1 dalis Akteozidas slopina RANKL sukeltą osteoklastogenezę, slopindamas C-Fos indukciją ir NF-kB kelią bei susilpnindamas ROS gamybą

1 dalis Kaip akteozidai skatina kaulų augimą?

Daugiau informacijos:ali.ma@wecistanche.com

Seung-Youp Lee1,2., Keun-Soo Lee3.¤, Sea Hyun Yi2., Sung-Ho Kook2, Jeong-Chae Lee2,3* 1 Čonbuko nacionalinio universiteto Klinikinės medicinos tyrimų institutas, Chonbuko nacionalinio universiteto Biomedicininių tyrimų institutas Ligoninė, Jeonju, Chonbuk, Pietų Korėja, 2 Ortodontijos skyrius, Burnos biomokslų institutas ir Odontologijos mokykla, Chonbuk nacionalinis universitetas, Jeonju, Chonbuk, Pietų Korėja, 3 Bioaktyviųjų medžiagų mokslų skyrius, Bioaktyvių medžiagų tyrimų centras, Chonbuk nacionalinis universitetas, Jeonju, Chonbuk, Pietų Korėja

Abstraktus

Daugybė tyrimų parodė, kad uždegiminiai citokinai yra svarbūs osteoklastogenezės tarpininkai, todėl sukelia pernelyg didelę kaulų rezorbciją ir osteoporozę.Akteozidas, pagrindinis aktyvus Rehmannia glutinosa junginys, plačiai naudojamas tradicinėje Rytų medicinoje, turi priešuždegiminių ir antioksidacinių savybių. Šiame tyrime mes nustatėme, kad CTE pusė žymiai slopino osteoklastų diferenciaciją ir susidarymą iš kaulų čiulpų makrofagų (BMM) ir RAW264.7 makrofagų, stimuliuojamų branduolinio faktoriaus-kappaB (NF-kB) ligando (RANKL) receptorių aktyvatoriaus. Išankstinis gydymas akteozidu taip pat užkirto kelią kaulų rezorbcijai subrendusiems osteoklastams, priklausomai nuo dozės. Akteozidas (10 mM) susilpnino RANKL stimuliuojamą p38 kinazės, ekstraląstelinio signalo reguliuojamų kinazių ir c-Jun N-galinės kinazės aktyvavimą, taip pat slopino NF-kB aktyvaciją, slopindamas p65 subvieneto ir inhibitoriaus kBa fosforilinimą. Be to, dėl RANKL padidėja c-Fos ekspresija ir aktyvuotų T ląstelių branduolinis faktorius, citoplazminis 1 (NFATc1) ir auglio nekrozės faktoriaus-a, interleukino (IL)-1b gamyba. , ir IL-6 buvo akivaizdžiai slopinami dėl išankstinio apdorojimo akteozidu. Be to, geriamasis akteozidas sumažino kiaušidžių pašalinimo sukeltą kaulų retėjimą ir uždegiminių citokinų gamybą iki kontrolinio lygio. Mūsų duomenys rodo, kadakteozidoslopina osteoklastų diferenciaciją ir brendimą nuo osteoklastų pirmtakų, slopindamas RANKL sukeltą mitogeno aktyvuotų baltymų kinazių ir transkripcijos faktorių, tokių kaip NF-kB, c-Fos ir NFATc1, aktyvaciją. Visi šie rezultatai rodo, kadakteozidogali veikti kaip antirezorbcinis agentas, mažinantis kaulų retėjimą, blokuodamas osteoklastų aktyvaciją.

Norėdami gauti daugiau informacijos, susisiekite:ali.ma@wecistanche.com

Spustelėkite norėdami gauti Cistanche efektų produktus

Įvadas

Kaulas nuolat remodeliuojamas dėl subalansuoto osteoklastų ir osteoblastų aktyvumo [1]. Osteoklastai atsiranda iš monocitų / makrofagų linijos kraujodaros pirmtakų ląstelių, o osteoblastai yra mezenchiminės linijos [2]. Nenormalus osteoklastų aktyvavimas arba sumažėjusi osteoblastogenezė gali sutrikdyti kaulų homeostazę, galiausiai sukelti ligas, tokias kaip osteoporozė, artritas ir kaulų vėžys [3,4]. Osteoporozė yra dažna kaulų liga, dėl kurios padidėja lūžių rizika. Dažniausia osteoporozės forma atsiranda dėl estrogenų trūkumo moterims menopauzės metu. Tokie vaistai kaip kortikosteroidai ir vaistai nuo epilepsijos taip pat gali sutrikdyti kaulų rezorbcijos ir formavimosi pusiausvyrą, o tai gali sukelti osteoporozę [5]. Daugelis antirezorbcinių inhibitorių, įskaitant bisfosfonatus, kalcitoniną, estrogeną ir selektyvius estrogenų receptorių moduliatorius, buvo naudojami osteoporozei gydyti. Šie inhibitoriai palaiko kaulų masę slopindami osteoklastų funkciją [6]. Pakaitinė estrogenų terapija yra populiariausias pomenopauzinės osteoporozės profilaktikos ir gydymo būdas. Tačiau ilgalaikė pakaitinė estrogenų terapija gali padidinti endometriumo ir krūties vėžio riziką. Todėl daugelis tyrėjų sutelkė savo pastangas kurdami naują antirezorbcinį agentą, kuris neturėtų šalutinio poveikio [7–10]. Kadangi osteoklastai veikia rezorbuojant kaulus, daugelyje tyrimų pagrindinis tikslas buvo specifiškai slopinti osteoklastus. Osteoklastai yra daugiabranduolės milžiniškos ląstelės, kurias sudaro monocitų/makrofagų šeimos mononukleariniai pirmtakai, nuosekliai proliferuojant, diferencijuojant ir susiliejant kraujodaros pirmtakų ląstelėms [11]. Makrofagų kolonijas stimuliuojantis faktorius (M-CSF) ir branduolinio faktoriaus (NF)-kB (RANK) ligando (RANKL) receptorių aktyvatorius yra esminiai osteoklastų diferenciacijos veiksniai[12]. Be to, keli uždegiminiai citokinai, tokie kaip naviko nekrozės faktorius (TNF) ir interleukinas (IL)-1b, prisideda prie osteoklastogenezės, moduliuodami RANKL, osteoprotegerino ir M-CSF indukciją [7,13]. RANKL prisijungimas prie ląstelės paviršiaus RANK receptoriaus sukelia RANKL/RANK/TNFR susijusių faktorių (TRAF) kompleksus, kurie nuosekliai aktyvuoja NF-kB ir mitogenu aktyvuotas baltymų kinazes (MAPK), įskaitant c-Jun N-galinę kinazę (JNK), p38. kinazė ir su ekstraląsteliniu signalu susijusi kinaze (ERK) [14]. Šis aktyvinimas atlieka pagrindinį vaidmenį tarpininkaujant osteoklastų diferenciacijai, aktyvacijai ir išgyvenimui. RANKL taip pat suaktyvina transkripcijos faktorių, tokių kaip aktyvuotų T ląstelių branduolinis faktorius, citoplazminis 1 (NFATc1) ir Fos, kurie yra būtini osteoklastų vystymuisi. 7,9]. Todėl RANKL signalizacija yra laikoma pagrindiniu antirezorbcinių medžiagų, slopinančių osteoklastų aktyvaciją ir kaulų retėjimą, taikiniu.

Akteozidasyra pagrindinis aktyvus Rehmannia glutinosa junginys, plačiai naudojamas tradicinėje Rytų medicinoje [15,16]. Akteozidas yra stiprus antioksidantas ir turi antihepatotoksinį, priešuždegiminį ir antinociceptinį poveikį [17–20]. Anksčiau mes tai nustatėmeakteozidosumažina tirozinazės aktyvumą ir melanino biosintezę reguliuodamas ERK signalizaciją [21], apsaugo nuo reaktyviųjų deguonies rūšių (ROS) sukeliamo dantenų pažeidimo[22] ir slopina mikotoksinų sukeltą ląstelių pažeidimą [23]. Šie poveikiai yra glaudžiai susiję suakteozidogalimybė pašalinti ROS ir reguliuoti MAPK tarpininkaujamą signalizaciją. Visų pirma, ROS siūloma tarpininkauti RANKL sukeltuose signalizacijos keliuose ir ląstelių įvykiuose osteoklastuose. Išankstinis gydymas antioksidantais slopino RANKL sukeltą NF-kB, ERK ir IkBa aktyvaciją, taip slopindamas osteoklastogenezę [24]. Šios išvados tvirtai rodo, kad, be priešuždegiminio aktyvumo, antioksidacinis aktyvumas yra labai svarbus antirezorbciniam agentui, todėlakteozidogali slopinti RANKL sukeltą osteoklastogenezę.

Šiame tyrime ištyrėme, arakteozidoturi gydomąjį poveikį kaulų retėjimui. Mes ištyrėme poveikįakteozidoapie osteoklastų diferenciaciją ir kaulų rezorbciją bei susijusius ląstelių mechanizmus, naudojant in vitro ir in vivo eksperimentines sistemas.

Medžiagos ir metodai

Etikos pareiškimas

Gyvūnų priežiūros ir naudojimo praktikas patvirtino Čonbuko nacionalinio universiteto laboratorinių gyvūnų priežiūros ir naudojimo etikos komitetas (leidimo Nr. CBU 2010-0007). Visi šio tyrimo eksperimentai buvo atlikti pagal universiteto Gyvūnų priežiūros ir naudojimo komiteto gaires.

Pelės, chemikalai ir laboratoriniai reikmenys

Keturių savaičių ICR pelių patelės buvo įsigytos iš OrientBio Inc. (Seulas, Korėja) ir laikomos 2261 uC temperatūroje ir 5565 procentų drėgnumo 12 valandų šviesos/tamsos cikle su laisva prieiga prie maisto ir vandens. Akteozidas (3,4-dihidroksi-b-fenetil-Oa-ramnopiranozė-Syl-(1R3)-4-O-kofeoil-bD-gliukopiranozidas; C29H36O15) (S1 pav.) buvo išskirtas iš lapų. Rehmannia glutinosa. Prieš naudojimą akteozidas buvo ištirpintas fosfatiniu buferiniu tirpalu (PBS). RANKL, TNF-a, IL-1b, IL-6 ir M-CSF buvo įsigyti iš MTEP sistemų (Mineapolis, MN, JAV). Antikūnai, specifiniai c-Fos, p65, p-p65, p-ERK, ERK, JNK, p-JNK, NFATc1, IkBa, p-IkBa ir b-aktinui buvo gauti iš Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, JAV). ). Antikūnai p-p38 ir p38 buvo įsigyti iš Cell Signaling Technology (Danvers, MA, JAV). CalciumAssay ir Osteocalcin (OC) EIA rinkiniai buvo įsigyti atitinkamai iš BioAssay Systems (Hayward, CA, JAV) ir Biomedical Technologies (Stoughton, MA, JAV), siekiant nustatyti serumo biocheminius parametrus. Pelės tartratui atsparios rūgštinės fosfatazės (TRAP) tyrimo rinkinys (Immunodiagnostic Systems, Scottsdale, AZ, JAV) taip pat buvo naudojamas TRAP5b lygiui serume matuoti. Jei nenurodyta kitaip, papildomos cheminės medžiagos buvo gautos iš Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO, JAV), o laboratorijos reikmenys buvo iš SPL Life Sciences (Pochun, Pietų Korėja).

Ląstelių kultūros

Kaulų čiulpų ląstelės buvo gautos iš 6 savaičių amžiaus ICR pelių patelių blauzdikaulio ir šlaunikaulio pagal anksčiau aprašytus metodus [25]. Kaulų čiulpų suspensija buvo inkubuojama 100-mm kultūros lėkštelėje, esant 50 ng/ml M-CSF. Po 3 dienų prilipusios ląstelės buvo naudojamos kaip kaulų čiulpų makrofagai (BMM), kad sukeltų osteoklastinę diferenciaciją. Kai kurios kaulų čiulpų ląstelės taip pat buvo inkubuojamos 48 valandas be M-CSF, o prilipusios ląstelės buvo kultivuojamos osteoblastų diferencijavimo terpėje, kaip aprašyta kitur [25]. RAW264.7 makrofagų ląstelės buvo kultivuojamos Dulbecco modifikuotoje Eagle terpėje (DMEM), papildytoje 10 procentų galvijų vaisiaus serumo (FBS), 2 mM L-glutamino ir antibiotikais. Šios ląstelės buvo naudojamos kaip BMM ląstelių linija, siekiant ištirti akteozido poveikį osteoklastogenezei.

Osteoklastinė diferenciacija ir TRAP dažymas

Prieš stimuliuojant 100 ng/ml RANKL, BMM buvo iš anksto apdorotas įvairių koncentracijų (0–50 mM) akteozidu 2 valandas. 2 ir 5 dienomis auginimo terpė buvo pakeista nauja terpe. Po 7 dienų inkubacijos kultūros buvo fiksuotos 4 procentų PBS buferiniame paraformaldehide ir nudažytos TRAP naudojant sigma Aldrich rinkinį pagal gamintojo instrukcijas. TRAP teigiamos ląstelės buvo skaičiuojamos naudojant optinę mikroskopiją, o ląstelės, turinčios 3 ar daugiau branduolių, buvo laikomos osteoklastais. RAW 264.7 ląstelės taip pat buvo veikiamos 100 ng/ml RANKL po 2 valandų išankstinio apdorojimo akteozidu ir po 7 dienų inkubacijos. ląstelės buvo apdorotos dažymui TRAP.

Ląstelių gyvybingumo matavimas

Ląstelių gyvybingumas buvo nustatytas naudojant vandenyje tirpios tetrazolio druskos (WST) -8 reagentą. Trumpai tariant, BMM arba RAW264.7 ląstelės, kultivuotos auginimo terpėje, kurioje yra 10 procentų FBS ir antibiotikų, buvo apdorotos 10 mM akteozidu arba fenolio junginiu, tokiu kaip kvercetinas, liuteolinas, apigeninas arba epigallocatechin -3- galatas (EGCG). WST-8 reagentas buvo įdėtas į kultūras po 48 valandų inkubacijos. Po papildomų 4 valandų inkubavimo, naudojant mikroplokštelių skaitytuvą (Packard Instrument Co., Downers Grove, IL, JAV) buvo išmatuota WST{10}specifinė absorbcija esant 450 nm.

Kaulų rezorbcijos tyrimas

BMM (16105 ląstelės/ml) buvo suspenduoti a-MEM, turinčiame 50 ng/ml M-CSF ir 100 ng/ml RANKL, tada padalinti į šulinio plokštelę, padengtą kalcio fosfato nanokristalais (OAAS{{6}). }; Osteoclast Activity Assay Substrate, Oscotec Inc., Choongnam, Pietų Korėja), esant 26104 ląstelių/cm2 tankiui su akteozidu ir be jo. Po 7 dienų inkubacijos ląstelės buvo pašalintos iš plokštelių su 5 procentų natrio hipochloritu, o informacija buvo stebima optiniu mikroskopu. Rezorbuota sritis taip pat buvo išmatuota vaizdo analizatoriumi ir išreikšta kontrolinės vertės procentais.

Western blot analizė

Visi baltymų lizatai buvo paruošti lizės buferyje, kaip aprašyta kitur [26]. Citozoliniai ir branduoliniai baltymai buvo paruošti, kaip aprašyta anksčiau [25]. Lygiai baltymo ekstrakto kiekiai buvo atskirti 12–15 procentų SDS-PAGE ir užpilami ant polivinildifluorido membranų. Blotai buvo tiriami pirminiais antikūnais per naktį 4 uC temperatūroje, prieš inkubuojant su antriniu antikūnu blokuojančiame buferyje 1 valandą. Blotai buvo sukurti naudojant sustiprintą chemiliuminescenciją (Amersham Pharmacia Biotech Inc., Bekingemšyras, JK) ir eksponuoti rentgeno plėvele (Eastman-Kodak Co., Rochester, NY, JAV).

MAPK aktyvumo tyrimas

Ląstelės buvo iš anksto apdorotos akteozidu 2 valandas, o po to stimuliuojamos RANKL papildomai -30 min. MAPK aktyvumas buvo nustatytas naudojant imunometrinių tyrimų rinkinius, tokius kaip p-p38kinazės tyrimo rinkinys (Assay Designs, Inc., MI, JAV), p-ERK fermento tyrimo rinkinys (Assay Designs) ir p-SAPK/JNK sumuštinis ELISA rinkinys ( Cell Signaling Technology, MA, JAV). Visos procedūros buvo vykdomos pagal gamintojo instrukcijas, o absorbcija buvo matuojama mikroplokštelių skaitytuvu.

Elektroforetinio judumo poslinkio tyrimas (EMSA)

DNR ir baltymų prisijungimo reakcijos buvo atliekamos 3{6}} min. kambario temperatūroje, 10–15 mg baltymo 20 ml buferyje, kuriame yra 1 mg/ml BSA, 0,5 mg/ml poli (dI-dC), 5 procentai glicerolio. ,1 mM DTT, 1 mM PMSF, 10 mM Tris-Cl (pH 7,5), 50 mm NaCl, 30, 000 CPM [a-32P] dCTP pažymėtų oligonukleotidų ir Klenow fragmento DNR polimerazės. Mėginiai buvo atskirti 6 procentų poliakrilamido geliais, kurie buvo išdžiovinti ir 12–24 valandas veikiami rentgeno plėvele (Eastman Kodak Co.) 270 uC temperatūroje. NF specifinės oligonukleotidų pradmenų sekos buvo 59-AAG GCC TGT GCT CCG GGA CTT TCC CTGGCC TGG A-39 ir 39-GGA CAC GAG GCC CTG AAA GGGACC GGA CCT GGA A{{30 }}.

NF-kB liuciferazės tyrimas

RAW264.7 makrofagai 24-šulinėlių plokštelėse buvo transfekuoti 0,8 mg kB-luciferazės reporterio vektoriumi, naudojant 2 ml Lipofectamine2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA, JAV) pagal gamintojo instrukcijas. Praėjus 24 valandoms po transfekcijos, ląstelės buvo stimuliuojamos RANKL, esant akteozidui ir be jo 24 valandas. Ląstelės buvo resuspenduotos 100 ml reporterio lizės buferyje (Promega, Madison, WI, JAV). Vienodas kiekis baltymų mėginių buvo dedamas į 96-šulinėlių mikroplokštes ir sumaišytas su luciferazės substratu. Liuminescencija buvo matuojama naudojant mikroplokštelės luminometrą (MicroLumat Plus LB 964, Berthold Technologies, Bad Wildbad, Vokietija). Šiame eksperimente kaip teigiamas kB inhibitorius buvo naudojamas pralaidus NF-B inhibitoriaus peptidas (BIOMOL, Butler Pike, PA, JAV).

Citokinų matavimas

BMM arba RAW264.7 ląstelės buvo stimuliuojamos RANKL dalyvaujantakteozido24-šulinėlių kultūros plokštelėse. Po 48 valandų inkubacijos kultūros supernatantai buvo surinkti ir įvertinti ELISA metodu, naudojant specifinius TNF-a-, IL-1b- ir IL-6- OptEIATM rinkinius pagal gamintojo instrukcijas.

Realaus laiko atvirkštinės transkripcijos-polimerazės grandininė reakcija (RT-PGR)

Osteoklastinių žymenų, tokių kaip c-Fos, NFATc1 ir TNF-a, mRNR ekspresija buvo nustatyta realaus laiko RT-PGR. Trumpai tariant, visa RNR buvo išgauta iš makrofagų naudojant Trizolreagent pagal gamintojo instrukcijas (Invitrogen). cDNR buvo susintetinta su 1 mg visos RNR, naudojant SuperScriptReverse Transcripatase II ir pradmenis (Invitrogen). Power SYBRGreen PCR Master Mix (Applied Biosystems, Foster City, CA, JAV) buvo naudojamas PGR produkto kaupimuisi aptikti važiuojant ciklu su ABI 7500 sekos aptikimo sistema (taikoma naudojant keturiasdešimt 3-žingsnių denatūravimo ciklų esant 95uC temperatūrai. 15 sek., atkaitinimas 60 uC temperatūroje 1 sek. ir pratęsimas 72 uC temperatūroje 30 sek. Visos PGR reakcijos buvo atliktos bent trimis egzemplioriais, o ekspresijos lygiai buvo normalizuoti pagal namų ruošos geną HPRT toje pačioje reakcijoje. Šiame tyrime buvo naudojamos tos pačios aprašytos pradmenų sekos kitur [7].

Intraląstelinės ROS matavimas

Pradinis 29,79-dichlordihidrofluoresceino-diacetato (DCFH-DA) (50 mM; Calbiochem, Darmštatas, Vokietija) tirpalas buvo paruoštas DMSO ir laikomas 220 uC temperatūroje tamsoje. Trumpai tariant, BMM (106 ląstelės/ml 6-šulinėlių plokštelėse) buvo kultivuojami su 50 ng/MLM-CSF 24 valandas, o po to 2 valandas prieš stimuliavimą 100 ng/ml RANKL. Po 1 valandos bendro inkubavimo šios ląstelės vėliau buvo inkubuojamos su 25 mM DCFH-DA 30 minučių. Žalia 29,79-dichlorfluoresceino (DCF) fluorescencija buvo užfiksuota ties 515 nm (FL 1), naudojant FACS VantageH sistemą (Becton-Dickinson, San Chosė, CA, JAV) ir 10,000 įvykių buvo skaičiuojami kiekvienam mėginiui

Kiaušidžių pašalinimo sukeltos osteoporozės sukėlimas

Šiam tyrimui buvo naudojamos ICR pelių patelės (6 savaičių amžiaus). Pelėms buvo atlikta fiktyvi operacija (Sham, n=10) arba chirurginė kiaušidžių pašalinimas (OVX, n=20) taikant anesteziją. Praėjus savaitei po operacijos, OVX pelės buvo atsitiktinai suskirstytos į 2 grupes po 10 pelių: dvišalis OVX ir dvišalis OVX, papildytas 200 ml PBS, kuriame yra 1 mM akteozido per burną (AC grupė). Oralinisakteozidobuvo skiriamas kartą per 3 dienas 8 savaites po operacijos, o toks pat kiekis PBS buvo skiriamas fiktyvioms ir OVX grupėms. Praėjus 1 dienai po paskutinio vartojimo, pelės buvo numarintos, o po to buvo analizuojami biocheminiai serumo parametrai ir 3-dimensinė kaulų struktūra.

Serumo biocheminių parametrų nustatymas

Kraujo mėginiai buvo paimti per širdies punkciją, o serumas buvo paimtas centrifuguojant. Biocheminių parametrų analizei serumo mėginiai buvo laikomi 280 uC temperatūroje. IL-1b ir IL-6 koncentracija serume buvo apskaičiuota naudojant ELISA rinkinį, kaip aprašyta aukščiau, o šarminės fosfatazės (ALP) aktyvumas buvo nustatytas naudojant biocheminį kolorimetrinį tyrimą, kuris matuoja p kiekį. -nitrofenolis, pagamintas iš p-nitrofenolio fosfato substrato, kaip aprašyta kitur [27]. Norint įvertinti kaulų formavimosi ir rezorbcijos biomarkerius, pagal gamintojo instrukcijas taip pat buvo nustatytas OC, kalcio ir TRAP5b kiekis serume.

Kaulų sandaros ir morfometrinių parametrų analizė

Pelių (Sham, OVX ir AC grupių) šlaunikaulis buvo išpjaustytas ir užpildytas fiziologiniu tirpalu mechaniniam tyrimui. Šlaunikaulio mechaninis stiprumas buvo matuojamas taip, kaip aprašyta kitur [28]. Lūžio apkrova buvo užfiksuota kaip didžiausia jėga niutonais toje vietoje, kur lūžta dešiniojo šlaunikaulio vidurio velenas. Be to, kiekvieno gyvūno lengvas šlaunikaulis buvo histomorfometriškai ištirtas naudojant mikrokompiuterinės tomografijos (mikro-CT) sistemą (SkyScan 1076 mikrofokuso rentgeno sistema, Kontich, Belgija). Trumpai tariant, 4 procentų formaldehido saugykloje esantys kaulai buvo paviršutiniškai išdžiovinti ant popierinio audinio, prieš suvyniojant į plastikinę „klijuojančią plėvelę“ arba parafilmą, kad nuskaitymo metu neišdžiūtų. Kiekvienas plastiku apvyniotas kaulas buvo patalpintas į plastiko / putų polistirolo vamzdelius, kurie buvo sumontuoti vertikaliai horizontaliai 1076 skaitytuvo mėginio kameroje mikro-KT vaizdavimui. Skenavimas buvo atliktas naudojant 100 kV šaltinio įtampą ir 140 mA šaltinio srovę su 35 mm skiriamąja geba. Trimačiai šlaunikaulio trabekulinių kaulų modeliai buvo rekonstruoti naudojant SkyScan CT Analyzer 1.11 versiją. Struktūriniai parametrai, tokie kaip trabekulinio kaulo mineralinis tankis (KMT, g/cm3), kaulo tūrio procentas (kaulo tūris (BV)/audinio tūris (TV), proc.), storis (Tb.Th, mm), atsiskyrimas (Tb.Sp). , mm) ir skaičius (Tb.N, 1/mm) buvo išmatuotas.

Osteogeninės diferenciacijos ir mineralizacijos tyrimas

Kaulų čiulpų ląstelės, kultivuotos 6-šulinėlių auginimo plokštelėse, buvo apdorotos DAG (10 nM deksametazono, 50 mM askorbo rūgšties ir 20 mM b-glicerofosfato), dalyvaujant 10 mM.akteozido. Po 2 savaičių diferenciacijos ląstelės buvo fiksuotos lediniu 70 procentų (tūrio/tūrio) etanoliu 1 val. ir dažytos 0,2 procentų alizarino raudonojo Sin distiliuotu vandeniu 30 min. kambaryje. temperatūros. Po to, kai ląstelės buvo pašalintos ir išdžiovintos ore, ląstelių kultūros plokštelės buvo įvertintos šviesos mikroskopu, naudojant apverstą mikroskopą (Nikon TS100, Japonija). Norint kiekybiškai įvertinti raudonų dažų kiekį, dėmė buvo eliuuojama 10 procentų acetilpiridinio chloridu, kratant 20 minučių, o absorbcija buvo matuojama esant 560 nm. Ląstelių sluoksniuose nusėdusio kalcio kiekis taip pat buvo matuojamas naudojant Calcium Kit (Wako Chemical Inc. Osaka, Japonija) pagal gamintojo instrukcijas. Be to, kaulams specifinių mRNR žymenų, pvz., su bėgimu susijusio transkripcijos faktoriaus -2(Runx2), osterikso, kaulo sialoproteino (BSP) ir OC, ekspresija buvo nustatyta realiojo laiko RT-PGR. Šių žymenų oligonukleotidiniai pradmenys buvo sukurti su mažesniais nei 200 bp gaminiais, naudojant PrimerExpress Software 3.0 (Applied Biosystems), kaip aprašyta kitur[27].

Statistinė analizė

Jei nenurodyta kitaip, visi duomenys išreiškiami kaip 3 ar daugiau nepriklausomų eksperimentų vidutinis6 standartinis nuokrypis (SD). Vienpusė ANOVA buvo naudojama daugkartiniams palyginimams naudojant SPSS 12 versiją.{4}} programinę įrangą. P reikšmė 0,05 buvo laikoma statistiškai reikšminga.

Rezultatai

Akteozidas, priklausomai nuo dozės, slopina makrofagezino sukeliamą osteoklastų susidarymą

Siekiant patikrinti akteozido poveikį BMM diferenciacijai į osteoklastus, ląstelės buvo kultivuojamos su įvairiomis koncentracijomis (0–20 mM) akteozido 7 dienas, esant 50 ng/ml M-CSF ir 100 ng/ml. RANKL. Akteozidas sumažino osteoklastų skaičių priklausomai nuo dozės. Kai ląstelės buvo iš anksto apdorotos 10 mM akteozidu 2 valandas, osteoklastų skaičius sumažėjo 43 procentais, palyginti su ląstelėmis, papildytomis M-CSF ir RANKL (1A pav.). 1B pav. parodyta RANKL sąlygota osteoklastų diferenciacija ir jos slopinimas kombinuoto gydymo akteozidu. Atsižvelgiant į šį rezultatą, išankstinis apdorojimas akteozidu sumažino RANKL stimuliuojamą RAW264.7 ląstelių diferenciaciją ir osteoklastų susidarymą (1C ir D pav.). Palyginus antiosteoklastinį akteozido potencialą ant KMM su kelių fenolio junginių antiosteoklastiniais potencialais esant tokiai pačiai koncentracijai (10 mM), liuteolinas pasižymėjo didžiausiu aktyvumu (2A pav.). Tačiau pats liuteolinas, kvercetinas ar apigeninas sumažino ląstelių gyvybingumą (2B pav.). Visi junginiai slopino osteoklastinę diferenciaciją RAW264.7 makrofagais su tokia santykine veikla: liuteolinas. kvercetino=apigenino .EGCG=akteozido (2C pav.). Liuteolinas, kvercetinas ar pats apigeninas taip pat parodė sumažėjusį ląstelių gyvybingumą (2D pav.). Priešingai, gydymas kvercetinu reikšmingai sumažino BMM ir RAW264.7 ląstelių gyvybingumą, kai šios ląstelės 2 dienas buvo veikiamos 10 mM kiekvieno junginio su 50 ng/ml M-CSF, 100 ng/ml RANKL, arba abu (duomenys nerodomi). Kai reikia šių junginių koncentracijos slopinti 50 proc

osteoklastų susidarymas KMM (IC50) buvo apskaičiuotas naudojant koncentracijos ir aktyvumo kreives, IC50akteozido, kvercetino, liuteolino, apigenino ir EGCG buvo atitinkamai 5,1, 2,3, 2,6, 4,8 ir 6,6 mM (2E pav.). Šis rezultatas buvo panašus į atvejį, kai buvo ištirti RAW264.7 makrofagai. Šie duomenys rodo, kad liuteolino ir kvercetino antiklastogeninis aktyvumas buvo didesnis nei akteozido. Priešingai, kvercetinas, esant IC50, taip pat turėjo nedidelį toksinį poveikį ląstelėms (duomenys nerodomi).

Akteozidas slopina kaulų rezorbciją makrofaguose

Akteozidas taip pat užkirto kelią RANKL sąlygotai kaulų rezorbcijai priklausomai nuo dozės, matuojant in vitro modelio sistema (3A pav.). Kaulų rezorbcija buvo žymiai slopinama, kai BMM buvo inkubuojami su 1 mM akteozido (3B pav.). 10 mMakteozidogydymas beveik visiškai susilpnino RANKL sukeltą informaciją BMM. Panašiai, akteozidas sumažino kaulų rezorbciją RANKL stimuliuojamose RAW264.7 ląstelėse (S2A ir B pav.). Akteozido gebėjimas slopinti kaulų rezorbciją priklausė nuo gydymo laiko, palyginti su RANKL stimuliacija. Akteozidas (10 mM), pridėtas praėjus 4 dienoms po RANKL stimuliacijos, nesumažino BMM informacijos, tuo tarpu slopino susidariusių osteoklastų skaičių (3C pav.). Šį skirtingą rezultatą iš dalies lėmė duobės plotas, susidaręs po 4 dienų RANKL stimuliacijos formavimosi (3D pav.).

Acteoside Down-reguliuoja ankstyvuosius RANKL signalizacijos kelius

RANKL sukelia 3 gerai žinomų MAPK ir NF-kB aktyvavimą osteoklastų pirmtakuose, ir šis aktyvinimas reikalingas ankstyvam osteoklastų diferenciacijai. Norėdami suprasti galimus mechanizmus, kuriais akteozidas slopina osteoklastogenezę, ištyrėmeakteozidodėl MAPK ir NF-B aktyvinimo makrofaguose. BMM ir RAW264.7 ląstelės buvo iš anksto apdorotos 10 mM akteozidu 2 valandas, o po to stimuliuojamos 100 ng / ml RANKL 30 minučių. MAPK fosforilinimas buvo tiriamas Western blot ir imunometrine analize. RANKL sukėlė p38, ERK ir JNK fosforilinimą BMM (4A pav.) ir RAW264.7 ląstelėse (4B pav.). Akteozidas užkirto kelią šiems RANKL sukeltam p-p38, p-ERK ir p-JNK padidėjimui. Šį rezultatą patvirtino imunometrinė analizė, kuri buvo apdorota 10 mMakteozidoreikšmingai slopino fosforilintų MAPK kiekį šiuose makrofaguose (4C pav.). Gydymas RANKL padidino NF-kB prisijungimą prie DNR, o akteozidas slopino RANKL sukeltą NF-kB-DNR prisijungimo aktyvaciją (5A pav.). Šis slopinimas buvo ryškesnis BMM nei RAW264.7 ląstelėse. Akteozidas taip pat sumažino RANKL stimuliuojamą p65 ir IkBa fosforilinimą BMM ir RAW264.7 ląstelėse (5B ir C pav.). 10 mMakteozido pridėjimas beveik visiškai slopino IkBa skaidymą ir aktyvavimą BMM (5B pav.). Siekiant dar labiau patvirtinti, kad NF kB aktyvacija yra susijusi su akteozido veikimu, kB promotoriaus-luciferazės konstrukcijos buvo laikinai transfekuotos į RAW264.7 ląsteles. Ląstelės, inkubuotos su 100 ng/ml RANKL, turėjo 3- kartų didesnį kB promotoriaus aktyvumą, kurį žymiai susilpnino 10 mM akteozido (5D pav.).

Akteozidas slopina uždegiminių citokinų gamybą ir TNF-a, c-Fos ir NFATc1 ekspresiją RANKL stimuliuojamuose makrofaguose

TNF-a, IL-1b ir IL-6 yra svarbūs osteoklastų formavimuisi ir funkcijai, kurią tarpininkauja NF-kB signalizacija RANKL stimuliuojamuose makrofaguose. RANKL stimuliavo šių citokinų gamybą ir ši gamyba buvo žymiai sumažinta 10 mMakteozidoišankstinis apdorojimas BMM (6A pav.). Panašiai akteozidas susilpnino RANKL sukeltą citokinų, išskyrus IL-6, gamybą RAW264.7 makrofaguose (S3 pav.). Norėdami suprasti molekulinius akteozido veikimo mechanizmus osteoklastogenezėje, toliau tyrėme akteozido poveikį TNF-a, c-Fos ir NFATc1 ekspresijai. RANKL padidino šių veiksnių mRNR ekspresiją BMM ir RAW264.7 ląstelėse (6B ir C pav.). Išankstinis apdorojimas 10 mM akteozidu reikšmingai slopino RANKL sukeltą šių faktorių ekspresiją abiem atvejais.

BMM ir RAW264.7 ląstelės. Išankstinis apdorojimas akteozidu taip pat stipriai sumažino c-Fos ir NFATc1 baltymų kiekį RANKL stimuliuojamuose BMM (6D pav.). Šie rezultatai rodo, kad akteozidas sumažina RANKL indukuojančius osteoklastų susidarymo mediatorius genų ir baltymų lygiu.

Akteozidas sumažina tarpląstelinę ROS susidarymą BMM, priklausomai nuo dozės. Kadangi žinoma, kad tarpląstelinė ROS gamyba yra susijusi su RANKL stimuliuojama osteoklastogeneze, ištyrėme, ar akteozidas slopina ROS gamybą RANKL sukeltos osteoklastų diferenciacijos metu, naudojant ląstelėms pralaidžią oksidaciją. , DCFH-DA. Srauto citometrijos analizė parodė, kad vidutinis fluorescencinis signalas, būdingas DCF BMM, po stimuliacijos RANKL buvo akivaizdžiai pasislinkęs į dešinę, palyginti su neapdorotomis kontrolinėmis ląstelėmis (7A pav.). Šis poslinkis buvo panašus į atvejį, kai po RANKL stimuliacijos buvo pastebėti RAW264.7 makrofagai (duomenys nerodomi). BMM gydymas akteozidu sumažino DCF signalo intensyvumą priklausomai nuo dozės. Išankstinis apdorojimas 10 mM akteozidu beveik visiškai sumažino tarpląstelinio ROS, susidarančio osteoklastų diferenciacijos metu, lygius iki neapdorotų kontrolinių lygių (7B pav.).

Geriamasis akteozido vartojimas slopina osteoporozės biocheminių žymenų pasikeitimą ir kaulų praradimą pelėms, kurių kiaušidės pašalintos

Norėdami ištirti akteozido poveikį kaulų retėjimui, parengėme osteoporozinio gyvūno modelį kiaušidžių pašalinimo būdu. Eksperimentiniu laikotarpiu buvo reikšmingas kūno svorio skirtumas tarp OVX ir Shammice (duomenys nerodomi). Grupės IL{0}}b ir IL-6 koncentracija serume buvo žymiai didesnė nei fiktyvi grupė (8 pav.). Kiaušidžių pašalinimo sukeltas šių uždegiminių citokinų padidėjimas buvo susilpnintas vartojant geriamąjį akteozidą (AC grupė). OVX grupėje žymiai padidėjo kaulų apykaitos žymenų, tokių kaip ALP, kalcio, TRAP5b ir OC, kiekis serume. Iš šių osteoporozinių žymenų padidėjęs kalcio, TRAP5b ir OC kiekis OVX pelėse buvo akivaizdžiai slopinamas gydant akteozidu, o ALP kiekis serume gydymas nepakito. Vidutinė maksimali lūžio apkrova iki dešiniojo šlaunikaulio veleno vidurio buvo žymiai mažesnė OVX grupėje nei apgaulingoje grupėje (9A pav.). Gydymas akteozidu padidino maksimalų atsarginį lūžių skaičių iki apgaulingos grupės. Kai šlaunikaulio žievės kaulas buvo išpjaustytas ir stebimas optiniu mikroskopu, OVX grupėje parodytos osteoporozės požymiai beveik visiškai išnyko AC pelėms (9B pav.). Siekiant patikrinti akteozido poveikį OVX sukeltos osteoporozės modeliui, mikro-KT buvo išanalizuoti KMT ir kaulų morfologiniai parametrai šviesaus proksimalinio šlaunikaulio trabekuliacijoje. Kaip parodyta 9C pav., OVX pelėms buvo rastas šlaunikaulio trabekulinės architektūros pakitimas, o šis pokytis buvo sumažintas gydant akteozidu. Mikro-KT analizės rezultatai atskleidė, kad OVX pelių KMT, kaulų stiprumo matas, labai sumažėjo (9D pav.). Palyginti su „Sham“ grupe, OVX pelėms taip pat buvo reikšmingų BV / TV, Tb pokyčių. Sp ir Tb. N, bet ne Tb.Th. OVX pelių gydymas geriamuoju akteozidu reikšmingai užkirto kelią KMT, taip pat BV/TV ir Tb.N pokyčiams.

Akteozidas neturi įtakos osteoblastogenezei kaulų čiulpų ląstelėse

Akteozido vaidmuo osteoblastinei diferenciacijai buvo toliau tiriamas naudojant kaulų čiulpų ląsteles. Kaip parodyta 10A pav., DAG gydymas padidino alizarinu raudonai nusidažytų ląstelių skaičių ir to nepakeitė išankstinis apdorojimas 10 mM akteozidu. Esamų dažų kiekis parodė, kad kombinuotas gydymas akteozidu ir DAG mineralizacijos nepakeitė (10B pav.). Panašiai DAG sukeltas kaulams būdingų žymenų, tokių kaip Runx2, osterix, BSP ir OC, kalcio kiekio padidėjimas ląstelėse (10C pav.) ir mRNR lygis (10D pav.) nebuvo paveiktas išankstinio apdorojimoakteozido.