Ribes Meyeri Antocianinų anti-senėjimo poveikis nervinėms kamieninėms ląstelėms ir senstančioms pelėms 2 dalis

Susisiekite suoscar.xiao@wecistanche.comdaugiau informacijos

Nar gelbsti senescencinius 23M-NSC fenotipus

R. Meyerio antocianinuose gausu įvairių rūšių flavonoidų ir bioaktyvių komponentų [1,3-5]. Norėdami nustatyti, kuris R. Meyerio antocianinų komponentas vaidina svarbų vaidmenį anti-senėjimo procese, atlikome metabolominę R. Meyer antocianinų analizę. Mes atskleidėme, kad Nar gali būti svarbus flavonoidų metabolitas, nes flavonoidų biosintezės kelias buvo labai praturtintas R. Meyer antocianinais (1 papildoma lentelė). Siekiant nustatyti Nar anti-senescencinį poveikį, 23M-NSC ir CCK-8 tyrimams buvo naudojamos įvairios koncentracijos (0, 1,7,3,4,6,6,8,13,6 ir 27,2 μg/ml). Kaip parodyta 3 papildomame paveiksle, gydymas 6,8 μg/ml Nar padidino ląstelių gyvybingumą 150 %. Norėdami toliau tyrinėti nar anti-senescencinį poveikį, 23M-NSC buvo gydomi Nar, o tada buvo aptikti su senėjimu susiję rodikliai.hesperidinas naudoja23M-NSC, gydytų 6,8 μg/ml Nar, p16nk4a mRNR ekspresija buvo sumažinta (3A pav.). Nar taip pat prailgino kultivuotų mNSC telomerus ir padidino DNR sintezę (3B,3C pav.). Norėdami toliau tyrinėti Nar poveikį ląstelių proliferacijai, atlikome Ki67 imunofluorescencinį dažymą, kuris yra mitozinių ląstelių branduolinis antigenas, išreikštas per visą ląstelių ciklą, išskyrus G0 [19,27]. Gydymas Nar sustiprino ląstelių proliferaciją, išmatuotą padidėjusiu Ki67 teigiamų ląstelių skaičiumi (3D, 3E pav.). Toliau mes taip pat aptikome NSC diferenciacijos potencialą į neuronus. Iš tiesų, gydymas 6,8 rugpjūčio / ml Nar taip pat padidino MAP2 teigiamų ląstelių skaičių (3F,3G pav.). Šie rezultatai nuosekliai rodo, kad Nar gali pakeisti 23M-NSC senescenciją.

2 pav. Ribes Meyer antocianinai pagerina pelės atmintį ir mokymosi gebėjimus, didindami nervines kamienines ląsteles (NSC). eurų. Platformai rasti reikia laiko. eurų. Reikia laiko, kad pirmą kartą pasiektumėte platformą. (C) Vidutinis greitis norint rasti platformą. eurų. Atstumas plaukė prieš surandant platformą. (E. F) Gydymas R.prarasta imperijakiekvienas antocianinas padidino neurosferos skaičių ir dydį, palyginti su kontroliniais. (G) 50-100 um dydžio neurosferų skaičius padidėjo gydant R. Meyer antocianiną pelėms. Duomenys pateikiami kaip trijų nepriklausomų eksperimentų vidutinis ±SD. *P<><0.01, and=""><0.0001 compared="" with="" untreated="" cells."n"="" indicates="" the="" number="" of="" animals="" in="" each="" experimental="">

3 pav. Naringenino(Nar) poveikis pelių nervinių kamieninių ląstelių (DB) senescencijai. (A) p16k4a mRNR ekspresija buvo išmatuota qRT-PCR 23M-NSC, kai 6,8 ug/ml Nar buvo apdorotas ir be jo 48 h. (B) 23M-NSC ląstelių ciklo fazių pasiskirstymas, apdorotas Nar 48 h ir kontrolinėmis ląstelėmis. (C) Santykinis telomerų ilgis 23M-NSC žymiai padidėjo gydant Nar, (D)Imunofluorescencija Ki67 raumenų, gydytų Nar 48 h, dažymas su DAPI branduoliniu ženklinimu, (E) MAP2 tipinių laukų kiekybinis įvertinimas ir kultivuotų mNSC GFAPimmunofluorescencijos dažymas po kontrolės ir nar apdorojimo. G) (F) kiekybinis įvertinimas. Duomenys pateikiami kaip trijų nepriklausomų eksperimentų vidurkis± SD. *P<>< 0.01,="" and="">< 0.0001="" compared="" with="" untreated="">

Norėdami sužinoti daugiau, spustelėkite čia

Nar pagerina senstančių pelių atmintį ir pažinimą

Kognityvinis lygis mažėja senstant, o anti-senėjimo gydymas gali pagerinti kognityvinį lygį [11, 28]. Norėdami patikrinti Nar in Vivo anti-senėjimo poveikį, mes suleidome 20 mg/kg Nar į senstančias C57BL/6 peles (12 mėnesių) per uodegos veną. MWM testas buvo naudojamas pelių erdvinei atminčiai ir kognityviniams gebėjimams ištirti.mikronizuota išgryninta flavonoidų frakcija 1000 mgPer 5 dienas nuo pakartotinių treniruočių laikas, per kurį Nar gydėmos senstančios pelės, kad surastų platformą, palaipsniui mažėjo, palyginti su kontroline grupe (4A pav.). Bandymų rezultatai atskleidė, kad laikas, kurio prireikė norint pirmą kartą pasiekti platformą, buvo sutrumpintas (4B pav.), o laikas, praleistas platformos zonoje, buvo padidintas (4C pav.). Be to, Nar-gydomos senstančios pelės platformos zonoje buvo stebimos dažniau nei kontrolinė grupė (4D pav.). Kartu šie rezultatai rodo, kad Nar gali pagerinti senstančių pelių erdvinę atmintį ir kognityvinius gebėjimus.

Nar apdoroto kraujo iš senstančių pelių RNR sekos nustatymo analizė

Norėdami ištirti Nar specifinius anti-senėjimo mechanizmus, mes išanalizavome Nar apdoroto kraujo genų ekspresijos profilį iš senstančių pelių, naudodami RNR seką (RNR-seq). Rezultatai atskleidė 1 961 diferencijuotai išreikštą geną (DEG). Paprastai Naras sumažino genų ekspresiją ir tik nedidelis genų skaičius buvo reguliuojamas, palyginti su negydoma kontroline grupe (5A, 5B pav.). Be to, svarbūs signalizavimo kelio genai, susiję su senėjimu, buvo nereguliuojami, ypač TNF signalizacijos kelyje (5C pav.).oteflavonoidą,Šie rezultatai rodo, kad Nar veikia TNF signalizacijos kelią, taip giliai įtakodamas TNF-a funkciją, kuri yra susijusi su su senėjimu susijusiais pažinimo sutrikimais [29,30]. Todėl mes ištyrėme TNF-α kiekį pelių plazmoje. Imunosorbentinių tyrimų (ELISA) su fermentais susiję rezultatai

4 pav. Naringeninas (Nar) pagerina senstančių pelių atmintį ir mokymosi gebėjimus. eurų. Nar gydytų senstančių pelių pabėgimo delsa buvo trumpesnė, palyginti su kontroline grupe. (B) Laikas, kurio prireikė norint pirmą kartą pasiekti platformą, naru gydomoms senstančioms pelėms buvo trumpesnis nei kontrolinėje grupėje. C) Perono zonoje praleisto laiko trukmė. (D) Nar gydytų senstančių pelių platformos zonoje stebėjimo dažnis, palyginti su kontroline grupe. Duomenys pateikiami kaip trijų nepriklausomų eksperimentų vidutinis ±SD.*P<>< 0.01,=""><0.0001 compared="" with="" the="" control="" group.“n”="" indicates="" the="" number="" of="" animals="" used="" for="" each="" experimental="" group.="" revealed="" that="" nar="" treatment="" led="" to="" the="" downregulation="" of="" plasma="" tnf-a="" levels="" (figure="" 5d).="" we="" also="" examined="" pl6ink4agene="" expression="" in="" the="" hippocampus="" of="" mice="" and="" demonstrated="" that="" nar="" treatment="" downregulates="" pl6ink4amrna="" expression(figure="">

Cistanche gali anti-senėjimą

DISKUSIJA

Senėjimas yra susijęs su padidėjusia kognityvinio nuosmukio rizika, taip pat mokymosi ir atminties gebėjimų praradimu [22,23]. Neuronų praradimas ir sutrikusi neurogenezė yra glaudžiai susiję su su amžiumi susijusia smegenų disfunkcija [11-13]. Taigi neuronų skaičiaus didinimas ir neurogenezės gerinimas yra labai svarbūs gydant anti-senėjimą. R. Meyeris, augalas, turintis daug flavonoidų ir kitų bioaktyvių medžiagų [1, 3-6], turi daug funkcijų, kurios dar nebuvo aprašytos. Šiame tyrime R. Meyer antocianinai skatino NSC proliferaciją ir padidino neurosferų formavimąsi su vienoda morfologija. Gydymas R. Meyer antocianinu taip pat pagerino ląstelių senėjimo fenotipą, sumažėjus ROS kiekiui ir su senėjimu susijusiai P16nk4 genų ekspresijai, padidėjusiai DNR sintezės fazei ir pailgėjusiems telomerams.puritanai vitaminas cBe to, imunofluorescencijos dažymo rezultatai atskleidė, kad R Meyer antocianinai skatino neuronų susidarymą. Šie rezultatai rodo, kad R. Meyerio antocianinai turi anti-senėjimo poveikį mNSC, taip pat gali tiesiogiai skatinti neuronų susidarymą in vitro. Be to, kognityvinis nuosmukis yra glaudžiai susijęs su senėjimu [22, 23]. Mūsų MWM rezultatai parodė, kad R. Meyer antocianinų intragastrinis vartojimas pagerino senstančių pelių erdvinę atmintį ir mokymosi gebėjimus, taip pat padidino

5 pav. Naviko nekrozės faktorius (TNF)-a vaidina esminį vaidmenį naringenino (Nar) tarpininkaujamame anti-senėjimo procese. (A) Genų ekspresijų pelių kraujyje santrauka, nustatyta RNR-seq. eurų. Šilumos žemėlapis, rodantis diferencijuotai išreikštus genus (DEG) kraujyje tarp kontrolinių ir Nar apdorotų pelių. DEG buvo nustatyti pagal >2,0 arba<0.5. (c)bar="" graph="" showing="" the="" major="" correlated="" signaling="" pathways.="" (d)="" heatmap="" showing="" degs="" in="" the="" tnf="" signaling="" pathway="" (e)="" plasma="" tnf-a="" levels="" determined="" by="" enzyme-linked="" immunosorbent="" assay.="" (e)="" p16hka="" gene="" expression="" levels,="" as="" determined="" by="" qrt-pcr.="" data="" are="" presented="" as="" the="" mean="" ±="" sd="" of="" three="" independent=""><><><0.0001 compared="" with="" the="" control="" group.="" nsc="" and="" neuronal="" numbers="" in="" the="" hippocampus="" of="" aging="" mice.="" these="" results="" suggest="" that="" r.="" meyer="" anthocyanins="" may="" enhance="" cognitive="" function="" by="" increasing="" nsc="" proliferation="" and="">

Metabolominės analizės naudojimas konkrečiai R. Meyer antocianinų sudėčiai ištirti atskleidė, kad Nar gali būti svarbus flavonoidų metabolitas. Anksčiau buvo pranešta, kad Naras palengvina miokardo ląstelių senescenciją [31], pagerina žarnyno trakto metabolinį pajėgumą [32] ir sukelia priešuždegiminį [33] bei priešvėžinį poveikį [34]. Tačiau Nar poveikis NSC senėjimo metu lieka nežinomas. Norėdami ištirti R. Meyerio antocianinų anti-senėjimo poveikį, atlikome tolesnius tyrimus naudodami Nar. Gydymas 6,8 ug/ml Nar padidino ląstelių gyvybingumą, sumažino P16ink4a genų ekspresiją, pailgino telomerus ir skatino NSC diferenciaciją į neuronus in vitro. Norėdami toliau vertinti Nar poveikį ląstelių proliferacijai, atlikome imunofluorescencijos tyrimus. Rezultatai parodė, kad nar gydymas padidino tiek Ki67 teigiamų ląstelių skaičių, tiek MAP2 teigiamų ląstelių dalį, o tai rodo, kad Nar gali skatinti neurogenezę. Be to, Nar poveikis mokymuisi ir atminčiai taip pat buvo įvertintas senstančioms pelėms. MWM testo rezultatai nuosekliai parodė, kad Nar gydymas pagerina senstančių pelių erdvinį lemą. Įdomu tai, kad RNR-seq analizė atskleidė, kad Nar gali paveikti senescenciją per TNF signalizacijos kelią, ypač sumažindamas TNF-a ekspresiją senstančių pelių kraujyje. ELISA tyrimai taip pat parodė, kad Nar gydymas sumažino TNF-a koncentraciją plazmoje, palyginti su kontrolinėmis senstančiomis pelėmis. TNF-a yra pagrindinis TNF signalizacijos kelio veiksnys ir yra glaudžiai susijęs su kognityviniu senėjimu. Jo funkcijos apima hipokampo sinapsių patologinių pokyčių skatinimą [29] ir pirmtakų ląstelių proliferacijos slopinimą [35]. Pakitęs TNF lygis yra susijęs su kognityviniais sutrikimais depresijos, šizofrenijos, bipolinio sutrikimo ir Alzheimerio ligos atvejais [30,36,37]. Konkrečiau kalbant, TNF-a yra reguliuojamas pacientams, sergantiems Alzheimerio liga [38].

Apibendrinant, mūsų tyrimas rodo, kad R. Meyerio antocianinai pagerina senėjimo poveikį NSC per Nar, kuris sumažina TNF-a lygį in vivo ir pagerina senstančių pelių pažinimą. Kartu mūsų išvados pateikia naują klinikinių gydymo būdų kūrimo strategiją, kuria siekiama geriau realizuoti R.Meyerio antocianinų medicininę vertę.

MEDŽIAGOS IR METODAI

Eksperimentiniai gyvūnai

Šį tyrimą patvirtino Tongji universiteto gyvūnų priežiūros komitetas ir jis buvo atliktas pagal institucines gaires. R. Meyerio antocianinai buvo administruojami intragastriškai 2 mėnesius 12 mėnesių amžiaus pelėms, išlaikytoms C57BL/6 fone. Naras buvo švirkščiamas į caudalinę veną nuo 1 mėnesio iki 12 mėnesių pelių, palaikomų C57BL/6 fone. Kontrolinėms pelėms buvo duodamas toks pat fosfatinio buferinio fiziologinio tirpalo (PBS) tūris.

R. Meyerio antocianinų ir Nar paruošimas

R. Meyer vaisiai(500 g)buvo homogenizuoti naudojant audinių homogenizatorių ir suspenduoti 1 l metanolyje, kuriame yra 0,1% hvdrochloro rūgšties. Ultragarsinis ekstrahavimas buvo atliktas tris kartus 30 min. Kambario temperatūroje. Ekstraktai buvo sujungti, o metanolis buvo koncentruotas esant sumažintam slėgiui, kad gautų R Meyer ekstraktus. Ekstraktas buvo toliau gryninamas AB-8 makroporine derva, siekiant padidinti antocianino kiekį.

Naringeninas(C15H1205; MW:272.25; grynumas: ≥98%; HPLC klasė) buvo įsigytas iš Chengdu Push Biotechnology Co. Ltd.(Sičuanas, Kinija) ir laikomas 2 °C-8 °C temperatūroje sausoje aplinkoje be šviesos. Pradinio tirpalo koncentracija dimetilsulfokside (DMSO) buvo 100 mM. Galutinė DMSO koncentracija kultūros terpėje neviršijo 0,1%.

Neurosferos ir diferenciacijos tyrimai

NSC buvo gauti iš pelės SVZ. Pelės buvo paaukotos po anestezijos, o SVZ buvo kruopščiai išpjaustytas ir išskaidytas į atskiras ląsteles su 0,4 U/ml papainu (Imogen, Alexandria, VA, JAV; Katinas Nr.: LS003126). NSC buvo dedami į 10 cm lėkšteles, kuriose buvo 10 ml NSC Basal Medium su 10 ng/ml EGF (PeproTech, Cranbury, NJ, JAV; Cat No:AF-100-15) ir 10 ng/mL FGF (PeproTech, Cranbury, NJ, JAV; Katė Nr.:AF-100-18B). Neurosferos buvo praeinamos kas 5 dienas. NSC iš šviežiai disocijuotų praeivių-2 neurosferų buvo pasėtos ant laminino(Gibco, Gaithersburg, MD, JAV; Katė Nr.: 23017015) ir poli-L-ornitino hidrobromidas (Poly-L; Sigma Aldrich, Sent Luisas, MO, JAV; Katės Nr.: P3655) dengtos stiklo čiuožyklos NSCBasalMedium be diferenciacijos priedų. Diferencijuotos ląstelės buvo imunostifikuotos Tu1(beta-tubulinas II; Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, JAV; Katė Nr.: 480011), MAP2 (Thermo Fisher Scientific, Kat. Nr.: MA5-12826) ir glialinis fibriliarinis rūgštinis baltymas (GFAP; Thermo Fisher Scientific, katė Nr. PA5-16291), o po to kontratakavo su 4'6-diamidino-2-fenilindole (DAPI; Thermo Fisher Scientific, Katinas Nr.: D1306). Skaidrės buvo tiriamos naudojant Olympus BX53 mikroskopą (Olympus, Madison, WI, JAV). TuJ1 ir MAP2 teigiamų ląstelių kiekybinis įvertinimas buvo atliktas skaičiuojant pažymėtas ląsteles iš trijų nepriklausomų eksperimentų. Statistinė analizė buvo atlikta naudojant nesusietą t-testą.

Šis straipsnis paimtas iš www.aging-us.com SENĖJIMAS 2020, 12 tomas, Nr. 17