Anastatino dariniai palengvina miokardo išemijos ir reperfuzijos sužalojimą dėl antioksidacinių savybių

Norėdami gauti daugiau informacijos, kreipkitėstina.xiang@wecistanche.com

Abstraktus:(±)-Anastatinai A ir B yra flavonoidai, išskirti iš Anastatica hierochuntica. Ankstesniame tyrime buvo sukurti dvidešimt keturi di- ir tripakeisti nauji anastatinų dariniai ir įvertintas jų preliminarus antioksidacinis aktyvumas. Šiame tyrime toliau buvo tiriamas apsauginis miokardo išemijos-reperfuzijos (I/R) poveikis ir sistemingas 24 darinių antioksidacinis pajėgumas. 13 junginys buvo stipriausias iš visų tirtų junginių, padidinęs H9c2 ląstelių išgyvenamumą iki 80,82 proc. 13 junginio antioksidacinės savybės buvo įvertintos pagal geležies redukuojančią antioksidacinę galią, 2,2'-azino-bis (3-etilbenzotiazolino-6-sulfonrūgštį) radikalų šalinimą ir 2,2-difenilą {20}}pikrilhidrazilo tyrimai. Pastebėta, kad 13 junginys reikšmingai sumažino infarkto vietas ir pagerino histopatologinius bei elektrokardiogramos pokyčius žiurkėms su miokardo I/R pažeidimu. Be to, 13 junginys sumažino serumo laktatdehidrogenazės, kreatinkinazės ir malonilo dialdehido nutekėjimo greitį iš žiurkių miokardo audinių ir padidino glutationo ir superoksido dismutazės aktyvumą po to.miokardo I/R pažeidimasžiurkėse. Apibendrinant, padarėme išvadą, kad 13 junginys turėjo stiprų kardioprotekcinį poveikį nuo miokardo I / R pažeidimo tiek in vitro, tiek in vivo dėl didelio antioksidacinio aktyvumo.

Raktažodžiai: flavonoidų dariniai; H9c2 ląstelės; hipoksija/reoksigenacija; kardioprotekcinis poveikis

Norėdami gauti daugiau informacijos apie produktą, spustelėkite čia

1. Įvadas

Išeminė širdies liga (IŠL) yra pagrindinė mirties priežastis visame pasaulyje [1]. Laiku atstačius kraujotaką galima efektyviai pagerinti klinikinę ligos baigtį; tačiau reperfuzija nekelia pavojaus dėl pačios reperfuzijos sukelto ląstelių pažeidimo masto. Todėl labai svarbu sukurti veiksmingas terapines strategijas prieš miokardo išemijos-reperfuzijos (I/R) pažeidimą [2]. Miokardo I/R pažeidimo mechanizmas yra labai sudėtingas; tai apima apoptozę, oksidacinį stresą [3], kalcio perteklių [4] ir uždegimą [5].Oksidacinis stresasgali sukelti apoptozę įvairiais signalo perdavimo būdais, įskaitant signalo reguliuojamą kinazę (ERK), c-Jun aminoterminalinę kinazę (JNK), p53 (naviko baltymo p53) ir p66shc varianto aktyvavimą. Be to, per didelė reaktyviųjų deguonies rūšių (ROS) gamyba gali negrįžtamai pažeisti ląstelių membranas ir ląstelių molekules, tokias kaip DNR, nukleino rūgštys, baltymai, lipidai, ir pradėti grandinines reakcijas, dar labiau pažeisdamos miokardo audinį. Oksidacinis stresas [6], kurį sukelia disbalansas tarp laisvųjų radikalų susidarymo ir ROS pašalinimo, vaidina svarbų vaidmenį I/R pažeidimo I patogenezėje. dėl miokardo I/R pažeidimo. Todėl dėl galimų laisvųjų radikalų šalinimo galimybių antioksidantais pagrįstos strategijos yra naudingos gydant I/R sužalojimą.

Klinikinių tyrimų metu antioksidantai naudojami sumažintimiokardo I/R pažeidimasdaugiausia skirstomi į du tipus: fermentinius ir nefermentinius. Fermentai, tokie kaip katalazė ir glutationo peroksidazė, sumažina vandenilio peroksido koncentraciją, kad išvengtų ląstelių pažeidimo; nefermentiniai antioksidantai, tokie kaip vitaminas E, vitaminas C, karotinas ir kt., susilpnina audinių oksidacinį stresą, kad sumažintų audinių pažeidimus ir skatintų funkcinį atstatymą. Tačiau abiejų taikymas šiuo metu turi tam tikrų apribojimų. Didelė fermentų preparatų molekulinė masė nėra palanki absorbcijai [8]. Taip pat yra tam tikrų problemų, susijusių su nefermentų stabilumu, todėl vaistų stabilumas yra prastas, todėl jie lengvai oksiduojasi [9].FlavonoidaiBuvo pranešta, kad kaip tam tikri nefermentiniai antioksidantai turi daug stiprių savybių, įskaitant antioksidacinį, priešvėžinį, antiapoptotinį ir širdies ir kraujagyslių sistemos apsaugą [10]. Jie neleidžia susidaryti labai reaktyviems oksidams ir slopina oksidacines reakcijas, pašalindamos ROS, pvz., vandenilio radikalus ir peroksinitritą. Anastatinai A ir B [11] yra flavonoidai, turintys hepatoprotekcinį poveikį. Anastasius A ir B yra aktyvūs Anastatica hierochuntica (Anastatica potipio, Brassicaceae šeimos) komponentai. Šiuo metu yra labai mažai pranešimų apie anastatinų A ir B cheminę sintezę ir struktūrines modifikacijas. 2003 m. buvo išskirti aktyvūs Anastatica hierochuntica junginiai ir nustatyta, kad jie turi hepatoprotekcinį poveikį prieš D-galaktozamino sukeltą citotoksiškumą pirminės kultūros pelių hepatocituose. Nakashima ir Emanas taip pat įrodė, kad junginiai in vitro turi antioksidacinį ir priešvėžinį poveikį. Tačiau anastatinų A ir B bei jų darinių farmakologinis poveikis, taip pat jų sintezės procedūros lieka neaiškūs. Todėl siekėme susintetinti anastatinus A ir B bei kai kuriuos jų darinius ir įvertinti jų antioksidacinį aktyvumą esant hipoksijai.reoksigenacija(H/R) modelis, kuris yra veiksmingas tiriant miokardo I/R pažeidimą [12].

Ankstesniame tyrime sintezavome anastatinus A ir B bei jų analogus ir įvertinome jų antioksidacines galimybes, naudodami H2O2 (vandenilio peroksido) sukeltos oksidacinės pažaidos ląstelių kultūros modelį13. Mūsų ankstesni rezultatai parodė, kad anastatinai A ir B turi stiprią hepatoprotekcinę veiklą, kuri, atrodo, yra susijusi su jų antioksidacinėmis savybėmis.

Šiame tyrime anastatinai A ir B bei 24 jų dariniai buvo susintetinti ir įvertinti dėl antioksidacinių savybių, naudojant redukcinės galios ir radikalų šalinimo testus. Be to, norint įvertinti junginių kardioprotekcinį poveikį, buvo naudojamas paprastas H9c2 ląstelių H/R modelis ir žiurkės miokardo I/R pažeidimo modelis.

2. Rezultatai

2.1.H/R modelio sukūrimas

Na2S, O4 apdorojimo koncentracija buvo įvertinta kaip parodyta 1A paveiksle, o H9c2 ląstelių išgyvenamumas sumažėjo didėjant Na2S2O4 koncentracijai. Esant 4 mM Na, S, Oa, ląstelių gyvybingumas sumažėjo iki mažiau nei 50 proc. (atitinkamai 13,7, 25 ir 43,4 proc., kai reoksigenacijos laikas yra 2,1 ir 0 val.) , o ląstelių gyvybingumo sumažėjimo lygis buvo mažesnis. Todėl hipoksiniam gydymui buvo naudojama 4 mM Na2S2O4 koncentracija. 1B paveiksle parodyta, kad 4 mM Na2S2O4 apdorojimas 2 valandas be reoksigenacijos (0 h) žymiai sumažino ląstelių gyvybingumą ir išliko pastovus. Esant 4 mM NazS2O4 koncentracijai 2 valandas imituojančios hipoksijos, 2 valandos deguonies sumažino ląstelių išgyvenamumą iki 17,37 proc. (1C pav.). Kaip aiškiai parodyta 1D paveiksle, 10 μM resveratrolio pakeitė sumažėjusį ląstelių gyvybingumą, kurį sukėlė H/R, kuris buvo stipresnis nei ta pati galio rūgšties koncentracija (74,34 ir 60,44 proc. galio rūgšties).

Dėl to hipoksijos / reoksigenacijos modelis buvo sukurtas naudojant Na2S, O4 galutinėje koncentracijoje 4 mM 2 valandas imituojančios hipoksiją, po to kultivavimą normalioje DMEM (Dulbecco modifikacija Erelio terpėje) / dideliu gliukozės kiekiu, kad būtų imituojamas reoksigenacijos pažeidimas. . Resveratrolis, kurio galutinė koncentracija buvo 10 μM, buvo naudojamas kaip teigiama kontrolė.

2.2. Anastatinai ir jų denioatijos pagerina H9c2 ląstelių, kurioms taikomas H/R gydymas, gyvybingumą

Pirmiausia ištyrėme anastatinų A ir B (2A, B pav.) ir jų darinių poveikį H9c2 ląstelių gyvybingumui MTT(3-(4,5)-dimetiltiahiazo(-z-y1){{ 10}},5-difeniltetrazoliumromido) tyrimas [13]. 20a, 21a, 22a, 20b, 22b, 20c, 20c', 21c, 22c, 10 ir 11 junginiai nebuvo reikšmingai citotoksiški H9c2 ląstelėms (3A, B pav., S2 lentelė). Anastatinai A ir B, jų dariniai ir resveratrolis (teigiama kontrolė) sumažino hipoksijos sukeltą ląstelių pažeidimą (4 pav.). Modelių grupėje ląstelių gyvybingumas sumažėjo iki 20,31 proc., o resveratrolis padidino iki 82,68 proc., o anastatinas A ir junginiai 22b, 22c, 24b, 24c, 13 ir 14 padidino ląstelių išgyvenamumą iki daugiau nei 70 proc. 71.49,71.00,76.50, 73.24,77.57, 80.82 ir 77.13 proc.). Todėl junginys 13 (2C pav.) turėjo stipriausią apsauginį poveikį tarp anastatinų darinių nuo H/R pažeidimo ir buvo naudojamas tolesniuose eksperimentuose.

2.3. 13 junginys palengvina H/R sukeltą ląstelių pažeidimą ir oksidacinį stresą

Siekiant ištirti junginio antioksidacinį pajėgumą, trysoksidacinis stresasJunginių antioksidaciniam gebėjimui įvertinti buvo pasirinkti rodikliai LDH (laktatdehidrogenazė), GSH (L-glutationas) ir SOD (superoksido dismutazė). LDH yra stabilus citoplazminis fermentas, esantis miokardo ląstelėse, kuris greitai išsiskiria iš ląstelės į ląstelių auginimo terpę, pažeidžiant miokardo ląstelių membraną. Kuo rimtesnis pažeidimas, tuo didesnis LDH lygis auginimo terpėje. 5A paveikslas parodė, kad 2 valandos hipoksijos ir 2 valandos deguonies prisotinimo žymiai padidino LDH išsiskyrimą (478,98 U/L, palyginti su 55,84 U/Lin tuščiojoje grupėje, p<0.001), which="" was="" inhibited="" by="" resveratrol="" (284.07="" u/l="" vs.="" the="" model="" group=""><0.01) and="" compound="" 13(276.61="" u/l="" vs.the="" model="" group,=""><0.001).gsh can="" act="" as="" a="" hydrogen="" donor="" for="" glutathione="" catalase="" (cat),="" eliminating="" o2-="" and="" its="" derivatives="" in="" the="" organism,="" thereby="" cells="" are="" protected="" from="" oxidant="" damage.="" additionally,="" sod="" can="" catalyze="" the="" disproportionation="" of="" superoxide="" anions="" and="" protect="" cells="" from="" damage.="" as="" shown="" in="" figure="" 5b,="" c,="" compound="" 13="" significantly="" increased="" gsh="" release="" and="" sod="" activity=""><0.01）. it="" increased="" gsh="" level="" to="" 39.93="" μmol/gprot="" which="" was="" higher="" than="" the="" level="" in="" the="" model="" group="" （18.2="" μmol/gprot）="" but="" slightly="" lower="" than="" that="" in="" the="" resveratrol="" group.="" additionally,="" it="" reversed="" h/r-induced="" reduction="" in="" sod="" activity="" by="" increasing="" sodlevel="" from="" 12.00="" u/mgprot="" to="" 22.98="" u/mgprot.="" these="" findings="" demonstrate="" that="" compound="" 13="" has="" a="" protective="" effect="" on="" h9c2="" cells="" subjected="" to="" h/r="">

2.4. 13 junginio antioksidacinė talpa

Vitamin C(Vc) was used as an antioxidant control in order to evaluate the antioxidant effects of resveratrol and compound 13 intuitively. FRAP assay was used to evaluate the reducing power of the compound that can transfer ions from Fe3+ into Fe2+ to determine the antioxidant capacity of compounds. The results of the experiment showed that the reducing power of compound 13 was 354.80 mg/mmol, significantly stronger than the values obtained for the positive control Vc (127.47 mg/mmol) and resveratrol (261.91 mg/mmol) (Figure 6A).ABTS (2'-Azinobis-(3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonate)and DPPH (2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl) are stable free radicals insolvent, but when a radical scavenger is added to the solvent, the result is a reduction in the number of free radicals and the degree of reduction in the number of free radicals is directly proportional to the antioxidant capacity. Figure 6B, C show the ABTS and DPPH radical scavenging abilities of compound 13. The results indicate that compound 13 had the strongest scavenging activity on ABTS and DPPH with EC50 values of 1.38 and 0.07 mM, respectively. The antioxidant capacities of the compounds tested in all three antioxidant assays followed the same trend: compound 13>resveratrolis. Todėl 13 junginio antioksidacinis pajėgumas gali būti didesnis nei kitų tipiškų antioksidantų.

2.5. Anastatino darinio 13 poveikis žiurkių miokardo I/R pažeidimams

2.5.1. 13 junginio poveikis oksidaciniam stresui ir antioksidantų fermentų veiklai

Miokardo pažeidimo lygis buvo įvertintas nustatant oksidacinio streso žymenį ir antioksidantų fermentų aktyvumą. Buvo įvertintas 13 junginio poveikis MDA (malondialdehido) aktyvumui miokardo audinyje, taip pat LDH, CK (kreatino kinazės), GSH ir SODin serume. Kaip parodyta 7 paveiksle, dėl I/R sužalojimo padidėjo LDH (7A pav.) ir CK (B pav.) ir žymiai sumažėjo GSH (7C pav.) ir SOD aktyvumas (7D pav.) (p<0.001). the="" level="" of="" mda(figure="" 7e)increases="" after="" i/r="" injury,="" which="" is="" a="" critical="" diagnostic="" marker="" of="" i/r="" injury.="" however,="" pretreatment="" with="" a="" positive="" control="" drug="" and="" different="" concentrations="" of="" compound="" 13="" significantly="" alleviated="" these="" injuries.="" ldh="" activity="" obtained="" for="" the="" i/r="" model="" group="" was="" 771.37="" u/ml,="" which="" was="" remarkably="" decreased="" to="" 416.129="" u/ml="" under="" resveratrol="" treatment.="" in="" the="" high-and="" low-dose="" 13="" groups,="" ldh="" activity="" decreased="" to="" 408.05="" and="" 462.81="" u/ml,="" respectively="" similar="" trends="" were="" observed="" for="" other="" myocardial="" injury="" markers,="" including="" the="" level="" of="" ck,="" gsh,="" sod,="" and="" mda="" release.="" these="" results="" indicated="" that="" compound="" 13="" exerted="" protective="" effects="" against="" oxidative="" stress-induced="" i/r="" injury="" in="" a="" dose-dependent="">

2.5.2. 13 junginio poveikis elektrokardiogramos (EKG) pokyčiams ir širdies susitraukimų dažniui

Tipiški EKG (elektrokardiogramos) pokyčiai, kuriuos sukelia miokardo I/R pažeidimas, parodyti 8 pav. Palyginti su normalia EKG (8A pav.), miokardo I/R pažeidimas gali sukelti ORS (elektrokardiografinės bangos dalies) amplitudės padidėjimą (8B pav.); QRS bangos ir ST bangos susiliejimas (8C pav.); ST segmento (intervalas tarp S bangos ir T bangos) pakilimas (8D pav.); ir ST segmento inversija (8E pav.). Po 15 minučių LAD ligavimo, QRS amplitudė žymiai padidėjo nuo maždaug 0,5 mV iki 1,2 mV modelių grupėje (9A pav.), o mažesnė QRS amplitudės padidėjimas buvo pastebėtas visose gydymo grupėse (nuo maždaug nuo 0,4 mV iki 1, 0,8 ir 0,6 mV atitinkamai resveratrolio, mažos dozės 13 ir didelės dozės 13 grupei) (9B-D pav. ). Be to, panaši tendencija buvo pastebėta surišant 30 min. Reperfuzijos metu QRS amplitudė pradėjo mažėti; tačiau modelių grupėje QRS banga išliko aukščiausia per visą laikotarpį. Po 20 min. reperfuzijos modelių grupėje QRS amplitudė sumažėjo iki maždaug {{30}},8 mV, gydymo grupėje vertė buvo apie 0,6, 0,5, 0,5 mV. atitinkamai resveratrolio, mažos dozės 13 ir didelės dozės 13 grupėje. Apskritai gydymas resveratroliu, maža doze 13 ir didele doze 13 sumažino patologinės QRS amplitudės padidėjimą, palyginti su modelio grupe tiek išemijos, tiek ankstyvo reperfuzijos proceso metu, o tai gali būti siejama su jų miokardo apsauginiu aktyvumu.

Kartu su EKG stebėjimu buvo atidžiai stebimi širdies ritmo pokyčiai. Kaip parodyta S3 lentelėje, 30 minučių perrišimas labai sumažino širdies susitraukimų dažnį visose grupėse, tuo tarpu jokių reikšmingų skirtumų tarp gydymo grupių ir modelių grupių nenustatyta. Po 2 valandų reperfuzijos širdies susitraukimų dažnis padidėjo, tačiau jokių reikšmingų pokyčių nebuvo nustatyta nė vienoje grupėje.

2.5.3. 13 junginio poveikis infarkto sričiai ir histopatologiniams pokyčiams

Norint įvertinti miokardo pažeidimo lygį, širdies audiniai nudažyti TTC (2,35-trifeniltetrazolio chloridu) ir nustatyti histopatologiniai pokyčiai. Kaip parodyta 10 paveiksle, apgaulingoje grupėje po TTC dažymo miokardo pokyčių nepastebėta, o I/R grupėje buvo pastebėta apie 30 procentų baltųjų infarkto sričių. Resveratrolio grupėje ir 13 mažų dozių grupėse infarkto plotai žymiai sumažėjo iki maždaug 10 proc., o 13 didelių dozių grupėse infarkto sritis buvo sumažinta iki maždaug 5 proc. 10 paveiksle parodytas HE (hematoksilino-eozino) dažymo tyrimo rezultatas: modelio grupės audinių pjūviuose pastebėtas širdies ląstelių, iš dalies ištirpusių membranų ir branduolių padidėjimas bei uždegiminių ląstelių infiltracija. Tačiau išankstinis gydymas 13 junginiu žymiai sumažino šiuos histopatologinius pokyčius. TTC dažymo ir HE dažymo rezultatai parodė, kad 13 junginys gali sumažinti I/R sukeltą miokardo infarktą priklausomai nuo dozės.

3. Diskusija

Siekdama išsiaiškinti galimą anastatinų A ir B antioksidacinį aktyvumą, mūsų laboratorija susintetino 24 anastatinų darinius ir atliko preliminarią junginių citotoksiškumo PC-12 ir jų citoprotekcinio aktyvumo HO sukeltame oksidaciniame pažeidime analizę [13]. . Šiame tyrime daugiausia atlikome 13 iš 24 darinių, turinčių stipriausią antioksidacinį aktyvumą, išsamų biologinį įvertinimą.

Šiame tyrime miokardo I/R pažeidimas buvo nustatytas H9c2 ląstelėse, indukuojant gydymą H/R. Tyrimo rezultatai parodė, kad anastatinai A ir B bei jų tirti dariniai pagerino H9c2 ląstelių gyvybingumą po gydymo H/R. Nustatyta, kad 13 junginys yra stipriausias iš 26 tirtų junginių, todėl buvo pasirinktas tolesniam vertinimui. LDH (ląstelių pažeidimo žymuo), SOD ir GSH (oksidacinio streso žymenų) aktyvumas buvo aptiktas H9c2 ląstelių supernatantuose po gydymo H/R. Mes nustatėme, kad išankstinis apdorojimas tiriamaisiais junginiais žymiai sumažino LDH lygį ir padidino SOD bei GSH kiekį ląstelėse. Taigi iškėlėme hipotezę, kad anastatino dariniai turėjo kardioprotekcinį aktyvumą, kuris gali būti siejamas su jų gebėjimu slopinti oksidacinį stresą. DPPH ir ABTS tyrimai naudojami siekiant įvertinti junginio radikalų šalinimo galią [14]. Dėl to 13 junginys turėjo didelę antioksidacinę galią ir pašalino ABTS ir DPPH esant žemoms EC50 vertėms, o tai dar labiau rodo oksidacinio streso slopinimą. LAD ligavimas yra įprastas metodas, naudojamas miokardo I/R modeliams nustatyti. Įvertinę QRS komplekso amplitudę prieš išemiją, po išemijos ir po reperfuzijos, nustatėme, kad išankstinis gydymas 13 junginiu gali žymiai palengvinti skilvelių aritmiją išemijos ir ankstyvos reperfuzijos metu. Be to, 13 junginys paveikė ir infarkto sritis bei miokardo infarkto histopatologinius pokyčius. Šie rezultatai, kartu su išvadomis, kad junginys 13 slopino oksidacinį stresą ir padidino antioksidantų fermentų kiekį žiurkės serume priklausomai nuo dozės, parodė, kad 13 junginys turėjo stiprų poveikį prieš miokardo pažeidimą.

Apibendrinant galima pasakyti, kad anastatino dariniai turėjo stiprių antioksidacinių savybių, o 13 junginys parodė didžiausią antioksidacinį aktyvumą tarp išbandytų junginių. Vis dar reikia aptarti mechanizmus, atsakingus už anastatinų darinių poveikį su oksidaciniu stresu susijusiems signalizacijos keliams. Astaksantinas (karotinoido potipis) gali sunaikinti ROS ir dar labiau palengvinti išemijos / reperfuzijos pažeidimus [15]. Vaistai, galintys užkirsti kelią ROS susidarymui, gali būti perspektyvūs gydant su oksidaciniu stresu susijusias ligas [4], tokias kaip ląstelių terapija ir širdies ir kraujagyslių ligos. Be to, ROS slopina hipoksijos sukeliamo faktoriaus -1 (HF-1) tikslinio geno ekspresijos hipoksinę indukciją, kuri, kaip pranešama, turi kardioprotekcinį poveikį išemijos ir reperfuzijos pažeidimui [16]. Manome, kad ROS ir HIF{10}} reguliuojantys baltymai gali turėti lemiamą vaidmenį 13 junginio kardioprotekciniame poveikyje. Tournefolio rūgštis B (TAB), gaunama iš Kinijos vaistažolių, apsaugo nuo miokardo I/R pažeidimo [17]. ]. Tyrimas atskleidė svarbų TAB vaidmenį endoplazminio tinklo (ER) stresui, apoptozei ir PI3K (fosfatidilinozitolio 3 kinazės) / AKT (baltymų kinazės B) keliams gydant miokardo I/R pažeidimą. Kiti keliai, tokie kaip mitogeno aktyvuotos proteinkinazės (MAPK) kelias [18] ir AMPK (5'-monofosfatu aktyvuotos proteinkinazės) signalizacijos kelias [19], taip pat gali būti susiję su miokardo I/R pažeidimu. Todėl kitas žingsnis – pradėti nuo ROS ir HIF-1 reguliuojančių baltymų ir naudoti TAB tarpininkaujamus kelius, kad ištirtumėte mechanizmus, kuriais 13 veikia antioksidacinį poveikį ir apsaugo miokardo I/R. Be to, šio tyrimo eksperimentai ląstelių lygiu taip pat turėtų būti atliekami su žmogaus ląstelių linijomis.

4. Medžiagos ir metodai

4.1.Ląstelių kultūra

Žiurkių kardiomiocitų H9c2 ląstelių linija buvo įsigyta iš Nanjing Kebai Biotechnology Company (Nanjingas, Kinija). Ląstelės buvo kultivuojamos DMEM / didelės gliukozės (Hyclone, JAV) ir papildytos 10 procentų FBS (Lanzhou Minhai Biological Engineering co.LTD, Lanzhou, Kinija) ir 1 procentu penicilino / streptomicino (Hyclone, Marlborough, MA, JAV) drėgnoje patalpoje. inkubatorius 37 laipsnių temperatūroje su 5 procentais CO2.

4.2. Ląstelių gyvybingumo tyrimas

Ląstelių gyvybingumas buvo matuojamas naudojant MTT tyrimą. H9c2 ląstelės buvo pasėtos į 96-šulinėlių plokštelę 1 × 10* ląstelių/šulinėlių 24 valandas. Po to ląstelės buvo apdorotos anastatinais A ir B ir jų dariniais 48 valandas arba iš anksto apdorotos anastatinais A ir B, o jų dariniai buvo apdoroti H / R. Tada buvo pridėta MTT (20 μl/šulinėlė) ir kultivuojama 37 laipsnių temperatūroje 4 valandas. Sugertis buvo matuojama esant 578 nm, naudojant mikroplokštelių skaitytuvą (Tecan, Infinite 50). Ląstelių gyvybingumas tuščiojoje grupėje buvo laikomas 100 procentų.

4.3. Hipoksijos/reoksigenacijos (H/R) modelis ir vaistų administravimas

4.3.1.H/R modelis

NazS, O4 buvo naudojamas imituoti hipoksinę būklę, kuri reaguoja su [20] deguonimi ir sumažina deguonies įtampą. Siekiant nustatyti optimalias Na2S, O4 koncentracijas, buvo atliktos įvairios septynios 0,5, 1, 2, 3, 4, 5 arba 6 mM koncentracijos. Norint pasirinkti optimalų hipoksijos laiką, po apdorojimo Na2S2O4 tirpalu buvo atliekamos 0,5, 1,2, 3 arba 4 valandų kultūros. Kultūra normalioje DMEM / didelės gliukozės terpėje 0, 1, 2, 3 arba 4 valandas buvo vykdoma siekiant imituoti reoksigenacijos laiką [21].

4.3.2. Vaistų administracija

Vaistų skyrimui anastatinai A ir B bei jų dariniai (cheminės struktūros pateiktos S1 lentelėje) buvo suskirstyti į dvi grupes: anastatinai A ir jo dariniai bei anastatinai B ir jo dariniai. Resveratrolis, kuris, kaip buvo pranešta, dėl savo antioksidacinio aktyvumo turi kardioprotekcinį poveikį, buvo naudojamas kaip teigiama kontrolė. Norint nustatyti teigiamos kontrolės koncentraciją, resveratrolis ir kitas antioksidacinis junginys, galo rūgštis (3-100 μM）), buvo įvertinti naudojant MTT tyrimą, kurio metu ląstelės buvo apdorotos 48 h 【22】. Apskritai, H9c2 ląstelės buvo iš anksto apdorotos anastatinais A ir B ir jų dariniais (10 uM galutinė koncentracija), taip pat 10 uM resveratroliu 30 minučių prieš gydymą H / R.

4.4.Antioksidacinės talpos įvertinimas

4.4.1. Geležies redukcinės antioksidacinės galios (FRAP) tyrimas

FRAP tyrimas buvo atliktas pagal Oivuano metodą 【23】. Iš viso pipete buvo įpilta 25 μL 1 procento kalio fericianido K3Fe (CN)6 ir 10 μL 13 junginio, vitamino c (askorbo rūgšties, Vc) ir resveratrolio (0).{8} Buvo pridėta } mM) plius 1 × PBS (pH=6,6). Mišinys buvo laikomas 50 laipsnių vandens voniose 20 minučių, po to greitai atvėsinamas ledu. Tada iš eilės įpilama 25 μl 10 procentų trichloracto rūgšties (TCA), 0,1 procento geležies chlorido (FeCl) ir distiliuoto vandens. Mišinys buvo perkeltas į 96-šulinėlių plokštelę ir ištirta absorbcija esant 650 nm. Vc tirpalas (20-200 ug/mL) buvo naudojamas standartinei kreivei sudaryti. Antioksidacinės savybės buvo apskaičiuotos pagal tiesinę kalibravimo kreivę ir pateiktos kaip Vc ekvivalentai.

4.4.2.ABTS metodas

ABTS radikalų šalinimo veikla [24] buvo atlikta pagal Sugahara ir kt. ir Re ir kt. ABTS tirpalas buvo praskiestas, kad sureguliuotų absorbcijos spektrofotometriškai ties 650 iš 0,70±0.02 nm, o ABTS pašalinimo aktyvumas buvo išmatuotas pagal šią formulę: E=((Acontrol-Ablank)-(A2 -A1)/(A control-Ablank))) × 10, kur kontrolė yra kontrolinės reakcijos, kurioje yra 130 μL ABTS, absorbcija · plius darbinis tirpalas ir 5,5 μL mėginio skiediklio (DMSO), o tuščiasis yra 130 μL natrio acetato buferio ir 5,5 μL DMSO absorbcija. A yra 130 μL ABTS plius darbinio tirpalo (natrio acetato buferio) ir 5,5 μL junginio 13（0.{24}} mM） absorbcija, o Az yra 130 μL natrio acetato buferio ir 5,5 μL (junginio) absorbcija. 0.{101}} mM). Visi mišiniai buvo maišomi 30 s ir inkubuojami kambario temperatūroje 10 minučių, po to matuojama absorbcija esant 650 nm. ECs0 buvo apskaičiuotas naudojant tiesinį ryšį tarp junginio koncentracijos ir ABTS slopinimo procento tikimybės.

4.5. Išemijos-reperfuzijos modelis

4.5.1.Gyvūnų priežiūra

Sprague Dawley (SD) žiurkės buvo gautos iš PLA karo medicinos mokslų akademijos laboratorinių gyvūnų centro (Pekinas, Kinija). Penkiasdešimt SD žiurkių patinų, sveriančių nuo {{0}} g, buvo aklimatizuojami vieną savaitę 23±1 laipsnio kambario temperatūroje, naudojant 12 valandų šviesos/tamsos ciklą, tiekiamas maistas ir vanduo. Žiurkės buvo suskirstytos į penkias grupes: tuščiąją grupę (žiurkėms buvo negydoma, o fiktyvi operacija), pavyzdinę grupę (žiurkės buvo gydomos nešikliu ir MI/R operacija), resveratrolio grupę (žiurkės gavo 200 mg/kg resveratrolio ir MI/R). operacija), mažos dozės 13 grupė (žiurkėms buvo skirta 100 mg/kg 13 junginio ir MI/R operacija) ir didelės dozės 13 grupė (žiurkėms buvo skirta 200 mg/kg 13 junginio ir MI/R operacija). Junginiai buvo sudaryti iš 0,5 procento natrio karboksimetilceliuliozės ir dozuojami kaip suspensija po 1 ml/kg per burną vieną kartą per parą septynias dienas. Visi eksperimentai su gyvūnais buvo atlikti pagal Nacionalinių sveikatos institutų laboratorinių gyvūnų priežiūros ir naudojimo vadovą ir patvirtinti Tiandzino mokslo ir technologijos universiteto akademinio komiteto.

4.5.2. Eksperimentinis protokolas

Sprague Dawley žiurkės buvo anestezuotos 20 procentų uretano (0,8 ml/100 g), o tada atlikome miokardo išemiją kairiuoju priekiniu nusileidžiančiu (LAD) perrišimu. Širdis buvo apnuoginta per kairiąją krūtinės ląstos pjūvį ir uždėta ant 4-0 šilko siūlės, kad būtų atlikta regioninė išemija 30 min. išemijos, po to 2 val. reperfuzija. Miokardo išemijos požymius patvirtino ST segmento pakilimas ir QRS amplitudės padidėjimas. Eksperimento metu žiurkės buvo laikomos ventiliatoriuje DW3000 (Beijing Zhishu Duobao Biological Technology Co. Ltd, Pekinas, Kinija). Širdies susitraukimų dažnis ir EKG buvo stebimi naudojant biologinio signalo gavimo sistemą MD3000 (Beijing Zhishu Duobao Biological Technology Co. Ltd, Pekinas, Kinija). Po išemijos / reperfuzijos proceso stebėjimo žiurkės buvo nužudytos, o kraujo mėginiai ir širdies homogenatai buvo naudojami miokardo pažeidimui nustatyti naudojant detektyvinius komercinius rinkinius.

4.5.3. TTC dažymas ir HE dažymas

Išeminės srities mastas buvo kiekybiškai įvertintas dažant trifeniltetrazolio chloridu (TTC). Širdies mėginiai buvo nedelsiant užšaldyti {{0}} laipsniu 10 minučių ir buvo padarytos penkios plonos 1–2 mm griežinėlių griežinėliai. Tada griežinėliai buvo dedami į 1 procento TTC fosfato buferį (pH{5}},0) ir 20 min. dažomi 37 laipsnių temperatūroje ir fiksuojami formalinu. Vaizdai buvo gauti naudojant skaitmeninę kamerą, o infarkto zonos (TTC neigiamas) ir rizikos zonos (TTC teigiamas) procentas buvo išmatuotas naudojant ImageJ programinę įrangą [25]. HE dažymui infarkto pažeista vieta buvo iškirpta ir fiksuota 10 procentų formaldehidu, o po to įterpta į parafiną. Po to audiniai buvo nudažyti HE (hematoksilino-eozinu) ir tiriami šviesos mikroskopu. Dehidratuotas įterptąsias dalis ir sandarinimo sekcijas užsakė Tianjin YiSheng Yuan Biotechnology Company (Tianjinas, Kinija).

4.6. Spektrofotometriniai komerciniai rinkiniai

Šiame tyrime naudojami komerciniai rinkiniai buvo įsigyti iš Beijing Solarbio Science & Technology Co. Ltd. (Pekinas, Kinija) ir Nanjing Jiancheng Bioengineering Company (Nanjing, Kinija). Žiurkių serume ir ląstelių supernatante miokardo pažeidimo žymeklis, laktato dehidrogenazė (LDH ), buvo įvertintas kreatinkinazės (CK), glutationo (GSH) ir superoksido dismutazės (SOD) aktyvumas. Malondialdehido (MDA) aktyvumas buvo matuojamas naudojant žiurkės širdies homogenatą. Visi komerciniai rinkiniai buvo pagaminti pagal gamintojo instrukcijas.

4.7.Statistikos procesas

Visi eksperimentai buvo kartojami mažiausiai tris kartus. Eksperimentiniai duomenys buvo apdoroti naudojant GraphPad Prism7 programinę įrangą, o kiekvienos grupės eksperimentinis rezultatas buvo išreikštas kaip vidurkis ± standartinis nuokrypis (x± s). t testas buvo naudojamas statistiniam reikšmingumui tarp grupių palyginti. P<0.05 was="" recorded="" as="" statistically="">

Nuorodos

1. Uzdensky, AB; Demyanenko, S. Histonų acetilinimas ir dezacetilinimas sergant išeminiu insultu. Neuroninis Regenas. Res. 2021, 16, 1529–1530. [CrossRef] [PubMed]

2. Li, H.; Yin, A.; Cheng, Z.; Fengas, M.; Zhang, H.; Xu, J.; Wang, F.; Qian, L. Na/K-ATPazės/Src/ROS stiprinimo signalo kelio susilpninimas naudojant pNaktide pagerina miokardo išemijos-reperfuzijos pažeidimą. Tarpt. J. Biol. Macromol. 2018, 118, 1142–1148. [CrossRef] [PubMed]

3. Levinas, RM; Xia, L.; Wei, W.; Schuleris, C.; Leggett, RE; Lin, ADY Ganoderma Lucidum apvalkalo sulaužytų sporų poveikis triušio šlapimo pūslės oksidaciniam stresui, naudojant in vivo išemijos / reperfuzijos modelį. Mol. Ląstelė. Biochem. 2017, 435, 25–35. [CrossRef] [PubMed]

4. Tanas, Z.; Liu, H.; Daina, X.; Ling, Y.; Jis, S.; Yan, Y.; Yan, J.; Wang, S.; Wang, X.; Chen, A. Honokiol po gydymo pagerina miokardo išemijos / reperfuzijos pažeidimą, sustiprindamas autofaginį ištekėjimą ir sumažindamas intracelulinę ROS gamybą. Chem. Biol. Bendrauti. 2019, 307, 82–90. [CrossRef] [PubMed]

5. Hausenloy, didžėjus; Yellon, DM Miokardo išemijos ir reperfuzijos pažeidimas: nepaisytas gydymo tikslas. J. Clin. Ištirti. 2013, 123, 92–100. [CrossRef]

6. Yu, C.; Li, D.; Li, Z.; Yu, D.; Zhai, G. Sakubitrilo / valsartano poveikis uždegimui ir oksidaciniam stresui doksorubicino sukelto širdies nepakankamumo modelyje triušiams. Acta Pharmaceut. 2021, 71, 473–484. [CrossRef]

7. Wang, Y.; Che, J.; Zhao, H.; Tangas, J.; Shi, G. Platycodin D slopina oksidacinį stresą ir apoptozę H9c2 kardiomiocituose po hipoksijos/reoksigenacijos pažeidimo. Biochem. Biofizė. Res. Komun. 2018, 503, 3219–3224. [CrossRef]

8. Pavlovičius, M.; BNáfrádi Rouster, P. Labai stabilus fermentus imituojantis antioksidacinio aktyvumo nanokompozitas. J. Colloid Interface Sci. 2019, 543, 174–182. [CrossRef]

9. Qi, HZ; Wangi, WZ; Jis, JY Deinococcus radiodurans antioksidacinė sistema. Res. Microbiol. 2019, 171, 822–831. [CrossRef]

10. Šao, L.; Shao, Y.; Yuan, Y. Pinocembrin flavanonas slopina ląstelių gyvybingumą sergant PC-3 žmogaus prostatos vėžiu, skatindamas ląstelių apoptozę, ROS gamybą ir ląstelių ciklo sustabdymą. Acta Pharmaceut. 2021, 71, 669–678. [CrossRef]