Akteozidas Kinijos natūraliame augale-Cistanche, skirtas inkstų ligai gydyti--I dalis

Susisiekite: emily.li@wecistanche.com

Natūralus akteozido produktas pagerina inkstų pažeidimą diabeto db/db pelėms ir HK-2 ląstelėms, reguliuodamas NADPH/oksidazės-TGF-/Smad signalizacijos kelią.

Qinwen Wang|Xinxin Dai ir kt

Šis tyrimas buvo skirtas ištirti apsauginį poveikį ir mechanizmusakteozidoDKD diabetu sergančių db/db pelių patinams ir didelio gliukozės kiekio sukeltoms HK-2 ląstelėms. Diabeto db/db pelės buvo atsitiktinai suskirstytos į pavyzdinę grupę, metformino grupę, irbesartano grupę irakteozidogrupė. Stebėjome natūralų produktąakteozidoturintis reikšmingą poveikįinkstų apsaugaatliekant biocheminių rodiklių ir endogeninių metabolitų analizę, histopatologinius stebėjimus ir Western blot metodą. In vitro eksperimentuose buvo naudojamos HK-2 ląstelės, paveiktos daug gliukozės. Molekuliniai mechanizmai buvo ištirti RT-PGR ir Western blot metodu.Akteozidasapsaugo nuo didelio gliukozės kiekio sukeltų HK-2 ląstelių ir diabeto db/db pelių, slopindamas NADPH/oksidazės-TGF-/Smad signalizacijos kelią.Akteozidasreguliavo sutrikusį lipidų metabolizmo, glioksilato ir dikarboksilato metabolizmo bei arachidono rūgšties metabolizmo kelią. Mes atradome natūralų produktąakteozidodaro didelį poveikįinkstų apsauga.Šis tyrimas atvėrė kelią tolesniam patogenezės tyrimui, ankstyvai diagnostikai ir naujo DKD terapinio agento kūrimui.

RAKTINIAI ŽODŽIAI akteozido, diabetikamsinkstų liga, metabolinis profiliavimas, NADPH/oksidazės-TGF-/Smad signalizacijos kelias, ROS

I dalis

Akteozidas gydo inkstų ligas

1|ĮVADAS

Akteozidasyra tipiškas feniletanoidinių glikozidų komponentas, plačiai paplitęs 79 augalų gentyse, tokiose kaip Rehmannia glutinosa,Cistanche deserticola, ir kiti vaistiniai augalai.Akteozidasyra būdinga tai, kad kavos rūgštis ir hidroksitirozolis yra atitinkamai sujungti su gliukozės dalimi per esterius ir glikozidinius ryšius, o ramnozės vienetas yra prijungtas prie gliukozės molekulės (Zhao ir kt., 2015). Pranešama, kadakteozidoturi plačią farmakologinę veiklą, pvzinkstasapsauga (Gan ir kt., 2018), antioksidacija (He ir kt., 2011), neuroprotekcija (Li, Zhou, Xu, Song ir Lu, 2018), kepenų apsauga (Lee ir kt., 2004), priešvėžinė (Ohno) , Inoue, Ogihara ir Saracoglu, 2002) ir pan. Tačiau apsauginis poveikisakteozidosergant diabetuinkstų pažeidimasyra neaiškūs.

Cukrinis diabetas yra viena iš sparčiausiai augančių XXI amžiaus pasaulinių sveikatos problemų. Apskaičiuota, kad 2019 m. cukriniu diabetu serga 463 milijonai žmonių ir prognozuojama, kad iki 2030 m. šis skaičius pasieks 578 milijonus, o iki 2045 m. – 700 milijonų. Pasaulinis diabeto paplitimas sparčiai auga, ypač besivystančiose šalyse, ir diabeto paplitimas.inkstų liga(DKD) ir galutinė stadijainkstų liga(ESRD) ir toliau auga (Hu, 2011). DKD yra viena iš labiausiai baimingų diabetinių lėtinių mikrovaskulinių komplikacijų ir pagrindinė ESRD priežastis. Asmenų, sergančių DKD, mirtingumas dėl visų priežasčių yra maždaug 30 kartų didesnis nei diabetu sergančių pacientų, kuriems nėra nefropatijos. Naujausi tyrimai rodo, kadinkstųkanalėlių epitelio-mezenchiminio perėjimo (EMT) ir ekstracitoplazminės matricos (ECM) kaupimasisinkstųinterstitium vaidina pagrindinius DKD patogenezės veiksnius (He ir kt., 2015; Yao ir kt., 2014). Vis daugiau tyrimų parodė, kad progresavimasinkstųdiabetinės nefropatijos fibrozė buvo tarpininkaujama daugeliu signalizacijos būdų. TGF- buvo susijęs su pagrindiniu patogeniniu veiksniu daugeliui CKD tipų, susijusių su fibroze, įskaitant DKD (Lv ir Zhang, 2019). Heteromerinis signalizacijos kompleksas, atsirandantis dėl TGF- 1 prisijungimo prie II tipo receptorių ir savo ruožtu I tipo receptorių, perduoda signalus per receptorių reguliuojamus Smad (Smad2/3) ir bendrą partnerį Smad (Smad4), todėl tikslinių genų transkripcijos reguliavimas (Sierra ir kt., 2015). ROS kaupimasis gali sukelti oksidacinį stresą ląstelėje, dėl kurio gali būti pažeisti ląstelių komponentai, įskaitant baltymus ir DNR. Galiausiai oksidacinis stresas sukeliainkstųfibrozė ir jos sumažėjimasinkstų funkcija. NADPH oksidazės (NOX) yra laikomos pagrindiniais ROS susidarymo šaltiniais sergant diabetine nefropatija ir lėtinėmis ligomis.inkstų liga. NOX reguliavimas ir hiperaktyvacija taip pat gali prisidėti prie oksidacinio streso patofiziologiniuose etapuose. Pakilimas išinkstųROS lygis dėl hiperglikemijos sukeltos NOX aktyvacijos sukelia oksidacinį stresą, kuris sukelia žaląinkstų audiniai, sukeliantis DKD (Lee, An, Kim ir Bae, 2020).

Metabolomika yra nauja ir svarbi omikos technologija, skirta kokybinei ir kiekybinei visų mažų molekulinių metabolitų gyvose ląstelėse, audiniuose ir kūno skysčiuose analizei. Kaip nauja disciplina, skirta nustatyti bendrus gyvų organizmų metabolinius pokyčius, metabolomika suteikia naujų įžvalgų apie diabeto ir diabeto komplikacijų tyrimą (Lu, Xie, Jia ir Jia, 2013).

Šio tyrimo tikslas buvo ištirti natūralaus produkto apsauginį poveikįakteozidodiabetu sergančių db/db pelių patinų DKD ir HK-2 ląstelių, sukeltų didelio gliukozės kiekio in vitro, ir jo mechanizmo. Taigi šiame tyrime db/db pelės buvo priimtos įvertintiinkstųapsauginis poveikisakteozido, ir buvo išanalizuotas skirtingų metabolitų reguliavimas serume, siekiant išsiaiškinti mechanizmusakteozido. Be to, didelio gliukozės kiekio sukeltas HK-2 modelis in vitro įvertinaakteozidodb/db pelėms, nustatant NADPH/oksidazės-TGF-/Smad signalizacijos kelio ekspresijos lygius.

2|MEDŽIAGOS IR METODAI

2.1|Chemikalai ir instrumentai

UPLC klasės acetonitrilas buvo pirktas iš Merck (Darmštatas, Vokietija); skruzdžių rūgštis pirkta iš Sigma-Aldrich (Sigma, St. Louis, Misūris).Akteozidas(Grynumas didesnis nei arba lygus 98 proc.) buvo įsigytas iš Nacionalinių maisto ir vaistų kontrolės institutų (Pekinas, Kinija). Struktūraakteozidoparodyta 1A paveiksle. Serumo karbamido azoto (BUN) reagentų rinkinys, aspartato aminotransferazės (GOT) reagentų rinkinys, alanino aminotransferazės (GPT) reagentų rinkinys, bendrojo cholesterolio (TCHO) reagentų rinkinys, trigliceridų (TG) reagentų rinkinys, serumo kreatinino (Scr) reagentų rinkinys, šlapimo mikroalbuminas (mALB) reagentų rinkinys ir insulino (INS) reagentų rinkinys buvo nupirkti iš Nanjing Jiancheng Bioinžinerijos instituto (Nandzingas, Kinija). Metformino hidrochlorido tabletės buvo įsigytos iš Sino American Shanghai Squib Pharmaceutical Ltd; Irbesartanas buvo nupirktas iš Shenzhen Haibin Pharmaceutical Co., Ltd. DMEM ir F12 buvo įsigyti iš GIBCO, Amerika; NOX1 (katalogo numeris: ab121009), NOX2 (katalogo numeris: ab129068), NOX4 (katalogo numeris: ab154244) ir Smad7 (katalogo numeris: ab216428) pirmasis antikūnas buvo nupirktas iš Abcam (Kembridžas, Jungtinė Karalystė). -SMA (katalogo numeris: 19245), E-kadherinas (katalogo numeris: 3195), NF-κB p65 (katalogo numeris: 8242), TGF- 1 (katalogo numeris: 3711), Smad2 (katalogo numeris: 5339) , Smad3 (katalogo numeris: 9523), Smad4 (katalogo numeris: 46535) ir PSmad2/3 (katalogo numeris: 8828) pirmasis antikūnas buvo nupirktas iš CST. Visos kitos šiame tyrime naudotos cheminės medžiagos ir reagentai buvo analitinės kokybės ir pagaminti Kinijoje.

Waters Acquity™ Ultra Performance LC sistema (Waters) su Quattro Micro MS spektrometru ir Waters Xevo TM G2 QTof MS (Waters MS Technologies, Mančesteris, Naujasis Hampšyras). Dejonizuotas vanduo buvo išgrynintas Milli-Q sistemoje (Millipore, Bedford, Masačusetsas). Duomenims analizuoti buvo pritaikyta Mass Lynx v4.1 darbo stotis, naudota itin didelės spartos centrifuga žemoje temperatūroje (Thermo Scientific, Jungtinė Karalystė) ir DMI3000M mikroskopas (Leica, Vokietija).

2.2|Eksperimento su gyvūnais sąlygos

Visas šiame tyrime naudotas eksperimentines procedūras ir protokolus peržiūrėjo ir patvirtino Nankino kinų medicinos universiteto (Nandzingas, Kinija) institucinis gyvūnų etikos komitetas. Šiame tyrime aprašyti protokolai atitiko institucines laboratorinių gyvūnų priežiūros ir naudojimo gaires. Pelės buvo įsigytos iš Nankino universiteto gyvūnų modelių tyrimų centro (sertifikato Nr. Su 2015–0001). Visi eksperimentai buvo atlikti su 8-savaičių senumo db/db pelių patinėliais ir pagal amžių atitinkančiomis laukinio tipo db/m vados pelėmis, kurių pradinis kūno svoris buvo 30 40 g. Db/db diabetinės pelės modelis yra tarptautiniu mastu pripažintas diabeto gyvūnų modelis. Tyrimai parodė, kad db/db pelių DKD mechanizmas yra panašus į žmonių. Gyvūnai buvo laikomi narveliuose su pastovia drėgme (apie 60 proc. ± 2 proc.) ir temperatūra (apie 23 ± 2 laipsniais), o šviesos/tamsos ciklas buvo 12 valandų. Gyvūnams buvo taikomas 3 savaičių adaptacijos laikotarpis, kurio metu jiems buvo leista neribotai gauti maistą ir vandens iš čiaupo. Po aklimatizacijos laikotarpio db/db pelės buvo atsitiktinai suskirstytos į keturias grupes po šešias kiekvienoje grupėje: modelio grupė (normalus fiziologinis tirpalas, M), metformino grupė (250 mg kg.^-1 d^-1, EJSG), irbesartano grupė (50 mg kg^-1 d^-1, EBST),akteozidogrupė (70 mg kg^-1 d^-1, MRHTG), kartą per dieną (Gao, Peng, Huo, Liu ir Yan, 2015). Be to, šiame tyrime metforminas ir irbesartanas buvo pasirinkti kaip teigiami kontroliniai vaistai. Buvo pranešta, kad irbesartanas gali sumažinti kraujospūdį, kraujo lipidų kiekį irinkstų lipidas.Jis neturi įtakos gliukozės kiekiui kraujyje ir kepenų lipidams. Tai gali pagerinti funkciją ir patologinius pokyčiusinkstaidb/db pelių. Apsauginis metformino poveikisinkstasTai atsispindi diabetu sergančių žiurkių ir pacientų, sergančių 2 tipo cukriniu diabetu, proteinurijos sumažėjimu. Metformino ir irbesartano dozė gyvūnams buvo ekstrapoliuota iš žmogaus paros dozės, taikant kūno paviršiaus ploto normalizavimo metodą. Tada pelėms buvo duodama atitinkamo vaisto kartą per dieną, plaunant skrandį 6 savaites, o db/m pelės buvo naudojamos kaip kontrolinė grupė, kurioms tuo pačiu metu buvo duodamas toks pat kiekis fiziologinio tirpalo.

2.3|Mėginių rinkimas

Eksperimentiniu laikotarpiu kūno svoris ir gliukozės kiekis kraujyje nevalgius buvo registruojami kas savaitę, GKS lygiai buvo matuojami One Touch Ultra II gliukozės kiekio kraujyje stebėjimo sistema (Life Scan, Milpitas, Kalifornija) kiekvieną pirmadienį (8 val.) iš uodegos venų. ). Po 6 savaičių vartojimo pelės buvo nevalgiusios metaboliniuose narvuose su laisva prieiga prie vandens, kad būtų galima surinkti 24 valandų šlapimą. Visi šlapimo mėginiai buvo nedelsiant centrifuguojami 3000 aps./min. greičiu 10 minučių po surinkimo, o supernatantai buvo atskirti ir iki analizės laikomi -80 laipsnių temperatūroje. Tyrimo pabaigoje pelės buvo numarintos anestezijos būdu su 10 procentų chloro hidratu (3 mg/kg), paimtas kraujas biocheminių parametrų koncentracijai ir metabolomikos tyrimui. Tada kraujo mėginiai buvo centrifuguojami 3000 aps./min. greičiu 10 min., o serumo mėginiai atskirti ir iki analizės laikomi -80 laipsnių temperatūroje. Dešinysis inkstas buvo pašalintas vienu gabalu, pritvirtintu 10 procentų neutraliu buferiniu formalinu histologiniam tyrimui. Theinkstųžievė buvo išskirta iš kito gabalo ir užšaldyta skystame azote, kad būtų atliktas Western blotavimas.

Cistanche inkstų nepakankamumui gydyti

2.4|Ląstelių kultūra ir gydymas

Žmogaus RTEC linija HK{{0}} buvo gauta iš Nanjing Keygen Biotechnology Development Co., Ltd. Visa terpė buvo mažos gliukozės DMEM su 10 % FBS ir 1 % penicilino-streptomicino tirpalu. HK-2 ląstelės buvo kultivuojamos 37 laipsnių temperatūroje, 5 proc. CO2 ir prisotintoje drėgmėje. Ląstelės buvo subkultūros 80 procentų santakoje, kuri buvo pašalinta iš inkubatoriaus, o pradinė terpė lėkštelėje buvo išmesta. Ląstelės buvo nuplaunamos naudojant 0, 5 ml fosfato buferinio fiziologinio tirpalo (PBS) ir virškinamos apdorojant 0, 5 ml tripsino 1–2 minutes 37 laipsnių temperatūroje. Virškinimas buvo nutrauktas naudojant 2 ml DMEM terpę, o vėliau ląstelių suspensija centrifuguojama 450 g 5 minutes 4 ° C temperatūroje. Supernatantas buvo išmestas, o ląstelės pakartotinai suspenduotos 2 ml atitinkamoje DMEM terpėje, kad būtų gauta vienos ląstelės suspensija. Ląstelės buvo pasėtos į skirtingus lėkštes / mikroplokštes skirtingu tankiu tolesniam eksperimentui, kaip aprašyta toliau. HK-2 ląstelės buvo dedamos ant 96-šulinėlių lėkštelių ir lėkštelių, iš anksto apdorotos DMEM mažos gliukozės koncentracijos (5 mmol/L), inkubuojamos 37 °C temperatūroje ir 5 proc. CO.₂6 valandas, o tada buvo sinchronizuojami. Eksperimentinės grupės buvo suskirstytos taip: kontrolinė grupė (C), be intervencijos faktoriaus; modelio grupė (M), kurioje ląstelės buvo kultivuojamos didelės gliukozės (30 mmol/L) DMEM tirpale; osmosinio slėgio kontrolinė grupė (DMEM plius 24,5 mmol/L manitolis, GLC); irbesartano grupė (25 mmol/L) irakteozido(MRHTG) grupėje atitinkamai penkiomis dozėmis (5, 10, 25, 50 ir 100 μmol/L).

2,5|Ląstelių morfologija

HK-2 ląstelės du kartus plaunamos PBS ir apžiūrimos apverstu mikroskopu (OLYMPUS IX51). Ląstelių morfologija buvo stebima 100 padidinimų.

2.6|Biocheminių rodiklių matavimai

Terapinis veiksmingumasakteozidodb/db pelėse buvo įvertintas mALB kiekis šlapime ir FBG, INS, T-CHO, TG, Scr, GOT, GPT ir BUN kiekis serume, kurie buvo aptikti, o po to buvo pateiktas rinkinio gamintojo aprašymas.

2.7|Patologinė analizė

Dalisinkstųžievė buvo atlikta hematoksilino-eozino (HE) ir periodinės rūgšties-Schiff (PAS) dažymui, siekiant stebėti patologinius pokyčiusinkstų audinys, fibrozės audinių hiperplazijos laipsniai, glomerulų ir kanalėlių struktūros per elektroninį mikroskopą (400). Fotografuodami stenkitės užpildyti visą regėjimo laukąinkstų audinyskad kiekvienos nuotraukos foninis apšvietimas būtų vienodas. „Image-Pro Plus 6.{2}}“ programinė įranga buvo naudojama ta pačiai raudonai violetinei spalvai pasirinkti kaip vieningą kriterijų vertinant visų nuotraukų teigiamas savybes. Išanalizavus kiekvieną nuotrauką buvo gautas bazinės membranos teigiamos ekspresijos sukauptas optinis tankis (IOD) ir glomerulų kraujagyslių rezginio pikselių plotas (AREA) ir apskaičiuotas vidutinis optinis tankis (IOD/AREA).

2,8|Western blotingas

Inkstų audinysir ląstelės buvo ekstrahuotos lizės buferiu; lizatai buvo centrifuguojami. Po pilnos pirolizės centrifuguokite 5 minutes 12000 aps./min., Paimkite supernatantą, o supernatantai buvo surinkti. Baltymų koncentracijai nustatyti buvo naudojamas bicinchonino rūgšties (BCA) baltymų koncentracijos rinkinys. Po kiekybinio įvertinimo baltymas buvo atskirtas 10 procentų SDS-PAGE, perkeltas ant PVDF membranų, po to blokuojamas 5 procentų BSA TBST ir inkubuojamas su pirminiais antikūnais, o po to atitinkamais antriniais antikūnais. Tada antikūnų reaktyvumas buvo aptiktas ECL ir kiekybiškai įvertintas naudojant „ImageJ“ programinę įrangą.Inkstų audiniaimėginiai buvo analizuojami Western blot metodu, siekiant nustatyti -SMA, TGF- 1 (1:1300), Smad2 (1:3000), Smad3 (1:1000), P-Smad2/3 (1:500) ekspresijos lygius. ), Smad4 (1:1000) ir Smad7 (1:1000) baltymus.

2,9|ELISA analizė

Monocitų chemoattraktanto baltymo -1 (MCP-1), interleukino-1 (IL-1), naviko nekrozės faktoriaus (TNF-) ir interleukino-6 (IL) sekrecija -6) kiekvienos ląstelės supernatante buvo išmatuoti ELISA rinkiniu.

2.10|Realaus laiko PGR

Be to, šios ląstelės buvo paruoštos realaus laiko PGR, siekiant ištirti NOX1, NOX2, NOX4, -SMA, E-kadherino, NF-κB p65, TGF- 1, Smad2, Smad3, Smad4 ir Smad7 mRNR. Buvo surinktos kiekvienos grupės ląstelės (apie 1 107 ląstelių). Bendra RNR buvo ekstrahuota Trizol vieno žingsnio metodu, nustatytas jos grynumas ir koncentracija. Kai vidinė nuoroda yra GAPDH, pradmenų seka buvo tokia. TGF- 1, jutimo pradmenys: 5-ACACATCAGAGCTCCGAGAA-3, antisensinis pradmuo: 5-GAGGTATC GCCAGGAATTGT-3;E-kadherinas, jutimo pradmenys: 5- ACGCATTGCCA CATACACTC-3, antisensinis pradmuo: 5-GGTGAATTCGGGCTTGTTGT-3; NF-κB p65, sensorinis pradmuo: 5-CTTCCTGCCCTACAGAGGTC-3, antisensinis pradmuo: 5-AGAGCAAGGAAGTCCCAGAC-3;NOX1, sensorinis pradmuo: 5-CCTAGAAGGGCTCCAAACCA{{33} }, antisensinis pradmuo: 5-GGAAGGCATCCACAAACAGG-3; NOX2, sensorinis pradmuo: 5-ACCCTTCGCATCCATTCTCA-3, antisensinis pradmuo: 5-TCTGCAAACCACTCAAAGGC-3; NOX4, jutimo pradmenys: 5-CAAGCAGGAGAACCAGGAGA-3, antisensinis pradmenys: 5-AGTTGAGGGCATTCACCAGA-3; Smad2, jutimo pradmenys: 5-TGAGCACGTGAGGTGAGATT-3, antisensinis pradmuo: 5-CTCCATCACAGTGCACCAAG-3; Smad3, sensorinis pradmuo: 5-CAGCCGGTTTGGATTACAGG-3, antisensinis pradmuo: 5-GAGTCAAAGTCCCTGCTCCT-3; Smad4, jutimo pradmenys: 5-CACTGCCAACTTTCCCAACA-3, antisensinis pradmuo: 5-ATCCATTCTGCTGCTGTCCT-3; Smad7, sensorinis pradmuo: 5-AAGAGTCAGCTGGTGCAGAA-3, priešprasminis pradmuo: 5-GCGGACTTGATGAAGATGGG-3; -SMA, sensorinis pradmuo: 5-GGTGCTGTCTCTCTATGCCT-3, antisensinis pradmuo: 5-CAGATCCAGACGCATGATGG-3; GAPDH, sensorinis pradmuo: 5-TGGTATCGTGGAAGGACTCA-3, antisensinis pradmuo: 5-CCAGTAGAGGCAGGGATGAT-3.

2.11|Statistinė analizė

Duomenys ir statistinė analizė atitinka rekomendacijas dėl eksperimentinio planavimo ir analizės farmakologijoje. Visi eksperimentai buvo atsitiktinių imčių ir akli. Rezultatai išreiškiami kaip nurodyto nepriklausomų eksperimentų skaičiaus (n) M ± SD/SEM. Dabartinio tyrimo duomenys pateikiami kaip M ± SD / SEM iš mažiausiai trijų nepriklausomų eksperimentų. Skirtumų reikšmingumas buvo analizuojamas taikant vienpusę ANOVA, po kurios buvo atliktas Tukey testas (daugiau nei dvi grupės) arba Stjudento t-testas (dvi grupės). Post hoc testai atliekami tik tada, kai F pasiekia p < .05="" ir="" nebuvo="" reikšmingo="" dispersijos="" nehomogeniškumo.="" visi="" testai="" buvo="" dvipusiai,="" o="" p="">< 0,05="" buvo="" laikomas="" statistiškai="" reikšmingu.="" statistinė="" analizė="" atlikta="" naudojant="" graphpad="" prism="" 7.0="" programinę="">

Cistanche akteozidas, skirtas pagerinti inkstų veiklą

2.12|UPLC-QTOF/MS sąlygos ir duomenų analizė

Visi serumo mėginiai prieš paruošimą buvo atšildyti kambario temperatūroje. 300 ul acetonitrilo buvo pridėta prie 100 ul serumo mėginių į nusodintą baltymą ir energingai maišoma 60 s. Visi mėginiai buvo centrifuguojami 13 000 aps./min 10 min 4 laipsnių temperatūroje. Galiausiai supernatantas buvo švirkščiamas į UPLC-QTOF / MS analizę. Metabolitų atskyrimas buvo atliktas naudojant Waters Acquity™ Ultra Performance LC sistemą (Waters), aprūpintą Waters Xevo™ G2 Q/TOF-MS (Waters MS Technologies). 2 ul mėginio tirpalo alikvotinė dalis buvo įšvirkščiama į Acquity UPLC BEH C18 (100 mm 2,1 mm, 1,7 μm, Waters Corporation, Milford, Konektikutas) 35 laipsnių temperatūroje, o srautas buvo 0,4 ml/min. Optimalią mobiliąją fazę sudarė vanduo (A) (su 0,1 proc. skruzdžių rūgšties) ir acetonitrilas (B). Optimizuotos UPLC eliuavimo sąlygos serumo analizei buvo 0 3 min., 95 procentai 55 procentai A; 4 13 min., 55 procentai 5 procentai A; 13 14 min., 5 proc. A. Automatinis mėginių ėmiklis buvo palaikomas 4 laipsnių temperatūroje.

Masių spektrometrija buvo atlikta naudojant Xevo™ G2 QTof (Waters MS Technologies), kvadrupolį ir ortogoninio pagreičio skrydžio laiko tandeminį masės trometrą. Leucinas-enkefalinas buvo naudojamas kaip užrakto masė, sukurianti [M plius H]^pliusasjonų (m/z 556,2771) ir [MH]^-jonų (m/z 554,2615) atitinkamai teigiamu ir neigiamu režimu. Leucino-enkefalino koncentracija buvo 200 pg/ml, o infuzijos srauto greitis – 100 ul/min., kad būtų užtikrintas tikslumas atliekant MS analizę naudojant švirkšto pompą. Duomenys buvo renkami centroido režimu nuo 100 iki 1,000 m/z. Tiek teigiamam, tiek neigiamam elektropurškimo režimui kapiliarinė ir kūgio įtampa buvo nustatyta atitinkamai 3, 0 kV ir 30 V. Desolvatavimo dujos buvo nustatytos 600 l/val., kai temperatūra 350 laipsnių, kūgio dujos – 50 l/val., o šaltinio temperatūra – 120 laipsnių. Duomenų gavimo sparta buvo nustatyta 30 ms su 0,02 s tarpinio nuskaitymo delsa.

Be to, iš kiekvienos grupės atsitiktinai buvo atrinkta 10 serumo mėginių ir atitinkamai sumaišyti kaip kokybės kontrolės (QC) mėginiai. QC pavyzdys buvo naudojamas optimizuoti UPLCQTOF / MS būklę, nes jame buvo daugiausia informacijos apie visą mėginį. QC mėginiai buvo švirkščiami šešis kartus bandymo pradžioje, kad būtų galima kondicionuoti arba subalansuoti sistemą, o vėliau kas 10 mėginių, kad būtų toliau stebimas analizės stabilumas. Kiekvieną dieną, kai prietaisas buvo sukalibruotas, QC mėginys pirmiausia buvo analizuojamas, siekiant patikrinti prietaiso stabilumą, kad būtų užtikrintas nuoseklus sistemos veikimas.

Visi duomenų rinkimai ir duomenų analizės buvo kontroliuojami Waters MassLynx v4.1 programine įranga. Daugiamatė duomenų matrica buvo analizuojama EZinfo programine įranga 2.0 (Waters Corp.). Pagrindiniai parametrai apima saugojimo laiko intervalą 0 14 min; masės santykis m/z 100 1,000, masės tolerancijos diapazonas 0.{{10}}1 Da, didžiausio intensyvumo slenkstis 50, kokybės langas 0,05 Da, sulaikymas laiko langai 0,20 min, ir automatinis 5 procentų piko aukščio ir triukšmo aptikimas. Kiekvieno jono intensyvumas buvo normalizuotas atsižvelgiant į bendrą jonų skaičių, kad būtų sukurta duomenų matrica, kurią sudarė sulaikymo laikas, m/z vertė ir normalizuotas smailės plotas.

Gautos duomenų matricos buvo įtrauktos į EZinfo 2.{1}} programinę įrangą, skirtą pagrindinių komponentų analizei, dalinei mažiausiųjų kvadratų diskriminacinės analizės (PLS-DA) ir ortogonaliosios projekcijos į latentines struktūras (OPLS-DA) analizei. Remiantis OPLS-DA, galima nustatyti, kad įvairūs metabolitai yra atsakingi už kontrolinės grupės ir modelio grupės atskyrimą, todėl buvo laikomi potencialiais žymenimis. Potencialūs dominantys žymenys buvo išgauti iš S-plotų, sukonstruotų atlikus analizę su OPLS-DA, o kintamieji, kurie reikšmingai prisidėjo prie grupių diskriminacijos, buvo toliau identifikuoti molekulinė formulė.

Kintamojo svarba (VIP) projekcijos vertėje yra svertinė PLS svorių kvadratų suma, o kintamieji, kurių VIP > 1, turėjo įtakos mėginių atskyrimui balų diagramose, sukurtose iš OPLS-DA analizės. Visuose eksperimentuose buvo nustatytas 95 procentų patikimumo lygis, siekiant nustatyti skirtumo reikšmingumą (p < .{10}}5).="" tie="" kintamieji="" galiausiai="" buvo="" pasirinkti="" kaip="" galimi="" biomarkeriai.="" pls-da="" balų="" diagramos="" buvo="" aprašytos="" kryžminio="" patvirtinimo="" parametrais="" r2y="" ir="" q2,="" kurie="" atitinkamai="" parodo="" bendrą="" paaiškintą="" x="" matricos="" pokytį="" ir="" modelio="" nuspėjamumą.="" puikūs="" modeliai="" gaunami,="" kai="" suminės="" r2y="" ir="" q2="" reikšmės="" yra="" didesnės="" nei="" 0,8.="" santykiniai="" atstumai="" tarp="" administravimo="" grupių="" ir="" kontrolinės="" grupės="" pagal="" pls-da="" balų="" diagramą="" buvo="" apskaičiuoti="" naudojant="" kontrolinės="" grupės="" mėginių="" vidutinę="" vertę="" (x="" ašis="" ir="" y="" ašis)="" kaip="" atskaitos="">

Galimi atrinkti metabolitai buvo identifikuoti pagal tikslią m/z, sulaikymo trukmę ir tipinį MS/MS fragmentą bei aukščiau pateiktų potencialių biomarkerių modelį, kurie buvo gauti teigiamų ir neigiamų jonų režimais. Metabolizmo kelias buvo sukurtas naudojant „Metabo Analyst“, kuris yra internetinis metabolomikos vizualizavimo įrankis (https://www.metaboanalyst.ca/), pagrįstas duomenų bazės šaltiniais, įskaitant KEGG (HTTP://www.genome). .jp/kegg/) ir HMDB (http://www.hmdb. ca/) duomenų bazėse paieškai. Sulaikymo laikas ir tipiškas MS / MS fragmentas ir modelis labai padėjo susiaurinti galimų molekulių diapazoną.

Cistanche esantis akteozidas gali pagerinti inkstų funkciją

3|REZULTATAI

Spustelėkite čia, jei norite gauti informacijos apie šio straipsnio II dalį (rezultatus).

Ištrauka iš: „Natūralus produktas išakteozidopagerintiinkstų pažeidimasdiabeto db/db pelėms ir HK-2 ląstelėms, reguliuojant NADPH/oksidazės-TGF-/Smad signalizacijos kelią' -----, Qinwen Wang|Xinxin Dai ir kt

----Fitoterapijos tyrimai. 2021;35:5227–5240. wileyonlinelibrary.com/journal/ptr © 2021 John Wiley & Sons Ltd. DOI: 10.1002/ptr.7196