taip pat uždraudžiant KLK ir angiogenezę. Akteozidas gali būti naudingas kaip papildoma priemonė gydant pažengusią HCC klinikoje.

Nuorodos

1 Bray F, Ferlay J, Soerjomataram I, Siegel RL, Torre LA, Jemal A. Pasaulinė vėžio statistika 2018 m.: GLOBOCAN įvertinimai apie 36 vėžio atvejų dažnumą ir mirtingumą visame pasaulyje 185 šalyse. CA Cancer J Clin. 2018;68(6):394–424..

2. Llovet JM, Zucman-Rossi J, Pikarsky E, Sangro B, Schwartz M, Sherman M, Gores G. Hepatoceliulinė karcinoma. Nat Rev Dis gruntai. 2016;2:16018.

3. Sim HW, Knox J. Kepenų ląstelių karcinoma imunoterapijos eroje. Curr Probl Vėžys. 2018;42(1):40–8. 4. Jiang Y, Han QJ, Zhang J. Kepenų ląstelių karcinoma: progresavimo mechanizmai ir imunoterapija. Pasaulis J Gastroenterolis. 2019;25(25):3151–67.

5. Forner A, Da Fonseca LG, Diaz-Gonzalez A, Sanduzzi-Zamparelli M, Reig M, Bruix J. Hepatoceliulinės karcinomos valdymo ginčai. JHEP Rep. 2019;1(1):17–29.

6. Hartke J, Johnson M, Ghabril M. Hepatoceliulinės karcinomos diagnostika ir gydymas. Semin Diagn Pathol. 2017;34(2):153–9.

7. Finn RS, Qin S, Ikeda M, Galle PR, Ducreux M, Kim TY, Kudo M, Breder V, Merle P, Kaseb AO ir kt. Atezolizumabas ir bevacizumabas sergant neoperuojama kepenų ląstelių karcinoma. N Engl J Med. 2020;382(20):1894–905.

8. Jis ZD, Ueda S, Akaji M, Fujita T, Inoue K, Yang CR. Monoterpenoidiniai ir feniletanoidiniai glikozidai iš Ligustrum peduncular. Fitochemija. 1994;36(3):709–16.

9. Li H, Chou GX, Wang ZT, Hu ZB. HPLC nustatymasakteozidoRadix Rehmanniae. Zhongguo Zhong Yao Za Zhi. 2006;31(10):822–4.

10. Wong IY, He ZD, Huang Y, Chen ZY. Ligustrum purpurascens feniletanoidinių glikozidų antioksidacinė veikla. J Agric Food Chem. 2001;49(6):3113–9.

11. Mulani SK, Guh JH, Mong KK. Bendra sintetinė strategija ir natūralių feniletanoidinių glikozidų prostatos vėžio ląstelių linijų antiproliferacinės savybės. Org Biomol Chem. 2014;12(18):2926–37.

12. Cheimonidi C, Samara P, Polychronopoulos P, Tsakiri EN, Nikou T, Myrianthopoulos V, Sakellaropoulos T, Zoumpourlis V, Mikros E, Papassideri I ir kt. Selektyvus augalinės medžiagos akteozido citotoksiškumas prieš naviko ląsteles ir jo mechaninės įžvalgos. Redox Biol. 2018;16:169–78.

13. Attia YM, El-Kersh DM, Wagdy HA, Elmazar MM. Verbascoside: gaubtinės ir tiesiosios žarnos vėžio ląstelių identifikavimas, kiekybinis nustatymas ir galimas jautrinimas 5-FU, taikant PI3K/AKT kelią. Sci Rep. 2018;8(1):16939.

14. Liu S, Zhao Z, Huo Z, Xu Z, Zhong Y, Wang X, Yang Y, Wang Z. Osmanthus fragrans gėlių vandeninis ekstraktas ir jo praturtintas akteozidas slopina melanogenezę ir ultravioletinių spindulių sukeltą pigmentaciją. Nat Prod Commun. 2018;13(5):575–80.

15. Wang J, Ma S, Chen X, Zhang S, Wang Z, Mei Q. Naujasis PI3K inhibitorius S1 sinergizuojasi su sorafenibu nesmulkialąstelinėse plaučių vėžio ląstelėse, kuriose dalyvauja Akt-S6 signalizacija. Naujų narkotikų tyrimas. 2019;37(5):828–36.

16. Hanahan D, Weinberg RA. Vėžio požymiai: nauja karta. Ląstelė. 2011;144(5):646–74. 17. Emami N, Diamandis EP. Su kallikreinu susijusių peptidazių (KLK) kaip vėžio biomarkerių naudingumas. Clin Chem. 2008;54(10):1600–7.

18. Tailor PD, Kodeboyina SK, Bai S, Patel N, Sharma S, Ratnani A, Copland JA, She JX, Sharma A. Diagnostic and prognostic biomarker potencial of kallikrein family gens in different cancer types. Oncotarget. 2018;9(25): 17876–88.

19. Kontos CK, Mavridis K, Talieri M, Scorilas A. Kallikrein-related peptidases (KLKs) in gastrointestinal cancer: mechanistic and klinikai aspektai. Thromb Haemost. 2013;110(3):450–7.

20. Cheng AL, Kang YK, Chen Z, Tsao CJ, Qin S, Kim JS, Luo R, Feng J, Ye S, Yang TS ir kt. Sorafenibo veiksmingumas ir saugumas pacientams Azijos ir Ramiojo vandenyno regione, sergantiems pažengusia kepenų ląstelių karcinoma: III fazės atsitiktinių imčių, dvigubai aklas, placebu kontroliuojamas tyrimas. Lancet Oncol. 2009;10(1):25–34. 21. Llovet JM, Ricci S, Mazzaferro V, Hilgard P, Gane E, Blanc JF, de Oliveira AC, Santoro A, Raoul JL, Forner A ir kt. Sorafenibas sergant pažengusia kepenų ląstelių karcinoma. N Engl J Med. 2008;359(4):378–90.

22. Daina MJ. Kepenų arterijų infuzinė chemoterapija pažengusiai kepenų ląstelių karcinomai. Pasaulis J Gastroenterolis. 2015;21(13):3843–9.

23. Liao YF, Rao YK, Tzeng YM. Vandeninis Anisomeles India ekstraktas ir jo išgrynintas junginys turi antimetastazinį aktyvumą, nes slopina NF kappaB/AP-1-priklausomą MMP-9 aktyvavimą žmogaus krūties vėžio MCF-7 ląstelėse. Food Chem Toxicol. 2012;50(8):2930–6.

24. Zhang Y, Yuan Y, Wu H, Xie Z, Wu Y, Song X, Wang J, Shu W, Xu J, Liu B ir kt. Verbaskozido poveikis žmogaus burnos plokščiųjų ląstelių karcinomos apoptozei ir metastazėms. Int J Vėžys. 2018;143(4):980–91.

25. Hwang TW, Kim DH, Kim DB, Jang TW, Kim GH, Moon M, Yoon KA, Choi DE, Park JH, Kim JJ. Akteozido ir temozolomido pagrindu pagamintos glioblastomos chemoterapijos sinergetinis priešvėžinis poveikis. Int J Mol Med. 2019 m.; 43(3):1478–86.

26. Peerzada KJ, Faridi AH, Sharma L, Bhardwaj SC, Satti NK, Shashi B, Tasduq SA. Akteozidas tarpininkauja eksperimentinės kepenų kancerogenezės chemoprevencijai per STAT-3 reguliuojamą oksidacinį stresą ir apoptozę. Aplinkos toksikolis. 2016;31(7):782–98.

27. Cui Q, Pan Y, Zhang W, Zhang Y, Ren S, Wang D, Wang Z, Liu X, Xiao W. Dietinio akteozido metabolitai: profiliai, izoliacija, identifikavimas ir hepatoprotekcinės galimybės. J Agric Food Chem. 2018;66(11):2660–8.

28. Xiong Q, Hase K, Tezuka Y, Namba T, Kadota S. Akteozidas slopina apoptozę D-galaktozamino ir lipopolisacharido sukelto kepenų pažeidimo atveju. Life Sci. 1999;65(4):421–30.

29. Zhao J, Liu T, Ma L, Yan M, Zhao Y, Gu Z, Huang Y. Apsauginis akteozido poveikis imunologiniam kepenų pažeidimui, kurį sukėlė Bacillus Calmette Guerin ir lipopolisacharidas. Planta Med. 2009;75(14):1463–9.

30. Lu B, Li M, Zhou F, Huang W, Jiang Y, Mao S, Zhao Y, Lou T. Osmanthus kvapiųjų gėlių feniletanoido glikozidų turtingas ekstraktas: ūmaus ir subchroninio toksiškumo tyrimai. J Etnopharmacol. 2016;187:205–12.

31. Diamandis EP, Yousef GM. Žmogaus audinių kallikreinai: naujų vėžio biomarkerių šeima. Clin Chem. 2002;48(8):1198–205.

32. Sawant S, Snyman C, Bhoola K. Audinių kallikreino ir kinino receptorių ekspresijos palyginimas esant skrandžio opoms ir neoplazmoms. Int Immunopharmacol. 2001;1(12):2063–80.

33. Lu L, Yang Z, Zhu B, Fang S, Yang X, Cai W, Li C, Ma JX, Gao G. Kallikreinbinding protein slopina hepatocelulinės karcinomos augimą antiangiogeniniu aktyvumu. Vėžys Lett. 2007;257(1):97–106.

34. Guntur VP, Waldrep JC, Guo JJ, Selting K, Dhand R. Didėjant p53 baltymui, nesmulkialąstelinis plaučių vėžys jautrinamas paklitakseliui ir cisplatinai in vitro. Anticancer Res. 2010;30(9):3557–64.

35. Zhou L, Feng Y, Jin Y, Liu X, Sui H, Chai N, Chen X, Liu N, Ji Q, Wang Y, Li Q. Verbascoside skatina apoptozę reguliuodamas HIPK2-p53 signalus žmonėms gaubtinės ir tiesiosios žarnos vėžys. BMC vėžys. 2014;14:747.

36. Liu L, Cao Y, Chen C, Zhang X, McNabola A, Wilkie D, Wilhelm S, Lynch M, Carter C. Sorafenibas blokuoja RAF/MEK/ERK kelią, slopina naviko angiogenezę ir sukelia naviko ląstelių apoptozę kepenų ląstelėse karcinomos modelis PLC/PRF/5. Cancer Res. 2006;66:11851–8.