2 skyrius: Kroppel panašus faktorius 15 slopina inkstų glomerulų mezangialinių ląstelių dauginimąsi, sustiprindamas P53 SUMO1 konjugaciją

Norėdami gauti daugiau informacijos. kontaktastina.xiang@wecistanche.com

3 REZULTATAI

3.1|KLF15-surišančių genų patikrinimas naudojant ChIP-Seq pirminiuose inkstų glomerulų MC

Norėdami nustatyti KLF15 tiesioginio surišimo partnerio genus, atlikome ChlP-Seq analizę ir galiausiai patikrinome 2478 genus. Šių genų GO analizė naudojant įrankį svetainėje www.uniprot.org (1A, B pav.) atskleidė molekulinių funkcijų terminus, susijusius su 1941 genu, ląstelių komponentų terminus, susijusius su 1662 genais, ir biologinio proceso terminus, susijusius su 1766 genais. Kadangi mūsų tikslas buvo išsiaiškinti, kaip KLF15 veikia MC, mes sutelkėme dėmesį į su ląstelių procesu susijusius genus. Nustatyta, kad tarp 1315 su ląstelių procesu susijusių genų 74 genai dalyvauja ląstelių ciklo procesuose; konkrečiai, šie genai dalyvavo mitoziniame ląstelių cikle, ląstelių ciklo fazės perėjime ir kituose procesuose (1C, D pav.). Be to, išanalizavome augime dalyvaujančius genus ir nustatėme, kad jie buvo susiję su vystymosi augimu, ląstelių augimu ir kitais augimo tipais (1E pav.).

3.2|Diferenciškai reguliuojamų genų KLF15-, per daug ekspresuojančių inkstų glomerulų MC, atranka naudojant SILAC ir LC/MS

SILAC ir LC / MS analizė HRMC, kurios per daug ekspresuoja KLF15, palyginti su tėvų ląstelėmis, leido nustatyti 1357 baltymus. Mes panaudojome DAVID ir IPA, kad gautume SILAC nustatytų kiekybinių baltymų GO domenus ir praturtintus kelius. Įdomu tai, kad daugelis su baltymų biologinėmis funkcijomis susijusių terminų buvo tarp 30 labiausiai praturtintų GO terminų, įskaitant ląstelių aminorūgščių metabolinio proceso reguliavimą, proteasomų kompleksą, baltymų surišimą ir transkripcijos bei vertimo terminus, kurie visi yra glaudžiai susiję su ubikvitinacija (2A pav.). 2B paveiksle parodyta 30 geriausių žymiai praturtintų kelio terminų. Keletas biologinio proceso terminų, įskaitant proteasomų ir neurodegeneracinių ligų terminus, taip pat buvo susiję su ubikvitinacija.

Spustelėkite norėdami sužinoti apiecistancheParduodu su detalėmis

3.3|KLF15-surišančių genų, potencialiai susijusių su inkstų glomerulų MC proliferacija, bioinformatinė analizė

Norėdami ištirti KLF{0}}rišančius genus, kurie gali būti susiję suinkstų glomerulųMC platinimui, atlikome ChIP-Seq duomenų ir SILAC-LC/MS duomenų bioinformatinę analizę. Buvo patikrinti 52 genai (2 lentelė ir 2C paveikslas), o penki iš šių genų, įskaitant SUMO1, makrofagų migraciją slopinantį faktorių (MIF), eukariotų iniciacijos faktorių (EIF), į insuliną panašų augimo faktorių (IGF) ir retikulocalbiną (RCN). ), buvo glaudžiai susijęląstelių proliferacija. Kadangi diferencijuotai ekspresuotų baltymų GO ir kelio analizė parodė, kad patikrinti genai daugiausia buvo susiję su ubikvitinacijos procesu, padarėme išvadą, kad SUMO1, į ubikvitiną panašių (UBL) baltymų šeimos narys, dalyvauja potransliacinėje modifikacijoje, panašioje į ubikvitinacija kaip tikslinis KLF15 genas.

Vis daugiau įrodymų rodo, kad HG yra vienas iš pagrindinių veiksnių, skatinančių diabetinės nefropatijos vystymąsi ir skatina MC proliferaciją bei padidina matricos sintezę in vitro.25 Ankstesnis tyrimas parodė, kad PDGF-BB yra būtinas MC proliferacijai prieš vystymąsi. glomerulosklerozės sergant eksperimentiniu glomerulonefritu.26 Patvirtinus, kad MC buvo stimuliuojamas HG arba PDGF-BB in vitro, aptikome KLF15 ir SUMO1 ekspresijos pokyčius tiek RNR, tiek baltymuose.

lygius ir nustatė, kad šios molekulės turėjo panašias tendencijas (2D-l pav.). Galiausiai nustatėme, kad SUMO1 yra tikslinis KLF15 genas.

3.4|KLF15 padidina SUMO-1 geno ekspresijos reguliavimą, prisijungdamas prie 16 bp CACCCA-SUMO-1 promotoriaus srities ir C plius A turtingo motyvo

Naudojome MEME rinkinį (http://meme-suite.org/tools/meme), kad apibūdintume KLF15-surišančius 52 genų motyvus iš KLF15 ChlP-Seq duomenų ir nustatėme KLF surišantį motyvą (3A pav.). Be to, toliau išanalizavome daugiau nei tūkstantį bazių prieš SUMO1 promotorių ir nustatėme, kad KLF15 gali atpažinti 16 bp seką (nukleotidų -205~-199) ir prie jos prisijungti, įskaitant: CACCCA-(3B pav.).ChIP-PCR patvirtino, kad KLF15 yra prijungtas prie SUMO1 promotoriaus, o rezultatai parodė žymiai didesnę SUMO1 ekspresiją anti-KLF15 antikūnų grupėje nei foninėje kontrolinėje grupėje (3C pav.).

Be to, atlikome dvigubo liuciferazės reporterio tyrimą, kad patvirtintume nukreipimo ryšį tarp SUMO1 ir KLF15. Laukinio tipo SUMO1 promotoriaus grupė parodė didesnį luciferazės aktyvumą nei pGL3 vektoriaus ir mutantų grupės HRMC, o aktyvumas žymiai padidėjo dėl per didelio KLF15 ekspresijos. Liuciferazės aktyvumo padidėjimas buvo pakeistas transfekuojant plazmidę, ekspresuojančią mutanto promotoriaus sritį (3D pav.). Visi šie duomenys rodo, kad SUMO1 yra tiesioginis KLF15 transkripcijos taikinys.

3.5 |P53, kaip SUMO1 SUMOilinimo substrato, atranka

SUMO modifikacijos yra plačiai išreikštos potransliacinės modifikacijos eukariotuose. Šių modifikacijų grįžtamasis konjugacija su substrato baltymais taip pat žinomas kaip SUMOilinimas, kuris vaidina svarbų vaidmenį reguliuojant tikslinių baltymų funkcijas ir toliau dalyvauja įvairiuose biologiniuose procesuose, tokiuose kaip nukleocitoplazminis transportavimas, transkripcijos reguliavimas, apoptozė, baltymų stabilizavimas, atsakas į stresą ir kt. ląstelių ciklo progresavimą.27 Norėdami ištirti pasroviui signalizuojančias molekules, tiesiogiai konjuguotas SUMO1, atlikome SUMO1 tinklo analizę naudodami IPA duomenų bazę ir duomenys parodė, kad SUMO1 gali tiesiogiai susieti su P53, APP, JUN ir AKT, be kita ko. baltymai (4A-C pav.). Iš pradžių mes pasirinkome P53 kaip SUMO1 molekulę pasroviui, nes tai gerai žinomas baltymas, glaudžiai susijęs su ląstelių proliferacija.28.29 Be to, naudojome SUMOsp programinę įrangą, kad prognozuotume galimas įvairių rūšių P53 SUMOilinimo sekas, ir nustatėme, kad P53 turi SUMOilinimo seką. 4D pav.). Norėdami nustatyti, ar P53 iš tikrųjų yra modifikuotas SUMOilinimo būdu, laikinai transfekavome HRMC su SUMO1 ekspresijos plazmide arba SUMO1 siRNR. Tiek IP, tiek Western blot rezultatai atskleidė SUMO1-P53 ir P53 ekspresijos pokyčių tendencijas, kurios atitiko pokyčius. SUMO1 (4E-J pav.). Šie duomenys rodo, kad P53 yra SUMO1 SUMOilinimo substratas.

3.6|KLF15 slopina MC proliferaciją skatindamas SUMO1 ekspresiją ir P53 SUMOilinimą

Norėdami nustatyti P53 SUMOilinimo ir MC proliferacijos reguliavimą KLF15 ir SUMO1, mes įsikišome į KLF15 arba SUMO1 ekspresiją HRMC ir gydėme HRMC PDGF-BB. Tarp PDGF-BB apdorotų HRMC ląstelių, transfekuotų KLF15 ekspresijos plazmide, buvo didesnė SUMO1-P53, P53, KLF15 ir SUMO1 ekspresija nei ląstelėse, transfekuotose KLF15 kontroline plazmide. Tie patys SUMO1-P53, P53 ir SUMO1 pokyčiai buvo nustatyti SUMO1 per didelės ekspresijos plazmide transfekuotose ląstelėse, o KLF15 ekspresija šiose ląstelėse nepakito (5A-F pav.). PDGF-BB yra vienas iš efektyviausių iki šiol aprašytų MC augimo faktorių, ir buvo pastebėtas HRMC proliferacinis atsakas į PDGF-BB. Kaip parodyta 5G paveiksle, H, EdU teigiamų ląstelių procentas buvo žymiai padidintas vartojant rekombinantinį PDGF-BB. EdU dažymo rezultatai parodė, kad tiek KLF15, tiek SUMO1 ekspresija slopino PDGF-BB sukeltą ląstelių proliferaciją (5G pav., H).

Norėdami gauti daugiau informacijos apie KLF15 ir SUMO1 vaidmenį proliferuojant HRMC, mes transfekavome ląsteles tik su SUMO1 siRNR arba kotransfekavome jas su SUMO1 siRNR ir KLF15 ekspresijos plazmide. Sumažėjęs SUMO1 reguliavimas neturėjo įtakos KLF15 ekspresijai, tačiau SUMO1-P53 ir P53 ekspresijos lygiai akivaizdžiai sumažėjo po SUMO1 siRNR transfekcijos (6A-C pav.). Be to, kai buvo slopinama SUMO1 ekspresija, SUMO1-P53 ir P53 ekspresijos lygiai taip pat buvo slopinami net ląstelėse, kurios per daug ekspresuoja KLF15 (6D-F pav.). Tada MC proliferacija buvo įvertinta naudojant EdU dažymo testą. SUMO1 RNAi sustiprino PDGF-BBon HRMC proliferacinį poveikį, o grupė, kuri buvo kotransfekuota su KLF15 pernelyg didelės ekspresijos plazmide ir SUMO1 siRNR, turėjo daugiau EdU teigiamų ląstelių nei grupė, kuri buvo kotransfekuota pernelyg didelės ekspresijos plazmide ir hibridinės sekos kontrolės siRNR (6G pav., H). . Todėl darome išvadą, kad KLF15 slopina MC proliferaciją, sustiprindamas P53 SUMOilaciją.

3.7|Globalinė SUMO1 ir P53 ekspresija glomerulų MC neigiamai koreliuoja su MC proliferacija sergant žiurkės Thy-1 nefritu

Anti-Thy1 nefritas yra klasikinis savaime ribojamo mezangialinio proliferacinio glomerulonefrito modelis su proliferacine faze ir atsigavimo faze. Norėdami sukurti šį modelį, Wistar žiurkėms suleidome Thy1 antikūną. Tiek serumo karbamido azotas, tiek kreatininas neturi reikšmingų pokyčių tarp kontrolinių žiurkių ir pavyzdinių žiurkių (S1 pav.). Žymi mezangialinė proliferacija ir ECM kaupimasis buvo pastebėtas proliferacinės fazės metu (5 ir 7 dienomis) modelio žiurkėms, o MC skaičius sumažėjo 10 dieną atsigavimo fazėje (7A pav.). Taip pat IHC nustatėme ląstelių proliferacijos žymens PCNA ekspresijos pokyčius (7A, B pav.). PCNA lygis padidėjo 5 dieną, didžiausias buvo 7 dieną ir sumažėjo 10 dieną (7F pav.). Western blot analizė parodė, kad P53, SUMO1 ir KLF15 baltymų ekspresija izoliuotuose glomeruluose modelių grupėse buvo mažesnė nei kontrolinėje grupėje (7C, D pav.), o tai atitinka imunohistocheminius rezultatus (7E, F pav.). Šie rezultatai rodo, kad nenormalus MC dauginimasis anti-Thy1 modelio žiurkėse yra susijęs su žemo lygio KLF15 ir SUMO1 ekspresija. Tikimasi, kad trukdymas šių molekulių ekspresijai palengvins žiurkių patologinį fenotipą.

4. DISKUSIJA

Theglomerulųyra filtravimo vienetaiinkstas. Glomerulų funkcijos sutrikimą gali sukelti pirminė glomerulų patologija arba jis gali būti antrinis dėl sisteminių ligų. Mesangialiniai pokyčiai buvo pastebėti po glomerulų pažeidimo, įskaitant MC hiperproliferaciją, po to per didelę ECM gamybą (mezangialų išsiplėtimą) ir chemoatraktanto gamybą uždegiminėms ląstelėms. Todėl MC atsakų, ypač nenormalaus proliferacijos, moduliavimas yra naujas terapinis metodas. KLF15 yra baltymas, kuris atlieka reguliuojantį vaidmenį kaip transkripcijos faktorius, prisijungdamas prie specifinių DNR sekų. Daugelis tyrimų pranešė, kad KLF15 dalyvauja reguliuojant ląstelių proliferaciją. Pavyzdžiui, buvo nustatyta, kad KLF15 dalyvauja slopinant su MC proliferacija susijusius signalizacijos kelius, 15, 30, tačiau literatūroje nebuvo pranešta apie jo tiesioginį tikslinį geną. Todėl šis tyrimas daugiausia apėmė bendrą transkripcijos ir transliacijos lygių patikrinimą, siekiant nustatyti tiesioginį KLF15 tikslinį geną.

KLF15 reguliuoja skirtingus genus skirtingose ​​rūšyse ir skirtinguose audiniuose bei organuose. Reguliuodamas MC proliferaciją, KLF15 veikia daugelio genų ekspresiją ir dalyvauja keliuose keliuose.131,32 Norėdami ištirti tiesioginius KLF15 genus, mes panaudojome ChIP-Seg. Klein RH ir jo kolegos naudojo ChlP-seq. technologija, skirta tirti KLF7 reguliavimą dėl ragenos epitelio ląstelių diferenciacijos.33 Ying M ir kiti naudojo šį metodą tirdami slopinamąjį KLF9 poveikį glioblastomos pluripotencijai.34 Palyginti su ChlP lustu, ChIP-Seq leidžia atlikti tikrą viso genomo analizę. su didesne skiriamąja geba, didesniu aptikimo jautrumu ir mažesniu imties dydžio poreikiu.35 Naudojome ChP, kad gautume DNR fragmentus, tiesiogiai surištus su KLF15, o palyginę ir išanalizavę su GenBank, patikrinome 2478 galimus tikslinius genus. Atlikdami GO ir kelio analizę, nustatėme daugybę tikslinių genų, dalyvaujančių ląstelių cikle ir proliferacijos procesuose.

ChlP-Seq eksperimentams reikia PGR, kad būtų sustiprintas aptikimo signalas, o tam tikras šališkumo laipsnis stiprinimo proceso metu yra neišvengiamas. Be to, ChIP-Seq gauna tik tuos genus, kuriuos gali susieti KLF15, ir nenurodo šių genų ekspresijos pokyčių, kai pasikeičia KLF15 ekspresija. Norėdami kompensuoti šiuos trūkumus, naudojome SILAC-LC / MS proteomikos analizę. Šis metodas suteikia informacijos apie visus baltymus, kurių ekspresija keičiasi reguliuojant KLF15, įskaitant baltymus, tiesiogiai reguliuojamus KLF15, ir baltymus, kurie yra netiesiogiai reguliuojami arba modifikuojami po transliacijos. HRMC buvo kultivuojami naudojant SILAC, o KLF15 buvo per daug ekspresuojamas ląstelėse per plazmidės transfekciją. Baltymai buvo surinkti LC/MS aptikimui ir buvo gauti 1357 skirtingai išreikšti baltymai. GO ir kelio analizės atskleidė, kad kai kurie skirtingai išreikšti baltymai dalyvavo ubikvitinacijoje. Genų ir baltymų duomenys buvo susikerta. Su tyrimo tikslu nesusiję ir KLF15 tiesiogiai nereguliuojami genai buvo pašalinti; galiausiai buvo patikrinti 52 genai. Tarp jų buvo atrinkti penki genai su ryškiausiais ekspresijos skirtumais, kurie buvo labiausiai susiję su proliferacija. Atsižvelgiant į bendrus kelio analizės, SUMO1 ir KLF15 ekspresijos analizės rezultatus proliferuojančių HRMC, ChlP-PCR ir dvigubo liuciferazės reporterio tyrimuose, baltymas SUMO1 buvo pasirinktas kaip tikslinis KLF15 genas.

Be ubikvitino, identifikuojamas vis daugiau UBL baltymų 3637, įskaitant SUMO, 38 neuroninių pirmtakų ląstelių ekspresuojamų, vystymosi sulėtėjusių 8(NEDD8)3940 ir interferono stimuliuojamų genų 15(ISG15),41. Šie modifikuojantys baltymai galingai reguliuoja įvairius biologinius procesus. Kovalentinis SUMO pridėjimas prie substratų, vadinamas SUMOilacija, yra potransliacinė modifikacija, susijusi su daugybe ląstelių procesų, įskaitant branduolio citozolinį transportą, transkripcijos reguliavimą, apoptozę, baltymų stabilumo kontrolę, atsaką į stresą ir ląstelių ciklo progresavimą.27 SUMO paprastai yra prijungtas prie baltymų substratų lizino akceptorių liekanų, turinčių konsensuso seką ir prisideda prie baltymų ir baltymų sąveikos reguliavimo, taip pat prie tarpląstelinio suskaidymo ir baltymų stabilumo.2 sUMO1, kaip SUMOS šeimos narys, gali paveikti ląstelių dauginimąsi modifikuodamas substratą ir stabilizuojančius ląstelių ciklą reguliuojančius baltymus.43 Todėl kartu su literatūros ataskaita ir išsamiais atrankos bei analizės rezultatais sutelkėme dėmesį į tai, kaip KLF15 reguliuoja SUMO1 poveikį mezangialinių ląstelių proliferacijai.

Norėdami nustatyti SUMO1 substratus, atlikome SUMO1 tinklo analizę naudodami IPA duomenų bazę ir SUMOsp programinę įrangą. Kartu su paskelbtais P53 tyrimais, mūsų pradiniai atrankos duomenys parodė, kad P53 yra pasroviui esanti SUMO1 molekulė su SUMOylation seka YKxD/E. Ankstesni tyrimai parodė, kad P53 buvo SUMOilinimo substratas45, o sustiprinta P53 SUMO1 konjugacija skatino P53 stabilumą ir aktyvumą bei paskatino senėjimą.46 Mūsų tyrime trukdžiai SUMO1 raiškai HRMC sukėlė tokias pačias pokyčių tendencijas. SUMO1-P53 ir P53, nurodant, kad P53 buvo SUMO1 SUMOilinimo substratas.

Nauji įrodymai rodo, kad SUMOilinimas ir de-SUMOilinimas vaidina svarbų vaidmenį daugelyje nefropatinių ligų, tokių kaip inkstų disgenezė, inkstų karcinoma, glomerulų liga, podocitų apoptozė ir inkstų šerdies hipertoniškumas, ūminis inkstų pažeidimas ir nefrolitiazė.7-51 Norėdami paaiškinti ryšį tarp KLF15, SUMO1, P53 SUMOilinimo ir MC proliferacijos, atlikome daugybę transfekcijos procedūrų ląstelėse, kurioms buvo atlikta PDGF-BB sukelta proliferacija. Pernelyg didelė KLF15 ekspresija padidino SUMO1 ekspresijos reguliavimą, o per didelė SUMO1 ekspresija neturėjo įtakos KLF15 ekspresijai. KLF15 arba SUMO1 per didelė ekspresija padidino P53 SUMOilinimą ir antagonizavo PDGF-BB sukeltą ląstelių proliferaciją. Kai buvo slopinama SUMO1 ekspresija, taip pat buvo slopinamas P53 SUMOilinimas, o KLF15 prarado antagonistinį poveikį ląstelių proliferacijai. In vivo. MC proliferacija palaipsniui didėjo, paūmėjus mezangialiniam proliferaciniam nefritui, o KLF15, SUMO1 ir P53 ekspresija žymiai sumažėjo. Atsižvelgdami į integruotus stebėjimus ląstelėse ir audiniuose, preliminariai darome išvadą, kad KLF15 reguliuoja P53 SUMOilinimą per SUMO1, taip slopindamas MC proliferaciją.

5. IŠVADOS

Kai kurie tyrimai parodė, kad KLF15 vaidina svarbų vaidmenį reguliuojant MC dauginimąsi. Šiame darbe ištyrėme šio transkripcijos faktoriaus sąlygojamus MC proliferacijos slopinimo mechanizmus. Mes nustatėme SUMO1 kaip pagrindinį KLF15 taikinį MC, atlikdami bioinformatikos analizę, kurioje dalyvavo ChIP-Seq ir SILAC-LC / MS. Be to, naudodamiesi IPA duomenų baze ir SUMOsp programine įranga, nustatėme, kad P53 buvo tiesioginis SUMO1 substratas. In vitro ir in vivo eksperimentai patvirtino, kad KLF15 gali skatinti SUMO1 ekspresiją ir P53 SUMOilinimą, tada slopina MC proliferaciją (S2 pav.). Šie rezultatai padeda suprasti KLF15 reguliavimo vaidmenį MC proliferacijoje ir suteikia teorinį pagrindą ieškant naujų su MC proliferacija susijusių inkstų ligų gydymo būdų.