Arilo angliavandenilių receptorių aktyvinimas 6-formilindolo[3,2-b]karbazolu sumažino ūminį inkstų pažeidimą slopindamas uždegimą ir apoptozę
Mar 20, 2022
Santrauka:Ūmusinkstų pažeidimas(AKI) yra įvairių etiologijų daugiafaktorinė liga. Arilo angliavandenilio receptorius (AhR) yra ligandų aktyvuotas transkripcijos faktorius, kuris reaguoja į ligandus, kad sukeltų arba slopintų genų ekspresiją, taip reguliuodamas įvairų biologinio ar patofiziologinio poveikio spektrą. Tačiau AhR poveikis AKI lieka nežinomas. Viena intraperitoninė 50 procentų glicerolio injekcija buvo atlikta siekiant sukelti rabdomiolizę C57BL / 6J pelėms. Dvišalisinkstųpedikulai buvo užkimšti 30 minučių, o po to pašalinami stimuliuotiinkstųI/R trauma. Buvo naudojamas 6-formilindolo[3,2-b]karbazolas (FICZ), triptofano fotooksidacijos produktas, turintis didelį afinitetą AhR. Tyrimas in vitro buvo atliktas su HK-2 ląstelėmis. Geležies mioglobinas ir FICZ buvo ištirpinti terpėje skirtingose ląstelių grupėse. Gydymas AhR agonistu FICZ žymiai sumažino kreatinino ir karbamido padidėjimą serume sergant AKI. Sukeltas AKI modeliavimoinkstų pažeidimasbuvo susilpnintas FICZ. AhR daugiausia ekspresuojamas proksimalinėse kanalėlių ląstelėse ir gali būti aktyvuotas vartojant FICZ. Tuo tarpu AKI sukėlė priešuždegiminių citokinų gamybą sužeistiesiemsinkstus, o FICZ slopino jų išraiškas. Be to, FICZ veiksmingai pakeitė ląstelių apoptozę AKI modeliuose. Mechaniškai AKI paskatino NF-κB ir JNK takų aktyvavimąinkstus, o FICZ žymiai slopino šias atitinkamas baltymų ekspresijas. In vitro tyrimo metu FICZ taip pat slopino uždegimą ir apoptozę mioglobino arba H/R stimuliuojamose HK-2 ląstelėse. Apibendrinant, FICZ AhR agonizmas sumažino rabdomiolizę ir I / R sukeltą AKI. FICZ slopino uždegimą ir apoptozę, slopindamas NF-κB ir JNK kelius proksimalinėse kanalėlių ląstelėse.
Raktiniai žodžiai:ūminis inkstų pažeidimas, apoptozė, arilo angliavandenilio receptoriai, uždegimas, inkstų kanalėlių epitelio ląstelė
CISTANCHE PAGERINS INKSTŲ/INKSTŲ LIGĄ
ĮVADASŪmusinkstų pažeidimas(AKI) reiškia spartų mažėjimąinkstų funkcijaper kelias valandas iki kelių dienų dėlinkstųperfuzijos nepakankamumas, nefrotoksiniai vaistai ar nuodai, šlapimo takų obstrukcija ir kitos priežastys.1 Klinikinės AKI priežastys daugiausia yra išemijos-reperfuzijos pažeidimas, nefrotoksinės medžiagos (tokios kaip vaistai, kontraktinės medžiagos ir raumenų ląstelių turinys, išsiskiriantis dėl rabdomiolizės) ir sepsis. Pasaulyje kasmet nuo AKI kenčia apie 13,3 mln. žmonių.2 AKI dėl didelio mirtingumo ir didelių išlaidų sukelia didelę naštą.3 Pagrindiniai patofiziologiniai mechanizmai apima sužalojimą.inkstųkraujagyslių sistema, 4,5 endoplazminis tinklas stresas, 6,7 mitochondrijų pažeidimas,8 apoptozė,9 oksidacinis stresas ir uždegimas.10 Rabdomiolizė (RM) yra sindromas, kuriam būdinga raumenų nekrozė ir raumenų ląstelių turinio išleidimas į kraujotaką, kurio metu AKI yra dažniausia komplikacija11; Išemija-reperfuzija (I/R) yra viena iš pagrindinių AKI patofiziologijų, sukeliančių 60 procentų visų AKI priežasčių.12 Šiuo metu nėra veiksmingo AKI gydymo, kurį sukelia abi pirmiau minėtos priežastys, išskyrus etiologijos pašalinimą, palaikomąjį. gydymas irinkstųpakaitinė terapija.
Arilo angliavandenilio receptorius (AhR) yra transkripuojamas ir verčiamas iš AHR geno. Žmonėms AhR išreiškiamas įvairiuose organuose, įskaitant plaučius, užkrūčio liauką,inkstas,kepenys, žarnynas ir kt.13 Nerišamas AhR yra citozolyje baltymų komplekse, kuriame taip pat yra šilumos šoko baltymo 90 (HSP90) dimeras ir ko-chaperonai AIP ir p23.14 Prisijungus prie ligando, AhR aktyvuojamas ir patenka į jį. branduolys, kur jis jungiasi prie AhR branduolio translokatoriaus (ARNT) ir skatina daugelio skirtingų pasroviui esančių genų transkripciją.15 AhR ligandai yra labai įvairūs ir gali būti klasifikuojami kaip egzogeniniai arba endogeniniai. Skirtingų šaltinių ir struktūrų ligandai jungiasi prie AhR su skirtingu afinitetu ir gali sukelti skirtingą fiziologinį ar patologinį poveikį.16 Ankstesni tyrimai parodė, kad AhR, esantis pasroviui, turėjo priešuždegiminių, 17 antiapoptozės, 18 ląstelių ciklų19 reguliavimo ir reguliavimo funkcijas. imunitetas,20 kurie yra svarbūs AKI patogenezės komponentai. Endogeniniai AhR ligandai daugiausia yra iš triptofano metabolizmo. 6-formilindolo[3,2-b]karbazolas (FICZ), triptofano fotooksidacijos produktas, turi didelį afinitetą su AhR.21 Anksčiau FICZ rodė apsauginį poveikį įvairiems ligų modeliams.{{ 19}} Nors tyrėjai nustatė, kad ureminių toksinų aktyvuotas AhR turėjo neigiamą poveikį pacientams, sergantiems lėtinėmis ligomis.inkstų ligos(CKD),25 jokiame tyrime nebuvo išmatuoti jo raiškos pokyčiai AKI. Taip pat neaišku, ar FICZ turi ainkstųapsauginis poveikis rabdomiolizės ir I / R sukeltos AKI atveju, nes AhR gali suaktyvinti visiškai skirtingus pasroviui skirtus efektus.
Eksperimentai su gyvūnaisVisi eksperimentiniai protokolai ir procedūros su gyvūnais buvo atliekami pagal Sičuano eksperimentavimo universiteto priimtus ir Sičuano universiteto Gyvūnų priežiūros ir naudojimo etikos komiteto patvirtintus etinius eksperimentų su gyvūnais principus. C57BL/6 pelių patinai (10-12 sav., svoris nuo 25 iki 27 g) buvo įsigyti iš Sičuano universiteto (Čengdu, Kinija) gyvūnų laboratorijos centro. Pelės buvo laikomos pastovioje temperatūroje (23 ± 2 laipsniai) ir šviesos / tamsos sąlygomis (12/12 valandų), turint laisvą prieigą prie vandens ir maisto. Pelės buvo pritaikytos prie šios aplinkos 1 savaitę prieš tolesnį tyrimą. Rabdomiolizės modelyje pelės buvo atsitiktinai suskirstytos į keturias grupes: kontrolinės (n {{10}}), FICZ (n=3), glicerolio (n=6) ir glicerolio. plius FICZ (n=6). Glicerolio grupės pelėms buvo sušvirkšta 50 procentų glicerolio, ištirpinto 0,9 procento normaliame fiziologiniame tirpale (9 μL/g kūno svorio), į nugaros galūnes abipusiai, kad būtų išprovokuota rabdomiolizės sumažėjusi AKI. Tuo tarpu kontrolinės grupės pelėms į raumenis buvo sušvirkštas toks pat kiekis fiziologinio tirpalo. Kalbant apie glicerolio ir FICZ grupę, FICZ buvo ištirpintas 2,5 procento PEG400 ir praskiestas 0,9 procento įprastu fiziologiniu tirpalu, kad būtų suleidžiama į pilvaplėvės ertmę po 100 ug / kg per dieną keturias dienas iš eilės prieš glicerolio injekciją. FICZ grupės pelėms keturias dienas iš eilės buvo sušvirkštos tos pačios FICZ dozės be glicerolio injekcijos.
CISTANCHE PAGERINS INKSTŲ/INKSTŲ NEAPTARKIMĄ
Inkstų išemijos-reperfuzijos modelyje pelės buvo atsitiktinai suskirstytos į keturias grupes: kontrolinę (n=6), FICZ (n=3), I/R (n=6) ir I. /R ir FICZ (n=10). Sužalojimas I/R grupėje buvo padarytas 30 minučių suspaudus inkstų pedikelius netrauminiais mikrovaskuliniais spaustukais, po to 24 valandas po spaustuko pašalinimo atlikta reperfuzija. Okliuziją ir reperfuziją patvirtino spalvos pokyčiaiinkstus. Kontrolinės grupės pelėms buvo atliktos tos pačios chirurginės procedūros, išskyrus pėdsakų užspaudimą. Kalbant apie I/R ir FICZ grupę, FICZ buvo skiriamas kaip minėta pirmiau keturias dienas iš eilės prieš I/R modeliavimą. Panašiai FICZ grupės pelėms keturias dienas iš eilės buvo skiriamos tos pačios FICZ dozės ir jos patyrė visas chirurgines procedūras kaip ir kontrolinė grupė. Dvi pelių partijos buvo atitinkamai numarintos švirkščiant pentobarbitalio natrio druską (50 mg/kg, ip) ir numarintos praėjus 24 valandoms po modeliavimo. Serumas irinkstasMėginiai buvo paimti ir saugomi –80 laipsnių tolesnei analizei.
Serumo biocheminiai tyrimaiKraujo mėginiai buvo nedelsiant centrifuguojami 1509,3 g 20 minučių, kad būtų galima išskirti serumą tyrimui. Kreatinino (sCr), karbamido ir kreatinkinazės (CK) kiekis serume buvo aptiktas automatiniu biocheminiu analizatoriumi (Mindray BS-240). Modeliavimo grupių sCr lygiai, padidėję iki dviejų kartų už kontrolines vertes, rodė sėkmingą AKI modeliavimą.
Histologinis įvertinimasInkstų audiniai buvo fiksuoti 10 procentų neutraliu buferiniu formalinu, įterpti į parafiną ir supjaustyti 4 μm storiu. Pjūviai buvo nudažyti periodine Schiff rūgštimi (PAS) po deparafinavimo ir rehidratacijos. PAS dažytos sekcijos buvo tiriamos šviesos mikroskopu, padidinant × 200 arba × 400. Dešimt laukų buvo atsitiktinai atrinkti naudojant × 200 padidinimą iš kiekvienos sekcijos, o pusiau kiekybinei analizei atsitiktinai buvo atrinktos dvi sekcijos iš kiekvieno mėginio, kuriame yra mažiausiai trys kiekvienoje grupėje. Histopatologiniai pokyčiai buvo vertinami pagal sužeistųjų/pažeistųjų procentąinkstųkanalėlių, kaip rodo kanalėlių išsiplėtimas, lizė, ardymas ir gipso susidarymas. Audinių pažeidimas buvo įvertintas pagal skalę {{0}}, o 0, 1, 2, 3 ir 4 atitinka 0 procentų,<25%, 26%-50%,="" 51%-75%="" and="">Sužeistųjų/sužalotų 76 procinkstųkanalėlių atitinkamai.26
Imunofluorescencinis dažymasPelė sustingoinkstasaudiniai, įterpti į UŠT, kriostate buvo supjaustyti į 4- μm storio dalis ir iki dažymo laikyti –80 laipsnių temperatūroje. Fosfatu buferinis fiziologinis tirpalas (PBS), turintis 5 procentus arklio serumo, buvo naudojamas 1 valandą kambario temperatūroje, kad būtų užblokuotos nespecifinės surišimo vietos. Tada sekcijos buvo inkubuojamos su pirminiais antikūnais drėgnoje kameroje 4 laipsnių temperatūroje per naktį. Po plovimo PBS, atitinkamas antrinis antikūnas buvo naudojamas 1 valandą, vengiant šviesos. Tada mėginiai buvo nuplauti PBS, nudažyti DAPI (D8200, Solarbio) ir galiausiai pritvirtinti dangteliais. Pirminiai antikūnai buvo pakeisti PBS neigiamoje kontrolėje. Fluorescenciniams signalams eksportuoti buvo naudojami antriniai antikūnai (1:500 praskiedimas; Jackson ImmunoResearch), suderinti su pirminiais antikūnais. Vaizdai buvo užfiksuoti ir analizuojami ZEN 2012 (mėlynojo leidimo) mikroskopijos programine įranga.
ImunohistochemijaInkstų audiniai buvo fiksuoti formalinu, dehidratuoti, įterpti į parafiną, supjaustyti 5 μm storio dalimis ir po to pritvirtinti ant stiklinių stiklelių. Tada stikleliai buvo užblokuoti 2,5 procento normaliu ožkos serumu ir inkubuojami su pirminiais antikūnais 4 laipsnių temperatūroje. Skaidrės buvo tris kartus plaunamos PBS, o dažymui naudojome VECTASTAIN ABC rinkinį (vektorių). Vaizdai buvo užfiksuoti naudojant ZEN 2012 (mėlynojo leidimo) mikroskopijos programinę įrangą.
TUNEL dažymasInkstų audiniai buvo fiksuoti formalinu, įterpti į parafiną ir supjaustyti 4 μm storiu. Galutinis deoksinukleotidiltransferazės sukeltas dUTP slapyvardžio žymėjimo (TUNEL) dažymas buvo atliktas naudojant DeadEnd™ Fluorometric TUNEL sistemą (G3250, Promega). Branduoliniam dažymui sekcijos buvo inkubuojamos su DAPI (D8200, Solarbio), praskiedus 1:500. Vaizdai buvo pateikti fluorescencine mikroskopija, padidinant × 400. Mes suskaičiavome teigiamas ląsteles ir kiekviename mėginyje ištyrėme bent 10 laukų.
CISTANCHE PAGERINS INKSTU/INKSTŲ FUNKCIJĄ
Western blot analizėTheinkstų audinyss arba HK{{0}} ląstelės buvo homogenizuotos radioimuninio nusodinimo (RIPA) lizės buferiu (P0013B, Beyotime Biotechnology), turinčiu 1‰ proteinazės inhibitorių (Keygen Biotech). Po centrifugavimo (18 894,2 g, 4 laipsniais) 15 minučių, supernatantas buvo surinktas ir baltymų koncentracija buvo nustatyta bicinchonino rūgšties baltymų tyrimo rinkiniu (Beyotime Institute of Biotechnology) pagal gamintojo instrukcijas. Baltymų lizatas su vienodais kiekiais buvo atskirtas 10 procentų - 12 procentų SDS-PAGE, po to perkeltas ant polivinilideno difluorido membranos (Bio-Rad). Membranos buvo užblokuotos 5 procentų neriebiu sausu pienu (m/v) Tris buferiniame fiziologiniame tirpale su 0,1 procento Tween-20 (TBS-T) 1 valandą kambario temperatūroje, o po to inkubuojamos su atitinkamais pirminiais antikūnais. naktį 4 laipsniai šilumos. Tris kartus perplovus TBS-T 5-minučių intervalais, membranos buvo inkubuojamos su HRP konjuguotais antriniais antikūnais kambario temperatūroje 1 valandą. Baltymų dėmės ant membranų buvo vizualizuotos Immobilon Western Chemiluminescent HRP substratu (Millipore Corporation) su Bio-Rad Chemi Doc MP. Densitometrijos analizė buvo atlikta naudojant ImageJ 6.0 programinę įrangą (Nacionaliniai sveikatos institutai), o -aktinas buvo naudojamas kaip pakrovimo kontrolė.
Kiekybinė realaus laiko PGR analizėBendra RNR iš užšaldytosinkstasmėginiai buvo išskirti naudojant Animal total RNR izoliacijos rinkinį (Foregene). Išskirtos mRNR koncentracija buvo nustatyta naudojant ScanDrop 100 (Analytik Jena) nustatiklį, o cDNR buvo susintetinti naudojant PrimeScript™ RT reagentų rinkinį (Takara Bio). Kiekybinė realaus laiko PGR buvo atlikta naudojant iTaq™ Universal SYBR Green Supermix (Bio-Rad) PGR sistemoje (CFX Connect; Bio-Rad) po atvirkštinės transkripcijos. Pradmenų sekos išvardytos S1 lentelėje. Santykiniai genų kiekiai buvo apskaičiuoti 2−∆∆Ct metodu, lyginant su -aktino ekspresijos lygiais.
Ląstelių kultūra ir gydymasŽmogaus inkstų proksimalinių kanalėlių ląstelių linija (HK{0}} ląstelė) buvo maloni prof. Xueqing Yu (Guangdongo provincijos liaudies ligoninė) dovana ir kultivuota (DMEM)/F12 terpėje (SH30023. 01B, Hyclone), papildyta 10 proc. vaisiaus galvijų serumas (SH30084. 03, Hyclone), 37 laipsnių temperatūroje drėgnoje atmosferoje, kurioje yra 5 procentai CO2 ir 95 procentai oro. nmol/L FICZ 24 valandas; mioglobino grupė, 24 valandas inkubuota su 200 μmol/L geležies mioglobinu; Mb plius FICZ grupė, inkubuota su FICZ 100 nmol/l, taikant gydymą mioglobinu; ir kontrolinė grupė, ląstelės buvo inkubuojamos tik su visa terpe kontrolinėje grupėje. Geležies mioglobinas buvo paruoštas, kaip aprašyta anksčiau.26,27 Hipoksijos/reoksigenacijos (H/R) modelyje HK-2 ląsteles suskirstėme į tris grupes. H/R grupės ląstelės buvo kultivuojamos hipoksinėmis sąlygomis (1 proc. O2, 94 proc. N2 ir 5 proc. CO2) terpėje be serumo 12 valandų, kad sukeltų hipoksiją. Tada ląstelės buvo perkeltos atgal į įprastą auginimo terpę su deguonimi 6 valandoms pakartotiniam deguoniui. Kontrolinės ląstelės buvo inkubuojamos pilnoje auginimo terpėje įprastame inkubatoriuje. FICZ (100 nmol/L) H/R ir FICZ grupėje buvo skiriamas prieš pat H/R operaciją.
Aneksino V-FITC/propidžio jodido tyrimasPritaikėme Annexin V-FITC apoptozės analizės rinkinį (AO2001- 02PH, SUNGENE). HK-2 ląstelės buvo pasėtos į šešių šulinėlių plokšteles. Po to, kai 24 valandas buvo veikiamos skirtingos terpės, prilipusios ląstelės buvo atskirtos tripsinu. Tada ląstelės buvo pakartotinai suspenduotos rišančiame buferyje ir nudažytos 5 μL aneksino V-FITC ir 5 μL propidžio jodido (kambario temperatūra, 15 minučių, vengiant tamsos). Apoptotinės ląstelės buvo identifikuotos srauto citometru.
Statistinė analizėDuomenys pateikti kaip vidurkis ± SD. Kelių grupių palyginimų statistinės vertės buvo analizuojamos naudojant vienpusį ANOVA, o porinis palyginimas atliktas SNK testu. Visos statistinės analizės buvo atliktos naudojant SPSS 21.0. P < 0,05="" buvo="" laikomas="" statistiškai="">
REZULTATAI
AhR agonistas FICZ susilpnino AKINorėdami patikrinti, ar FICZ suteikia renoprotekcinį poveikį, sukūrėme rabdomiolizės ir išemijos / reperfuzijos (I / R) sukeltus AKI modelius. Tada įvertinome inkstų funkciją ir patologinius inkstų audinių pokyčius. Nėra reikšmingų kreatinino, karbamido, CK koncentracijos serume, kepenų fermentų metabolinio aktyvumo sutrikimų.
FICZ grupėje buvo pastebėti (1A-C pav.; S3 lentelė). Kaip parodyta 1A-B paveiksluose, FICZ vartojimas reikšmingai sumažino kreatinino ir karbamido koncentracijos serume padidėjimą praėjus 24 valandoms po glicerolio injekcijos arba I/R operacijos, nedarant įtakos rabdomiolizės pelių CK lygiui serume (1C pav.). Tuo tarpu PAS dažymas parodė, kad FICZ veiksmingai sumažino patologinę žalą, kuriai būdingas vamzdelių išsiplėtimas, patinimas, liejimo formavimasis ir šepečio krašto praradimas, palyginti su abiejų modelių AKI modeliais (1D-E pav.). Imunofluorescencinis dažymas ir realaus laiko PGR rezultatai parodė, kad FICZ naudojimas žymiai sumažino sužeistųjų su neutrofilų želatinaze susijusio lipokalino (NGAL), inkstų pažeidimo biomarkerio, ekspresiją ir transkripciją.inkstus(2A-D pav.). Panašiai FICZ taip pat slopino glicerolio sukeltą mRNR lygįinkstų pažeidimas1 molekulė (KIM1) po glicerolio injekcijos (2A pav.).
Toliau ištyrėme AhR transkripciją ir ekspresijąinkstasaudinių. 3 paveiksle rt-PGR, Western blot, imunohistochemijos ir imunofluorescencinio dažymo rezultatai slopino, kad AhR mRNR ir baltymų lygis buvo žymiai sumažintas abiejose AKI modeliavimo grupėse. Intraperitoninė FICZ injekcija žymiai paskatino jo transkripciją ir ekspresiją glicerolio ir FICZ bei I/R ir FICZ grupėse. Kadangi inkstų kanalėlių epitelio ląstelės vaidina gyvybiškai svarbų vaidmenį AKI, mes išbandėme, ar AhR gali būti išreikštas kanalėlių epitelio ląstelėse. Imunochemijos rezultatai parodė, kad AhR daugiausia buvo išreikštas inkstų kanalėliuose (3C-D pav.). Be to, inkstų audinių pjūviai buvo nudažyti lektinu, proksimalinių kanalėlių epitelio ląstelių žymekliu, AhR ir DAPI branduoliams. Kaip parodyta 3E-F paveiksle, AhR susijungė su lektinu, taip parodydamas, kad AhR daugiausia ekspresuojamas proksimalinėse kanalėlių epitelio ląstelėse. Apibendrinant, FICZ apsaugojo nuo rabdomiolizės ir I/R sukeltos AKI, suaktyvindamas sužeistųjų AhR.inkstus.
FICZ sumažino priešuždegiminių citokinų gamybą AKI pelių inkstuoseNorint įvertinti, ar FICZ sugebėjo sukelti AKI sukeltą uždegimą, q-PCR buvo naudojamas priešuždegiminių faktorių transkripcijos lygiams inkstuose nustatyti. IL-1, IL-6 ir TNF-mRNR lygiai inkstų audiniuose labai padidėjo dėl glicerolio injekcijos arba I/R pažeidimo, o FICZ vartojimas žymiai sumažino šias genų transkripcijas (4A pav.). Nuosekliai, AKI modeliavimo sukeltas IL-1, IL-6 ir TNF padidėjimas buvo veiksmingai susilpnintas gydant FICZ (4B-C pav.). Šie rezultatai rodo, kad FICZ gali palengvinti inkstų uždegimą modeliuojant AKI.
FICZ sumažino ląstelių apoptozę AKI pelių inkstuoseBe uždegimo, ląstelių apoptozė yra dar vienas svarbus AKI patogenezės požymis. Mes taikėme TUNEL dažymą, kad ištirtume FICZ poveikį inkstų apoptozei I / R sukeltose pelėse. Kaip parodyta 5B paveiksle, FICZ žymiai sumažino TUNEL teigiamų ląstelių skaičiųinkstusI/R pelių. Be to,
imunohistocheminio dažymo rezultatai parodė, kad suskaldytos kaspazės -3, gyvybiškai svarbios budelio, modifikuojančios su apoptoze susijusius baltymus, ekspresija buvo žymiai sumažinta FICZ skyrus rabdomiolizės modelyje (5A pav.). Tuo tarpu FICZ galėjo sumažinti kaspazės -3 mRNR lygį tiek rabdomiolizės, tiek I/R sukeltų AKI modeliuose. Be to, Western blot rezultatai parodė, kad FICZ gali sumažinti suskaldytos kaspazės -3 ir Bax ekspresiją bei padidinti Bcl-2 lygįinkstusAKI pelių (5C pav.). Apibendrinant, šios išvados parodė, kad FICZ parodė anti-apoptotinį poveikįinkstusAKI pelių.
FICZ slopino NF-κB ir JNK signalizaciją AKI pelių inkstuose
Signalizacijos kelių aktyvavimas buvo toliau tiriamas atliekant Western blot analizę, siekiant išsiaiškinti FICZ priešuždegiminį ir antiapoptotinį mechanizmą.inkstusAKI pelių. Kaip parodyta 6 paveiksle, IκB ir P65 fosforilinimo lygiai AKI pelių inkstuose buvo akivaizdžiai didesni nei FICZ gydytų grupių. Be to, ankstesni tyrimai išaiškino, kad JNK signalizacija gali moduliuoti apoptozę ir sąveikauti su NF-κB signalizacija.29 Mes nustatėme, kad JNK fosforilinimas buvo žymiai didesnis, palyginti su atitinkamomis kontrolinėmis grupėmis, o gydymas FICZ veiksmingai jį pakeitė. Aukščiau šie rezultatai reiškė, kad NF-κB ir JNK keliai prisidėjo prie FICZ priešuždegiminio ir antiapoptozinio aktyvumo AKI pelių inkstuose.
FICZ apsaugojo HK-2 ląsteles nuo mioglobino stimuliacijos ir H/R pažeidimo slopindama uždegimą ir apoptozęĮrodėme, ar AhR aktyvinimas FICZ gali slopinti uždegimą ir apoptozę mioglobino stimuliuojamose žmogaus proksimalinių kanalėlių epitelio (HK-2) ląstelėse. Pirma, patvirtinome, kad AhR ekspresija in vitro mioglobino stimuliuojamose arba H / R pažeistose ląstelėse buvo žymiai sumažinta, o FICZ jas pakeitė (7B-D pav.). Kiekvienos mioglobino modelio grupės ląstelių apoptozės greitis buvo aptiktas srauto citometrija (7A pav.). Palyginti su kontroline grupe, FICZ grupėje nepadidėjo HK-2 ląstelių apoptozės ir nekrozės. Priešingai, po mioglobino stimuliacijos HK-2 ląstelėse buvo daug apoptozinių ląstelių, kurios sudaro 12,3 proc. Nors Mb ir FICZ grupė parodė žymiai mažiau apoptozinių ląstelių. Be to, FICZ sumažino suskaidytos kaspazės-3 ir Bax ekspresiją mioglobino stimuliuojamose arba H/R pažeistose HK-2 ląstelėse (7BD pav.). Be to, FICZ žymiai pakeitė mioglobino arba H/R sukeltą priešuždegiminių faktorių padidėjimą (7B-D pav.). Nuosekliai P65 ir JNK fosforilinimo lygiai buvo žymiai didesni po mioglobino stimuliacijos ar H/R sužalojimo, o gydymas FICZ juos veiksmingai susilpnino (7B-D pav.). Taigi šie rezultatai parodė, kad AhR agonistas FICZ apsaugojo HK-2 ląsteles nuo mioglobino ir H/R slopindamas uždegimą ir apoptozę.
DISKUSIJA
Dabartiniame tyrime nustatėme, kad FICZ AhR agonizmas gali susilpnėtiinkstų pažeidimasrabdomiolizės ir išemijos / reperfuzijos sukeltos AKI atveju. AhR daugiausia buvo proksimalinėse kanalėlių epitelio ląstelėse, o AhR agonistas FICZ galėjo apsaugoti proksimalines kanalėlių epitelio ląsteles nuo AKI, reguliuodamas uždegimą ir ląstelių apoptozę per NF-κB ir JNK signalizacijos kelius. Ankstesni tyrimai parodė, kad ureminiai toksinai, tokie kaip indoksilsulfatas, buvo AhR agonistai.30 Pacientai, sergantys CKD, buvo veikiami tais ureminiais toksinais, todėl AhR suaktyvino ir stacionarius ligonius, ir peles, sergančias CKD.25,31 Naujausi tyrimai parodė, kad endogeniniai metabolitai iš žarnyno mikrobiotos32 arba ureminis metabolizmas gali suaktyvinti AhR33,34 CKD pelių ir žiurkių inkstuose, kurių tendencijos skiriasi nuo mūsų išvadų AKI pelėms. Tačiau skirtingi AhR ligandai gali paveikti skirtingus signalų perdavimo kelius pasroviui.35 Be to, ankstesni AKI tyrimai parodė, kad leflunomidas gali suaktyvinti AhR sergant I/R sukelta AKI ir pagerinti inkstų patologinius pažeidimus, reguliuodamas imunitetą ir slopindamas uždegimą.36 MiR{{ 11}}b suaktyvino AhR slopindamas AhR represorių ir apsaugojo inkstus nuo cisplatinos sukelto pažeidimo.37 Baicalinas pagerino aristolochinės rūgšties I sukeltą poveikįinkstų pažeidimasper nuo AhR priklausomą CYP1A1/2 indukciją kepenyse.38 Mūsų rezultatai atitiko šiuos ankstesnius duomenis apie AKI. Be to, AhR agonistas FICZ darė apsauginį poveikį įvairiems ligų modeliams, tokiems kaip metabolinis sindromas, 39 autoimuninis uveitas, 22 kolitas, 23 psoriazė ir kt.
Remiantis naujausiais Huang ir kt.22 rezultatais, eksperimentinis autoimuninio uveito modeliavimas suaktyvino NF-κB ir STAT1/3 kelius ir padidino priešuždegiminių veiksnių IL-1, IL-6 ir TNF išraišką. - . Tuo tarpu ląstelių apoptozė padidėjo. Gydant AhR agonistu, buvo nustatyta sumažėjusi priešuždegiminių citokinų ekspresija ir NF-κB kelio slopinimas. AhR aktyvinimas taip pat lėmė ląstelių apoptozės slopinimą. Šie rezultatai atitiko mūsų eksperimentą. Jie taip pat nustatė, kad AhR aktyvinimas perkėlė makrofagų poliarizaciją nuo M1 link M2. Ji pasiūlė, kad AhR galėtų dalyvauti imuniniame reguliavime, o tai buvo dar vienas galimas priešuždegiminių citokinų reguliavimo paaiškinimas. Buvo keletas pranešimų apie neigiamą koreliaciją tarp AhR ir NF-κB ekspresijos RelA (P65) subvieneto įvairiose ląstelėse. Bendras imunoprecipitavimas buvo atliktas su visais Hepa1c1c7 ląstelių ekstraktais. Kadangi tiek AhR, tiek NF-κB gali įvykti nuo signalo priklausoma branduolio translokacija, o ARNT nebuvo susijęs su P65, todėl buvo manoma, kad AhR ir P65 susiejimas pirmiausia buvo citoplazminiame skyriuje. AhR ir NF-κB moduliuoja transkripcijos koaktyvatoriai. Kaip pranešta anksčiau, jų koaktyvatoriai iš dalies sutampa. Todėl galima įsivaizduoti, kad gali kilti konkurencija dėl koaktyvatoriaus prisijungimo, kad aktyvavus vieną kelią, kitas kelias bus slopinamas dėl konkurencijos dėl koaktyvatoriaus prieinamumo.41 Neigiama koreliacija vėl buvo patvirtinta epigenetikos tyrimais.42 Tuo tarpu NF -κB veikia JNK, galbūt per reaktyviąsias deguonies rūšis (ROS).29 Mitochondrijų ROS gali skatinti NF-κB aktyvaciją, o JNK prisideda prie ROS susidarymo, o tai savo ruožtu skatina JNK aktyvaciją. Nors išsamų mechanizmą reikia toliau tirti, galima daryti prielaidą, kad egzistuoja teigiama koreliacija tarp NF-κB ir JNK kelių.
CISTANCHE PAGERINS INKSTU/INKSTŲ SKAUSMĄ
Ankstesni tyrimai 43, 44 nustatė, kad rabdomiolizės ir I / R sukeltos AKI metu modeliavimo grupėse žymiai padidėjo uždegimas ir ląstelių apoptozė, tuo tarpu buvo suaktyvinti NF-κB ir JNK keliai. Šios išvados atitiko mūsų rezultatus. Pagrindiniai AKI mechanizmai buvo hipoksija, oksidacinis streso atsakas ir uždegimas. Jie gali skatinti ląstelių mirtį (apoptozę, autofagiją, nekrozę) arba audinių remodeliavimąsi. Ląstelių sužalojimas arba mirtis išleido medžiagas, turinčias su pažeidimu susijusius molekulinius modelius (DAMP) ir su patogenais susijusius molekulinius modelius (PAMP), o tai dar labiau sustiprino uždegimą.45 DAMP ir PAMP sąveika su įgimtos imuninės sistemos jutikliais taip pat sustiprino uždegiminį atsaką.46 Tuo tarpu ląstelių mirtis, įskaitant apoptozę, taip pat buvo įtraukta į AKI patogenezę. Kaspazių šeimos ekspresija yra reguliuojama, o AKI metu keičiasi daugybė su mitochondrijomis susijusių antiapoptotinių ir proapoptotinių reguliatorių.26,47,48 Kartu uždegimas ir ląstelių apoptozė skatina vienas kitą ir abu vaidina gyvybiškai svarbų vaidmenį AKI. Mes nustatėme, kad AhR aktyvinimas FICZ sumažino uždegimą ir apoptozę slopindamas NF-κB ir JNK kelius.
Tačiau dar liko keletas problemų, kurias reikia ištirti. Mūsų tyrime daugiausia buvo tiriamas FICZ AhR aktyvacijos renoprotekcinis poveikis ir galimas jo mechanizmas rabdomiolizės ir I / R sukeltos AKI atveju. Be to, prieš AKI modeliavimą pelėms naudojome profilaktiškai FICZ. Nors ankstesniuose tyrimuose vartojimo būdas buvo plačiai naudojamas,{1}} buvo neatitikimų tarp eksperimentų su gyvūnais ir klinikinės praktikos. Ateityje reikia toliau tirti, kaip AhR raiška keičiasi vystantis AKI ir, tiksliau, tarpląstelinei AhR lokalizacijai. Nors NF-κB ir JNK fosforilinimo sumažėjimas veikiant FICZ yra aiškus, reikia atlikti tolesnius atitinkamų blokuojančių medžiagų eksperimentus. Be to, norint geriau paaiškinti mechanizmą, in vivo tyrimui reikalingos AhR išmušimo ir pernelyg didelės ekspresijos pelės, o in vitro tyrimui reikalinga AhR per didelė ekspresija ir tylėjimas. Be to, reikia daug daugiau ištirti, kaip skirtingi ligandai veikia skirtingus AhR signalizacijos kelius.
