ltKalba
Namuose / Išmanymas / Turinys

Išmanymas

Autofluorescencija kaip neinvazinis senėjimo ir pažangios glikacijos galutinių produktų biologinis žymeklis Cistanche Tubulosa

Apr 11, 2023

DISKUSIJA

Anksčiau autofluorescencija buvo naudojama lipofuscinui, amžiaus pigmentui, stebėti kaip senėjimo biomarkeris.4,13. Nors stebėjome raudonąFluorescencija, rodanti lipofusciną, kaip matyti ankstesniuose tyrimuose9, mėlynafluorescencija buvo aptikta ankstesniame gyvenimo etape, kai kirminai buvo tiriami naudojant M165 FCFluorescencinis stereomikroskopas (Leica Microsystems, Tokijas, Japonija) (duomenys nerodomi). Šio tyrimo tikslas buvo ištirti, ar mėlyna autofluorescencija galėtų būti jautresnis žymeklis atskirų kirminų senėjimui atsekti.

anti- senescence cistanche function

Cistanche UžAnti-senescencija

Buy Cistanche

Senėjimą stabdantis „Cistanche“ produktas paruoštas pristatymui


TheFlatskirų kirminų uorescencija padidėjo su amžiumi; tuo mažiau kirminųfluorescuoti, tuo ilgesnė jų gyvenimo trukmė. Taigi, mėlynaFluorescencija gali būti alternatyvus biomarkeris senėjimui atsekti. Tačiau Pincus ir kt. pranešė, kad kirminai, kurie vėliau mirė (per 24 val.)Fluorescuojamas dėl kinurenino biosintezės; tie tyrinėtojai pavadino šią mėlyną šviesą"mirtisFluorescencija". Pranešama, kad mirtisFluorescencija reFlveikia glikozilintos antranilo rūgšties, pagamintos kinurenino keliu, emisiją; mašinaFluorescuojanti medžiaga aptinkama į lizosomas panašiose žarnyno granulėse31. Ši mėlyna šviesa gali būti tas pats mirties žymeklis, kurį Coburn ir kt. pastebėta mC. eleganskelias valandas prieš mirtį ir po mirties, ir tai buvo pastebėta tiek jauniems kirminams, kurie buvo mirtinai sužaloti, tiek kirminams, kurie natūraliai miršta nuo senatvės. Iš tiesų, mes pastebėjome, kadmalonus-1mutantas, kuriam trūksta kinureninazės aktyvumo, buvo mažiau autofluorescencinis nei laukinio tipo. Tačiau mūsų rezultatai parodė, kad dalis mėlynos spalvosFluorescencija siejama su senėjimu, o ne su mirtimi. Pažymėtina, kaip parodyta fig.3b, senstantys kirminai pasižymėjo padidėjusia mėlyna spalvaFluorescencija net neįskaitant duomenų, gautų per 2 dienas iki mirties. Be to, kirminai vis darFluoresced daugiau senstant, nepriklausomai nuo būklėskynu-1genas. SumažintasFluorescencijakynu-1mutantas turėtų būti dėl praradimoAGE sintezės pagreitis kinureninais, o ne mirties trūkumasFluorescencija32.


Tam tikri AGE junginiai yraFluorescentinis27. Mes padarėme išvadą, kad mėlynaFluorescencija gali apimti emisiją iš tų AGE, atskirai nuo tos, kuri priskiriama mirčiaiFluorescencija. Kai ekstrahuoti kirminų baltymai buvo inkubuojami su cukrumi in vitro,fluorescencijos intensyvumas ir AGE lygiai laikui bėgant didėjo. Kirminai, auginami terpėje, kurioje yra ribozėsFluorescuoja daugiau nei kontroliniai gyvūnai auginami be papildomos ribozės, net kaikynu-1buvo mutavęs. Priešingai, kirminai, auginami naudojant rifampiciną, žinomą AGE gamybos inhibitorių, sumažino mėlynos spalvos kiekį.Fluorescencija. Iš tiesų, fluorescencinė mikroskopija parodė, kad 13-viendieniai kirminai skleidė daugiau mėlynos šviesos nei 3-dienų senumo jauni suaugusieji. Imuninis dažymas anti-LML arba anti-pentosidino antikūnais neparodė difuziškai plintančių AGE pasiskirstymo modelio, panašaus į mėlyną.Fluorescencija. TheFluorescencija gali kilti iš kitų gausiųFluorescuojantys AGE, tokie kaip vespertinas A, LM-1 ir argpirimidinas33,34.


Norėdami gauti trynį oocistoms,C. eleganshermafroditai suvartoja savo žarnyno biomasę, todėl vėlesniame amžiuje atsiranda žarnyno atrofija ir negimdinis trynio nusėdimas. Vitellogeninų (trynių baltymų) senų kirminų organizme buvo dvigubai daugiau (palyginti su jaunesniais gyvūnais), kaip buvo pranešta anksčiau.35, o eksponuojama šešis kartus didesnėFluorescencija po glikacijos in vitro. Šie duomenys rodo, kad patys vitellogeninai generuos 12-kartąfluorescencija vyresnio amžiaus kirminuose, palyginti su jaunų suaugusiųjų teoriškai. Western blot tyrimas parodė, kad pagrindinės juostos, reaguojančios su anti-LML antikūnu, buvo trynio baltymai. Ši išvada atitinka ankstesnes Nakamura ir kt. ataskaitas, kurios aptiko sunkų vitellogenino glikaciją36ir Golegaonkar ir kt., kurie aptiko sumažėjusią glikaciją vitellogenino -2, vitellogenino-6 ir pailgėjimo faktoriaus 1 alfa rifampicinu gydytiems nematodams30. Pranešama, kad vitellogeninai veikia kaip antioksidantai ir prisideda prie bičių motinėlių ilgaamžiškumo37. ĮC. eleganai, vitelogeninai vaidina lemiamą vaidmenį atsparumui stresui 38. Kadangi antioksidantai gali lengvai oksiduotis patys, glikuoto vitellogenino kaupimasis gali pabloginti apsaugą nuo oksidacinės pažaidos, todėl gali atsirasti atvirkštinis ryšys tarp gyvenimo trukmės ir mėlynos spalvos intensyvumo.Fluorescencija, pastebėta šiame tyrime. Tačiau Sornda ir kt. neseniai pranešė, kad gyvenimo trukmė nėra susijusi su atsparumu oksidaciniam stresui, kurį sukelia YP115/YP88 (vitelogeninas-6)39. Tie mokslininkai pasiūlė, kad vitellogenino YP170, gauto iš vitellogeninų 1, kaupimasis–5, sukelia žarnyno atrofiją ir sutrumpina gyvenimo trukmę, o YP115 / YP88 kaupimasis gali sulėtinti žarnyno atrofiją ir pailginti gyvenimo trukmę. Vitellogenino-6 glikacija ir dėl to atsirandanti disfunkcija gali prisidėti prie senėjimo. Nors pailgėjimo veiksniaiFluorescuoja tris kartus intensyviau po glikacijos in vitro, šių baltymų kiekiai buvo panašūs tarp jaunų ir senų kirminų. Todėl šio veiksnio indėlis į sustiprintą autofluorescenciją gali būti mažesnis nei priskirtinas vitellogeninams.

anti- senescence cistanche function


Cistanchepaprastai buvo naudojamas kaip pavyzdysstudijuotisenėjimo ir senėjimo intervencijos. Mes pasiūlėme naudoti kirminą kaip modelį, skirtą ilgaamžiškumo poveikiui ištirtipieno rūgšties bakterijų8. Atsižvelgiant į demonstraciją (šiame tyrime), kad mėlynaFluorescencija nematoduose yra galimas AGE kaupimosi rodiklis, mes tai siūlomeCistanche hermafroditai gali būti pavyzdys tiriant senėjimą stabdančių intervencijų, veikiančių slopinant AGE gamybą, naudingumą. Priešingai, mažai tikėtina, kad autofluorescencija būtų patinų kirminų senėjimo biologinis žymeklis, nes vitelogeninų turi būti nedaug.

anti- senescence cistanche function

5 pav. Mėlyna fluorescencija iš kynu-1 mutantų, kurie neturėtų skleisti mirties fluorescencijos. a7-dienų ir 13-dienų senumo fluorescencijos intensyvumas (ex 340/em 430)kynu-1mutantai (n = po 37); vyresni kirminai vis tiek išmetė daugiauFluorescencija nei jaunesni kirminai, nepaisantkynu-1mutacija. Tačiau jokios reikšmėsfifiMann aptiko autofluorescencijos verčių skirtumą–WhitneyU bandymas.b 7-Dienos kirminas, prižiūrėtas riboze, skleidė daugiau mėlynos spalvosFluorescencija, nepaisantmalonus-1mutacija. MėlynaFluorescencijaC. elegansauginamas su riboze (n = 24) arba sorbitolis (n = 18) buvo lyginamas su kontrolinių kirmėlių be cukrų (n = 20). Autofluorescencijos vertės buvo palygintos naudojant neparametrinį plieną–Dwass metodas (**p < 0.01). c Išgyvenimo kreivėsC. elegansauginamas su riboze (n = 62) arba sorbitolis (n = 84) buvo lyginami su kontrolinių kirmėlių be cukrų (n = 64). Kirmėlės buvo 3 dienų amžiaus 0 dieną. Nematodų išgyvenamumą apskaičiavo Kaplanas–Meier metodas ir išgyvenamumo skirtumai buvo patikrinti dėl reikšmingumo naudojant log-rank testą (**p < 0.01).


METODAI

NematodaiCistanche Bristolio padermę N2 ir jo išvestines mutantines padermes maloniai pateikė Minesotos universiteto Caenorhabditis genetikos centras. Šiame tyrime naudotos mutacijos buvo CB1370daf-2 (e1370)ir CB1003Kynu-1 (E1003). Nematodai buvo palaikomi ir dauginami naudojant NGM pagal standartinę techniką 40. Suaugusių kirminų kirmėlių kiaušinėliai buvo paimti po poveikio natrio hipochlorito/natrio hidroksido tirpalu, kaip aprašyta anksčiau 41. Kiaušinių suspensijos buvo inkubuojamos per naktį 25 laipsnių temperatūroje, kad būtų galima išperėti, ir suspensija L1- stadijos kirminų buvo centrifuguotas 156 ×g 1 min. Supernatantas buvo pašalintas, o likusios lervos buvo perkeltos į šviežias be peptono modifikuotas NGM (mNGM) plokšteles, padengtasE. colipadermė OP50 (OP50). Padermės buvo auginamos mNGM agaro plokštelėse 25 laipsnių temperatūroje, išskyrusdaf-2štamas, kuris buvo auginamas 20 laipsnių temperatūroje iki L4 stadijos. Visi tyrimai buvo pradėti nuo jaunų suaugusių kirminų, kurie pradėjo dėti kiaušinėlius 25 laipsnių temperatūroje. Nematodams nereikėjo jokio etinio patvirtinimo.Bakterijų padermėsOP50 buvo naudojamas kaip tarptautiniu mastu pripažintas nematodų maistas. OP50 auginimui buvo naudojamas triptoninis sojų agaras (Nissui Pharmaceutical, Tokijas, Japonija). Bakterijos (100 mg šlapio svorio) buvo suspenduotos 0,5 ml M9 buferio; po to 50-µL bakterijų suspensijos alikvotinė dalis buvo paskleista ant mNGM 55- cm skersmens plokštelėse, jei nenurodyta kitaip.


anti- senescence cistanche function

Daugiamatė autofluorescencijos analizė

Po 100 suaugusiųjų populiacijos buvo atkurtos 3 ir 17 dienų amžiaus.tris kartus plaunamas, koncentruojamas 3 µl M9 buferio ir laikomas užšaldytasadresu–80 laipsnių iki naudojimo. Prieš ekstrahavimą, 3 µL lizės buferio (sudaryto iš50 mM Tris-HCl buferio (pH 7,5), 150 mM NaCl, 0,1 proc. natrio dodecilsulfato(SDS), 1 proc. Triton X-100, 1 mM fenilmetilsulfoniloFluoridas (PMSF) ir
Į kiekvieną mėgintuvėlį buvo paskirstyta 2 procentai 2-merkaptoetanolio) ir 4 µl 15 procentų SDS. Tada buvo atlikti mėginiaifive užšaldymo-atšildymo ciklus, kad išsiskirtų baltymai. Fotoliuminescenciniai spektrai buvo surinkti naudojant aFluorescencijaspektrofotometras (Hitachi FL{{0}}) su duomenų interpretavimo programine įranga (FL Solutions versija 2.0). Nematodų suspensijų fluorescencinės savybės buvo

analizuojama naudojant sužadinimo-emisijos matricą (EEM)Fluorescencinė spektroskopija. Daugiamatė analizė (vieno bangos ilgio sužadinimas su keliaisbangos ilgio emisija ir sinchroninis nuskaitymasFluorometrija) davė EEM diagramas, susidedančias iš vieno nuskaitymo sužadinimo ir sinchroniniofluorescencijabuvo nubrėžti kiekvienos serijos spektrai.



Senstančių kirminų fluorescencijos spektrai

Kirminai (3–13 dienų amžiaus) buvo paimti iš auginimo terpės, kurioje yra 2'-deoksi-5-Fluorouridinas (Tokijo chemijos pramonė, Tokijas, Japonija). Taijunginys blokuoja palikuonių embrioninį vystymąsi, taip užkertant kelią užteršimui palikuonimis. Buvo surinkti atskiri senstantys kirminaivamzdeliai, išplautipenkioskartų, sukoncentruotas 3 µl M9 buferio ir laikomas užšaldytas–80 laipsnių iki naudojimo. Prieš ekstrahavimą, 100 µL lizės buferio(susideda iš 50 mM Tris-HCl buferio (pH 7,5), 150 mM NaCl, 10 mM ditiotreitolio (DTT), 1 mM PMSF ir 1 µL proteazės inhibitorių kokteilio (Sigma, Sent Luisas, MO, JAV)). kiekvienas vamzdelis. Tada mėginiai buvo sumalti naudojant mini akumuliatorinį malūnėlį (Funakoshi, Tokijas, Japonija), kad būtų galima išlaisvinti
baltymas. Baltymų kiekis buvo kiekybiškai išmatuotas naudojant Pierce™ 660 nm baltymų tyrimo reagentas (Thermo Fisher Scientific Meridian,Waltham, MA, JAV) ir „NanoDrop OneC“ instrumentas („Thermo Fisher Scientific“.). Thefluorescencijaspektras buvo nustatytas kiekvienam 30-µL mėginiui (turinčiam 1,5μg viso baltymo) naudojant daugiamodes groteles

mikroplokštelių skaitytuvo modelis SH-9000Lab su SF6 duomenų apdorojimo programine įranga(„Corona Electric“, Ibaraki, Japonija). Kiekvienas matavimas buvo atliktas tris kartus.


image

Atskirų gyvų kirminų autofluorescencijos matavimas (įvyniojimo metodas)

Atsitiktinai atrinkti kirminai buvo nuplauti M9 buferiu, o po toatskiri kirminai buvo patalpinti į 1.{1}} µL M9 buferio ant Saran Wrap klijųfilm (Asahi Kasei, Tokijas, Japonija) ištemptas virš 384-šulinėlio juodos plokštės(STEM, Tokijas, Japonija). Ant kiekvieno šulinio buvo suformuoti nedideli įdubimai, naudojant areplikatorius (Watson, Kobe, Japonija). Ši modifikacija buvo skirta saugiai atkurti kirminus po matavimo, kad būtų galima atsekti nuo amžiaus priklausomą kiekvieno kirmino autofluorescencijos pokytį. Prilipimasfilm buvo pasirinktas, nes jis automatiškai fluorescuoja mažiau nei kiti parduodamifilms.

Tačiau tušti (tik M9 buferio) duomenys buvo patikrinti tris kartuskiekvienas šulinys, atsižvelgiant įsvyravimasiš šulinio į šulinį. Minimalios aptikimo ribos ir kiekybiškai įvertinamos ribos buvo nustatytos remiantis tuščiais kiekvienos dienos duomenimisμ (tuščios reikšmės vidurkis)pliusas3.29σ (standartinis nuokrypis) irμpliusas√2 × 10σ, atitinkamai. Autofluorescencija kiekvieno kirmino kūne

buvo užfiksuotas daugiamodiu grotelių mikroplokštelių skaitytuvu. Po tokiekvienas kirminas buvo atskirai prižiūrimas 4.{1}}cmskersmens plokštelė, padengta OP50 (2 mg/10μL M9 buferis) 25 laipsnių kampu. Kiekvienastyrimas buvo atliktas su mažiausiai 20 kirminų ir pakartotas du kartus.


Gyvenimo trukmės matavimas

Kirminai buvo laikomi mNGM plokštelėse, padengtose OP50, 25 laipsnių temperatūroje iki 13 dienų. Po įvertinimo pagalfluorescencijapo 30 kirminųperkelta ant atskirų naujų mNGM plokščių, padengtų OP50. Plokštelės buvo inkubuojamos 25 laipsnių temperatūroje, o gyvi ir negyvi kirminai buvo vertinami kas 24 valandas. Kirminas buvo laikomas mirusiu, kai nereagavo į švelnų sliekų rinktuvo prisilietimą.

anti- senescence cistanche function


AGE po glikacijos in vitro

Baltymų ekstrahavimas buvo atliktas taip, kaip aprašyta anksčiau. Dirbtinai glikacijai buvo naudojami trijų dienų kirminai. Baltymų mėginiai (2 mg/ml)buvo inkubuojami su 500 mM gliukozės, 100 mM ribozės arba 500 mM fruktozės(finalinė koncentracija). Visi mėginiai buvo inkubuoti 37 laipsnių temperatūroje 0–4 savaites. Alikvotinės dalys (50μL) buvo išpilstytos į polistireno plokštelės šulinius
(Sumitomo Bakelite, Tokijas, Japonija) ir inkubuojamas 2 valandas 37 laipsnių temperatūroje. Po topašalinus mėginio tirpalą, plokštelė plaunama PBS-T(fosfatiniu buferiniu tirpalu (PBS), 0,05 proc. Tween 20); 250μL 3 procentų lieso pienobuvo pridėta į kiekvieną šulinėlį ir plokštelė buvo inkubuojama 2 valandas 37 laipsnių temperatūroje. Kiekvienasgerai, tada buvo nuplautas PBS-T ir 100μL anti-AGE (anti-LML)
monokloninis antikūnas (klonas Nr. 6D12, Trans Genic, Fukuoka, Japonija; 75 ng/ml) buvo išpilstytas į kiekvieną šulinėlį; tada plokštelė buvo inkubuojama kambaryjetemperatūra 1 val. Po plovimo PBS-T, 100μL peroksidaze konjuguotasožkos anti-pelės IgG antikūnas (Rockland Immunochemicals, Inc., Limerick, PA, JAV; 1:150, 000) buvo išpilstytas į kiekvieną šulinėlį ir
plokštelė buvo inkubuojama kambario temperatūroje 1 val. Po plovimo PBS-T, 100μL darbinio tirpalo (tetrametilbenzidino (TMB) dažymo tirpalas: peroksido tirpalas= 1:1; ELISA POD substrato TMB rinkinys, populiarus,Nacalai Tesque, Kiotas, Japonija) buvo išpilstytas į kiekvieną šulinėlį, o plokštelė buvo laikoma kambario temperatūroje tamsoje, kol užgesino.

papildymas 100μL 1 mol/l sieros rūgšties viename šulinyje. Kiekvieno iš jų absorbcijašulinys esant 450 nm (sub: 650 nm), tada buvo nedelsiant išmatuotas mikroplokštelių skaitytuvu. ELISA buvo atlikta tris kartus kiekvienai bandymo sąlygai.


Western blotingas senstantiems kirminams

Mėginiai buvo apdoroti 4 × varžtu™ LDS mėginio buferis (Thermo Fisher Scientifific) ir 10 × varžtas™ Mėginio reduktorius (Thermo Fisher Scientifific) ir kiekviename mėginyje, kuriame yra 1,5μg viso baltymo buvo paleista Bolt™ 4–12 procentų Bis-Tris Plus gelis (Thermo Fisher Scientifific). Tada baltymai buvo perkelti iš gelio į polivinilidenąFluorido membrana (ATTO, Tokijas, Japonija) ir užblokuota 5 procentų nugriebtu pienu PBS- 0.1 procento Tween 20 1 val. Membrana buvo inkubuojama per naktį 4 laipsnių temperatūroje su anti-AGE (anti-CML) monokloniniu antikūnu (klonas Nr. 6D12 santykiu 1:1{18}}), plaunama PBS-T ir inkubuojama kambario temperatūroje 1 val. h su peroksidaze konjuguotu ožkos anti-pelės IgG antikūnu (1:25, 000). Po plovimo PBS-T membrana buvo inkubuojama su ECL pirminiu Western blot aptikimo reagentu (GE Healthcare UK, Little Chalfont, Anglija) ir nuskaityta naudojant ChemiDoc Touch Imaging System (Bio-Rad, Hercules, CA, JAV) arba ImageQuant. LAS 500 (GE Healthcare UK). Tada membranos buvo plaunamos PBS-T, 30 minučių kambario temperatūroje inkubuojamos su Western BLoT pašalinimo buferiu (Takara, Shiga, Japonija) ir vėl plaunamos PBS-T. Membrana buvo pakartotinai patikrinta anti-vitellogenino antikūnais YP115 ir YP170 (kiekvienas 1:10 000) 4 laipsnių temperatūroje per naktį.42, plaunamas PBS-T ir inkubuojamas su ožkos anti-žiurkės IgG antikūnu, konjuguotu su peroksidaze (1:2000) (Proteintech, Rosemont, IL, JAV) kambario temperatūroje 2 valandas. Pakrovimo kontrolei membranos buvo pakartotinai tiriamos naudojant anti-aktininį antikūną (klonas Nr. C4; Merck KGaA, Darmštatas, Vokietija) ir peroksidaze konjuguotą anti-pelės antikūną (GE Healthcare UK). Vitellogenino (YP170 ir YP115) ir CML juostų tankiai kiekvienoje juostoje buvo normalizuoti, palyginti su aktino juostomis atitinkamoje juostoje. Juostų tankis buvo analizuojamas naudojant ImageQuant TL programinę įrangą (GE Healthcare). Kiekvienas tyrimas buvo atliktas du kartus.


Ribozės ir rifampicino poveikis AGE in vivo

Trijų dienų kirminai buvo auginami ant mNGM, turinčio 400 mM ribozėsarba 400 mM sorbitolio, kad atitiktų didelės ribozės osmoliarumą; Kirminų maistas buvo tiekiamas kaip karščiu (100 laipsnių, 10 min.) nužudytas OP50, kad bakterijos nefermentuotų cukraus. Kad būtų išvengta užteršimo palikuonimis, kirminai buvo perkeliami į šviežias lėkštes kasdien 4 dienas, kol visiškai išnyko.

baigtaskiaušinių dėjimas (7 dienų amžiaus). Norėdami įvertinti ribozės įtaką, atlikome išgyvenamumo tyrimus ir išmatavome autofluorescenciją. Buvo kirminaslaikoma mirusia, kai nesugebėjo reaguoti į švelnų sliekų rinktuvo prisilietimą. Kirmėlės, žuvusios dėl prilipusios prie plokštelės sienelės, nebuvo įtrauktos į analizę ir buvo cenzūruotos. Atskirame eksperimente,MGM, kuriame yra 50 µM (galutiniskoncentracija) rifampicinas (ištirpintasDMSO) buvo naudojamas. Kiekvienas tyrimas buvo pakartotas du kartus.


anti- senescence cistanche function

6 pav. Vitellogenino (Vit) ir pailgėjimo faktoriaus (EF) autofluorescencija. aSpektrofotometrija (ex 325/em 350–600) vitellogenino irpailgėjimo faktorius prieš ir po glikacijos in vitro riboze 14 dienų: gly-Vit ir gly-EF yra glikuotas vitellogeninas ir glikato pailgėjimasveiksnys, atitinkamai. RiboFLFLavin (Rib) rodomas kaip atstovasLFLuorescencinis junginys. Palyginimui parodytas ekstraktas iš 17-viendienių kirminų (laukinio tipo N2) (C. eleganai). b Vitellogenino ir pailgėjimo faktoriaus glikacija in vitro riboze padidino autofluorescenciją
su laiku.c AGE ir vitellogeninų Western blot analizė mėginiuose, išskirtuose iš įvairaus amžiaus kirminų (laukinio tipo N2) populiacijų. Blotai buvo gauti iš to paties gelio ir buvo apdoroti su kiekvienu antikūnu eilės tvarka.d Kiekybinis įvertinimasvitelogeninų ir AGE iš vakarųblotavimas naudojant densitometriją. Eksperimentai buvo pakartoti du kartus ir parodyti reprezentatyvaus eksperimento duomenys. Raudona linija ir punktyrinė linija rodo AGE pokyčius, o juodos spalvos rodo vitelogeninų kiekį. Uždaryti apskritimai ir kryžiai skirti juostų, atitinkančių atitinkamai YP170 ir YP115 duomenims.


Senų kirminams būdingų baltymų identifikavimas

3- ir 17-viendienių nematodų ekstraktų masės spektrometrinė analizėbuvo atliktas AB SCIEX 5800 LC-MALDI-TOF masės spektrometru (Newark, NJ, JAV) su Protein Pilot 4.0 versija. Abi matricos buvovirškinama tripsinu ir sumaišoma su matricos tirpalu (7 mg/l - ciano-4-hidroksicinamono rūgštis 0,1 proc. (t/v) trifluoracto rūgštyje (TFA), 70 proc.
(t/v) acetonitrilas (ACN)). Thekolegaatskyrimo greitis buvo 300 ml/min.ir atskyrimas buvo pasiektas naudojant tiesinį dviejų judrių fazių gradientą ({{0}},1 proc. (t/t) TFA 2 proc. ACN (tirpiklis A) ir 0,1 proc. (t/t) TFA 80 procentų ACN(tirpiklis B)) tokiomis proporcijomis: A/B= 100/0–50/50 (60 min.), A/B= 50/50–0/100 (20 min.), A/B= 0 iš 100 (10 min.). Peptidų masei gauti buvo naudojama MALDI-TOF masės sistemapiršto atspaudas. Peptidų derinimas irbaltymų paieškos buvo atliktos pagal Swiss-Prot 57 versijos.{2}} duomenų bazę.


Ekstrahuoti baltymai buvo ištirpinti 50 mM amonio bikarbonate(AmBic), kad baltymų koncentracija būtų nuo 0,1 iki 1 µg/µL. Siekiant maksimaliai padidinti baltymų tirpumą, apskaičiuojamas vandens tūrisRapigest (Waters Corporation, Milford, MA, JAV) buvo pridėtas derliusfinalinės koncentracijos 0.1–0.2 proc. Rapigest mėginiuose prieš virškinimą. Mėginiai
buvo kaitinami iki 40 laipsnių kratant 10 min.; turinys tada buvocentrifuguojama, o gautos nuosėdos buvo suspenduotos AmBic, turinčiame 10 mM DTT. Mėginiai kaitinami 80 laipsnių temperatūroje 15 minučių ir granuliuojami kambario temperatūroje. 200 mM jodoacetamido (IAM) alikvotinė dalis 50 mMĮ kiekvieną mėginį buvo pridėta AmBic, kad gautų agalutinisIAM koncentracija

20 mM (esant 2x moliniam DTT pertekliui); mišinys tada buvoinkubuojamas tamsoje kambario temperatūroje 30 min., kad prasidėtų alkilinimo reakcija. Tripsinas 50 mM AmBic buvo sumaišytas su kiekvienu tirpalu santykiu 1:50 (tripsinas: baltymų koncentracija). Mėginiai buvo virškinami mažiausiai 4 valandas arba per naktį 37 laipsnių temperatūroje, purtant. Sekantcentrifuguojant, buvo pridėta TFA ir ACNgalutiniskoncentracijos 0.5–1.0 procentai TFA ir 2 procentai ACN pagal tūrį. Mėginiai buvo purtomi 2 valandas 60 laipsnių temperatūroje. Po centrifugavimo 22 200 ×g 5 min., supernatantas buvopipete supilamas į automatinio mėginio ėmimo buteliuką. Prieš tai baltymai buvo virškinami tripsinuanalizuoti atvirkštinės fazės skysčių chromatografija, naudojant Ultimate3000RSnanoLC sistemą (Thermo Fisher Scientific), sujungtą su ESI-Q-TOF sistema (Impact II Bruker Daltonics). Mielių alkoholio dehidrogenazė(ADH1_MIELĖS) baltymas buvo įtrauktas į mėginius kaip vidinis standartas;spygliavimas buvo atliktas siekiant gauti maždaug 50 fmolstandartinis stulpelyje.


Autofluorescencija po glikacijos in vitro

Vitellogeninas PBS tirpale ({{0}},053 µM) buvo įsigytas iš Biosense Laboratories AS (Bergenas, NORVEGIJA). Pailgėjimo faktoriaus tirpalas (1,17 µM) buvo nupirktas iš Abnova Corporation (Taipei City, Taivanas). Šie tirpalai buvo glikuoti 0,1 mM riboze 23 dienas 37 laipsnių temperatūroje. RiboFLFLavin buvo įsigytas iš Sigma (Tokijas, Japonija) ir ištirpintas PBS 0,1 mM. Kiekvienas tirpalas buvo matuojamas fluorescencine spektrofotometrija tomis pačiomis sąlygomis.

Imunofluorescencijajaunų ir senų kirminųPagal amžių sinchronizuoti CB1003, maitinami OP50, buvo inkubuojami 25 laipsnių temperatūroje. Trijų dienų ir 13-dienų amžiaus suaugusieji buvo pralaidūs naudojant Bouin's vamzdelio fiksavimo protokolas43.


anti- senescence cistanche function

7 pav. 3-viendienių ir 13-dienų senumo kynu-1 mutantų fluorescenciniai vaizdai. a–cTridienių kirmėlių ird–f 13-vienadieniai kirminai, su neapdorotais vaizdais 1 stulpelyje. Siekiant pašalinti galimus mirties padariniusFluorescencija, kuri prasideda likus 2 dienoms iki kirminų' mirtis, mutantaskynu-1buvo naudojamas. Autofluorescencija matoma 2 ir 3 stulpelių vaizduose. 3 stulpelio nuotraukos buvo padidintos pagal nurodytas (stačiakampiais) 2 stulpelyje esančių vaizdų sritis. Pasenę kirminai (13-dienų senumo) autofluorescuojasignififigerokai didesnis nei jaunų kirminų (3-dienų senumo). Kiekviena skalės juosta rodo 50μm. g Kiekybinis nustatymasmėlynos spalvosfluorescencijanaudojant „ImageJ“ ir „ImageQuant TL“ programinę įrangą. Kiekviena juosta rodo vidutines reikšmesFluorescencijos intensyvumas 1 mm2 iš devynių kirminų. ** žymi statistinį ženkląfifinegali skirtis tarp 3-dienų ir 13-dienų kirminųp reikšmė < 0.01. Klaidų juostos žymi SE.

Mėginiai buvofiksuotasBouine's fiksatoriussu metanoliu/ - merkaptoetanoliskambario temperatūroje 30 min. Kad sutrūkinėtų odelė, buvo įdėtos kirmėlėsizopropanolio ir saugomi–80 laipsnių temperatūroje 10 min., po to dar 30 min inkubuojamas kambario temperatūroje. Thefiksatoriustirpalas buvo pašalintas irpakeistas BTB tirpalu (25 mM borato buferis, 0,5 proc. Triton X-100, 2 proc.
-merkaptoetanolis) kambario temperatūroje 1 val.; inkubacija BTB buvokartojama iš viso tris kartus. Tada kirminai buvo perkelti iš BTB į BT (25 mM borato buferis, 0,5 proc. Triton X-100), inkubuojami antikūnų buferiniame tirpale (1 × PBS, 0,5 proc. Triton X-100, 0,1 mM EDTA, {{10}},1 proc. galvijų serumo albumino (BSA), 0,05 proc. natrio azido, pH 7,2) kambario temperatūroje

1 val., ir užblokuotas antikūnų buferiniu tirpalu, kuriame yra 10 procentų ožkos serumo(Cosmo Bio, Tokijas, Japonija) 4 laipsniai per naktį. Pirminius antikūnus sudarė pelės monokloninis anti-AGE (anti-LML) antikūnas (klonas Nr. 6D12; 1:125) ir antikūnas prieš pentosidiną (klonas Nr. PEN-12, Trans Genic; 1:5 0). Antrinį antikūną sudarė Alexa Fluor 555- konjuguotas ožkos antikūnas prieš pelę (Abcam, Kembridžas, Anglija; 1:100). Visi antikūnų praskiedimai buvo atlikti naudojant antikūnų buferį, kuriame yra 0,5 procento BSA. Mėginiai buvo sumontuoti ant stiklinių stiklelių naudojant VECTASHIELD antifade montavimo terpę (Vector Laboratories, Burlingame, CA, JAV).



Fluorescencinė mikroskopija

3- arba 13-dienų senumo suaugusių kirmėlių, pritvirtintų ant stiklelių, kaip aprašyta aukščiau, fluorescenciniai vaizdai buvo įrašyti naudojant apverstąFluorescencijamikroskopas (BZ-X700; Keyence) su 10 × objektyvu (CFI Plan Fluor DL10×/0,30). AutomatinisFLFLkirminų uorescencija ir raudonafluorescencijaiš AlexaFluoras 555 buvo peržiūrėtas naudojant BZ-X DAPI (sužadinimo bangos ilgis (Ex), 360 ± 20 nm; emisijos bangos ilgis (Em), 460 ± 25 nm) ir TRITC (Ex, 545 ± 20 nm)12,5 nm; Em, 605 ± 35 nm)filtrai, atitinkamai. Skyrių vaizdai buvoužfiksuotas Sectioning režimu su vienmačiu plyšiu su aplotis 32, o Z rietuvės žingsnis 0.7μm už 40-μm storio pavyzdžiai. Kiekybiškai įvertinti mėlynąfluorescencija,fluorescencijaintensyvumas, išmatuotas pagal vaizdą
Quant TL programinė įranga (GE Healthcare) buvo normalizuota pagal tankio vertes 1 mm2 slieko's projekcijos plotas. Kūno dydis buvo nustatytas naudojant „Adobe Photoshop Elements“ ir „ImageJ“ programinę įrangą, kurią sukūrė Nacionaliniai sveikatos institutai. Šioje sistemoje kirmino sritis's projekcijabuvo įvertintas automatiškai ir naudojamas kaip kūno dydžio indeksas.



Statistinė analizė

Tikėtinos gyvenimo trukmės koreliacija buvo apskaičiuota naudojant Spearman's rango koreliacijos koeficientas. Autofluorescencijos lygiai po glikacijos in vitro buvo lyginami naudojant dviejų faktorių faktorių ANOVA ir Scheffe's F bandymas. TheELISA reikšmės po glikacijos in vitro buvo palygintos naudojant vieno faktoriaus ANOVA ir Dunnett testą daugkartiniam palyginimui. Nematodų išgyvenimasbuvo apskaičiuotas Kaplano–Meier metodas ir išgyvenamumo skirtumai buvo patikrinti dėl reikšmingumo naudojant log-rank testą. Autofluorescencijos vertės po gydymo rifampicinu ir senėjimodaf-2irkynu-1mutantai buvo lyginami kiekvienam naudojant Studentą's t testas, kartotinis dviejų faktorių ANOVA ir Mann–WhitneyU bandymas. Autofluorescencijos vertės po gydymo riboze N2 arbakynu-1mutantas buvo lyginamas naudojant neparametrinį plieną–Dwass metodas. Autofluorescencinės mikroskopijos tankiai buvo lyginami naudojant Studentą's t testas. Ten, kur buvo pastebėtas reikšmingumas, duomenys buvo klasifikuojamifified as *p < 0.05 and **p < 0.01. All statistinės analizės buvo atliktos su Microsoft Excel papildytapriedo programinė įrangapliusas„Statcel 3“ (OMS, Tokijas, Japonija) ir „JSTAT“, skirta „Windows“.(Nankodas, Tokijas, Japonija).


Ataskaitų santrauka

Daugiau informacijos apie tyrimų planavimą rasite Gamtos tyrimuoseAtaskaitų santrauka, susieta su šiuo straipsniu.


DUOMENŲ PRIEINAMUMAS

Dabartinio tyrimo metu sugeneruotus duomenų rinkinius galima rasti korespondencijojepagrįstu prašymu.



NUORODOS

1. Brenneris, S. GenetikaCaenorhabditis elegantiškas. Genetika 77, 71–94 (1974).
2. Riddle, DL, Blumenthal, T., Meyer, BJ, Priess, JR (red.).C. eleganai II. (ŠaltaPavasaris Uostas Laboratorija Spauda, Šaltis Pavasaris Uostas, 1997).
3. Herndonas, LA ir kt. Stochastiniai ir genetiniai veiksniai įtakoja specifinį audinių senėjimo mažėjimąC. eleganai. Gamta 419, 808–814 (2002).
4. Klass, MR Senėjimas nematodeCaenorhabditis elegantiškas: pagrindiniai biologiniai ir aplinkos veiksniai, turintys įtakos gyvenimo trukmei.Mech. Aging Dev. 6, 413–429 (1977).
5. Son, HG, Altintas, O., Kim, EJE, Kwon, S. & Lee, SV. Nuo amžiaus priklausomi pokyčiai ir senėjimo biomarkeriaiCaenorhabditis elegantiškas. Senstanti ląstelė 18, e12853 (2019).
6. Yoshino, J., Mills, KF, Yoon, MJ & Imai, S. Nikotinamido mononukleotidas, pagrindinis NAD (pliusas) tarpinis, gydo pelių mitybos ir amžiaus sukelto diabeto patofiziologiją.Ląstelės metab. 14, 528–536 (2011).
7. Denzel, MS, Lapierre, LR ir Mack, HID Naujos temosC. eleganssenėjimo tyrimai: transkripcijos reguliavimas, atsakas į stresą ir epigenetika.Mech. Age ing Dev. 177, 4–21 (2019).
8. Ikeda, T., Yasui, C., Hoshino, K., Arikawa, K. & Nishikawa, Y. InFLFLPieno rūgšties bakterijų įtaka ilgaamžiškumuiCaenorhabditis elegantiškasir šeimininko gynyba nuo salmoneliųenterinisserovaras Enteritidis.Appl. Aplinka. Microbiol. 73, 6404–6409 (2007).
9. Komura, T., Ikeda, T., Yasui, C., Saeki, S. & Nishikawa, Y. Mechanism underlying pro-longevity induced byfidobacteria inCaenorhabditis elegantiškas. Biogerontologija 14, 73–87 (2013).
10. Clark, LC ir Hodgkin, J. Commensals, probiotikai ir patogenaiCae Caenorhabditis elegansmodelis.Ląstelių mikrobiolas. 16, 27–38 (2013).
11. Cabreiro, F. & Gems, D. Kirmėlėms taip pat reikia mikrobų: mikrobiotos, sveikatos ir senėjimoCaenorhabditis elegantiškas. EMBO Mol. Med. 5, 1300–1310 (2013).
12. Kim, Y. & Mylonakis, E.Caenorhabditis elegantiškasImuniteto kondicionavimas probiotinėmis bakterijomisLactobacillus acidophiluspadermė NCFM sustiprina gramteigiamą imuninį atsaką.Užkrėsti. Imunitetas. 80, 2500–2508 (2012).
13. Gerstbrein, B., Stamatas, G., Kollias, N. & Driscoll, M. In vivo spektrofluorimetrijaatskleidžia endogeninius biomarkerius, pranešančius apie sveikatos trukmę ir mitybos apribojimusCaenorhabditis elegantiškas. Senstanti ląstelė 4, 127–137 (2005).
14. Coburn, C. ir kt. Antranilatasfluorescencijažymi kalcio plintančią nekrozinę bangą, kuri skatina organizmo mirtįC. eleganai. PLoS Biol. 11, e1001613 (2013).
15. Pincus, Z., Mazer, TC & Slack, FJ AutoFLFLuorescencija kaip senėjimo matasC. eleganai: žiūrėkite į raudoną, o ne į mėlyną ar žalią.Senėjimas (Albanis, Niujorkas) 8, 889–898 (2016).
16. Sebekova, K. & Sebekova, KB Glikuoti baltymai mityboje: draugas ar priešas?Exp. Gerontol. 117, 76–90 (2019).
17. Giacco, F. & Brownlee, M. Oksidacinis stresas ir diabetinės komplikacijos.Tiražas Res. 107, 1058–1070 (2010).
18. Srikanth, V. ir kt. Pažangūs glikacijos galutiniai produktai ir jų receptorius RAGE sergant Alzheimerio liga's liga.Neurobiol. Senėjimas 32, 763–777 (2011).
19. Zhuo, Q., Yang, W., Chen, JY & Wang, Y. Metabolinis sindromas atitinka osteoarinį tritą.Nat. Kunigas Reumatol. 8, 729–737 (2012).
20. Gkogkolou, P. & Bohm, M. Pažangūs glikacijos galutiniai produktai: pagrindiniai odos senėjimo veiksniai?Dermatoendokrinolis 4, 259–270 (2012).
21. Liu, J. ir kt. Pažangių glikacijos galutinių produktų receptorius skatina priešlaikinįproksimalinių kanalėlių epitelio ląstelių senėjimas aktyvuojant endoplazmąnuo tinklo streso priklausomas p21 signalizavimas.Mobilusis signalas 26, 110–121 (2014).

22. Mendler, M., Schlotterer, A., Morcos, M. & Nawroth, PP Diabetinės polineuropatijos ir ilgaamžiškumo supratimas: ko galime pasimokyti iš nematodoCae norhabditis elegans? Exp. Clin. Endokrinolis. Diabetas 120, 182–183 (2012).


Paprašyk daugiau:

El. paštas:wallence.suen@wecistanche.com Whatsapp plus 86 15292862950


























Tau taip pat gali patikti