Įgimta patogenų aptikimo strategija, apimanti bakterijų paviršiaus baltymų ubikvitinaciją, 2 dalis

DISKUSIJA

Metazoanai naudoja ubikvitinaciją kaip universalų mechanizmą citozolinei homeostazei palaikyti, užkertant kelią pažeistų baltymų / organelių kaupimuisi ir apsisaugodami nuo įsibrovėlių patogenų (40, 41). Atsižvelgiant į patogenų įvairovę ir įvairius pažeistų baltymų rinkinius, bendrų substrato atpažinimo ir vėlesnės ubikvitinacijos motyvų nustatymas yra protinga išteklių optimizavimo strategija. Proteolizei skirti baltymai eukariotinėse ląstelėse paprastai identifikuojami pagal trišalį degrono motyvą (24).

Imunitetas – tai organizmo gebėjimas kovoti su ligomis, įskaitant atsaką į bakterijas, virusus ir kitas kenksmingas medžiagas. Jei organizmo imuninė sistema bus pažeista, ji nebus pakankamai stipri susidoroti su užpuolusiomis ligomis. Tyrimai parodė, kad netinkama mityba turi įtakos imuninės sistemos veiklai, todėl organizmas tampa jautresnis infekcijoms ir ligoms. Baltymai yra viena iš svarbių medžiagų imunitetui palaikyti.

Baltymai yra pagaminti iš amino rūgščių, kai kurios iš jų vadinamos nepakeičiamomis aminorūgštimis, nes jų turi gauti maistas, o organizmas negali jų sintetinti. Šios nepakeičiamos aminorūgštys yra triptofanas, leucinas, fenilalaninas, lizinas, izoleucinas, metioninas, valinas ir histidinas. Jei organizmas negauna pakankamai nepakeičiamų aminorūgščių, gali sutrikti baltymų apykaita, o tai gali turėti įtakos imuninės sistemos veiklai.

Be to, aukštos kokybės baltymų vartojimas padeda palaikyti normalią imuninę sistemą ir kūno funkcijas. Kai organizmui trūksta baltymų, gali susilpnėti imuninė sistema ir organizmas tampa jautresnis ligoms. Jei žmogaus organizmui ilgą laiką trūksta baltymų, tai gali sukelti ilgalaikius imuninės sistemos pažeidimus, todėl žmonės tampa imlūs įvairioms ligoms.

Todėl subalansuota mityba ir tinkama mankšta yra raktas į baltymų suvartojimą. Žmonės gali patenkinti savo organizmo baltymų poreikius valgydami daugiau baltymų turinčio maisto, pavyzdžiui, mėsos, paukštienos, žuvies, pupelių, kiaušinių, pieno produktų, grūdų, riešutų ir sėklų. Be to, vidutinio sunkumo mankšta taip pat gali padidinti organizmo baltymų poreikį ir pasisavinimo efektyvumą. Subalansuota ir įvairi mityba bei sveikas gyvenimo būdas yra raktas į imuniteto palaikymą, sveiko ir stabilaus organizmo būklę bei atsparumą ligoms. Šiuo požiūriu turime stiprinti savo imunitetą. Cistanche gali žymiai pagerinti imunitetą, nes mėsoje esantys polisacharidai gali reguliuoti žmogaus imuninės sistemos imuninį atsaką, pagerinti imuninių ląstelių atsparumą stresui ir sustiprinti imuninių ląstelių imunitetą. Baktericidinis poveikis.

Spustelėkite cistanche deserticola papildą

Tai paskatino mus ištirti, ar panašių motyvų galima rasti patogenų paviršiuose, kur jie gali veikti kaip substrato atpažinimo tarpinis serveris. Čia parodome, kad šeimininko ubikvitino ligazės naudoja panašius molekulinius parašus, kad suvoktų filogenetiškai skirtingus patogenus. Patogeno atpažinimas naudojant bendrus molekulinius modelius / motyvus (PAMP) yra gerai apibūdintas įgimto imuniteto bruožas (42). Mūsų rezultatai rodo, kad į degroną panašios sekos bakterijų paviršiaus baltymuose veikia lygiaverčiai PAMP, kad būtų galima stebėti tarpląstelinį patogeną. Šį moduso operandą šeimininkas galėtų toliau panaudoti mikrobinių baltymų antigenams pristatyti pagrindiniame histokompatibilumo komplekse I, kad sukeltų stiprų CD8 atsaką, nukreiptą prieš tarpląstelinius patogenus.

Potenciali ubikvitino sukelto patogenų aptikimo svarba šeimininko apsaugai dar labiau pabrėžiama reikšminga likutinė ubikvitinacija, aptikta mutantiniame SPN, kuriame trūksta ir BgaA, ir PspA. Tai rodo, kad yra ir kitų neatpažintų ubikvitino mechanizmų substratų, o dėl to atsirandantis perteklius užtikrina tvirtą patogeno perėmimą. Pažymėtina, kad kai kurie neatidėliotini klausimai apie degrono motyvą ir jo svarbą bakterijoms (išskyrus atpažįstamą vienetą) suteikia įdomų evoliucinį kampą.

Degrono motyvas yra nepakeičiamas in vivo, ir, jei kas, motyvo mutavimas arba ištrynimas pagerino tarpląstelinį patvarumą, todėl padidėjo virulentiškumas. Tai patvirtina mūsų rezultatai, kad patogenai gali panaudoti degrono motyvo mutaciją, kad išvengtų ubikvitino sukelto atpažinimo, kaip matyti iš SPN 19F serotipo. Tačiau konservatyvus degrono motyvo pobūdis BgaA daugelyje SPN serotipų gali reikšti, kad bakterijos pasirinko priešingą strategiją, kad būtų mažiau mirtina šeimininkui.

Tai galėtų suteikti galimybę patogenui padidinti savo gyvenamąsias buveines. Tuo pačiu metu bakterijų paviršiaus arba išskiriamų baltymų ubikvitinacija degrono motyve gali juos funkciškai moduliuoti, kad sušvelnintų arba pakeistų šeimininko atsaką, kad būtų galima gauti naudos (43). Todėl į eukariotus panašių funkcinių domenų ar motyvų (pvz., degronų) buvimas ar nebuvimas gali priklausyti nuo patogeninės nišos ir pritaikytas išvengti arba modifikuoti šeimininko imuninį atsaką.

Panašus patogeno jutimo mechanizmas, apimantis guanilatą surišančius baltymus, taip pat buvo susijęs su bakterijų klirensu; Tačiau, skirtingai nuo ubikvitinacijos, pranešama, kad jų vaidmuo apsiriboja gramneigiamais patogenais (44–47). Ubikvitinacija nukreipta į patogeną, neatsižvelgiant į gramo kilmę, pavyzdžiui, buvo dokumentuota, kad RNF213 nukreiptas į Listeria spp. nepaisant LPS nebuvimo (48). Todėl mes nepašaliname galimybės, kad jis gali turėti antimikrobinį poveikį ir SPN.

Patogeninis paviršius gali būti ubikvitinuojamas su keliais grandinės tipais skirtingomis E3 ligazėmis ir tarpgrandinėmis sąveikomis (41). Visų pirma, Mtb atveju buvo įrodyta, kad Smurf1 ir Parkin sudaro K48 ir K63 grandinių tipus, kurie veikia sinergiškai ir skaido patogeną (12). Vis dar nepakankamai ištirtas K48 ubikvitinacijos ir E3 ligazių, dalyvaujančių infekcijos scenarijus, mechaninio vaidmens supratimas. STm atveju buvo pavaizduota viena E3 ligazė ARIH1, nukreipianti citozolinį STm su K48 ubikvitino grandinėmis, dėl kurių jie pašalinami iš sistemos (15). Remiantis mūsų ir kitų išvadomis, K48-Ub žymėti patogenai galiausiai suyra ir yra susiję su proteasomų mechanizmais.

Tačiau šis tyrimas rodo specifinių bakterijų paviršiaus baltymų K48-Ub dekoravimą. Yra žinoma, kad kai kurie patogenai aktyviai modifikuoja savo paviršiaus baltymus, apsaugodami juos nuo ubikvitinacijos ir vėlesnio žudymo, taip pabrėždami ubikvitino substrato paviršiaus lokalizacijos reikšmę (10). Be to, daugelis privalomų tarpląstelinių patogenų sukūrė strategijas, kaip deubikvitinuoti save arba šeimininko reguliavimo komponentus, kad būtų išvengta ubikvitino sukelto klirenso (5). Kartu šios išvados pabrėžia ubikvitino sukelto pavojaus sužadinimo, kaip pagrindinio tarpląstelinio patogeno jutimo mechanizmo, pagrindinio šeimininko gynybos mechanizmo, svarbą.

Mūsų tyrimas taip pat parodė pagrindinį SCF E3 ligazės vaidmenį, ypač su FBXW7, bakterijų ubikvitinacijoje, didinant patogeno skaidymą. Heterozigotinės mutacijos FBXW7, ypač R505C (kritinis likutis substrato atpažinimo kišenėje) variantas, sukelia daugybines karcinomas ir limfocitinę leukemiją žmonėms (49, 50). Neseniai atliktas kohortos tyrimas parodė, kad beveik 43 procentai pacientų, sergančių lėtine limfocitine leukemija (LLL), miršta nuo bakterinės pneumonijos ir sepsio, o vėliau – grybelinės infekcijos (51).

Tai patvirtina mūsų pastebėjimą apie FBXW7 mutaciją turinčių ląstelių šeimininkų gebėjimą pajusti ir pašalinti patogenus. Todėl mūsų išvados pateikia netikėtą molekulinį paaiškinimą apie padidėjusią infekcijų riziką pacientams, sergantiems LLL. Ryšį tarp E3 ligazės genų genetinio polimorfizmo ir jautrumo bakterinėms infekcijoms taip pat patvirtina Parkinsono liga sergantys pacientai, kurie yra pažeidžiami vidurių šiltinės ar raupsų (14), o tai rodo, kad E3 ligazės reikšmingai prisideda prie šeimininko imuniteto nuo bakterinių infekcijų ir palaikymo. ląstelių pastovios būsenos.

Apibendrinant, mes iššifravome universalią citozoliuose gyvenančių patogenų jutimo kalbą, kurią šeimininkas galėtų efektyviai pritaikyti, kad atpažintų mikroorganizmus, kad vėliau juos pašalintų. Visi šie atradimai parodo elementarių ląstelių imuninių procesų supratimą, kurie gali būti panaudoti stiprinant antibakterinį imunitetą.

MEDŽIAGOS IR METODAI

Ląstelių kultūros

Tiek žmogaus plaučių alveolinės karcinomos (II tipo pneumocitų) ląstelių linija A549 [American Type Culture Collection (ATCC) Nr. CCL185)] ir gimdos kaklelio adenokarcinomos ląstelių linija HeLa (ATCC Nr. CRM-CCL-2) buvo kultivuoti Dulbecco modifikuotoje Eagle terpėje (DMEM; HiMedia), papildytoje 10 procentų galvijų vaisiaus serumo (Gibco) 37 laipsnių ir 5 laipsnių kampu. procentų CO2.

Bakterijų padermės ir augimo sąlygos

SPN (R6, 2 serotipas, dovana Tim J. Mitchell, Birmingemo universitetas, Jungtinė Karalystė) buvo auginamas Todd-Hewitt sultinyje, papildytame 1,5 procento mielių ekstraktu 37 laipsnių temperatūroje, 5 procentų CO2. Jei reikia, SPN kultūroms auginti buvo naudojami šie antibiotikai: kanamicinas (200 ug/ml), spektinomicinas (100 ug/ml) ir chloramfenikolis (4,5 ug/ml). Devyni šimtai mikrolitrų 0,4 OD600 (optinis tankis esant 600 nm) išaugintos SPN kultūros buvo sumaišyti su 600 ul 80 procentų sterilaus glicerolio (32 procentų galutinė glicerolio koncentracija) ir laikomi –80 laipsnių šaldiklyje. Šios glicerolio atsargos buvo naudojamos kaip pradinis užkratas visuose eksperimentuose.

Escherichia coli DH5 ir STm (ATCC 14028) kultūros buvo auginamos Luria-Bertani sultinyje (LB) 37 laipsnių kratymo sąlygomis (200 aps./min.), o prireikus buvo naudojami šie antibiotikai: kanamicinas (50). ug/ml), spektinomicino (100 ug/ml), chloramfenikolio (20 ug/ml) ir ampicilino (100 ug/ml). Visiems infekcijos tyrimams bakterijos buvo auginamos iki OD600 ~ 0, 4, po to pakartotinai suspenduojamos fosfatiniu buferiniu tirpalu (PBS) iki panašaus tankio prieš užkrečiant šeimininko ląsteles.

Numanomų ubikvitino tikslinių baltymų atranka

Visi paviršiaus baltymai, esantys STm ir SPN proteomuose, pirmiausia buvo nustatyti iš paskelbtos literatūros. Iš UniProt buvo gautos visos paviršiaus baltymų baltymų sekos, kurios vėliau buvo naudojamos degrono motyvų buvimui nustatyti. 29 numanomų degronų motyvų rinkinys buvo sukurtas iš paskelbtos literatūros (24, 52, 53) ir Eukariotų linijinių motyvų duomenų bazės. Python regex modulis buvo naudojamas visų tokių kuruojamų motyvų vietai nustatyti paviršiaus baltymų sekose. Toliau buvo atlikta linijinė paieška, siekiant nustatyti, ar šalia kiekvieno identifikuoto degrono motyvo yra lizino liekanos (nuo 8 iki 14 aminorūgščių liekanų). Manoma, kad ši lizino liekana veikia kaip ubikvitino dalies prijungimo vieta. Galiausiai, atrinktos baltymų sekos buvo įtrauktos į IUPred (54), baltymų struktūros numatymo įrankį, siekiant nustatyti, ar tarp degrono motyvo ir proksimalinio lizino yra netvarkinga sritis. Gauti baltymai (BgaA ir PspA SPN ir RlpA STm) buvo atrinkti įvertinti kaip ubikvitinacijos taikiniai ir dekoduoti jų vaidmenį patogeno klirensuose.

Bakterijų padermių konstrukcija

Alelių keitimas homologinės rekombinacijos būdu buvo atliktas naudojant genų gretimus regionus, kuriuose yra įterpta antibiotikų kasetė, kad būtų galima generuoti mutantines padermes tiek SPN, tiek STm (S2 lentelė).

SPN atveju 500-bp prieš ir pasroviui esantys bgaA, pspA ir jo genų regionai buvo amplifikuoti iš genomo su atitinkamais pradmenimis (S3 lentelė) ir surinkti pBKS vektoriuje. Po šių fragmentų klonavimo į šią konstrukciją buvo įdėta atsparumo antibiotikams kasetė (spektinomicinas maišeliui, taip pat pspA ir chloramfenikolis, skirtas hysA). Tada linijinės rekombinantinės plazmidės buvo transformuotos į WT SPN, naudojant kompetenciją stimuliuojantį peptidą 1 (GenPro Biotech), rekombinantai buvo atrinkti naudojant atitinkamus antibiotikus, o genų pakeitimas buvo patvirtintas polimerazės grandinine reakcija (PCR) ir atitinkamų genų lokusų seka. STm genų delecijos mutantams generuoti buvo naudojamas λ-raudonosios rekombinazės metodas (55).

Trumpai tariant, sekos, homologiškos virvės geno galams, buvo įtrauktos į pradmenų sekas, kurios naudojamos kanamicino atsparumo kasetei amplifikuoti. Tada kasetė buvo elektroporuota į WT STm padermę, o homologinės rekombinacijos metu sukurti išmušimai buvo parinkti pagal atsparumą kanamicinui. Genų ištrynimas buvo patvirtintas naudojant PGR ir geno lokuso seką. Viso ilgio pspA, hysA ir sutrumpintas bgaA-T (nuo 1 iki 3168 bp) buvo klonuoti po P23 promotoriumi šaudykliniame vektoriuje pIB166 (56) ir naudojami komplementacijai.

Šios rekombinantinės plazmidės taip pat buvo naudojamos į vietą nukreiptai mutagenezei, siekiant sukurti skirtingus bgaA-T (bgaA-TK96R, bgaA-TK97R, bgaA-TK96R, K97R ir bgaATΔDegron), pspA (pspAK314R, pspAK315RA4, p, spron, pspAK315RA4, p, spron) variantus. ), ir jo (hysADegron-BgaA ir hysADegron-PspA), naudojant atitinkamus pradmenų rinkinius (S3 lentelė) ir transformuojami į ΔbgaA ir ΔpspA mutantus. Visi klonai buvo patikrinti DNR seka. Įvairių BgaA, PspA ir HysA variantų ekspresija buvo patvirtinta Western blot metodu, naudojant tinkamus antikūnus.

Antikūnai ir reagentai

Anti-Enolase ir anti-PspA serumas (S. Hammerschmidt, Greifsvaldo universitetas, Vokietija); anti-BgaA serumas (S. King, Ohajo valstijos universitetas, JAV); ir antikūnai, specifiniai His6 (Invitrogen, MA1-21315), K48-Ub ryšiui (Millipore, 05-1307), K63-Ub ryšiui (Millipore, 14-6077-80) ), Ply („Santa Cruz Biotechnology“, sc-80500), FBXW7 („Bethyl Laboratories“, A301-721A), SKP1 („Invitrogen“, MA5-15928), „Cullin1“ („Invitrogen“, {{15} }), gliceraldehido fosfato dehidrogenazė (Millipore, MAB374), GSK3 [ląstelių signalizacijos technologija (CST), D5C5Z], fosfotreoninas (CST, 9381S), IgA, kappa nuo pelių mielomos, klonas TEPC-15, M1421) ir PSMB7 („Invitrogen“, PA5-111404) buvo įsigyti. Buvo naudojami šie antriniai antikūnai: krienų peroksidaze (HRP) pažymėtas anti-triušis (BioLegend, 406401), HRP pažymėtas anti-pelės (BioLegend 405306), anti-triušis Alexa Fluor 488 (Invitrogen, A27206), anti-rabbit Alexa. Fluor 555 (Invitrogen, A31572), biotinu konjuguotas anti-pelės imunoglobulinas A (Life Technologies, M31115), anti-pelės Alexa Fluor (Invitrogen, A31570), anti-pelės Alexa Fluor 488 (Invitrogen, A212 Alexa02). Fluor 633 („Invitrogen“, A21082) ir FM4-64 („Thermo Fisher Scientific“, T13320).

Baltymų ekspresija ir valymas

BgaA-T ir jo variantai buvo klonuoti pET28 naudojant Xba I/Not I restrikcijos vietas. Rekombinantinės plazmidės, koduojančios BgaA-T su N-galiniu His-žymu, buvo transformuotos į E. coli BL21 (DE3) ląsteles baltymų ekspresijai. Šviežiai transformuotos kolonijos buvo auginamos LB, turinčioje kanamicino (50 ug/ml), 37 laipsnių temperatūroje purtyklės inkubatoriuje 12 valandų. Vienas procentas pirminės kultūros buvo įpiltas į 1 litrą LB sultinio ir inkubuojamas 37 laipsnių temperatūroje ant purtiklio inkubatoriaus, kol OD600nm pasieks 0,6–0,8. Baltymų ekspresija buvo sukelta pridedant 100 μM izopropil- -D-tiogalaktopiranozido (IPTG) ir toliau auginant kultūrą 37 laipsnių temperatūroje 5–6 valandas, maišant 150 aps./min.

Ląstelės buvo paimtos centrifuguojant 6000 aps./min. greičiu 10 min. 4 laipsnių kampu. Ląstelių nuosėdos buvo pakartotinai suspenduotos buferyje A [25 mM tris (pH 8,0) ir 300 mM NaCl] ir lizuojamos ultragarsu. Ląstelių liekanos buvo atskirtos centrifuguojant (14, 000 aps./min., 50 min., 4 laipsniai), o supernatantas užpilamas ant Ni-NTA kolonėlės, subalansuotos buferiu A. Kolonėlė plaunama 10 kolonėlės tūrių buferio. A ir His-žymėti baltymai buvo eliuuojami imidazolu (250 mM) buferyje A. Visi BgaA-T variantai buvo ekspresuojami ir išgryninti naudojant tą pačią procedūrą. FBXW7 buvo subklonuotas į pGEX-4 T-1 vektorių, turintį N-galo glutationo S-transferazės (GST) žymą iš pCMV6-Entry-FBXW7 vektoriaus, naudojant Eco RI restrikcijos fermentą.

GST pažymėtas FBXW7 buvo ekspresuojamas E. coli BL21 (DE3) ląstelėse po baltymų ekspresijos indukcijos 0,1 mM IPTG ir augimo 30 laipsniu 4 valandas. GST-FBXW7 iš E. coli neapdoroto ekstrakto buvo išgrynintas naudojant Glutation-Sepharose (GE HealthCare) kolonėlės chromatografiją. Frakcijos, kuriose yra išgrynintų baltymų, buvo sujungtos ir sukoncentruotos iki 0,5 mg/ml, naudojant 10- kDa molekulinės masės ribinį filtrą (Amicon), centrifuguojant 4700 aps./min 4 laipsnių kampu. Baltymų grynumas buvo patikrintas naudojant SDS-poliakrilamido gelio elektroforezę (SDS-PAGE), po to dažant Coomassie mėlyna spalva.

Šeimininkų ląstelių transfekcijos

BgaA-T buvo klonuotas į doksiciklino indukuojamą vektorių pAK_Tol2_TRE_Blast (Addgene Nr. 130261), naudojant infuzinį klonavimo rinkinį (Takara). Teigiamas klonas buvo patvirtintas Sangerio sekos nustatymu. FBXW7R505C mutacija buvo atlikta naudojant vietinę mutagenezę, naudojant pMRX-GFP-FBXW7 kaip šabloną ir patvirtinta Sangerio seka. Visos transfekcijos buvo atliktos naudojant Lipofectamine 3000 reagentą (Thermo Fisher Scientific), o atranka buvo atlikta dalyvaujant blasticidino hidrochloridui (2 ug/ml; HiMedia).

siRNR nukreiptas genų numušimas

Dėl RNR trukdžių sukeliamam specifinių genų numušimui buvo naudojamos šios siRNR: siFBW7 (Dharmacon ON-TARGET SMARTpool L-004246-00-0005), siCullin1 (Qiagen, 1027423), siSKP1 (Qiagen, SI00301819) ir siRNR. SMARTpool L-003010-00-0005). Trumpai tariant, A549 ląstelės, išaugintos 24-šulinėlių plokštelėje, buvo laikinai transfekuotos genų specifinėmis siRNR arba maišymu (siControl) (150 pmol), naudojant Lipofectamine 3000, kaip nurodyta gamintojo instrukcijoje. Praėjus trisdešimt šešioms valandoms po transfekcijos, ląstelės buvo apdorotos Western blot ir imunofluorescencijos arba penicilino-gentamicino apsaugos tyrimams.

Struktūros numatymas ir modeliavimas

Visos struktūros buvo numatytos AlphaFold (baltymų homologijos / analogijos atpažinimo varikliu V 2.0) (57) ir vizualizuotos naudojant PyMOL (The PyMOL Molecular Graphics System, 2 versija.0 Schrödinger, LLC). Struktūros buvo koduojamos PyMol spalvomis, remiantis IUPred (54) balais, nuo tvarkingos (mėlynos) iki netvarkingos (raudonos) iki baltos.

Western blotingas

SPN kultūros, išaugintos iki {{0}}.4 OD600nm, buvo lizuojamos ultragarsu, o neapdoroti ekstraktai buvo surinkti po centrifugavimo (15, 000 aps./min., 30 min., 4 laipsniai). A549s monosluoksniai buvo kelis kartus plaunami PBS ir lizuojami lediniame radioimunoprecipitacijos tyrimo (RIPA) buferyje [50 mM tris-Cl (pH 7,89), 150 mM NaCl, 1 proc. Triton X-100, 0,5 proc. natrio deoksicholatas ir 1 procentas SDS], kurio sudėtyje yra proteazės inhibitorių kokteilio (Promega), natrio fluorido (10 mM) ir EDTA (5 mM). Ląstelių suspensija buvo trumpai apdorota ultragarsu ir centrifuguojama, kad būtų surinkti ląstelių lizatai. Baltymai, esantys bakterijų arba A549 ląstelių lizatuose (10 arba 20 ug), buvo atskirti 12 procentų SDS-PAGE gelyje ir perkelti į aktyvuotą polivinilideno difluorido membraną. Užblokavus 5 procentų nugriebto pieno, membranos buvo tiriamos atitinkamais pirminiais ir HRP pažymėtais antriniais antikūnais. Galiausiai blotai buvo sukurti naudojant sustiprintą chemiliuminescencinį substratą (Bio-Rad).
Penicilino ir gentamicino apsaugos tyrimas

SPN padermės, išaugintos iki OD600nm 0.4 Todd-Hewitt sultinyje, papildytame 0.2 procentų mielių ekstraktu (THY), buvo susmulkintos, resuspenduotos PBS ( pH 7,4) ir praskiedžiama tyrimo terpėje, skirta A549 vienasluoksnių sluoksnių užkrėtimui, kai infekcijos dažnis (MOI) yra 10. Praėjus 1 valandai po infekcijos, monosluoksniai buvo plaunami DMEM ir inkubuojami su tyrimo terpe, kurioje yra penicilino (10 ug/ml). ) ir gentamicino (400 ug/ml) 2 valandas, kad sunaikintų tarpląstelinį SPN. Tada ląstelės buvo lizuojamos su 0,025 proc. Triton X-100, o lizatas buvo dedamas ant Brain Heart Infusion agaro plokštelių, kad būtų galima suskaičiuoti gyvybingą SPN. Invazijos procentas buvo apskaičiuotas kaip [kolonijas formuojantys vienetai (CFU) lizate / CFU, naudojami infekcijai] × 100. Norint įvertinti intracelulinį išgyvenamumą, praėjus 9 valandoms po užsikrėtimo (nuo gydymo penicilinu ir gentamicinu pradžios), ląstelių lizatai buvo paruošti kaip paminėtos aukščiau, buvo surašytos išplitusios ir išgyvenusios bakterijos. Išgyvenamumo efektyvumas (procentais) buvo pavaizduotas kaip procentinis išgyvenamumo pokytis, palyginti su kontroline kontrole nurodytu laiko momentu (normalizuotas iki 0 valandų).

Imunofluorescencija

Imunofluorescenciniam tyrimui A549 arba HeLa ląstelės buvo auginamos ant stiklinių dangtelių ir užkrėstos SPN arba STm padermėmis esant MOI ~ 25 1 valandą, po to 2 valandas buvo gydomos antibiotikais. Po užsikrėtimo pageidaujamu laiko momentu (9 valandos SPN infekcijai A549s ir 3 valandos STm infekcijai HeLa) ląstelės buvo plaunamos DMEM ir fiksuojamos ledu atšaldytu metanoliu –20 laipsnių temperatūroje 10 min. Be to, dangteliai buvo užblokuoti 3 procentų galvijų serumo albuminu (BSA) PBS 2 valandas kambario temperatūroje (RT). Tada ląstelės buvo apdorotos tinkamu pirminiu antikūnu, esančiu 1% BSA PBS per naktį 4 °C temperatūroje, plaunamos PBS ir inkubuojamos su tinkamu antriniu antikūnu 1% BSA PBS 1 valandą kambario temperatūroje. Galiausiai dengiamieji stikleliai buvo nuplauti PBS ir pritvirtinti ant stiklelių kartu su VECTASHIELD su arba be 4′,6-diamidino-2-fenilindolio (Vector Laboratories), kad būtų galima vizualizuoti naudojant lazerinį skenuojantį konfokalinį mikroskopą (LSM 780, Carl Zeiss). ) pagal 40 × arba 63 × naftos tikslus. Vaizdai buvo gauti po optinio atskyrimo ir apdoroti naudojant ZEN lite programinę įrangą (5.0 versija). Superresolution mikroskopija buvo atlikta panašiai naudojant Elyra 7 (Carl Zeiss) SIM režimu. Kolokalizacijos analizei bakterijos buvo įvertintos vizualiai skaičiuojant n> 100 bakterijų viename pakartojime.

Perdavimo elektronų mikroskopija

Užkrėtus SPN ir STm, ląstelės buvo plaunamos {{0}},1 M natrio kakodilato buferiu, fiksuotu 2,5 % glutaraldehidu (Sigma-Aldrich) 0,1 M natrio kakodilato buferyje ( Sigma-Aldrich) 3 valandas 4 laipsnių temperatūroje. Po fiksavimo ląstelės buvo surinktos per ląstelių grandiklį ir granuliuotos 2000 aps./min. greičiu 10 min. Tada ląstelės buvo plaunamos 0, 1 M natrio kakodilato buferiu ir 20 minučių 4 laipsnių temperatūroje fiksuojamos 1 procento osmio tetroksidu 0, 1 M natrio kakodilato buferyje. Po tolesnio plovimo kakodilato buferiu ir distiliuotu vandeniu ląstelės buvo dehidratuotos didėjančiomis etanolio (50, 70, 95 ir 100 proc.) ir propileno oksido koncentracijomis 30 min., o galiausiai įterptos į epoksidinę dervą (Electron Microscopy Sciences, 14300). polimerizacija 75 laipsnių temperatūroje 45 min. Vėliau kapsulės buvo perkeltos į 95 laipsnių orkaitę 45 min. Itin plonos pjūviai (70 nm) buvo supjaustyti naudojant deimantinį peilį ant Leica EM UC7 Ultramicrotome ir nudažyti 2% uranilo acetatu ir 1% švino citrato ir apžiūrėti naudojant perdavimo elektronų mikroskopą (Talos L120 C, Thermo Fisher Scientific) esant 120 KV.

Ex vivo ubikvitinacija

A549-išreiškiantis BgaA-T ir jo variantai buvo apdoroti MG132 (5 μM), o baltymų ekspresija buvo sukelta doksiciklinu (100 ug/ml) 24 valandas. Tada ląstelės buvo lizuojamos RIPA buferyje, o mėginiai elektroforezuojami naudojant SDS-PAGE (8 proc.). Baltymų ekspresijos ir BgaA-T bei jo variantų ubikvitinacijos patvirtinimas buvo įrodytas Western blot metodu, atitinkamai atlikus zondavimą anti-BgaA ir anti-K48-Ub antikūnais.

In vitro ubikvitinacija

In vitro ubikvitinacijos tyrimams rekombinantiniai baltymai buvo išgryninti, kaip aprašyta anksčiau (58). SCFFBW7 E3 ligazės kompleksas buvo inkubuojamas su rekombinantiniu 0,1 mM E1 (UBE1; Boston Biochem), 0,25 mM E2 (cdc34; Boston Biochem) ir ubikvitinu (2,5 ug/ml; Bostonas). Biochem), esant išgrynintam BgaA-T ir jo variantams. Ubiquitilinimo reakcijos buvo atliekamos tyrimo buferyje [50 mM tris (pH 8), 5 mM MgCl2, 5 mM adenozino trifosfato (ATP), 1 mM -merkaptoetanolio ir 0,1 proc. Tween 20] 2 valandas 25 laipsnių temperatūroje. . Reakcijos buvo sustabdytos naudojant 5 × Laemmli buferį, ištirpintos SDS-PAGE geliais ir analizuojamos imunoblotingu, naudojant anti-BgaA antikūną.

In vitro kinazės tyrimas

Norint atlikti kinazės tyrimą in vitro, GSK3 kinazės fermentų sistema (Promega) buvo naudojama pagal gamintojo protokolą su šiais pakeitimais. Trumpai tariant, 3 ug rekombinantinio BgaA-T buvo pridėta prie 0,5 ug aktyvaus GSK3 su 400 μM ATP reakcijos buferyje, sudarytame iš 40 mM tris, (pH 7,5), 20 mM MgCl2. , BSA (0,1 mg/ml) ir 50 μM ditiotreitolio. Reakcija buvo inkubuojama 2 valandas 30 laipsnių temperatūroje ir sustabdyta pridedant 1 × Laemmli buferio. Tada mėginiai buvo virti ir atlikti elektroforezė Western blot'ui, kaip minėta anksčiau. Fosforilintas BgaA-T buvo aptiktas naudojant anti-fosfotreonino antikūną.

In vivo modelis

All animal experiments were performed at the University of Liverpool in strict accordance with U.K. Home Office guidelines, under project license PP2072053, following approval from local animal welfare and ethics committees. For infection studies, 7- to 8-week female CD1 mice were purchased from Charles River Laboratories, United Kingdom, and allowed to acclimatize for 7 days before use. Briefly, mice were placed into a restraint tube, and S. pneumoniae was administered by intravenous injection into the tail vein (1 × 106 CFU in 100 μl of PBS). Mice were periodically scored for clinical signs of disease and culled when they showed signs of advanced pneumococcal disease or else at predetermined times after infection. Severity endpoints were defined as one or more of the following: substantially elevated or reduced respiratory rate, substantial reduction in natural behavior or moderate reduction in provoked behavior, loss of >20 procentų pradinio kūno svorio ir ryškios išskyros iš nosies ar akių. Kraujo mėginiai buvo paimti širdies punkcija taikant galutinę anesteziją, o blužnies buvo pašalintos po mirties, kad būtų galima suskaičiuoti bakterijas. Audinių mėginiai buvo apdoroti rankiniu audinių homogenizatoriumi, o homogenatai buvo nuosekliai skiedžiami PBS, prieš dedant ant kraujo agaro plokštelių. Plokštelės buvo inkubuojamos per naktį 37 laipsnių temperatūroje, 5 procentai CO2, o bakterijų kolonijų skaičius buvo įvertintas kitą dieną.

Statistinė analizė

Statistinei analizei buvo naudojama GraphPad Prism 5 versija. Atskiriems eksperimentams atlikti statistiniai testai paminėti atitinkamose paveikslų legendose. P < 0,05 buvo laikomas statistiškai reikšmingu. Duomenys buvo tikrinami siekiant nustatyti normalumą ir nustatyti kiekvienos tiriamos grupės dispersiją. Visos kelių parametrų analizės apėmė daugybinių palyginimų pataisymus, o duomenys pateikiami kaip vidurkis ± SD, jei nenurodyta kitaip.

NUORODOS IR PASTABOS

ME Bianchi, DAMP, PAMP ir signalins: viskas, ką turime žinoti apie pavojų. J. Leukoc. Biol. 81, 1–5 (2007).

2. TH Mogensen, patogenų atpažinimas ir uždegiminis signalizavimas įgimtoje imuninėje sistemoje. Clin. Microbiol. 22, 240–273 (2009).

3. K. Ray, B. Marteyn, PJ Sansonetti, CM Tang, Gyvenimas viduje: citozolinių bakterijų viduląstelinis gyvenimo būdas. Nat. Rev. Microbiol. 7, 333–340 (2009).

4. X. Jiang, ZJ Chen, „Ubiquitilation“ vaidmuo imuninėje gynyboje ir patogenų vengimas. Nat. Rev. Immunol. 12, 35–48 (2011).

5. V. Vozandychova, P. Stojkova, K. Hercik, P. Rehulka, J. Stulik, The ubikvitinacijos sistema bakterijų šeimininko ir patogeno sąveikoje. Mikroorganizmai, 9, 638 (2021).

6. E. Fiskin, T. Bionda, I. Dikic, C. Behrends, Visuotinė šeimininko ir bakterijų ubikvitinomo analizė reaguojant į salmonella typhimurium infekciją. Mol. Cell 62, 967–981 (2016).

7. Q. Chai, X. Wang, L. Qiang, Y. Zhang, P. Ge, Z. Lu, Y. Zhong, B. Li, J. Wang, L. Zhang, D. Zhou, W. Li, W. Dong, Y. Pang, GF Gao, CH Liu, Mycobacterium tuberculosis paviršiaus baltymas įdarbina ubikvitiną, kad sukeltų šeimininko ksenofagiją. Nat. Komun. 10, 1973 (2019).

8. EG Otten, E. Werner, A. Crespillo-Casado, KB Boyle, V. Dharamdasani, C. Pathe, B. Santhanam, F. Randow, Ubiquitylation of Lipopolysaccharide by RNF213 bakterinės infekcijos metu. Nature 594, 111–116 (2021).

9. A. Yamada, M. Hikichi, T. Nozawa, I. Nakagawa, FBXO2/SCF ubikvitino ligazės kompleksas nukreipia ksenofagiją per atpažindamas bakterijų paviršiaus glikaną. EMBO Rep. 22, e52584 (2021).

10. P. Engstrom, TP Burke, CJ Tran, AT Iavarone, MD Welch, Lizino metilinimas apsaugo tarpląstelinį patogeną nuo ubikvilitacijos ir autofagijos. Sci. Adv. 7, eabg2517 (2021).

11. J. Celli, LRSAM1, E3 ubikvitino ligazė, jautri bakterijoms. Cell Host Microbe 12, 735–736 (2012).

12. LH Franco, VR Nair, CR Scharn, RJ Xavier, JR Torrealba, MU Shiloh, B. Levine, The ubikvitino ligazė Smurf1 veikia selektyvioje mikobakterijų tuberkuliozės autofagijoje ir antituberkuliozinėje šeimininko gynyboje. Cell Host Microbe 21, 59–72 (2017).

13. J. Noad, A. von der Malsburg, C. Pathe, MA Michel, D. Komander, F. Randow, LUBAC Susintetintos linijinės ubikvitino grandinės riboja citozolį invazuojančias bakterijas, aktyvuodamos autofagiją ir NF-κB. Nat. Microbiol. 2, 17063 (2017).

14. PS Manzanillo, JS Ayres, RO Watson, AC Collins, G. Souza, CS Rae, DS Schneider, K. Nakamura, MU Shiloh, JS Cox, Ubikvitino ligazės parkinas tarpininkauja atsparumui intraceluliniams patogenams. Gamta 501, 512–516 (2013).

15. M. Polajnar, MS Dietz, M. Heilemann, C. Behrends, Expanding the host cell ubiquitilation machinery, targeting the citozolic Salmonella. EMBO Rep. 18, 1572–1585 (2017).

For more information:1950477648nn@gmail.com