Lepisorus Thunbergianus kafeoilchino rūgščių ir jų melanogenezę slopinančio aktyvumo apibūdinimas

Kontaktai: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 El. paštas:audrey.hu@wecistanche.com

Hakas Hyunas Kimas, Jae Kwon Kim, Jaehyunas Kimas, Se-Hui Jungas* ir Kooyeonas Lee*

SANTRAUKA:Hiperpigmentacija, atsirandanti dėl per didelio tirozinazės aktyvinimo, sukelia tamsesnes dėmes ar dėmelius ant žmogaus odos. Nors šie reiškiniai yra nekenksmingi, vis dar yra didelis melanogenezės inhibitorių poreikis, siekiant užkirsti kelią hiperpigmentacijai, slopinant tirozinazę, greitį ribojantį melanogenezės fermentą. Nors Lepisorus thunbergianus buvo naudojamas liaudies gynimo priemonėse kaip diuretikas ir hemostazinis agentas, jo poveikis melanogenezei dar nepraneštas. Šiame tyrime paruošėme L.thunbergianus ekstraktą ir jo tirpiklių frakcijas bei įvertinome jų biologinį aktyvumą prieš laisvųjų radikalų ir melanino sintezę. L. thunbergianus ekstraktas veiksmingiau slopino grybų tirozinazės aktyvumą nei arbutinas in vitro ir turėjo panašų antioksidacinį aktyvumą. Lyginamasis L. thunbergianus tirpiklių frakcijų anti-melanogenezės ir antitirozinazės aktyvumo įvertinimas parodė, kad, slopindama tirozinazės aktyvumą, butanolio frakcija turi didžiausią potencialą slopinti melanogenezines melanomos ląsteles. Atlikdami struktūrinę analizę, naudojant aukštos kokybės skysčių chromatografiją (HPLC) ir BMR spektroskopiją, nustatėme, kad pagrindiniai butanolio frakcijos junginiai buvo trys kafeoilchino rūgšties dariniai. Trys dariniai turėjo panašų radikalų šalinimo ir antitirozinazės aktyvumą in vitro, o tik 5-kofeoilchino rūgštis slopino -MSH sukeltą melanogenezę. Slopinamasis 5-kofeoilchino rūgšties poveikis buvo patikrintas nustatant melanino kiekį ir tirozinazės aktyvumą sergant melanoma, ląsteles apdorojus komerciniu junginiu. Be to, mes atskleidėme, kad 5-kofeoilchino rūgštis slopino melanogenezę, sudarydama chelatinius vario katijonus iš vario-tirozinazės komplekso. Taigi 5-kofeoilchino rūgštis arba butanolis, išskirtas iš L. thunbergianus, gali būti naudingi kosmetikoje kaip odą balinanti priemonė.

Cistanche tubulosa: odą balinanti medžiaga.

ĮVADAS

Melaninas, natūralių pigmentų grupė, randama daugumoje organizmų, vaidina svarbų vaidmenį ruduojant vaisiams, grybams ir daržovėms bei pigmentacijai žmogaus odoje.1 Melaninis gaminamas iš aminorūgšties tirozino per daugiapakopį procesą, apimantį fermentinę oksidaciją ir polimerizaciją. 2 Nežmonėms melanino pigmentą sintetina specializuoti dendritinių ląstelių melanocitai, esantys epidermio ir dermos sandūroje, kur sintezę inicijuoja ultravioletiniai (UV) spinduliai.3 Melanino pigmentas pernešamas į keratinocitus, siekiant apsaugoti odą nuo UV spindulių ir laisvųjų radikalų; taigi, odos spalvą lemia melanino pigmento pasiskirstymo modelis.2 Sutrikusi inmelanino sintezė sukelia daugybę hiperpigmentacijos formų, tokių kaip melasma, strazdanos, amžiaus dėmės, saulės lentigo, použdegiminė hiperpigmentacija ir kiti hiperpigmentacijos sindromai. šimtas baltymų yra susiję su tomelanino sinteze, o tarp jų tirozinazė yra greitį ribojantis fermentas, kuris yra pripažintas atsakingas už formelanino sintezę.5 Taigi dauguma tyrimų, kuriais siekiama užkirsti kelią hiperpigmentacijai, yra skirti naujų stiprių medžiagų identifikavimui, išskyrimui, sintezei ir apibūdinimui. tirozinazės inhibitoriai melanogenezės prevencijai.1,6 Kai kurie tirozinazės inhibitoriai, tokie kaip kojo rūgštis, arbutinas, hidrochinonas, azelaino rūgštis, ellago rūgštis ir traneksamo rūgštis, buvo populiarūs kosmetikos pramonėje kaip anti-melanogenezės agentai; tačiau dėl cheminių vaistų apribojimų, įskaitant citotoksiškumą ir šalutinį poveikį, vis dar reikia naujų medžiagų, kurios pagerintų saugumą, stabilumą ir veiksmingumą.

Dėl mažesnio toksiškumo ir geresnio biologinio suderinamumo bei biologinio prieinamumo natūralūs produktai, įskaitant augalus, bakterijas ir grybus, tapo alternatyviais šaltiniais ieškant veiksmingų odą balinančių ingredientų. arba medžių žievė ir paplitęs Rytų Azijos vidutinio klimato regionuose, pavyzdžiui, Korėjoje, Japonijoje, Kinijoje, Filipinuose ir Indokinijoje. L. thunbergianus buvo naudojamas kaip adiuretikas, hemostazinis agentas ir mažina kosulį korėjiečių liaudies gynimo priemonėse. Ankstesni tyrimai pranešė, kad L. thunbergianus ekstraktas turi vietinį antilipidų peroksidacinį aktyvumą ir vietinį ir antioksidacinį aktyvumą.9 Be to, L. thunbergianus ekstraktas parodė reikšmingą nuo koncentracijos priklausomą burnos vėžio ir gaubtinės žarnos vėžio ląstelių augimo slopinimą.10 L. thunbergianusekstraktas gali būti pritaikytas. kosmetikos pramonėje, nes šiame augale yra įvairių flavonoidinių junginių ir daugybės bioaktyvių molekulių, tarp kurių yra kvercetino 3-metilo eterio gliukozidas, viteksinas, rytietiškas, periodinis gliukozidas, izoviteksinas, orientinas, korentinas ir kofeoilchinarūgštis.9a Tačiau L. thunbergianus ekstrakto onmelanino sintezė melanocituose dar neišaiškinta.

1 pav. L. thunbergianus ekstrakto (A) ABTS radikalų šalinimo, (B) antitirozinazės ir (C) tarpląstelinio ROS pašalinimo aktyvumo analizė.

Šiame tyrime mes paruošėme L. thunbergianus ekstraktą ir jo tirpiklių frakcijas serijinės frakcijos būdu ir ištyrėme tirpiklio frakcijų slopinamąjį poveikį melanino biosintezei B16F10 melanomos ląstelėse. Mes nustatėme, kad butanolio (n-BuOH) frakcija yra pagrindinė dalis, kurioje yra natūralaus inhibitoriaus, ir toliau apibūdinome kofeoilchino rūgšties darinių, išskirtų iš L. thunbergianus ekstraktų, poveikį melanino biosintezės slopinimui.

cistanche apžvalga: antioksidacija

REZULTATAI IR DISKUSIJA

L. thunbergianus etanolio ekstraktas pašalina 2,2′-Azinobis(3-etilbenzotiazolino-6-sulfonrūgštį (ABTS) radikalą ir slopina tirozinazės aktyvumą.

L ištraukimas. thunbergianus su 70 procentų etanolio (EtOH) buvo atliktas siekiant įvertinti galimą natūralių junginių slopinamąjį aktyvumą augale. L.thunbergianus ekstrakto radikalų šalinimo aktyvumas buvo nustatytas 2–200 ug/mL koncentracijos intervale. Etanolio ekstraktas parodė nuo koncentracijos priklausomą radikalų šalinimo aktyvumą, kurio didžiausias poveikis buvo 50 ug/ml, o rezultatas atitiko arbutino, naudoto kaip teigiamą kontrolę, rezultatą (1A pav.).

Taip pat įvertinome ekstrakto slopinamąjį poveikį grybų tirozinazės aktyvumui, matuodami tirozinazės katalizuojamą dopachromo sintezės greitį. Etanolekstraktas slopino 87 procentus tirozinazės aktyvumo esant 500 ug/ml, o arbutinas slopino tik 38 procentus tirozinazės aktyvumo esant tokiai pačiai koncentracijai (1B pav.). Tada įvertinome ekstrakto pašalinimo aktyvumą tarpląsteliniame ROS, padidintą 100 μM vandenilio peroksido. Gydymas vandenilio peroksidu padidino B16F10 ląstelių tarpląstelinį ROS lygį maždaug 2.{7}} (1C pav.). Mes nustatėme, kad dėl vandenilio peroksido sukeltą intracelulinės ROS padidėjimą ekstraktas pašalino priklausomai nuo dozės: maksimalus pašalinimo aktyvumas esant 100 ug/ml buvo 78 procentai (1C pav.). Šie rezultatai rodo, kad L. thunbergianus etanolio ekstrakte yra biologiškai aktyvių ingredientų, kurie slopina tirozinazės aktyvumą, taip pat pašalina ABTS radikalą ir tarpląstelinį ROS.

cistanche deserticola ekstraktas: slopina tirozinazės aktyvumą.

L. thunbergianus frakcijų slopinimo potencialas prieš melanogenezę.

A crude EtOH extract was fractionated with various solvents including hexane (Hex), methylene chloride (CH2Cl2), ethyl acetate (EtOAc), and butanol to identify and characterize ingredients inhibiting melanogenesis. To identify which solvent fractions have the potential against melanin synthesis, we performed a comparative analysis of four different L. thunbergianus solvent fractions for the radical scavenging and anti-tyrosinase activities. First, to evaluate the antioxidant activity of the four solvent fractions of the L. thunbergianus extract, we determined the ABTS radical scavenging activities in the concentration range of 2−200 μg/ mL. All fractions showed a concentration-dependent increase in ABTS radical scavenging activity (Figure 2A). In particular, EtOAc and n-BuOH fractions completely scavenged the ABTS radical at a 50 μg/mL concentration. The ABTS radical scavenging activity was in the order of n-BuOH > EtOAc >CH2Cl2 > Hex, o tai atitinka ankstesnę ataskaitą.10b Be to, skirtingų tirpiklių frakcijų slopinamasis poveikis tirozinazės aktyvumui padidėjo priklausomai nuo koncentracijos: maksimalus n-Hex ir CH2Cl2 frakcijų slopinamasis aktyvumas buvo mažesnis nei 65 proc., o EtOAc ir n-BuOH frakcijos buvo didesnės nei 70 procentų (2B pav.). Slopinamasis aktyvumas buvo toks: n-BuOH > EtOAc > CH2Cl2 > n-Hex. Šie rezultatai rodo, kad daugiau hidrofilinių frakcijų, įskaitant n-BuOH ir EtOAc frakcijas, pasižymėjo didesniu radikalų sulaikymu ir geresniu slopinamuoju aktyvumu nei lipofilinės n-Hex ir CH2Cl2 frakcijos. .

Toliau buvo tiriamas L. thunbergianus tirpiklių frakcijų poveikis melanomos ląstelių proliferacijai apdorojant B16F10 ląsteles 200 ug/mL skirtingų frakcijų arba 2 mg/mL arbutino. melanocitus stimuliuojančio hormono (-MSH), kuris, kaip žinoma, skatina melanogenezę per su mikroftalmija susijusio transkripcijos faktoriaus (MITF) indukciją.11 Rezultatai parodė, kad nė viena frakcija neturėjo reikšmingo poveikio melanomos ląstelių proliferacijai (2C pav.). Tada ištyrėme tirpiklio frakcijų slopinamąjį poveikį melanogenezei, kurią stimuliuoja -MSH melanomos ląstelėse. Gydymas -MSH sukėlė B16F10 ląstelių tarpląstelinio melanino kiekio padidėjimą maždaug 2{13}} kartus (2D pav.). Mes nustatėme, kad -MSH tarpininkaujamą melanogenezę visiškai slopino n-BuOH frakcija (p < 0,01)="" ir="" iš="" dalies="" slopino="" etoacfraction="" (40="" proc.,="" p="">< 0,01),="" o="" -msh="" tarpininkaujamą="" melanogenezę="" n-hex="" reikšmingai="" nepakeitė.="" ir="" ch2cl2="" frakcijos="" (2d="" pav.).="" be="" to,="" buvo="" nustatytas="" tirpiklių="" frakcijų="" slopinamasis="" poveikis="" tirozinazės="" aktyvacijai,="" kurią="" sąlygoja="" -msh,="" kadangi="" tirozinazė="" vaidina="" pagrindinį="" vaidmenį="" melanogenezėje.="" -msh,="" o="" n-hex="" ir="" ch2cl2="" frakcijos="" to="" nepadarė,="" kaip="" parodyta="" 2e="" paveiksle.="" be="" to,="" vandenilio="" peroksidas="" paskatino="" skirtingų="" tirpiklių="" frakcijų="" šalinimo="" poveikį="" tarpląsteliniam="" ros="" padidėjimui.="" visos="" tirpiklio="" frakcijos="" pakeitė="" tarpląstelinį="" ros="" padidėjimą,="" kurį="" sąlygoja="" vandenilio="" peroksidas,="" kaip="" parodyta="" 2f="" paveiksle.="" šie="" rezultatai="" rodo,="" kad="" l.="" thunbergianus="" buoh="" frakcija="" slopino="" -msh="" sukeltą="" melanino="" sintezę,="" slopindama="" tarpląstelinį="" tirozinazės="" aktyvumą="" b16f10="" ląstelėse.="" be="" to,="" šie="" rezultatai="" rodo,="" kad="" bioaktyvūs="" ingredientai,="" slopinantys="" melanino="" sintezę,="" buvo="" hidrofiliniai="" ir="" daugiausia="" randami="" n-buoh="">

2 pav. Tirpiklio frakcijų poveikis ABTS radikalų šalinimui, antitirozinazei ir anti-melanogenezei.

L. thunbergianus ekstrakto bioaktyvių junginių identifikavimas ir apibūdinimas.

Norint nustatyti ir apibūdinti melanogenezę slopinančius ingredientus, buvo atlikta visų tirpiklių frakcijų didelio efektyvumo skysčių chromatografijos (HPLC) analizė. Tirpiklio frakcijų HPLC analizė parodė, kad visose frakcijose yra trys pagrindiniai junginiai, kurių sulaikymo laikas yra atitinkamai 21, 28 ir 29 min. 1, 2 ir 3 junginiams (3A–D pav.). Šie trys pagrindiniai junginiai buvo toliau išskirti preparatyviniu HPLC gryninimu. Remiantis ankstesne ataskaita, trijų pagrindinių junginių kiekiai n-BuOH frakcijoje buvo nustatyti naudojant komercinius kafeoilchino rūgšties darinius kaip vidines standartines molekules.

Tada izoliuoti junginiai buvo identifikuoti palyginus jų 1H ir 13C BMR duomenis su literatūroje ir buvo nustatyta, kad jie sutampa su pasiūlytomis struktūromis (4 pav.).13 3E paveiksle parodyta trijų junginių molekulinė struktūra. 1 junginys (išeiga, 3,2 ± 0,1 mg/100 mg n BuOH frakcija) buvo gautas kaip šviesiai geltoni milteliai. 1H BMR (400 MHz, DMSO-d6) 8 9,66 (1H, brs), 9,20 (1H, brs), 7,49 (1H, d, J=15,9 Hz), 7,04 (1H, s), 6,99 ( 1H, d, J=8,2 Hz), 6,78 (1 H, d, J=8,1 Hz), 6,23 (1 H, d, J=15,9 Hz), 5,20( 1H, m), 5,08 (1H, brs), 4,89 (1H, brs) 4,13 (1H, m), 3,84 (1H, m), 3,56 (1H, s), 3,35 (1H, s), 1,99 (1H, s). m), 1,92 (1 H, m), 1,89 (1 H, m), 1,79 (1 H, m). 13C{1H} BMR (100 MHz, DMSO-d6) 8 (176,42, 168,10, 148,14, 145,53, 144,75, 125,65, 121,07, 115,75, 121,07, 115,75, 3,3,7,2,7,8,2,7,8,2,8,5,8,114,71). 1 junginys buvo identifikuotas kaip 3-kofeoilchinarūgštis pagal BMR analizę ir palyginus su ankstesne literatūra.13b

2 junginys (išeiga, 14,1 ± 0,1 mg/100 mg n-BuOH frakcija) buvo gautas kaip šviesiai geltoni milteliai. 1H BMR (400 MHz, DMSO-d6) 8 9,64 (1H, brs), 9,20 (1H, brs), 7,52 (1H, d, J=15,9 Hz), 7,06 (1H, s), 7,02 ( 1H, d, J=8,1 Hz) 6,79 (1 H, d, J=7,9 Hz), 6,30 (1 H, d, J=15,9 Hz), 4,85 ( 1H, brs), 4,70 (1H, d, J=4,9 Hz), 4,12 (1H, brs), 3,95 (1H, m), 1,97 (2H, m), 1,88 (1H, m), 1,83 (1H, m). 13C{1H} BMR (100MHz, DMSO-d6) 8 (176,02, 166,27, 148,28, 145,55, 144,77, 125,54, 121,19, 115,76, 121,19, 115,76, 121,19, 115,76, 121,19, 115,76, 121,19, 115,76, 121,19, 115,76, 27,6,6,6,6,6,67,114,6. 2 junginys buvo nustatytas kaip 5-kofeoilchino rūgštis pagal BMR analizę ir palyginus su ankstesne literatūra.13c

3 junginys (išeiga, 3,9 ± 0,2 mg/100 mg n-BuOH frakcija) buvo gautas kaip šviesiai geltoni milteliai. 1H BMR (400 MHz, DMSO-d6) 8 9,64 (1H, brs), 9,20 (1H, brs), 7,52 (1H, d, J=15,9 Hz), 7,06 (1H, s), 7,02 ( 1H, d, J=8,1 Hz) 6,79 (1 H, d, J=7,9 Hz), 6,30 (1 H, d, J=15,9 Hz), 4,85 ( 1H, brs), 4,70 (1H, d, J=4,9 Hz), 4,12 (1H, brs), 3,95 (1H, m), 1,97 (2H, m), 1,88 (1H, m), 1,83 (1H, m). 13C{1H} BMR (100MHz, DMSO-d6) 8 (176,02, 166,27, 148,28, 145,55, 144,77, 125,54, 121,19, 115,76, 121,19, 115,76, 121,19, 115,76, 121,19, 115,76, 121,19, 115,76, 121,19, 115,76, 27,6,6,6,6,6,67,114,6. 3 junginys buvo nustatytas kaip 4-kofeoilchino rūgštis pagal BMR analizę ir palyginus su ankstesne literatūra.13a

3 pav. L. thunbergianus (A) n-Hex, (B) CH2Cl2, (C) EtOAc ir (D) n-BuOH frakcijų HPLC chromatogramos ir trijų pagrindinių junginių (E) struktūra.

Kofeoilchino rūgšties darinių, išskirtų iš L. thunbergianus, slopinamasis potencialas prieš melanogenezę.

Toliau, norėdami nustatyti biologiškai aktyvų ingredientą, pagrindžiantį stiprią anti-melanogenezę, nustatėme trijų kafeoilchino rūgšties darinių, išskirtų iš L. thunbergianus, slopinamąjį aktyvumą prieš melanino sintezės inmelanomos ląsteles. Pirma, buvo ištirtas trijų darinių poveikis ABTS radikalų šalinimui. Rezultatai parodė, kad trys dariniai turėjo panašų ABTS radikalų šalinimo aktyvumą (5A pav.). Tada ištyrėme trijų darinių, išskirtų iš L. thunbergianus ontirozinazės aktyvumo, slopinamąjį poveikį. Trys dariniai parodė nuo koncentracijos priklausomą tirozinazės aktyvumo slopinimą, o didžiausią slopinimą esant 200 μM koncentracijai (5B pav.). Be to, ištyrėme trijų darinių slopinamąjį poveikį -MSH sukeltai melanino sintezei B16F10 ląstelėse. Gydymas -MSH sukėlė maždaug 2{11}}viduląstelinio melanino kiekio padidėjimą B16F10 ląstelėse (5C pav.). Įdomu tai, kad junginiai 1 (3-kofeoilchinarūgštis) ir 3 (4-kofeoilchino rūgštis) žymiai padidino melanino sintezę atitinkamai 25 ir 23 procentais (5C pav., p.< 0.001),="" while="" compound="" 2="" (5-caffeoylquinic="" acid)="" completely="" reversed="" α-msh-induced="" melanogenesis="" (p="" <="" 0.001).="" these="" results="" suggest="" that="" the="" three="" caffeoylquinic="" acid="" derivatives="" with="" similar="" structures="" but="" different="" substitution="" sites="" have="" different="" biological="" activities="" on="" melanogenesis.="" furthermore,="" 5-caffeoylquinic="" acid="" has="" potent="" inhibitory="" activity="" against="">

4 pav. (A) 3-kofeoilchino rūgšties, (B) 4-kofeoilchino rūgšties ir (C) 5-kofeoilchino rūgšties 1H BMR spektrai ir (D) {{13C BMR spektrai 6}}kafeoilchino rūgštis, (E) 4-kofeoilchino rūgštis ir (F) 5-kofeoilchino rūgštis

5-Kofeoilchino rūgšties antimelanogenezės veiksmingumo patikrinimas.

Siekdami patikrinti {{0}}kofeoilchino rūgšties slopinamąjį poveikį melanogenezei, nustatėme komercinės 5-kofeoilchino rūgšties onmelanino sintezės, kurią tarpininkauja -MSH, slopinamąjį poveikį. Gydymas mažesnėmis koncentracijomis 0,1 ir 0,2 mM 5-kofeoilchinarūgšties šiek tiek padidino melanino sintezę ir intracelulinės tirozinazės aktyvumą, o didesnės 0,5 ir 1 mm junginio koncentracijos panaikino -MSH sukeltą melanogenezę. ir tarpląstelinis tirozinazės aktyvumas (6A, B pav.), kurių rezultatai atitinka ankstesnę ataskaitą.14

Kofeoilchino rūgštis yra fenolio junginys, susidarantis esterio ryšiu tarp kavos rūgšties ir L-chino rūgšties. Buvo žinoma, kad kofeoilchino rūgšties dariniai turi anti-melanogenezės ir antitirozinazės aktyvumą, taip pat ROS šalinimo aktyvumą. Tirozinazė yra daugiafunkcis vario turintis metalofermentas su dvivalenčiais vario katijonais.1 Kofeoilchino rūgšties dariniai gali slopinti tirozinazės aktyvumą sudarydami chelatus vario katijoną, atsakingą už aktyvios tirozinazės būsenos palaikymą. Norint numatyti 5-kofeoilchino rūgšties ir tirozinazės sąveiką, buvo atliktas skaičiavimo molekulinio prijungimo tyrimas naudojant Maestroprogramą. Geriausia junginio poza, prijungta totirozinazė, pavaizduota 6C, D paveiksle. Molekulinio prijungimo tyrimas atskleidė, kad 5-kofeoilchino rūgštis sąveikauja su variu 2,43 Å atstumu ir sukuria π-π sudėjimą su His 259, Asn 260, His 85 ir His 263 liekanos ir H-jungtis su Arg 268. Be to, tirozinazės ir 5-kofeoilchino rūgšties surišimo energija buvo –4,425 kJ/mol. Šie rezultatai rodo, kad 5-kofeoilchino rūgštis gali slopinti tirozinazės aktyvumą, sudarydama vario chelatą. Norėdami patikrinti melanogenezę slopinantį 5-kofeoilchinarūgšties mechanizmą, nustatėme 5-kofeoilchino rūgšties vario kompleksonų susidarymą. 5-kofeoilchino rūgšties vario kompleksonas buvo padidintas priklausomai nuo koncentracijos (6E pav.). Šis rezultatas rodo, kad 5-kofeoilchinarūgštis slopina melanino sintezę sudarydama chelatinius vario katijonus, sąveikaujančius su tirozinaze.

5 pav. Trijų kafeoilchino rūgšties darinių poveikis radikalų šalinimui, in vitro antitirozinazei ir anti-melanogenezei B16F10 ląstelėse.

MEDŽIAGOS IR METODAI

Medžiagos

L. thunbergianus buvo įsigytas iš internetinės rinkos www.jirisangol.com (Korėja) ir išdžiovintas aplinkos sąlygomis prieš naudojimą šiame tyrime. Reagentai, tokie kaip 2,2′-cinko bis(3-etil-benzotiazolino-6-sulfonrūgštis (ABTS) ir 3-(4,5-dimetiltiazolas-2- il)-2,5-difeniltetrazolio bromidas (MTT), -melanocitus stimuliuojantis hormonas (-MSH) ir fermentai, tokie kaip grybų tirozinazė, buvo gauti iš Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, Kalio sulfatas (K2S2O8), pirokatecholio violetinis ir 3,4-dihidroksi-L fenilalaninas (L-DOPA) buvo įsigyti iš Alfa Aesar (Haverhill, MA, JAV).

L. thunbergianus ekstrahavimas ir frakcionavimas.

Džiovintas L. thunbergianus (80 g) buvo susmulkintas naudojant pulverizatorių (HBL-3500S, Samyang Electronics, Korėja) ir tris kartus ekstrahuotas 70 procentų EtOH (kiekvieną kartą 800 ml). ) 70 laipsnių temperatūroje 3 dienas. Gautas ekstraktas vakuuminiu būdu filtruojamas naudojant Advantecfilter popierių Nr. 1 ir 2 (Toyo Roshi Kaisha, Ltd., Tokijas, Japonija) ir sukoncentruotas naudojant Hei-Vap Advantage rotacinį garintuvą (Heidolph, Vokietija), kad būtų gauta 17,2 g EtOH neapdoroto ekstrakto. Šis neapdorotas ekstraktas buvo suspenduotas dH2O (180 ml) ir paeiliui frakcionuojamas su Hex, CH2Cl2, EtOAc ir n-BuOH, kad gautų Hex (1,51 g, 8,8 proc.), CH2Cl2 (0,88 g, 5,1 proc.), EtOAc (3,95 g). proc.) ir n-BuOH (3,02 g, 17,6 proc.), kaip aprašyta anksčiau.15 Gauti ekstraktai ir frakcijos prieš naudojimą buvo išdžiovinti šalčiu ir laikomi –80 laipsnių temperatūroje.

ABTS laisvųjų radikalų pašalinimo aktyvumo nustatymas.

Norint įvertinti L.thunbergianus ekstraktų ir jo tirpiklių frakcijų antioksidacinį aktyvumą, kaip aprašyta anksčiau, buvo nustatytas ABTSradikalų sugėrimo aktyvumas.16 Norint sukurti ABTS radikalą, 10 ml 7 mMABTS buvo sumaišyta su 176 μL 140 mM. kaliomperoksidisulfatas dH2O ir inkubuojamas tamsoje kambario temperatūroje (RT) 16 valandų prieš naudojimą. ABTS radikalų tirpalas buvo praskiestas absoliučiu metanoliu, kad būtų gauta beveik 0, 7 absorbcija prie 734 nm. 100 μL kiekvieno ekstrakto arba frakcijų alikvotinės dalys nurodytoje 2–200 ug/mL koncentracijos diapazone buvo pridėtos prie 100 μL praskiesto ABTS radikalų tirpalo ir 10 minučių inkubuojami tamsoje kambario temperatūroje. Tada absorbcija buvo išmatuota esant 732 nm, naudojant daugiamodį mikroplokštelių skaitytuvą SpectraMaxM5 (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, JAV). ABTS radikalų šalinimo aktyvumas buvo apskaičiuotas taip

ABTS radikalų šalinimo veikla (procentais ) =1−(Asample / Acontrol)×100 (1)

Tirozinazės slopinimas in vitro.

L.thunbergianus ekstraktų ir jo tirpiklių frakcijų slopinamasis poveikis tirozinazės aktyvumui buvo įvertintas pagal dopachromesintezės kiekį katalizinės tirozinazės reakcijos metu.2a,17Trumpai tariant, 50 μL kiekvieno ekstrakto ar frakcijos nurodytoje koncentracijos diapazone buvo sumaišyta su 50 50 μL. U/mL grybų tirozinazė 50 mM fosfatiniu buferiniu tirpalu (PBS; 8,1 mM Na2HPO4, 1,2 mM KH2PO4, pH 6,8, 2,7 mMKCl ir 138 mM NaCl) 96- šulinėlių plokštelėje ir inkubuojama 30 min. Tada į kiekvieną šulinį įpilta 100 μL 1 mM L-DOPA, po to inkubuojama dar 10 minučių 37 laipsnių temperatūroje. Gauto tirpalo absorbcija buvo išmatuota esant 475 nm, naudojant SpectraMax M5 daugiamodį mikroplokštelės skaitytuvą.

Ląstelių kultūros.

B16F10 pelių melanomos ląstelės buvo kultivuojamos Dulbecco modifikuotoje Eagle terpėje (DMEM) (Gibco, Gaithersburg, JAV), papildytos 10 procentų karščiu inaktyvuotu galvijų vaisiaus serumu (Gibco), 100 vienetų/ml penicilino ir 100 ug/ml (3 GG streptomicino) esant drėgnam 5 proc. CO2.

Ląstelių gyvybingumas.

B16F10 ląstelių gyvybingumas buvo nustatytas naudojant MTT tyrimą, kaip aprašyta anksčiau.18 Trumpai tariant, B16F10 ląstelės buvo pasėtos į 24-šulinėlių plokšteles, kurių tankis buvo 1 × 104 ląstelių vienoje duobutėje. Po 24 valandų ląstelės buvo apdorotos nurodytos koncentracijos L. thunbergianus ekstraktais arba frakcijomis 48 valandas. Tada ląstelės buvo inkubuojamos su MTT tirpalu 4 valandas, o redukuoti formazano kristalai buvo ištirpinti DMSO. Gautas tirpalas buvo perkeltas į 96-šulinėlių plokšteles, o absorbcija buvo išmatuota esant 540 nm, naudojant SpectraMax M5multimode mikroplokštelių skaitytuvą.

Tarpląstelinių reaktyvių deguonies rūšių (ROS) nustatymas.

Intraląstelinis ROS lygis buvo matuojamas naudojant DCF / H2DCFDA ląstelių ROS tyrimo rinkinį (ab113851, Abcam), pagal gamintojo instrukcijas. Trumpai tariant, B16F10 ląstelės buvo pasėtos į 48-šulinėlių plokšteles, kurių tankis buvo 2 × 104 ląstelių viename šulinyje. Po 24 valandų kultivavimo ląstelės buvo apdorotos 1 valandą nurodytomis koncentracijomis L. thunbergianus ekstraktorinių tirpiklių frakcijomis 0,1 procento galvijų serumo albumino (BSA) turinčioje auginimo terpėje be fenolio raudonojo. Po to ląstelės buvo inkubuojamos su 100 μM vandenilio peroksidu 30 min. Po plovimo PBS, ląstelės buvo apdorotos 25 μMH2DCFDA PBS 45 min. ROS lygis buvo analizuojamas mikroplokštelių skaitytuvu (Synergy H1, Biotek, Vermont, JAV), turinčiu fluorescencinį filtrą esant 485/545 nm (sužadinimo / emisijos bangos ilgis). Vidutinis santykinis kontrolės fluorescencijos intensyvumas buvo prilygintas 100 procentų, proporcingai apskaičiuojant gydymo sąlygas.

Melanino kiekio nustatymas.

Melanino kiekis buvo nustatytas, kaip aprašyta anksčiau, su tam tikrais pakeitimais.19 Melanomos ląstelės buvo kultivuojamos šešių šulinėlių plokštelėje 24 valandas. Jie buvo apdoroti nurodytos koncentracijos L. thunbergianus ekstraktu arba jo tirpiklių frakcijomis dar 48 valandas, esant 100 nM -MSH. Du kartus išplovus atšaldytu Dulbecco fosfatu buferiniu fiziologiniu tirpalu, papildytu kalcio chloridu ir magnio chloridu (D-PBS, Gibco), gautos ląstelės buvo atskirtos inkubuojant su tripsino-EDTA tirpalu. Po centrifugavimo 1000 aps./min 3 minutes, ląstelių nuosėdos buvo ištirpintos 150 μL 1 M NaOH, turinčio 10 procentų DMSO, 1 valandą 60 laipsnių temperatūroje 1 valandą. Melanino kiekis buvo nustatytas pagal absorbciją esant 405 nm, naudojant mikroplokštelių skaitytuvą.

Cistanche ekstraktas slopina melaniną.

Ląstelių tirozinazės aktyvumo nustatymas melanomos ląstelėse.

Tirozinazės aktyvumas B16F10 ląstelėse buvo ištirtas pagal dopachromo kiekį, susidarantį vykstant katalizinei viduląstelinės tirozinazės reakcijai.20 Trumpai tariant, melanomos ląstelės buvo kultivuojamos šešių šulinėlių plokštelėje 24 valandas, po to buvo apdorotos skirtingomis L.thunbergianus ekstrakto arba jo tirpiklio koncentracijomis. frakcijos dar 48 hin, kai yra 100 nM -MSH. Du kartus nuplovus lediniu D-PBS, ląstelės buvo lizuojamos 200 μl radioimunoprecipitacijos tyrimo (RIPA) buferio (Sigma-Aldrich), kuriame yra proteazės ir fosfatazės inhibitorių. Po ląstelių lizato, surinkto iš kiekvieno šulinio, centrifugavimo 15,000g 15 min., 100 μL supernatanto sumaišoma su 100 μL 1 mM L-DOPA PBS (pH 6,8), po to inkubuojama 30 min 37 laipsnių temperatūroje. . Dopachromo absorbcija buvo išmatuota esant 475 nm, naudojant mikroplaterių skaitytuvą. Duomenys buvo normalizuoti naudojant baltymų koncentraciją, nustatytą bicinchonino rūgšties tyrimu.

Bioaktyvių junginių išskyrimas ir apibūdinimas naudojant HPLC.

HPLC buvo atlikta naudojant YL{{0}}(Young Lin Instrument, Korėja), turinčią TC-C18 kolonėlę (4,6 mm, 25{9}} mm ir 5 μm, Agilent, JAV), jungtį su gradiento sistema, sudaryta iš tirpiklio A (0,2 proc. skruzdžių rūgšties) ir tirpiklio B (MeOH). Nuolydžio tirpiklis nustatytas į 0–5 min, 15 procentų B; 5–10 min., 15–20 procentų B; 10−15 min, 20−30 procentų B; 15–30 min., 30–40 procentų B; 30−37 min, 40−60 procentų B; 37−40 min, 60−100 procentų B; 40−45 min, 100 procentų B; 45−50min, 100−15 procentų B; ir 50–55 min., 15 procentų B. Tirpiklio frakcijų sudedamosioms dalims identifikuoti mobilioji fazė buvo tiekiama 1 ml/min srauto greičiu, o eliuavimo aptikimas buvo atliktas esant 330 nm. Norint surinkti biologiškai aktyvių ingredientų nemokias frakcijas, judrioji fazė buvo tiekiama 15,0 ml/min srauto greičiu, o eliuavimo aptikimas buvo atliktas esant 330 nm, naudojant prep-HPLC (YL-9100 s, Young Lin Instrument, Korėja). ), įrengta prep-C18 kolonėlė (4,6 mm, 212 mm, 10 μm, Agilent, JAV), kartu su gradiento sistema, sudaryta iš tirpiklio A (0,2 proc. skruzdžių rūgšties) ir tirpiklio B (MeOH). Nuolydžio tirpiklio santykis nustatytas į 0–10 min, 10 procentų B; 10–20 min., 10–15 procentų B; 20−40 min, 15 procentų B; 40−60 min, 15−20 procentų B; ir 60–70 min., 30 procentų B.

Molekulinis modeliavimas.

Molekuliniam modeliavimui skirtos grybotirozinazės kristalinė struktūra buvo agaricustyrosinase (PDB daro: 2Y9X), gauta iš baltymų duomenų banko (PDB). Fermentas buvo paruoštas naudojant proteinwizard paruošimo darbo eigą, įterptą į Maestroprogramą (Maestro, versija 11.9.011, Schrödinger, LLC, NewYork, NY, USA, 2019). Vanduo ir visos kitos PBP failuose esančios molekulės buvo pašalintos. Molekulinis prijungimas buvo atliktas naudojant indukuoto tinkamumo prijungimo (IFD) protokolą (Schrödinger Suite 2019 Induced Fit Docking protokolą), kaip buvo pranešta anksčiau.21

Vario kompleksonų sudarymo galimybė.

Iš L. thunbergianus išskirtų junginių gebėjimas sudaryti vario kompleksonus buvo nustatytas pagal ankstesnę ataskaitą.22 Kiekvienas nurodytos koncentracijos kafeoilchino rūgšties darinys (1{5}} μL) buvo sumaišytas su 280 μL 50 mM natrio acetato buferio (pH 6,0). 6 μL 4 mM pirokatecholio violetinio tirpalo, paruošto tame pačiame buferyje, ir 10 μL 1 ug/μL CuSO4·5H2O. Mėlynos spalvos išnykimas buvo stebimas matuojant absorbciją ties 632 nm, naudojant daugiamodį mikroplokštelių skaitytuvą SpectraMax M5. Vanduo buvo naudojamas kaip kontrolė vietoj mėginio. Procentinis vario kompleksono aktyvumas buvo apskaičiuotas pagal absorbciją esant 632 nm, kuri yra tokia

vario kompleksonas (procentais)=1− (Pavyzdys/valdiklis)×100 (2)

Statistinė analizė.

Visi šio tyrimo duomenys buvo išreikšti kaip vidutinis ± standartinis nuokrypis (SD) iš trijų nepriklausomų eksperimentų. Statistinė analizė buvo atlikta naudojant GraphPad Prism 8.0 (GraphPad Software Inc., La Jolla, CA, JAV). Kontrolės ir paveiktų grupių vidutinių verčių skirtumai buvo išanalizuoti naudojant vienpusę dispersijos analizę (ANOVA), o po to Dunnett post hoctest. Visų analizių statistinio reikšmingumo slenkstis buvo p < 0,05="" (dviejų="">

IŠVADOS

Šiame tyrime mes parodėme, kad L. thunbergianus ekstraktai sulaiko ABTS radikalus ir turi stiprų slopinamąjį poveikį melanino biosintezei be reikšmingo citotoksiškumo. Abioaktyvus ingredientas, esantis L. thunbergianus ir slopinantis melanogenezę, buvo išskirtas n-BuOH frakcijoje. Be to, mes nustatėme, kad trys kafeoilchino rūgšties dariniai yra pagrindiniai junginiai, esantys n-BuOH frakcijoje ir kad 5-kofeoilchino rūgštis yra svarbi sudedamoji dalis slopina melanogenezę melanomos ląstelėse, slopindamas ląstelių tirozinazės aktyvumą. Čia iš L.thunbergianus ekstrakto išskyrėme natūralų junginio inhibitorių 5-kofeoilchino rūgštį, kad išvengtume hiperpigmentacijos ir atskleistume jos slopinimo mechanizmą, kuriuo grindžiama melanogenezė. Taigi, mūsų išvados rodo, kad 5-kofeoilchino rūgštis ir n-BuOH frakcija, išskirta iš L. thunbergianus, gali būti naudingos kosmetikoje kaip odą balinančios medžiagos.

cistanche griežinėliai