Mikotoksinų biostebėjimas Alzheimerio ir Parkinsono liga sergančių pacientų plazmojeⅡ

2. Rezultatai ir aptarimas

2.1. LC-MS/MS analizė

Dėl skirtingų fizikinių ir cheminių savybių mikotoksinai chromatografiniam atskyrimui buvo suskirstyti į dvi grupes (žr. skyrių „Medžiaga ir metodai“). Tolesniuose paveikslėliuose (1–4 pav.) pavaizduotos viena ant kitos išskirtos mikotoksinų chromatogramos kalibratoriuose ir plazmos mėginys (koduojami kaip 1–4 mėginiai) prieš ir po fermentinio apdorojimo. Kaip matyti, OTA atsiranda mėginiuose prieš ir po fermentinio apdorojimo (1 pav.; 3 pav.); tuo tarpu STER atsiranda tik po fermentinio apdorojimo (3 pav.). Kitų tirtų mikotoksinų plazmos mėginiuose neaptikta.

Kiekviena kalibravimo kreivė, naudota nustatant mikotoksinų kiekį, atitiko kriterijus, anksčiau apibrėžtus metodo patvirtinimo metu. Gautų kiekvieno mikotoksino kalibravimo kreivių pavyzdžiai pateikti S1 ir S2 lentelėse. Taip pat buvo įvertintas junginių tapatumas: kiekvieno aptikto mikotoksino kvalifikavimo (q) ir kiekybinio įvertinimo (Q) perėjimai buvo pastebėti kiekviename iš asmenų ir teigiamų mėginių, o gauta santykinė paklaida (RE) tarp q/Q santykio verčių. kiekvienas mikotoksinas kalibratoriuose ir mėginiuose buvo mažesnis nei 20 procentai [32]. Be to, sulaikymo laikas mėginiuose ir kalibratoriuose nesiskyrė daugiau nei 2,5 proc. [33] (1,3 proc. OTA prieš ir 1,6 proc. po fermentinio apdorojimo; 0,3 proc. OTB ir 1,8 proc. STER).

2.2. Plazmos mėginiai

Iš viso 93 tiriamieji, įskaitant 25 sveikus kontrolinius (CNT) ir 68 pacientus, buvo įdarbinti iš San Pedro ligoninės La Rioja (Ispanija) neurologinės tarnybos. Kontroliniai donorai buvo nesusiję pacientų, kuriems nebuvo jokių akivaizdžių ar diagnozuotų neurologinių ligų, kompanionai. Pacientai buvo suskirstyti pagal patologijas: 44 pacientai serga PD ir 24 sergantys AD.

Spustelėkite cistanche tubulosa kapsules nuo Alzheimerio ir Parkinsono ligos

Įdarbintų pacientų diagnozę ir ligos progresavimą atliko ekspertai neurologai pagal Hoehn ir Yahr (HY) skalę PD (S3 lentelė) ir visuotinę pablogėjimo skalę (GDS) AD (S4 lentelė). Visiems AD sergantiems pacientams jau buvo klinikiniai lengvo pažinimo susilpnėjimo arba demencijos požymiai (nuo 3 iki 7, GDS skalė). PD pacientai buvo suskirstyti į dvi grupes, nes ligos progresavimas buvo skirtingas tarp pacientų, kurių laikysenos refleksai nebuvo sutrikę (1 ir 2, HY skalė), o kitiems, kuriems jau buvo sutrikę laikysenos refleksai (nuo 2,5 iki 3, HY skalė).

Tačiau dėl mažo mėginių skaičiaus statistinė PD pacientų analizė buvo atlikta kaip viena grupė. Kiekvienoje grupėje ir pogrupyje įtrauktų tiriamųjų skaičius, kartu su lytimi, amžiaus intervalu ir ligos progresavimu, nurodytas 1 lentelėje. Išsami individuali informacija apie tiriamuosius, įdarbintus tyrimui, pateikiama papildomoje medžiagoje (S5 ir lentelės). S6).

2.3. Mikotoksinų buvimas

Iš 19 įvertintų mikotoksinų mėginiuose buvo aptikta tik OTA, OTB ir STER. OTA buvo prieš ir po gydymo gliukuronidazės / arilsulfatazės mišiniu, o OTB buvo aptiktas tik prieš, o STER atsirado tik po fermentinio apdorojimo. Pažymėtina, kad dėl riboto kai kurių mėginių tūrio vertinti po fermentinio apdorojimo buvo galima tik 74 iš 93 paimtų mėginių.

OTA, OTB ir STER analizės rezultatai apibendrinti 2 lentelėje. Dėl identifikavimo kriterijų patvirtinimo (turėtų būti q ir Q perėjimai ir palyginami su kalibratoriais RE abiejų q/Q santykio ir sulaikymo laiko atžvilgiu, būti < 20 procentų arba 2,5 procento, atitinkamai), mėginiai, kurių vertės yra didesnės arba lygios LOD, buvo naudojami duomenų tvarkymo analizei. Todėl skaičiavimai buvo atlikti taikant apatinės ribos pakeitimo metodą [34].

Only OTA (77% of the samples) and OTB (13% of the samples) were detected (>LOD) mėginiuose, apdorotuose prieš fermentinį apdorojimą. Kalbant apie OTA buvimą, visose grupėse buvo rasti mėginiai, mažesni už LOD. Didžiausias OTA lygis (8,81 ng/ml) atitiko 66 metų moterį kontrolinėje grupėje. Kalbant apie kontrolinę populiaciją, OTA ir OTB buvo atitinkamai 92 proc. ir 24 proc. mėginių.

Šie rezultatai atitinka neseniai Navaroje, kaimyniniame Ispanijos regione, atliktą tyrimą. Tame tyrime OTA buvo 97,3 proc., o OTB – 10 proc. mėginių (n=438) [35], išmatuota tuo pačiu metodu, kaip ir dabartiniame tyrime [36]. Šiame tyrime vidutinis OTA lygis (2,15 ng/ml) yra šiek tiek mažesnis nei išmatuotas Navaroje (2,87 ng/ml). OTA lygis svyravo nuo LOD iki 8,81 ng/ml, o Navaros mėginiuose OTA koncentracija svyravo nuo LOD iki 19,9 ng/mL (66-metų moters mėginys siekė 45,7 ng/ml).

Kalbant apie lytį, taip pat sutinkant su Navarros tyrimu [35], galima pastebėti, kad vidutinės OTA vertės prieš gydymą fermentais buvo didesnės vyrams nei moterims visose grupėse. Nors OTA teigiamų mėginių procentas sutampa su ankstesniais Ispanijoje atliktais tyrimais, šio tyrimo ir naujausio Navaros tyrimo [35] vidutinis ir didžiausias OTA lygis CNT populiacijoje yra didesnis nei ankstesniuose Ispanijoje atliktuose tyrimuose. .

Kadangi ši informacija buvo gauta iki 2011 m., mūsų duomenys patvirtina poreikį ir toliau stebėti mikotoksinų kiekį bendroje populiacijoje. Kaip pastebėta anksčiau [35], OTB buvo keliuose mėginiuose ir visada buvo kartu su OTA (išskyrus vieną CNT žmogų). Keista, bet OTB nebuvo aptikta AD grupėje. OTB yra dechloruotas OTA analogas ir iki šiol nebuvo išmatuotas žmogaus biomonitoringo tyrimuose.

OTB gali būti žmogaus mėginiuose, kaip žinoma, kad jis yra kai kuriose maisto matricose, pavyzdžiui, vyne [37], bet gali būti ir žmogaus OTA metabolitas [38]. Deja, šiame tyrime neįmanoma atskirti galimų OTB šaltinių arba žinoti, ar OTB nebuvimas AD grupėje gali būti dėl skirtingo pacientų maisto vartojimo modelio arba dėl skirtingo metabolizmo dėl liga arba jei taip yra dėl mažo ištirtų mėginių skaičiaus. Išanalizavus duomenis po fermentinio apdorojimo, nustatyta, kad OTA vis dar buvo nustatyta (89 proc. mėginių).

Be to, kaip anksčiau buvo pastebėta sveikiems Navaros donorams [35], STER atsirado daugumoje mėginių (88 proc.), o OTB nebebuvo aptikta. Lyginant OTA buvimą prieš ir po fermentinio gydymo, teigiamų mėginių procentas prieš fermentinį gydymą CNT buvo didesnis nei pacientų; kadangi po fermentinio gydymo OTA sumažėjo CNT, o padidėjo AD ir PD sergantiems pacientams. Kai kurie autoriai palaiko hipotezę, kad OTA konjugatai gali susidaryti vykstant žmogaus metabolizmui [39–41].

However, more data are needed to understand and monitor the human metabolism of OTA. In this study, and again in line with the study conducted in Navarra, STER only appeared after treating the samples with β-glucuronidase/arylsulfatase and this mycotoxin was found positive (>LOD) 88 procentuose tirtų mėginių. Šie duomenys patvirtina hipotezę, kad STER-gliukuronidai susidaro vykstant žmogaus metabolizmui [35,42].

2.4. Statistinė analizė

Remiantis analitiniais rezultatais, statistiniai skaičiavimai atlikti tik OTA ir STER. OTB nebuvo įtraukta į statistinę analizę, nes tik 12 mėginių (13 proc.) buvo didesni už LOD arba lygūs jai. Normalumo pasiskirstymo hipotezė (Shapiro–Wilk testas) buvo atmesta, todėl statistiniam apdorojimui buvo naudojami neparametriniai testai, kurie nereiškia jokios pasiskirstymo prielaidos. STER buvo aptiktas tik po fermentinio apdorojimo, todėl statistinė STER analizė buvo atlikta naudojant 74 turimus rezultatus, gautus po fermentinio virškinimo. Kita vertus, buvo gauti du OTA rezultatų duomenų rinkiniai: vienas, gautas apdorojant duomenis prieš fermentinį apdorojimą ir gautas po fermentinio apdorojimo (ty OTA prieš ir po).

Dėl OTA neužbaigtumo po duomenų rinkinio (74 įrašai), buvo nuspręsta atlikti statistinius skaičiavimus, atsižvelgiant tik į OTA prieš duomenų rinkinį (93 įrašai). Siekiant patvirtinti sprendimą neįtraukti OTA po duomenų rinkinio, buvo atliktas Wilcoxon suderintų porų pasirašytų rangų testas, siekiant ištirti galimus skirtumus tarp suporuotų OTA rezultatų prieš ir po duomenų rinkinių.

Testas neparodė jokio reikšmingo skirtumo, kai buvo taikomas visos populiacijos grupės OTAbefor ir OTAafter reikšmėms (n=74, z=−1,438, p reikšmė=0.1503), tai patvirtina. kad visas OTAbefore duomenų rinkinys atitiktų statistinius vertinimus. Kaip minėta anksčiau, nėra jokių ankstesnių tyrimų, stebinčių mikotoksinus PD ar AD pacientų plazmos mėginiuose. Todėl, norint užfiksuoti visus galimus OTA ir STER koncentracijos lygių skirtumus ir sąsajas tarp grupių ir pogrupių, buvo atliktas Wilcoxon rango sumos testas arba Kruskal-Wallis testas kelių kintamųjų palyginimui.

Be to, buvo tiriami galimi statistiškai reikšmingi skirtumai suskirstant grupes pagal lytį ir ligą (pacientai, sergantys PD ir AD), taip pat atsižvelgiant į ligos stadiją (HY arba GDS skalė). Visų skirtumų, kurie buvo statistiškai reikšmingi (p vertė < 0,050), santrauka lyginant OTA arba STER pasiskirstymą tarp grupių, tarp CNT ir pacientų grupės (visos ir kaip PD ir AD grupės), tarp lyčių ir tarp grupių kiekvienoje lytyje ir lyties kintamajame, parodyta 3 lentelėje.

Nustatyta, kad skirtumai tarp OTA pasiskirstymo lygių yra statistiškai reikšmingi lyginant CNT grupę, PD ir AD, tačiau šis skirtumas (p-reikšmė=0.0447) pagrįstas palyginimu PD/AD (p- vertė=0.0114), kuri yra PD – pacientų grupė, kuriai būdingos didesnės reikšmės. Vertinant ligos stadiją, lyginant PD 1 pogrupio ir 2 PD pogrupio pasiskirstymą, skirtumo nepastebėta, o tai rodo, kad PD grupėje ligos stadija neturi įtakos pasiskirstymo skirtumui. Lyginant lytis, lyginant vyrų ir moterų OTA lygius, buvo statistiniai skirtumai arba visuose tiriamuosiuose, arba pacientų grupėje (PD plius AD), o vyrų lygis visada buvo didesnis nei moterų.

Taigi, OTA pasiskirstymas nesiskiria lyginant CNT ir pacientų grupes, tačiau atrodo, kad lytis gali būti OTA lygio pasiskirstymo skirtumų veiksnys labiau nei diagnozė. Be to, tiriant OTA pasiskirstymo skirtumus vyrams ir moterims atskirai, tarp grupių (CNT, PD, AD) testas neparodė jokio skirtumo.

Statistinė STER lygių analizė tarp CNT ir pacientų grupės parodė statistiškai skirtingą pasiskirstymą (p vertė < 0.0001), o CNT reikšmės buvo mažesnės. CNT/PD/AD grupėje buvo statistiškai skirtingi pasiskirstymai (p reikšmė=0,0001), o skirtumas taip pat buvo patvirtintas lyginant CNT/PD ir CNT/AD (abiem atvejais p reikšmė < 0,0001), su vidutinė mažesnė vertė AD grupėje.

Todėl STER lygiuose CNT grupės pasiskirstymas visada buvo skirtingas lyginant su pacientais ir ligų grupėmis. Lyginant vyrų ir moterų pasiskirstymą pagal lytį, buvo išryškintas bet koks statistinis skirtumas, STER lygiai vyrų ir moterų atskirose grupėse buvo skirtingi visuose palyginimuose (CNT/PD/AD, CNT/pacientų grupė, CNT/PD, CNT/AD), o vyrai ir moterys CNT grupėje visada buvo mažesni nei pacientų grupėse.

Tai rodo, kad ligos diagnozė gali turėti įtakos STER lygio pasiskirstymui. OTA ir STER koncentracijos lygių skirtumai taip pat buvo tiriami lyginant dviejų pacientų grupių (PD ir AD) pasiskirstymą kiekvienoje lytyje (vyrams ir moterims) ir lyginant ligos skalę, GDS AD pacientų grupėje ir HY skalę. AD pacientų grupėje, o statistinio skirtumo nebuvo. Nei OTA, nei STER pasiskirstymas neparodė jokio skirtumo, lyginant HY skalę kaip dvejetainį kintamąjį HY_d=0 (1 PD pogrupis, HY skalė 1–2 diapazone) ir HY{{6 }}d=1 (2 PD pogrupis, HY skalė 2,5–3 diapazone).

Taigi, lyginant OTA ir STER pasiskirstymo elgseną, nustatyta, kad OTA skirtumai yra lyties viduje (su M > W) ir pacientų grupėse (PD > AD), o visuose palyginimuose išryškėjo ryškus statistinis skirtumas. Kalbant apie STER, pasiskirstymo skirtumai registruojami siekiant palyginti CNT ir pacientų grupę (pacientų grupė > CNT), o visuose vertinimuose visada buvo tikrinamas statistinis skirtumas. Kita vertus, du tirti mikotoksinai nepabrėžė jokio skirtumo tiriant pacientų pogrupius ir (arba) ligos stadiją.

Mūsų žiniomis, nėra jokių kitų tyrimų, kuriais būtų galima palyginti mikotoksinų kiekį pacientams, sergantiems neurodegeneracinėmis ligomis. Tačiau kai kurie autoriai pasiūlė toliau vertinti mikotoksinų vaidmenį prastinant autizmo spektro sutrikimų klinikines apraiškas [43, 44].

Iš tiesų, autoriai pabrėžė statistiškai reikšmingus skirtumus, lygindami mikotoksinus (DON, DOM{0}} šlapime ir AFM1, OTA ir FB1 plazmoje) tarp autistiškų ir kontrolinių vaikų grupių. Šio tyrimo rezultatai taip pat sutampa su naujesniu mūsų grupės tyrimu [45], kuriame nustatyta, kad OTA dažnis ir koncentracija plazmoje buvo didesnė kontrolinės grupės vaikams nei vaikams, turintiems autizmo spektro ar dėmesio stokos hiperaktyvumo sutrikimų.

Kalbant apie sekso įtaką, ir remiantis šio tyrimo rezultatais, daugumoje paskelbtų tyrimų vyrų OTA koncentracija plazmoje buvo didesnė nei moterų [46]; nors Warensjö ir kt. (2020) Švedijos paaugliams [47] ir Coronel ir kt. (2011) [48] nenustatė OTA koncentracijos plazmoje skirtumų tarp vyrų ir moterų. Galiausiai, norint įvertinti ryšį tarp OTA ir STER lygių plazmoje ir amžiaus kintamojo, buvo apskaičiuotas Spearman rango koreliacijos koeficientas (rho).

Visi rho su statistiniu reikšmingumu (p reikšmės < 0.050) apibendrinti 4 lentelėje. Paprastai buvo nustatytos silpnos neigiamos ir teigiamos koreliacijos: OTA ir STER silpnai koreliuoja su amžiumi. Visų pirma, OTA lygis mažėja su amžiumi (neigiamos koreliacijos, rho < 0), o rho reikšmė didėja, kai pasirenkama PD grupė arba vyrų grupė; be to, rho reikšmė dar didesnė, kai pasirenkamos PD grupės vyrų reikšmės. Ir atvirkščiai, STER koreliacijos yra teigiamos ir yra statistiškai reikšmingos, kai pasirenkama moterų grupė.

Siekiant parodyti pastebėtas koreliacijas, sklaidos grafikai OTA/vyrams PD pacientų grupėje ir STER/moterims visiems tiriamiesiems pateikiami 5 paveiksle. Juose parodyta dviejų kintamųjų toksinų ir amžiaus sklaidos diagrama, o pritaikyta linija padeda vizualizuoti. koreliacija.

Cistanche mechanizmas gydo Parkinsono ir Alzheimerio ligas

Cistanche yra tradicinė kinų žolelė, kuri buvo naudojama daugelį metų dėl galimos naudos sveikatai. Naujausiuose tyrimuose buvo nustatyta, kad Cistanche gali turėti neuroprotekcinį poveikį ir gali būti veiksmingas gydant Alzheimerio ligą (AD) ir Parkinsono ligą (PD).

Cistanche mechanizmas veiksmingai gydant AD ir PD yra priskiriamas jo aktyviems komponentams, tokiems kaip echinakozidas, akteozidas ir cistanozidai. Manoma, kad šie junginiai turi antioksidacinių ir priešuždegiminių savybių, kurios gali sumažinti oksidacinį stresą ir uždegimą smegenyse, kurie yra susiję su neurodegeneracinių ligų vystymusi ir progresavimu.

Cistanche taip pat gali skatinti nervinių ląstelių augimą ir pagerinti pažinimo funkciją, padidindamas smegenų kilmės neurotrofinio faktoriaus (BDNF), baltymo, kuris vaidina lemiamą vaidmenį augant ir palaikant neuronus, kiekį. Be to, buvo įrodyta, kad Cistanche sumažina amiloidines plokšteles, kurios yra būdingos Alzheimerio ligos ypatybės, ir sumažina su Parkinsono liga susijusio -sinukleino kaupimąsi smegenyse.

Apskritai galima terapinė Cistanche nauda gydant AD ir PD yra daug žadanti, tačiau reikia atlikti tolesnius tyrimus, siekiant išsiaiškinti tikslius jo veikimo mechanizmus ir patvirtinti jo veiksmingumą bei saugumą klinikinėje aplinkoje.

bus tęsiamas...

Beatriz Arce-López 1, Lydia Alvarez-Erviti 2, Barbara De Santis 3, María Izco 2, Silvia López-Calvo 4, Maria Eugenia Marzo-Sola 4, Francesca Debegnach 3, Elena Lizarraga 1, ópez de6ain Elena González-Peñas 1,† ir Ariane Vettorazzi 5,6,* ,†

1 Farmacijos technologijos ir chemijos katedra, tyrimų grupė MITOX, Farmacijos ir mitybos mokykla, Universidad de Navarra, 31008 Pamplona, ​​Ispanija; barce@alumni.unav.es (BA-L.); elizarraga@unav.es (EL); mgpenas@unav.es (EG-P.)

2 Molekulinės neurobiologijos laboratorija, La Riochos biomedicininių tyrimų centras (CIBIR), Piqueras 98, 3rd Floor, 26006 Logroño, Ispanija; laerviti@riojasalud.es (LA-E.); mizco@riojasalud.es (MI)

3 Nacionalinė mikotoksinų ir augalų toksinų etaloninė laboratorija, Istituto Superiore di Sanità, 00161 Roma, Italija; barbara.desantis@iss.it (BDS); francesca.debegnach@iss.it (FD)

4 Servicio de Neurología, Hospital San Pedro, Piqueras 98, 26006 Logroño, Ispanija; slcalvo@riojasalud.es (SL-C.); memarzo@riojasalud.es (MEM-S.)

5 Department of Pharmacology and Toxicology, Research Group MITOX, School of Pharmacy and Nutrition, Universidad de Navarra, 31008 Pamplona, Spain; acerain@unav.es 6 IdiSNA, Navarra Institute for Health Research, 31008 Pamplona, Spain