Ūmus nuo dozės priklausomas neuroprotekcinis poli(pro-17 estradiolio) poveikis stuburo sumušimo sužalojimo pelės modelyje

Anotacija

17 -Estradiolis (E2) suteikia neuroprotekcinę apsaugą ikiklinikiniuose nugaros smegenų pažeidimo modeliuose, kai vartojamas sistemiškai. Šio tyrimo tikslas buvo E2 lokaliai užtepti pažeistas nugaros smegenis, naudojant poli(pro-E2) plėvelės biomedžiagas.

Kai žmonės daugiau sužino apie nugaros smegenų pažeidimus, pradedame suprasti, kokį poveikį tai daro žmonių fizinei ir psichinei sveikatai. Nors nugaros smegenų pažeidimai gali sukelti daug neigiamų padarinių, laimei, jų poveikį atminčiai galima kontroliuoti.

Pirmiausia turime išsiaiškinti, kas yra nugaros smegenų pažeidimas. Nugaros smegenys yra stuburo apsaugotas nervas, atsakingas už nurodymų perdavimą iš smegenų į įvairias kūno dalis. Jei pažeidžiamos nugaros smegenys, kai kurios kūno dalys praranda gerą ryšį su smegenimis, todėl gali sutrikti galūnių judėjimas, jutimas ir autonominė kontrolė.

Nugaros smegenų pažeidimai gali turėti tam tikrą poveikį žmonių atminčiai, ypač ankstyvosiose pacientų, patyrusių nugaros smegenų pažeidimus, reabilitacijos stadijose. Dėl nugaros smegenų traumų gali pablogėti žmogaus dėmesys, darbinė atmintis ir emocinio apdorojimo gebėjimas, o tai turės įtakos žmogaus atminties gebėjimui.

Tačiau šis neigiamas poveikis palaipsniui mažės, kai pacientams bus taikomas reabilitacinis gydymas. Pacientai gali pagerinti savo atmintį dalyvaudami atminties žaidimuose ir kituose pažintiniuose mokymuose. Tuo pačiu metu fizinė reabilitacija taip pat padeda atkurti kūno motorines ir jutimo funkcijas, taip pagerinant emocines ir pažinimo funkcijas.

Turėtume skatinti pacientus, patyrusius nugaros smegenų pažeidimus, aktyviai dalyvauti reabilitaciniame gydyme ir atkakliai tęsti reabilitacijos treniruotes, siekiant pagerinti fizinę ir psichinę sveikatą. Prašome patikėti, kad teisingo pažinimo ir pooperacinio gydymo pagalba pacientai gali įveikti nugaros smegenų pažeidimo įtaką atminčiai ir toliau gyventi aktyvų gyvenimą. Matyti, kad turime pagerinti atmintį, o Cistanche gali žymiai pagerinti atmintį, nes Cistanche taip pat gali reguliuoti neuromediatorių pusiausvyrą, pavyzdžiui, padidinti acetilcholino ir augimo faktorių kiekį, kurie labai svarbūs atminčiai ir mokymuisi. Be to, Cistanche taip pat gali pagerinti kraujotaką ir skatinti deguonies tiekimą, o tai gali užtikrinti, kad smegenys gautų pakankamai mitybos ir energijos, taip pagerinant smegenų gyvybingumą ir ištvermę.

Norėdami pagerinti atmintį, spustelėkite žinokite papildus

Po kontūzinio nugaros smegenų pažeidimo suaugusiems pelių patinams poli(pro-E2) plėvelės buvo implantuotos subduraliai, o neuroapsauga buvo įvertinta naudojant imunohistochemiją praėjus 7 dienoms po sužalojimo ir implantacijos. Šiuose tyrimuose poli(pro-E2) plėvelės šiek tiek pagerino neuroprotekciją, nepaveikdamos uždegiminio atsako. lyginant su sužeistomis kontrolėmis.

Norint padidinti išsiskiriančią E2 dozę, buvo pagamintos boliuso atpalaiduojančios poli (pro-E2) plėvelės, į poli (proE2) plėveles įtraukiant nesurištą E2.

Tačiau, palyginti su sužeistomis kontrolinėmis grupėmis, boliusą atpalaiduojančios poli(pro-E2) plėvelės reikšmingai nepadidina neurologinės apsaugos ir neapribojo uždegimo praėjus 7 ar 21 dienai po traumos. Ateityje pagrindinis dėmesys bus skiriamas poli(pro-E2) biomedžiagų, galinčių tiksliau atpalaiduojant terapines E2 dozes.

ĮVADAS

Trauminis stuburo smegenų pažeidimas (SCI) yra sekinanti būklė, kuri kasmet Jungtinėse Valstijose paveikia daugiau nei 18,{1}} žmonių1, o pasaulinis SCI paplitimas yra nuo 236 iki 1009 milijonui žmonių.2

SCI paveikti pacientai patiria rimtų neurologinių sutrikimų, įskaitant jutimo praradimą, sutrikusią žarnyno / šlapimo pūslės funkciją ir paralyžių.3,4 Dėl pirminio poveikio nugaros smegenims pažeidimo vietoje miršta neuronai, o tai dar labiau apsunkina kelios antrinės traumos kaskados, apimančios astrocitus ir makrofagus. .

Laikui bėgant šie astrocitai sudaro glijos randą, kuris neleidžia aksonams išsiplėsti už pažeidimo krašto.5 Iki šiol nėra FDA patvirtintų neuroprotekcinių vaistų, skirtų SCI gydyti.

Keletą dešimtmečių trunkantys tyrimai buvo skirti sisteminiam biomolekulių skyrimui, siekiant išvengti neuronų praradimo dėl antrinio sužalojimo ir (arba) skatinti aksonų regeneraciją, o tai galiausiai lemia prarastos funkcijos atkūrimą. 6 Viena biomolekulė, kuri ikiklinikiniuose SCI modeliuose yra daug žadanti, yra moteriškoji lytis. lytinis hormonas, 17 -estradiolis (E2).

E2 vartojimas yra plačiai naudingas centrinei nervų sistemai, nes sumažina uždegimą, 7–9 mažina glijos ląstelių reaktyvumą, 10 riboja oksidacinį stresą, 11–14 ir mažina glutamato sukeltą eksitotoksinę neuronų mirtį.15 E2 pagerina funkcinį atsigavimą įvairiuose SCI graužikų modeliuose.10, 16,17 Įdomu tai, kad sistemingai vartojant daugkartines E2 dozes, funkcija greičiau atsistato18,19, palyginti su gyvūnais, gaunančiais tik vieną dozę.17

Kadangi E2 veiksmingiau skatina funkcinį atsigavimą taikant kelių dozių režimus, mūsų tikslas buvo stabiliai atpalaiduoti E2 vietoje sužalojimo vietos (kad būtų išvengta bet kokio pašalinio poveikio), kad būtų išvengta problemų, kylančių dėl kelių dozių / sisteminių E2 injekcijų.

Tuo tikslu mes panaudojome poli(provaisto) biomedžiagų strategiją, kurioje natūralus vaistas (E2) pirmiausia buvo funkcionalizuotas reaktyviosiomis alilo grupėmis, o po to polimerizuotas pridedant fotoinicijuoto tiolio-eno radikalo su lanksčiu oligo-(etilenglikolio) ditioliu, kaip aprašyta anksčiau. .20 Gavome didelės molekulinės masės polimero grandines, kurias sudaro E2 provaistas kaip pasikartojantis polimero vienetas.

Po hidrolizinio skaidymosi polimeras palaipsniui išskiria E2 į aplinkinę terpę. Vieninteliai kiti šalutiniai produktai yra anglies dioksidas ir oligo(etilenglikolis) (oEG) (1 pav.). Poli(pro-E2) grandinės, pagamintos į plėveles arba mikropluoštus, gali išskirti E2 nanomolinės koncentracijos in vitro laikotarpiu nuo mėnesių iki metų. .20

Iš šių poli(pro-E2) pastolių išsiskiriantis E2 yra biologiškai aktyvus, o šie pastoliai skatina neurotrofizmą ir neuroapsaugą in vitro, apsaugodami neuronus nuo vandenilio peroksido sukelto oksidacinio streso. Čia mes pritaikėme poli (pro-E2) plėveles sumušimo SCI pelių modelyje, iškart po sužalojimo, ir įvertinome jų neuroprotekcinį gebėjimą in vivo .

Mūsų pradinis poli(pro-E2) plėvelės dizainas ūmiai padidino neuroprotekciją (7 dienas po sužalojimo) traumos vietoje, nepaveikdamas uždegiminio atsako. Kadangi poli (pro-E2) plėvelės išskiria nanogramus E2 per dieną, sukūrėme kitą išleidimo strategiją, pagal kurią nesurištas E2 buvo įtrauktas į poli (pro-E2) matricą. Iškėlėme hipotezę, kad nesurišto E2 boliuso išleidimas gali suteikti papildomos neuroprotekcinės naudos.

Poli(pro-E2) plėvelės išskiria E2 sprogimo būdu, po to nuolatinis E2 išsiskyrimas iš polimero esant mažesnei koncentracijai. Imunohistologinio dažymo metu buvo įvertinti neuronai, astrocitai ir makrofagai / mikroglijos, esantys pažeidimo vietoje ūmiai (7 dienos po sužalojimo) ir chroniškai (21 diena po sužalojimo) po SCI, esant šioms boliusą atpalaiduojančioms poli (pro-E2) plėvelėms.

REZULTATAI IR DISKUSIJA

Poli(pro-E2) plėvelės atpalaiduoja E2 esant nanomolinėms koncentracijoms, skatina neuronų išaugimą iš nugaros šaknies ganglijos ir apsaugo neuronus nuo vandenilio peroksido sukelto oksidacinio streso in vitro.20 Čia pateiktame tyrime siekiama nustatyti poli(pro-E2) gebėjimą plėvelės, užtikrinančios neuroprotekciją in vivo, naudojant pelių kontūzijos SCI modelį.

Suaugusiems pelių patinams buvo sukeltas vidutinio sunkumo kontūzijos SCI, o iškart po sužalojimo poli (pro-E2) plėvelės buvo dedamos tiesiai virš sužalojimo (2A pav.). Siekiant užtikrinti, kad poli (pro-E2) plėvelės liktų savo vietoje po implantacijos, poli (pro-E2) plėvelės, pakrautos rodamino B, buvo implantuotos į sužeistų gyvūnų nugaros smegenis. Praėjus septynioms dienoms po implantacijos, nugaros smegenys buvo surinktos ir pavaizduotos naudojant šviesos mikroskopą (2B pav.). Visiems gyvūnams implantuotos rodamino B pakrautos poli (pro-E2) plėvelės liko vietoje, patvirtindamos implantavimo protokolą.

Norint išbandyti poli (pro-E2) plėvelių gebėjimą apsaugoti nuo neuronų ir sušvelninti uždegimą, po stuburo sumušimo traumos buvo implantuotos poli (pro-E2) plėvelės (be rodamino B), o nugaros smegenys buvo surinktos praėjus 7 dienoms po sužalojimo ir implantacijos. Išilginės pjūviai (10 μm storio) buvo nupjauti, sutelkti aplink traumos epicentrą ir paženklinti imuniniu ženklu, kad būtų galima vizualizuoti nugaros smegenų neuronus ir makrofagus (3 pav.).

Sekcijos buvo pažymėtos NeuN, kad būtų galima įvertinti neuronų buvimą, o kiekybinė dažymo analizė atskleidė, kad poli(pro-E2) plėvelės žymiai padidino NeuN teigiamą plotą aplink traumos epicentrą, palyginti su sužeista kontrolė, kuriai nebuvo implantuoti plėvelės (3A pav.; p).=0.0002). Papildomas aksonų dažymas naudojant NFH (neurofilamentinė sunkioji grandinė) taip pat atskleidė ūmų neuroprotekcinį implantuotų poli(pro-E2) plėvelių poveikį (3B pav.; p=0.0017).

Pastebėjome, kad šis neuroprotekcijos pokytis nebuvo susijęs su apoptozės (3 kaspazės) pakitimu pažeidimo vietoje (pagal S1 paveikslą; p=0.9966). Aktyvuotų makrofagų (CD68) dažymas taip pat neatskleidė jokių reikšmingi skirtumai tarp poli(pro-E2) plėvele apdorotų gyvūnų ir negydytų gyvūnų (3C pav.; p= 0.7207).

Apibendrinant, poli(pro-E2) plėvelės nežymiai padidina neuroprotekciją, nepakeisdamos uždegiminio atsako. Poli(pro-E2) plėvelės ūmiai padidino neuronų tankį beveik 20 %, tačiau plėvelės neturėjo akivaizdaus priešuždegiminio poveikio (remiantis kiekybiniu aktyvuotų makrofagų užimamas plotas) (3 pav.).

Šis uždegimo sumažėjimas gali reikšti, kad priešuždegiminės ir neuroprotekcinės E2 dozės yra skirtingos ir tai nebuvo pasiekta naudojant dabartinę plėvelės formulę.20 Iškėlėme hipotezę, kad didėjantis E2 išsiskyrimas iš poli(pro-E2) plėvelių gali sumažinti uždegimą. ir įgalina stipresnį neuroprotekcinį atsaką.

Siekiant padidinti ūmiai išsiskiriančio E2 dozę, poli(pro-E2) plėvelės buvo modifikuotos taip, kad boliusas E2 atsiskirtų iškart po implantacijos. Išleidus E2 boliusu, polimeras suirtų ir išsiskirtų E2, esant tokiai pačiai koncentracijai kaip ir anksčiau. Aukščiau aprašytas eksperimentas buvo pakartotas naudojant šias boliusą atpalaiduojančias poli (pro-E2) plėveles, o neuroprotekcija ir uždegimas buvo įvertinti praėjus 7 dienoms po sužalojimo (dpi).

Tačiau vietoj papildomos naudos boliusą atpalaiduojančios poli(pro-E2) plėvelės reikšmingai nepadidino NeuN teigiamo ploto, palyginti su sužeistomis, negydytomis kontrolinėmis grupėmis (4A pav.; p=0.6770). Boliusą atpalaiduojančios poli(proE2) plėvelės padidino CD68 raišką, tačiau padidėjimas statistiškai nesiskyrė (p= 0.1780).

Didėjančios glijos reaktyvumo ir mikroglijos uždegimo tendencijos taip pat buvo stebimos esant boliusą atpalaiduojančioms poli(pro-E2) plėvelėms dėl padidėjusios GFAP (astrocitų) ir Iba1 (mikroglijos) ekspresijos; tačiau šis padidėjimas statistiškai nebuvo didesnis nei buvo pastebėtas sužeistųjų, negydytų kontrolinių grupių (atitinkamai p=0.3233 ir p=0.3053). Apibendrinant, boliusą atpalaiduojančios poli(pro-E2) plėvelės nepadidina neuroprotekcijos, o astrocitų reaktyvumas ir makrofagų/mikroglijų buvimas nesumažėjo, kaip buvo manyta iš pradžių.

Kadangi skirtumų tarp sužalotų, negydytų gyvūnų ir sužeistų, boliusą atpalaiduojančių poli(proE2) plėvele gydytų gyvūnų ūminiu 7 dpi laiko tašku nepastebėta, tolesniam tyrimui buvo pasirinktas lėtinis laikas, nes poli(pro-E2) plėvelė Aukščiau aprašytas eksperimentas buvo pakartotas su boliusą atpalaiduojančiomis poli(pro-E2) plėvelėmis, tačiau gyvūnai buvo vertinami chroniškai esant 21 dpi (5 pav.).

Nugaros smegenys buvo paženklintos tiems patiems ląstelių tipams, nurodytiems anksčiau. Atlikus analizę, pastebėta, kad boliusą atpalaiduojančių poli(pro-E2) plėvele implantuotų gyvūnų NeuN ploto dalis, palyginti su sužalotais, negydytais gyvūnais, didėjo (5A pav.; p=0.0897) .Be to, buvo pastebėtos tendencijos, kai boliusą atpalaiduojančios poli(pro-E2) plėvelės sumažino CD68 ir GFAP ekspresijos ploto dalį, palyginti su duomenimis, gautais iš negydytų, sužalotų gyvūnų kontrolinių grupių (5B pav., C; p=0.0859 ir p=0.2780).

Tačiau nė viena iš šių tendencijų statistiškai nesiskyrė. Kita vertus, Iba1 pažymėtos audinių dalys, gautos iš boliusą atpalaiduojančių poli(pro-E2) gydytų gyvūnų, parodė didesnę ekspresiją, palyginti su duomenimis iš negydytų, sužeistų kontrolinių gyvūnų (p < 0,0001). Ankstesnis mūsų darbas rodo, kad poli(pro) -E2) plėvelės, išlietos ant 15 mm × 15 mm dengiamųjų stiklelių, išskiria apie 266 ng E2 per dieną20, o tai reiškia apie 2 ng E2 per dieną iš čia naudojamų plėvelių (1 mm × 1,8 mm). Boliusą atpalaiduojančios poli(pro-E2) plėvelės po implantacijos ūmiai išskiria dar 40 ug nesurišto E2.

Tyrimai, skirti E2 naudojimui graužikų SCI modeliuose, rodo, kad mažos estrogeno dozės (10 ug/kg), vartojamos į veną, susilpnina reaktyviąją gliozę ir užtikrina neuroprotekcinę apsaugą, tuo pačiu slopindamos uždegiminius reiškinius, slopindamos apoptozę ir didindamos angiogenezę.21 Priešingai, didelės sisteminės estrogeno dozės neigiamas poveikis, įskaitant padidėjusį giliųjų venų trombozės ir vėžio skaičių22,23 ir moteriškų fizinių savybių vystymąsi vyrams. Tai verta dėmesio, nes dauguma E2 tyrimų buvo skirti sisteminiam E2 tiekimui į veną arba į pilvaplėvės ertmę.

Atsižvelgiant į saugumo susirūpinimą dėl sisteminio didelių E2 dozių vartojimo, svarbu optimizuoti E2 koncentraciją vietiniam tiekimui į pažeistas nugaros smegenis, kad būtų išvengta šalutinio poveikio. Iki šiol tik viename tyrime E2 buvo gauta iš biomedžiagos, naudojant nanodaleles, kad būtų galima tiksliai tiekti E2 (2,5 ug arba 25 ug). Išsiskyrimas iš nanodalelių greitai sumažino uždegimą ūmiai naudojant žiurkės sumušimo SCI modelį.9 Mūsų duomenų statistiškai reikšmingo atsako nebuvimas (4 ir 5 paveikslai) gali būti dėl E2 kiekio disbalanso, kurį lokaliai tiekiame į nugaros smegenis. per daug E2 (40 ug) išsiskiria ūmiai, o labai mažai (2 ng) išsiskiria chroniškai.

Nors tai, ką mes stebime iš šių duomenų, yra nedidelės tendencijos, šis tyrimas pabrėžia E2 dozavimo svarbą skatinant neuroprotekciją in vivo. Pradinės E2 dozės sumažinimas ir poli(pro-E2) biomedžiagos skilimo kinetikos koregavimas galėtų padėti sumažinti šią problemą ir galbūt užtikrinti geresnius neuroprotekcinius rezultatus.

Nors šis tyrimas buvo atliktas tik su vyrais, labai svarbu įvertinti šių poli(pro-E2) plėvelių poveikį abiem lytims, kad būtų nustatytas tinkamas šios biomedžiagos transliacijos potencialas. Tyrimai parodė, kad po SCI padidėjusį estrogenų kiekį patelėse gali iš dalies lemti geresni jų funkciniai rezultatai, palyginti su vyrais.24 Kadangi moterų estrogenų kiekis yra didesnis, bet kokia biomedžiagos strategija, naudojanti estrogenus, turi atsižvelgti į šį padidėjusį lygį ir modifikuoti medžiagą. Atitinkamai išlaisvinkite kinetiką, kad būtų užtikrinta, jog tiekiama dozė vyrams ir patelėms išliktų tokia pati.

METODAI

Poli(pro-E2) plėvelių gamyba.

Poli(pro-E2) polimeras P1 buvo susintetintas ir apibūdintas taip, kaip išsamiai aprašyta anksčiau.20 Pagal gelinio pralaidumo chromatografiją (GPC) polimero vidutinė molekulinė masė yra MW ~ 80 kDa, o dispersija yra Đ ~ 3. Poli(pro-E2) plėvelės buvo pagamintos ištirpinant polimerą chloroforme (5 masės %/masė; polimeras/chloroformas), tirpalą lašinant ant 15 mm × 15 mm stiklinių dengiamųjų stiklelių (100 μl tirpalo viename dengiamajame stiklelyje) ir paliekant juos. išdžiovinti per naktį vakuume (<100 mTorr) at room temperature (RT). In a subset of experiments, the polymer solution was supplemented with rhodamine B (0.005 wt %/wt; rhodamine B/chloroform) (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) to verify the presence of the poly(pro-E2) films in animals post-implantation.
Norint sukurti poli(pro-E2) plėveles su nesurištu E2, plėvelės buvo pagamintos pridedant nesurišto E2 (Abcam, Cambridge, MA) į polimero tirpalą (0,0625 masės %/masė; E2/chloroformas) prieš liejimą lašais. tirpalo ant dengiamųjų stiklelių. Prieš implantavimą dengiamieji stikleliai su plėvele buvo sterilizuojami naudojant ultravioletinę (UV) spinduliuotę 30 min., o plėvelės nulupamos nuo dengiamųjų stiklelių sterilioje biologinės saugos spintelėje. Po to poli (pro-E2) plėvelės buvo supjaustytos į 1 mm × 1, 8 mm gabalus, tinkančius implantuoti suaugusiai pelei, kaip aprašyta toliau.

Nugaros smegenų sumušimas ir poli(pro-E2) plėvelių implantacija.

Visos chirurginės ir pooperacinės priežiūros procedūros buvo patvirtintos Rensselaer PolytechnicInstitute ir Ohajo valstijos universiteto institucinių gyvūnų priežiūros ir naudojimo komitetų (IACUC). Norint sukelti sumušimą SCI, suaugę C57BL/6 pelių patinai (nuo 10- iki 12-sav.), įsigyti iš Jackson Laboratory (atsargos Nr. 000664; Bar Harbor, ME), buvo anestezuoti intraperitonine injekcija. ketamino (80 mg/kg) ir ksilazino (10 mg/kg). Gyvūnų nugarinės dalys buvo nuskustos ir aseptiškai paruoštos naudojant 70% etanolį ir betadiną.

Gyvūną uždėjus ant kaitinimo pagalvėlės, palaikomos 37 laipsnių kampu, odos ir raumenų sluoksniai buvo atidaryti, kad būtų atskleistas stuburas, o krūtinės ląstos devintojo (T9) slankstelio nugarinė laminektomija buvo atlikta siekiant atskleisti nugaros smegenis. Vidutinis (75 kdyn) sumušimas SCI buvo sukeltas šiame lygyje naudojant „Infinite Horizons“ smogtuvą (Precision Systems andInstrumentation, Lexington, KY).

Pasiekus hemostazę, kietakūnis buvo atidarytas (2 pav.) ir po kietakūniu bei virš nugaros smegenų uždėta poli(pro-E2) plėvelė arba boliusą atpalaiduojanti poli(pro-E2) plėvelė (1 mm × 1,8 mm). traumos vieta. Kontroliniams gyvūnams dura buvo atidaryta, bet poli(pro-E2) plėvelės nebuvo implantuotos. Raumenų sluoksniai buvo uždaromi naudojant sterilius siūlus, o oda buvo uždaryta naudojant sterilius metalinius žaizdų spaustukus.

Pelėms buvo sušvirkšta po oda 2 ml sterilaus fiziologinio tirpalo, jos buvo grąžintos į narvus ir per naktį dedamos ant stiklelio šildytuvo, nustatyto iki 37 laipsnių. Siekiant užtikrinti tinkamą hidrataciją ir užkirsti kelią infekcijoms, pirmąsias 5 dienas po sužalojimo (dpi) pelėms buvo švirkščiama po oda 1–2 ml sterilaus fiziologinio tirpalo ir Gentocin (1 mg/kg) kasdien. Eksperimentų metu šlapimo pūslės buvo rankiniu būdu ekspresuojamos du kartus per dieną. Visi gyvūnai buvo laikomi įprastomis sąlygomis 12-valandos šviesos-tamsos ciklu, ad libitum prieiga prie maisto ir vandens.

Audinių surinkimas.

Nurodytais galutiniais 7 arba 21 dpi laiko taškais pelėms buvo sušvirkšta mirtina ketamino/ksilazino dozė (1,5x chirurginė dozė) ir transkardiališkai perfuzuojama 0.1 M fosfatu buferiniu fiziologiniu tirpalu (PBS; pH 7,4). po to 4% paraformaldehido (PFA; pH 7,4). Nugaros smegenys buvo pašalintos, 2 valandas fiksuotos 4% PFA ir per naktį perkeltos į 0.2M fosfatinį buferį (PB; pH 7,4).

Nugaros smegenys buvo apsaugotos nuo šalčio 30% sacharoze 48 valandas 4 laipsnių kampu, o po to blokuojamos į 10 mm segmentus, esančius aplink traumos vietą, nugaros stulpeliais į viršų. Šios sekcijos buvo įterptos į optimalios pjovimo temperatūros terpę „Tissue-Tek“ (VWR International, Radnor, PA) ir greitai užšaldytos ant sauso ledo. Visos nugaros smegenys buvo perpjautos 10 μm pjūviais ant Microm HM505E kriostato, uždėtos ant „ColorFrost Plus“ stiklelių (The ScientermoFisher). Waltham, MA), o po to laikomas –20 laipsnių temperatūroje, kol bus naudojamas imuniniam dažymui.

Imunohistochemija ir kiekybinis įvertinimas.

Objektyvai buvo atšildyti stiklelių šildytuvu 1 val., o po to 3 kartus skalauti 0,1 MPBS. Endogeninės peroksidazės aktyvumas buvo sustabdytas 15 minučių kambario temperatūroje inkubuojant stiklelius 6% H2O2, praskiestame metanolyje. Po 3 kartų plovimo 0,1 M PBS, sekcijos buvo inkubuojamos su 4 % BSA ir 0,1 % Triton X-100 0,1 M PBS 1 h, po to pirminių antikūnų inkubavimas per naktį 4 laipsnių arba RT (1 lentelė).

Skaidrės buvo inkubuojamos su atitinkamais biotiniluotais antriniais antikūnais (1:1000; Vector Laboratories, Burlingame, CA) 1 valandą kambario temperatūroje. Norėdami vizualizuoti surištą antikūną, stikleliai buvo inkubuojami su Vectastain Elite-ABC (Vector Laboratories) 1 valandą ir 10 minučių buvo sukurti su ImmPACT3, 3′-diaminobenzidinu (DAB) arba Vector SG substratu (Vector Laboratories).

Šios sekcijos buvo dehidratuotos per nuoseklias 2 × 2 min inkubacijas 70% ir 90% etanolyje, 2 × 3 min. 100% etanolyje, po to 3 × 3 min. Histoclear ir galiausiai uždengtos „Permount“ („ThermoFisher Scientific“). Kiekybinei analizei buvo naudojamos šešios kiekvieno gyvūno sekcijos, išdėstytos 100 μm atstumu nuo sužeistų nugaros smegenų.

Imunitetu pažymėtos sekcijos buvo vaizduojamos naudojant Axioplan 2 vaizdo mikroskopą su AxioCamdigital kamera ir AxioVision 4.8.2 versijos programine įranga (Carl Zeiss Microscopy GmbH, Jena, Vokietija) ir 5 × objektyvu.

Teigiamų pikselių skaičius kiekvienoje sekcijoje buvo skaičiuojamas naudojant MIPAR vaizdo analizės programinę įrangą (MIPAR, Worthington, OH), kad būtų galima apskaičiuoti procentinę teigiamo ploto dalį vienoje pjūvyje. Kiekvienai dėmei buvo apskaičiuotas vidutinis procentas teigiamas šešių sekcijų plotas vienam gyvūnui ir apie jį pranešta.

Statistinė analizė.

Visi duomenys pateikiami kaip vidurkis ± standartinis nuokrypis. Statistinė analizė buvo atlikta naudojant GraphPad Prism 9 Statistical Software (GraphPad Software, San Diego, CA). Visuose eksperimentuose vienoje grupėje buvo naudojami 5–6 gyvūnai, kilę iš mažiausiai dviejų skirtingų gyvūnų partijų. Norint patikrinti skirtumus tarp kontrolinės ir poli(pro-E2) plėvelės grupių, buvo naudojamas Studento t testas (3, 4 ir 5 pav.). Reikšmė nustatyta ties p Mažiau arba lygi 0.05.

Papildoma medžiaga

Norėdami gauti papildomos medžiagos, žr. žiniatinklio versiją PubMed Central.

PADĖKA

Autoriai dėkoja Wenmin Lai už pagalbą atliekant pelių operacijas.

Finansavimas

Šį darbą parėmė Craigo H. Neilseno fondo stipendija (stipendija 468116) ir paralyžiuotų Amerikos veteranų tyrimų fondo stipendija (Stipendija 3171) MKG ir NIH R01 (Stipendija NS092754) ir Niujorko valstijos nugaros smegenų pažeidimo peržiūros tarybos institucinė parama C3224G5. Visas darbas su gyvūnais buvo atliktas padedant Ohajo valstijos universiteto Neurologijos departamento Chirurginės šerdies, remiamos NINDS Grant P30NS104177.

NUORODOS

(1). Nacionalinis nugaros smegenų traumų statistikos centras. (2020) Nugaros smegenų pažeidimo faktai ir skaičiai trumpai, Alabamos universitetas Birmingeme, Birmingemas, AL.

(2). Cripps RA, Lee BB, Wing P, Weerts E, MacKay J ir Brown D (2011) Visuotinis trauminio nugaros smegenų pažeidimo epidemiologijos žemėlapis: sužalojimų prevencijos gyvų duomenų saugyklos link. Nugaros smegenys. 49, 493–501. [Pubmed: 21102572]

(3). Donovan WH (2007) Nugaros smegenų pažeidimas – praeitis, dabartis ir ateitis. Journal of Spinal CordMedicine 30, 85–100.

(4). Pickelsimer E, Shiroma EJ ir Wilson DA (2010 m.) Viso valstijos medicininės priežiūros pacientų, turinčių nugaros smegenų pažeidimą, nepalankių sveikatos būklių tyrimas. J. Spinal Cord Med. 33 (3), 221–231. [PubMed: 20737795]

(5). Silver J ir Miller JH (2004 m.) Regeneracija po gliaulinio rando. Nat. Kunigas Neurosci. 5 (2), 146–156. [Pubmed: 14735117]

(6). Varma AK, Das A, Wallace G, Barry J, Vertegel AA, Ray SK, and Banik NL (2013) Spinal Cord Injury: A Current Therapy, Future Treatments and Basic Science Frontiers apžvalga.Neurochem. Res. 38, 895–905. [PubMed: 23462880]

(7). Zendedel A, Mönnink F, Hassanzadeh G, Zaminy A, Ansar MM, Habib P, Slowik A, Kipp M ir Beyer C (2018) Estrogenas silpnina vietinę uždegiminę išraišką ir aktyvavimą po nugaros smegenų pažeidimo. Mol. Neurobiol. 55 (2), 1364–1375. [Pubmed: 28127698]

(8). Lee JY, Choi HY, Ju BG ir Yune TY (2018) Estrogenai malšina neuropatinį skausmą, sukeltą po nugaros smegenų pažeidimo, slopindami mikrogliją ir astrocitų aktyvaciją. Biochim. Biofizė. Acta, Mol. Pagrindas Dis. 1864 (7), 2472–2480. [Pubmed: 29653184]

(9). Cox A, Varma A, Barry J, Vertegel A ir Banik N (2015) Nanodalelių estrogenas žiurkės nugaros smegenų pažeidime sukelia greitą priešuždegiminį poveikį plazmoje, smegenų skystyje ir audiniuose.J. Neurotrauma 32 (18), 1413–1421. [PubMed: 25845398]

(10). Sribnick EA, Samantaray S, Das A, Smith J, Matzelle DD, Ray SK ir Banik NL (2010) Lėtinio nugaros smegenų pažeidimo gydymas po traumų estrogenais pagerina žiurkių judėjimo funkciją. J. Neurosci. Res. 88 (8), 1738–1750. [Pubmed: 20091771]

(11). Honda K, Shimohama S, Sawada H, Kihara T, Nakamizo T, Shibasaki H ir Akaike A (2001) Negenominis antiapopotinis signalo perdavimas estrogenu auginamuose žievės neuronuose. J.Neurosci. Res. 64 (5), 466–475. [Pubmed: 11391701]

(12). Sribnick EA, Wingrave JM, Matzelle DD, Ray SK ir Banik NL (2003) Estrogenas kaip neuroprotekcinis agentas gydant nugaros smegenų pažeidimus. Ann. NY Akad. Sci. 993 125–133. [Pubmed: 12853305]

For more information:1950477648nn@gmail.com