Chromatino prieinamumas ir mikroRNR ekspresija nefrono progenitorinėse ląstelėse inkstų vystymosi metu

Daugiau informacijos:ali.ma@wecistanche.com

Andrew Clugston^1,2,3, Andrius Bodnaras^2,3, Débora Malta Cerqueira^2,3, Yu Leng Phua^2,5,6, Alyssa Lawler^8,9,10, Kristy Boggs⁷, Andreasas Pfenningas^8,10, Jacqueline Ho^2,3*ir Dennisas Kostka^1,4*

¹Vystymosi biologijos katedra, Pitsburgo universiteto medicinos mokykla, Pitsburgas, PA, JAV²Rangos tyrimų centras, Pitsburgo UPMC vaikų ligoninė, Pitsburgas, PA, JAV³Pediatrijos skyrius, Nefrologijos skyrius, Pitsburgo universiteto medicinos mokykla, PA, JAV⁴Kompiuterinės ir sistemų biologijos katedra ir Pitsburgo evoliucinės biologijos ir medicinos centras, Pitsburgo universiteto medicinos mokykla, Pitsburgas, PA, JAV⁵Genetinės ir genominės medicinos skyrius, Pediatrijos skyrius, UPMC vaikų ligoninė Pitsburge, Pitsburgas, PA, JAV⁶Patologijos skyrius, Klinikinės biocheminės genetikos laboratorija, UPMC vaikų ligoninė Pitsburge, Pitsburgas, PA, JAV⁷Pediatrijos departamentas, Gastroenterologijos, hepatologijos ir mitybos skyrius, Pitsburgo universiteto medicinos mokykla, Pitsburgas, PA, JAV.⁸Kompiuterinė biologija,⁹Biologijos mokslai ir¹⁰Neurologijos institutas, Carnegie Mellon universitetas, Pitsburgas, PA, JAV

Abstraktus

Žinduolių nefronai kilę iš populiacijosnefrono progenitorinės ląstelės, o šių ląstelių transkriptų pokyčiai prisideda prie nefrogenezės, svarbaus nefronų skaičių lemiančio veiksnio, nutraukimo. Norėdami apibūdinti mikroRNR (miRNR) ekspresiją ir nustatyti galimas cis-reguliacines sritis, surinkome nefrono progenitorines ląsteles iš pelės.inkstus14,5 embriono dieną ir 0 dieną po gimdymo ir ištirta maža RNR ekspresija bei transpozazei prieinamas chromatinas. Mes nustatėme 1 104 miRNR ekspresiją (114 su ekspresijos pokyčiais) ir 46 374 chromatinui prieinamų regionų (2 103 su pokyčiais neprieinamais). Visame genome mūsų duomenys išryškina tokius procesus kaip ląstelių diferenciacija, ląstelių migracija, tarpląstelinės matricos sąveika ir vystymosi signalizacijos keliai. Be to, jie nustato naujus Eya1 ir Pax8 cis reguliavimo elementus, abu genus, atliekančius nefrono progenitorinių ląstelių diferenciaciją. Galiausiai susiejame išraišką keičiančias miRNR, įskaitant let-7-5p, miR-125b-5p, miR-181a-2-3p ir miR{{ 20}}p, su kandidatais cis-reguliavimo elementais ir tiksliniais genais. Šios analizės išryškina naujus galimus cis-reguliacinius miRNR lokusus nefrono pirmtakuose.

Įvadas

Funkcinis vienetasinkstasyra nefronas, kuris filtruoja atliekas ir palaiko normalią vandens, rūgščių-šarmų ir elektrolitų homeostazę organizme. Nefronų skaičius žmonėms labai skiriasi (paprastai nuo dviejų šimtų tūkstančių iki daugiau nei vieno milijono nefronų (Hughson ir kt., 2003)) ir nustatomas prieš gimimą žmonėms (apytiksliai po gimdymo 2-3 pelėms (Hartman ir kt.). ., 2007; Hinchliffe ir kt., 1991)). Nefronai negali atsinaujinti po gimimo, o sumažėjęs nefronų kiekis yra susijęs su padidėjusia lėtinės inkstų ligos ir hipertenzijos rizika (Bertram ir kt., 2011). Savo ruožtu nefronų skaičių didžiąja dalimi lemia ląstelių populiacija, vadinamanefrono progenitorinės ląstelės(Cebrian ir kt., 2014b). Paskutiniuose etapuoseinkstasvystymuisi, nefrono pirmtakai padidina savo polinkį diferencijuotis, o tai palaipsniui išeikvoja jų populiaciją ir galiausiai nutrūksta nefrogenezė (Hartman ir kt., 2007; Rumballe ir kt., 2011; Volovelsky ir kt., 2018). Mechanizmų, reguliuojančių nefrogenezės nutraukimą, supratimas turi reikšmingų pasekmių nustatant nefrono aprūpinimą ir vėlesnės inkstų ligos riziką.

Perinkstasvystymasis, savaime atsinaujinantys Cited1 plus /Six2 plus nefrono pirmtakai yra skatinami tapti pirminiais Cited1-/Six2 plus pirmtakais ir vėliau diferencijuojami į Wnt{5}}išreiškiančias inkstų pūsleles, reaguojant į Wnt9b/ -kateniną (McMahon). ir kt., 2016; Rumballe ir kt., 2011). Ankstyvųjų ir vėlyvųjų nefrono pirmtakų vidiniai transkripcijos pokyčiai apima genus ir kelius, turinčius įtakos kamieninių ląstelių senėjimui, ypač mTor ir jo represorių hamartiną (S. Chen ir kt., 2015; Volovelsky ir kt., 2018). Iš tiesų, manoma, kad hamartinas desensibilizuoja nefrono pirmtakus savęs atsinaujinimo signalams ir tokiu būdu prisideda prie nefrogenezės nutraukimo (S. Chen ir kt., 2015). Atsižvelgiant į idėją, kad ankstyvieji nefrono pirmtakai turi didesnę polinkį savaime atsinaujinti, yra pastebėjimas, kad chromatino prieinamumas yra praturtintas pagrindinių nefrono progenitorinių ląstelių transkripcijos faktorių, įskaitant Six2 ir Wt1, surišimo vietomis, palyginti su vėlyvaisiais nefrono pirmtakais (Hilliard ir kt. , 2019). Įrodyta, kad šie transkripcijos faktoriai suriša stiprinimo sekas, esančias genomo „reguliavimo taškuose“ (O'Brien ir kt., 2018). Nefrono pirmtakų indukcija atsiranda dėl didėjančio katenino kiekio, dėl kurio suaktyvėja Lef1/Tcf7 kompleksai genuose, kurie yra pasirengę aktyvuoti nefrogenezės programą (Park ir kt., 2012), ir buvo pasiūlyta kompleksuoti su Tcf7l1 ir Tcf7l2. sukurti ir palaikyti reguliavimo chromatino kilpas, kurios palengvina genų aktyvavimą (Guo ir kt., 2021).

Spustelėkite norėdamiCistanche tubulosa milteliai, skirti inkstų ligoms gydyti

Naujausi tyrimai parodė, kad mikroRNR (miRNR) reguliuoja nefrogenezės nutraukimą. miRNR yra trumpos, nekoduojančios RNR molekulės, nukreipiančios į pasiuntinio-RNR nuorašus (mRNR), kad sumažėtų transliacija arba padidėtų skaidymas per RNR sukeltą tylėjimo kompleksą (RISC) (Bartel, 2009). Baltymas Lin28b yra žinomas miRNR šeimos represorius (Heo ir kt., 2008). Lin28b ekspresija mažėja nefrono pirmtakuose, kai vyksta nefrogenezė, ir tai sutampa su let-7 miRNR šeimos ekspresijos padidėjimu (Yermalovich ir kt., 2019). Be to, sąlyginė Lin28b ekspresijos indukcija Wt1-linijoje sukelia let-7 miRNR slopinimą, o to pakanka nefrogenezei pailginti (Yermalovich ir kt., 2019). Nežinoma, ar kitos miRNR reguliuoja nefrogenezės laiką. Be to, nors buvo nustatyti stiprikliai, reguliuojantys ilgą nekoduojančią RNR ekspresiją nefrogenezės metu (Nishikawa ir kt., 2019), nebuvo įrodyta, kad nė vienas reguliuoja miRNR ekspresiją nefrono pirmtakuose.

Šiame tyrime siekėme vienu metu nustatyti naują miRNR, kuri prisideda prie nefrogenezės nutraukimo, kartu su galimomis cis reguliavimo ypatybėmis. Todėl, norėdami stebėti miRNR ekspresijos ir chromatino prieinamumo pokyčius nuo 14.5 embriono dienos (E14.5) iki nulinės dienos po gimdymo (P0), sukūrėme suderintus mRNR seką ir ATAC seką duomenų rinkinius iš pirminių ir nepaskirstytų.nefrono progenitorinės ląstelėsšiais dviem laiko momentais. Mes nustatėme 114 miRNR, kurios yra skirtingai išreikštosnefrono progenitorinės ląstelėstarp šių dviejų laiko taškų, taip pat 2103 besikeičiančio chromatino prieinamumo regionai, kuriuos vadiname skirtingai prieinamais regionais (DAR). Prognozuojamų reikšmingai besikeičiančių miRNR genų taikinių, taip pat tarp DAR genominių vietų, praturtinimo analizė apima kelius, turinčius įtakos epitelio ląstelių diferenciacijai, ląstelių migracijai, tarpląstelinės matricos sąveikai ir pagrindiniams vystymosi signalizacijos keliams, tokiems kaip Wnt, Notch ir TGF signalizacija. . Stebime reikšmingus chromatino prieinamumo pokyčius ir pateikiame daugybę įrodymų, susijusių su dviem genominiais regionais kaip galimais Eya1 ir Pax8 genų stiprikliais nefrono progenitorinėse ląstelėse. Galiausiai nustatėme nuoseklius chromatino prieinamumo ir miRNR ekspresijos pokyčius 33 poroms miRNR ir DAR, įskaitant let-7-5p, miR-125b-5p, miR-181a{ {11}}p ir miR-9-3p, ir pateikia numanomus tikslinius genus, išreikštus nefrono pirmtakuose, skirtus skirtingai išreikštoms miRNR.

Rezultatai

Nefrono pirmtakų ląstelių populiacijų išskyrimas iš E14.5 ir P0inkstus

Nefrono progenitorinės ląstelėsbuvo išskirti teigiamos atrankos būdu Itg 8 ties E14.5 arba P 0, ir kiekvienas mėginys buvo padalintas, kad būtų atlikta mRNR seka, ATAC seka ir kokybės kontrolė (papildomas 1 pav. AB). Kiekybinė PGR (qRT-PCR) patvirtino, kad nefrono pirmtakų žymenų genai Six2 ir Cited1 (Huang ir kt., 2016) yra labai išreikšti izoliuotuose nefrono pirmtakų mėginiuose, palyginti su visuma.inkstas, labiau nei kitų tipų ląstelių žymenys (įskaitant šlapimtakio pumpurus (Caleb) (Cebrian ir kt., 2{{10}}14a), endotelio ląsteles (Pecan) (Kobayashi ir kt., 2008), inkstų stroma (Pdgfr ) (S. Chen ir kt., 2015) ir inkstų pūslelė (Lhx1) (Brunskill ir kt., 2014) (1 C papildomas paveikslas). Kalbant apie lytį, E14.5 mėginiams naudotas kraikas svyravo nuo 27–50 procentų patelių, o vados P0 mėginiams svyravo nuo 31 iki 75 procentų patelių. Vidutiniškai E14.5 mėginių buvo 38 procentai patelių, o P0 mėginių – 49 procentai patelių (papildomas paveikslas 1 D). Šios atsargiai sensta. - suderintos nefrono progenitorinių ląstelių populiacijos leido mums analizuotichromatino prieinamumasir maža RNR ekspresija tose pačiose vystymosi stadijose dviem laiko taškais (E14.5 ir P0).

Ankstyvieji ir vėlyvieji nefrono pirmtakai turi skirtingus miRNR transkripcijos profilius

Mažos RNR sekos nustatymas aptiko 1,104 žinomus miRNR nuorašus ir nustatė 114 miRNR, kurios rodo reikšmingą ekspresijos pokytį tarp E14.5 ir P{{10}} mėginių (klaidingų atradimų dažnis () FDR)=0.05; 1 papildoma lentelė). Pusė skirtingai išreikštų miRNR rodo padidintą ekspresiją ties P0, palyginti su E14.5, o pagrindinių komponentų analizė atskleidžia didesnį miRNR ekspresijos homogeniškumą tarp E14.5 mėginių, palyginti su P0 (1A pav.). Hierarchinis klasterizavimas atskleidžia aiškų miRNR grupavimą į didėjančios ir mažėjančios ekspresijos atitinkamai tarp E14.5 ir P0 (1B pav.). Let-7miRNR šeimos nariai yra tarp labiausiai aptiktų miRNR, todėl pastebime, kad visi šeimos nariai, turintys reikšmingų pokyčių, padidina ekspresiją ties P0 (duomenys nerodomi). Tai atitinka rezultatus, rodančius, kad dėl Lin28b ekspresijos sumažėjimo nefrogenezės eigoje labai padidėja let-7 šeimos raiška (Yermalovich ir kt., 2019). Kitos miRNR, kurių ekspresija P0 yra žymiai didesnė, yra miR-429-3p, miR-200 šeimos narys, kuris, kaip žinoma, turi įtakos podocitų diferenciacijai (Z. Li ir kt., 2016), ir abi miR{30 }}a-5p ir miR-125b-5p. Yra žinoma, kad pastarieji du iš jų slopina Lin28 nuorašus skirtingose ​​​​ląstelinėse aplinkose (Chaudhuri ir kt., 2012; Potenza ir kt., 2017). MiRNR, kurios ekspresija P0 yra žymiai mažesnė, apima angiogenezę (S. Wang ir kt., 2008) ir proliferaciją skatinantį (Schober ir kt., 2014) miR-126.

DIANA miRPath įrankis leidžia analizuoti miRNR KEGG kelią pagal atitinkamus genų taikinius, kaip numato mikro T-CDS (Vlachos ir kt., 2015). Mes nustatėme, kad miRNR, kurios ekspresijos pokyčiai yra didžiausi tarp E14.5 ir P0 (aukštyn arba žemyn), yra tie, kurie reguliuoja kelius, atliekančius pagrindinį vaidmenį nefrogenezėje (1C pav., 2 papildomas paveikslas). Pavyzdžiui, Tgf- išskiria aplinkinės stromos ląstelės, kad paskatintų nefrono pirmtakų diferenciaciją (Rowan ir kt., 2{{50}}18), ir pastebime sumažėjusią nefrono pirmtakų miRNR ekspresiją, nukreiptą į pasroviui esančius efektorius. „TGF signalizacijos kelias“ (KEGG kelias mmu04350, p reikšmė 1,45e- 6). „MAPK signalizacijos kelias“ (mmu04010) įtakoja nefrono pirmtakų organizavimą ir pradėjimą diferencijuoti, taip pat reguliuoja jų sąveiką su ekstraląsteline matrica (ECM) per Itg 8 (Ihermann-Hella ir kt., 2018). Pastebime daug aukštyn ir žemyn reguliuojamų miRNR, nukreiptų į skirtingus šio MAPK signalizacijos kelio genus (p vertės atitinkamai 3,5e- 6 ir 3,0e- 4 aukštyn ir žemyn). . Galiausiai, KEGG kelias „Ekstraląstelinės matricos (ECM) receptorių sąveika“ (mmu04512) yra labiausiai praturtintas kelias, o jį sudarantys genai yra daug labiau nukreipti miRNR, kurios ekspresija laikui bėgant didėja (p vertė 7,4e{ {32}} tarp didėjančios miRNR, palyginti su 1,1e-2 tarp mažėjančių). Su ECM susiję genai yra nukreipti į kai kurias labiausiai išreikštas ir žymiai didėjančias miRNR, kurias aptinkame, įskaitant miR-196a-5p, miR-148a-3p, miR -125a-5p ir leiskite-7f-5p. Konkrečiai, miR-196a-5p yra didžiausias išreikštas miRNR mūsų mėginiuose, o tarp E14.5 ir P0 pastebimas 8-karto padidėjimas. Genų nuorašai, kurie buvo numatomi miRNR taikiniai (naudojant TargetScan (Agarwal ir kt., 2015)) su padidinta ekspresija P0, apima Bach2, siūlomą molekulinį ryšį tarp MAPK/AP1 ir Six2/-catenin kelių, skirtų savaiminiam atsinaujinimui ir diferenciacijai. atitinkamai nefrono pirmtakuose (Hilliard ir kt., 2019).

Norėdami nustatyti numanomus skirtingai išreikštų miRNR taikinius nefronų pirmtakuose, naudojome miRNR skaičiavimo anotaciją, pateiktą miRDB (Y. Chen & Wang, 2020), ir anotuotas eksperimentines miRNR ir mRNR sąveikas iš skiedinio bazės (HY). Huang ir kt., 2020), kartu su mūsų anksčiau sukurtu E14.5 vienos ląstelės RNR sekos duomenų rinkiniu (Bais ir kt., 2020). Taigi, mes sukūrėme galimų miRNR ir mRNR sąveikų sąrašą, pagrįstą skirtinga miR ekspresija tarp E14.5 ir P0 nefrono pirmtakuose su atitinkamu tikslinio geno ekspresijos pokyčiu tarp savaime atsinaujinančių ir paruoštų nefrono pirmtakų, taip pat pradėtų ir diferencijuojantys nefrono pirmtakus (2 pav.). Mūsų analizė rodo, kad Meis2 ir Hmga2 yra galimi let-7 miRNR šeimos taikiniai nefronų pirmtakuose (2 pav.), o sumažėjusi Meis2 ir Hmga2 ekspresija susijusi su padidėjusia let-7 šeimos narių ekspresija. diferencijuojant arba senstant nefrono pirmtakuose. Transkripcijos faktorius Meis2 yra stipriai išreikštas nefrono pirmtakuose ir inkstų stromoje.inkstasvystymasis (Lam ir kt., 2014) ir yra susijęs su ląstelių proliferacijos reguliavimu kituose kontekstuose (Abruzzese ir kt., 2019). Hmga2 yra nehistono chromatiną surišantis baltymas, jis labai ekspresuojamas kamieninėse ląstelėse ir buvo siejamas su įvairiais mezenchiminiais navikais (Fusco ir Fedele, 2007; Lam ir kt., 2014). Panašiai didėja Jag1 išraiška, susijusi su mažėjančia miR-34b-5p, miR-983p ir miR-200a-3p išraiška diferencijuojant arba senstantys nefrono pirmtakai (2 pav.). Jag1 yra pagrindinis Notch signalizacijos ligandas, kurio ekspresija didėja, kai diferencijuojasi nefrono pirmtakai (Chung ir kt., 2016). Visi numatyti arba anotuoti miRNR taikiniai genams, kurių ekspresijos pokyčiai tarp savaime atsinaujinančių, paruoštų ir diferencijuojančių nefrono pirmtakų, yra pateikiami papildyme.

1 paveikslas. Esminiai miRNR ekspresijos pokyčiai tarp E14.5 ir P0 nefrono pirmtakų. A) Pagrindinių komponentų analizė rodo, kad vystymosi momentas yra pagrindinis miRNR ekspresijos kitimo veiksnys. B) Šilumos žemėlapis, vaizduojantis santykinę visos reikšmingai besikeičiančios miRNR ekspresiją. Stulpeliai, kuriuose yra E14.5 mėginių kairėje, pažymėti šviesiai žalia spalva, o stulpeliai su P0 pavyzdžiais dešinėje – tamsiai žalia spalva. C) Genų praturtinimas iš specifinių KEGG kelių tarp numatytų aukštyn ir žemyn reguliuojamų miRNR genų taikinių (atitinkamai raudonos ir mėlynos juostos). Minimali įtraukta p reikšmė yra 1e-5.

2 pav. miRNR ir mRNR sąveika su galimu vaidmeniu nefrono pirmtakinių ląstelių senėjimui ir diferenciacijai. Rodomos miRNR (apskritimai) ir mRNR (kvadratai). miRNR su padidinta ekspresija tarp E14.5 ir P0 rodomos raudonai, miRNR, kurių sumažėjimas rodomas mėlynai. Anotuoti tiksliniai genai (iš mirDB ir mir TarBase) su didėjančia išraiška tarp savaime atsinaujinančių, paruoštų ar diferencijuojančiųnefrono progenitorinės ląstelės(Bais ir kt., 2020) rodomi raudonai, mRNR su mažėjančia ekspresija mėlyna spalva. MirDB ir mirTarDB kraštai, kurie neatitinka pastebėtų išraiškos pokyčių, buvo praleisti, tačiau yra įtraukti į 2 papildomą lentelę.

Ankstyvieji ir vėlyvieji nefrono pirmtakai turi skirtingą chromatino aplinką

ATAC-seq duomenys iš E14.5 ir P0 nefrono pirmtakų leido mums nustatyti 46 374 prieinamo chromatino regionus (su nesumažinamu aptikimo dažniu (Boleu ir kt., 2015) slenksčiu {{ 22}}.1, žr. (papildomas 3 C paveikslas, 3 papildoma lentelė), sujungti pagal pavyzdžius ir laiko taškus. Atkreipiame dėmesį, kad mūsų duomenys atitinka ENCODE projekto ATAC-seq gaires (ENCODE, nd) (papildomas paveikslas 3 A, B) ir kad stebime padidėjusį išsaugojimo laipsnį tarp IDR smailių nei atsitiktinių imčių kontrolė (papildomas 3 D paveikslas). Iš mūsų pateiktų IDR 3576 yra stiprikliai, užfiksuoti VISTA (Visel ir kt., 2007) ir (arba) FANTOM5 (de Rie ir kt., 2017) stiprintuvų duomenų bazėse ir 13 495 yra DNR sekos, turinčios numatytus reguliavimo vaidmenis bent viename pelės audinyje arba ląstelių tipe pagal EnhancerAtlas 2.0 (Gao ir Qian, 2020).

Pagrindinių komponentų analizė (pataisyta atsižvelgiant į lyčių skirtumus tarp mėginių) atskleidė aiškų mėginių grupavimą pagal vystymosi laiką (3A pav.). Norėdami nustatyti genomo lokusus su chromatino prieinamumo pokyčiais, palyginome ATAC-seq signalą tarp E14.5 ir P0 mėginių. Stebėjome 2,103 DAR, valdydami FDR 10 proc. Iš jų 1 323 (55 proc.) buvo pasiekiamas didesnis P0, palyginti su E14.5, o hierarchinis grupavimas atskleidė aiškų skirtumą tarp DAR, kurie atidaromi ir uždaromi atitinkamai tarp E14.5 ir P0 (3B pav.).

Transkripcijos faktoriaus pėdsakai buvo nustatyti naudojant HINT ir suderinti su DNR surišančiais baltymais, naudojant motyvus iš HOCOMOCO 11 duomenų bazės (Kulakovskiy ir kt., 2018). Tarp 431 išbandyto motyvo DAR, kuriuose yra kelių su nefrogeneze susijusių transkripcijos faktoriaus baltymų pėdsakų, rodo didesnį prieinamumą tarp E14.5 ir P0. Tarp DAR esančių pėdsakų, kurių pasiekiamumas padidėja vidutiniškai, šeši geriausi priklauso transkripcijos faktoriaus pėdsakams, atitinkantiems Pax8 ({{10}.15), Six2 (0.14), Cebpd. (0.13), Six4 (0.13), Jun (0.12) ir Fos (0.11). Pėdsakai, anotuoti baigiamuosiuose DAR, apima transkripcijos faktorius E2F2 ir E2F4, kurie, kaip žinoma, daro įtaką ląstelių ciklo progresavimui (Gaudet ir kt., 2011) ir skatina ląstelių proliferaciją (D. Wang ir kt., 2000) kituose ląstelių kontekstuose (papildomas paveikslas). 4).

Norėdami įvertinti biologinį DAR atidarymo ir uždarymo kontekstą, naudojome Genominių regionų anotacijų praturtinimo įrankį (GREAT) (McLean ir kt., 2010), kad paryškintume genų rinkinius, praturtindami susijusius besikeičiančius chromatino regionus. Taikydami šį metodą nustatome genų ontologijos (GO) biologinius procesus, glaudžiai susijusius su nefrono pirmtakų vystymusi: visų pirma labiausiai praturtintas procesas tarp atidaromų DAR yra „Epitelio ląstelių diferenciacijos reguliavimas“ (GO:0030856, binominė Q vertė {{3). }}.5e-5), o „Teigiamas epitelio ląstelių diferenciacijos reguliavimas“ (GO:0030858, binominė Q vertė=5e-3) yra tarp 10 labiausiai praturtintų ( 5 papildomas paveikslas). Abu jie atitinka padidėjusį nefrono pirmtakų polinkį pereiti prie mezenchiminio į epitelį (MET), kai jie diferencijuojasi (S. Chen ir kt., 2015). Kiti žymiai praturtinti būdai apima „Teigiamas Notch signalizacijos kelio reguliavimas“ (GO:0045747, binominė Q vertė=2e-5), kuris atitinka Notch signalizacijos vaidmenį skatinant nefrono pirmtakų diferenciaciją ( Chung ir kt., 2016). Aptikti 10 083 uždarymo DAR neatskleidė reikšmingų GO terminų, pagrįstų numatytais GREAT reikšmingumo kriterijais (žr. 5 papildomą paveikslą).

3 pav. Chromatino prieinamumo skirtumai apibūdina E14.5 ir P0nefrono progenitorinės ląstelės.A) ATAC-seq mėginių pagrindinių komponentų analizė išryškina vystymosi laiko taškus kaip pagrindinį svyravimų šaltinį. B) Šilumos žemėlapis, rodantis reikšmingai besikeičiančius IDR regionus ATAC-seq mėginiuose. E14.5 pavyzdžiai / stulpeliai anotuoti šviesiai žalia spalva, o P0 mėginiai / stulpeliai anotuoti tamsiai žalia spalva. C) GO biologinio proceso terminai, praturtinti genominiams regionams, kurie atsidaro tarp E14.5 ir P0 pagal GREAT, suskirstyti pagal dvinario P reikšmę, FDR Mažiau arba lygi 0.001.

Toliau mes tyrinėjomechromatino prieinamumasgenomo regionuose, kuriuose yra genų, turinčių paskelbtų vaidmenų nefrono progenitorinių ląstelių diferenciacijoje, promotoriai ir stiprikliai. Tarp jų Six2 transkripcijos faktorius yra labai svarbus norint išlaikyti daugialypį potencialąnefrono progenitorinės ląstelės(Self ir kt., 2006), o visuose mėginiuose stebėjome prieinamą chromatiną, supantį jo promotorių ir žinomą Six2 stipriklį ~ 50 kb prieš Six2 transkripcijos pradžios vietą (TSS) (O'Brien ir kt., 2018) (Pav. 4A, B, mėlynos spalvos sritys). Taip pat atkreipiame dėmesį į prieinamo chromatino sritis ant promotoriaus ir paskelbtą Gdnf baltymo stipriklį (4D pav., E), kurį išskiria nefrono pirmtakai, skatinantys šlapimtakių pumpurų šakojimąsi (Sanchez ir kt., 1996; Vega ir kt., 1996). ). Šis stipriklis yra ~ 113 kb prieš geno promotorių ir žinoma, kad jis reaguoja į Wnt signalizaciją, kai vystosi nefrono pirmtakai (Park ir kt., 2012). Nors Gdnf promotorius laikui bėgant reikšmingai nesikeičia, anotuotas stipriklis žymiai padidina neprieinamumą. Taip pat atkreipiame dėmesį į prieinamo chromatino regionus, supančius paskelbtą Eya1 nefrono pirmtakuose aktyvų stipriklį, esantį ~ 325 kb prieš geno TSS (Park ir kt., 2012) (6 papildomas paveikslas). Eya1 yra transkripcijos faktorius, kuris sąveikauja su Six2, kad išlaikytų nefrono pirmtakų daugiafunkciškumą (J. Xu ir kt., 2014).

Stebime keletą DAR, kurie nepersidengia su žinomomis reguliavimo ypatybėmis, bet apima regionus, kuriuose, kaip prognozuojama, yra stiprinamasis aktyvumas tam tikriems genams įvairiose pelių ląstelių tipuose, kaip nurodyta EnhancerAtlas 2.0 (Gao ir Qian, 2020). Be paskelbto Eya1 stipriklio (Park ir kt., 2012) (papildomas 6 paveikslas), uždarymo DAR viename iš Eya1 intronų (5A-B pav.) apima regioną, kuris, kaip prognozuojama, turi Eya1 geno stiprintuvo aktyvumą pelėje. nervų pirmtakų ir granulocitų-monocitų progenitorinės ląstelės (Gao ir Qian, 2020). Sumažėjus stipriklio aktyvumui, anksčiau pastebėjome, kad Eya1 ekspresija sumažėja diferencijuojant nefrono pirmtakus, naudojant E14.5 scRNA-seq duomenis (7 papildomas paveikslas) (Bais ir kt., 2020). Tai atitinka paskelbtus ChIP-seq duomenis pirminiuose E16.5 nefrono pirmtakuose, kurie rodo aktyvaus stipriklio ženklo H3K27ac trūkumą ir Ctnnb1, Lef1, Six2 ir Tcf7 surišimo trūkumą (5 pav.) (Guo ir kt. ., 2021). Šiame potencialiame stiprintuve taip pat yra Hoxd10 transkripcijos faktoriaus pėdsakai, esantys jo smailėje, transkripcijos faktorius, kuris yra būtinas nefrono pirmtakų diferenciacijai ir integravimui mezenchiminio-epitelinio perėjimo (MET) metu (Yallowitz ir kt., 2011).

DAR, padidinantis 24 chromosomos neprieinamumą, sutampa su chromatino regionu ir numatomu transkripcijos faktoriaus Pax8 stipriklio aktyvumu ląstelėse, kultivuotose iš pelių inkstų, žarnyno epitelio ir gimdos (Gao ir Qian, 2020). Pax8 yra iš dalies perteklinis su Pax2, tačiau bent vienas iš šių dviejų transkripcijos faktorių reikalingas nefrono pirmtakuoseinkstasplėtra (Bouchard ir kt., 2002; Narlis ir kt., 2007). Anksčiau pastebėjome, kad Pax8 ekspresija didėja diferencijuotuose ir diferencijuotuose nefrono pirmtakuose (7 papildomas paveikslas), ir pastebime reikšmingą DAR prieinamumo padidėjimą, apimantį šią reguliavimo funkciją. Paskelbtuose ChIP-seq duomenyse iš pirminių E16.5 nefrono progenitorių (5 pav.) šis regionas taip pat yra susijęs su aktyviu stipriklio ženklu H3K27ac ir Ctnnb1, Lef1, Six2 ir Tcf7 surišimu (5 pav.) (Guo ir kt., 2021). Stebime daugybę transkripcijos faktorių pėdsakų, kurie patenka į šio DAR labai konservuotą prieinamumo smailę, įskaitant du Sall1, branduolinį faktorių, kuris, kaip žinoma, turi įtakos nefrogenezei (Kanda ir kt., 2014), ir septynis glaudžiai sugrupuotus su MYC susijusio cinko piršto pėdsakus. baltymas (Maz), transkripcijos faktorius, kuris, kaip įrodyta, turi nuo dozės priklausomą poveikįinkstasžmonių ir pelių vystymasis (Haller ir kt., 2018). 3 papildomoje lentelėje pateikiamas visas pasiekiamų regionų sąrašas, taip pat jų atitinkama diferencinio prieinamumo statistika, genų, egzonų ir promotorių, kurie sutampa, anotacijos ir pagrindinių nustatytų su nefrogeneze susijusių transkripcijos faktorių pėdsakų sąrašai.

4 pav. ATAC-seq profiliai žinomuose ir numanomuose reguliavimo lokusuose. Kiekvienoje plokštėje nuo viršaus iki apačios briaunelės rodo raukšlių sodrinimąchromatino prieinamumasE14.5 ir P0 pavyzdžiuose, o IDR ir DAR identifikuoti kaip paryškinti mėlyna (nekanti IDR) ir žalia (atidaranti DAR). ir raudona (uždarantis DAR). Toliau pateiktame aspekte pavaizduotos genų anotacijos, nukleozomų padėtis (pilka) ir sritys be nukleozomų (raudona), išmatuotos jungtiniuose E14.5 ir P0 mėginiuose, ir PhastCon60 išsaugojimo balai (juoda spalva reiškia 1{{ 12}}0 procentų išsaugojimo, balta 0 procentų konservuota A) Six2 transkripcijos faktoriaus promotorius ir geno kūnas. B) Enhancer for Six2, išleistas Park et. al. C) Skirtingai prieinamas Gdnf stiprintuvas su padidintu prieinamumu P0. D) Gdnf reklamuotojas.

5 pav. DAR, persidengiantys su galimais naujais su nefrogeneze susietų genų stiprintuvais. A ir C) Skydelėse pavaizduotas 1 MB srities, supančios dominantį geną, žemėlapis su baltymus koduojančiais genais žalia spalva ir siūloma stipriklio/promotoriaus sąveika kaip juoda kilpa. . B ir D) Iš viršaus į apačią plokštėse pavaizduotas raukšlių sodrinimaschromatino prieinamumasišmatuoti E14.5 ir P0 mėginiuose, o IDR paryškinti žaliai (atidarymas) ir raudonai (uždarymas), po to atlikti ChIP-seq matavimai šiuose regionuose, išmatuotuose Guo et. al. pirminiame nefrono pirmtakuoseląstelės(Guo ir kt., 2021). Trečioje skydelyje pavaizduotos genų anotacijos (mėlyna) ir numatomi reguliavimo elementai iš Enhancer Atlas 2.0 (raudona), o ketvirtasis skydelis žymi transkripcijos faktoriaus pėdsakus, nustatytus ATAC-seq duomenyse. Penktoje plokštėje pavaizduotos nukleosomos (pilka) ir NFR (raudona), o apatinė plokštė rodo išsaugojimą. A) 1 MB sritis, kurioje yra Eya1 geno korpusas ir galimas Eya1 stipriklis maždaug 325 kb prieš srovę. B) 4,5 kb sritis, kurioje yra potencialus Eya1 stipriklis. C) 1 MB sritis, kurioje yra Pax8 geno lokusas ir numatomas stipriklis. D) 4,5 kb sritis, kurioje yra numatomas stipriklis ir jo persidengiantis DAR.

Topologiškai susieti domenai padeda nustatyti galimus stipriklio – miRNR ryšius

Topologiškai susieti domenai (TAD) yra aukštesnio laipsnio chromatino organizavimo megabazės masto regionai, atsirandantys dėl chromatino pakavimo į branduolį trimatėje erdvėje (Dixon ir kt., 2012), o stipriklio ir promotoriaus sąveika paprastai apsiriboja elementai tame pačiame TAD (Symmons ir kt., 2014). Mes apytiksliai įvertinome TAD iš nefrono pirmtakų, naudodami anotacijas, sukurtas iš pelių embrioninių kamieninių ląstelių (ESC) (Y. Wang ir kt., 2018). Norėdami patikrinti galimas miRNR cis-reguliacines sritis, koreliavome pokyčiuschromatino prieinamumassu skirtingai išreikšta miRNR tame pačiame TAD. Iš viso 42 778 unikalūs pasiekiami regionai (apie 92 proc. ) yra anotuotų TAD viduje ir iš šių 30 626 (apie 72 proc.) nesutampa su žinomu reklamuotoju. Tai apima 2 103 DAR, atitinkamai 1 180 ir 923 atidaromi ir uždaromi laikui bėgant. Penkiolika atidaromų DAR dalijasi TAD su viena ar daugiau miRNR, kurių ekspresija yra didesnė tarp E14.5 ir P0, o devyni uždarantys DAR turi TAD su viena ar daugiau miRNR, kurių ekspresija yra sumažėjusi. 6 paveiksle apibendrinamas šis metodas ir pavaizduoti atstumai tarp DAR ir jų suderintos miRNR, kurie svyruoja nuo 27 kb iki daugiau nei 1 mb (vidurkis: 447 kb). 1 lentelėje pateikiami galimų DAR ir miRNR ryšių rinkiniai, kuriuose nurodytas vienas DAR kiekvienam suderintam miRNR.

Tarp anotuotų miRNR stiprintuvų porų pastebime tris ypač įdomius dalykus. Pirma, buvo nustatytas atidarymo DAR 120 kb pasroviui nuo let-7c-5p ir 73 kb pasroviui nuo miR-125b-5p, kuris yra susijęs su Six2 surišimo vieta anksčiau paskelbtame E16.5 nefrono progenitoriaus ChIP-seq duomenų rinkinyje (7A pav.) (Guo ir kt., 2021). Let-7c-5p yra viena didžiausių mūsų aptinkamų let-7 miRNR, o let-7 šeima taip pat slopina Lin28b nuorašus (Slack & Ruvkun, 1997; Zhu ir kt., 2011). Atkreipiame dėmesį, kad Hmga2 ir Meis2 taip pat identifikuojami kaip galimi nauji let-7 šeimos taikiniai nefronų pirmtakuose (2 pav.). Taip pat buvo įrodyta, kad miR-125b-5p slopina Lin28 transkriptus pelių kraujodaros ir progenitorinių ląstelių tipuose (Chaudhuri ir kt., 2012). Antra, miR-9-3p yra atvirkštinis papildymas miR-9-5p, miRNR, kuri neseniai buvo įrodyta, kad apsaugo nuoinkstasfibrozę, nukreipiant metabolizmo kelius (Fierro-Fernández ir kt., 2020). Aptikome daugiau nei 10-kartą miR-9-3ptranskriptų sumažėjimą tarp E14.5 ir P0 nefrono pirmtakų ir nustatėme galimą reguliavimo elementą, esantį maždaug už 249 kb (7B pav.). Susijusiame DAR stebime Snai1 ir Snai2 transkripcijos faktoriaus pėdsakus, kurie, kaip įrodyta, skatina epitelio-mezenchiminius perėjimus (EMT) (Sundararajan ir kt., 2019). Galiausiai suderinome miR-181a-2-3p su galimu tarpgeniniu cis-reguliaciniu lokusu 131 kb prieš srovę 2 chromosomoje, kur atkreipiame dėmesį į transkripcijos faktoriaus Wt1, pagrindinio nefrono pirmtakų reguliatoriaus, pėdsaką. išgyvenimas (Kreidberg ir kt., 1993) ir Six2 surišimas paskelbtame E16.5 nefrono pirmtakų ChIP-seq duomenų rinkinyje (7C pav.)) (Guo ir kt., 2021).

1 lentelė. miRNR ekspresijos pokyčiai, suderinti su vienu ar daugiau DAR tame pačiame TAD.

6 paveikslas. Kandidato stipriklio – tikslinės-miRNR porų radimas. A) Struktūrinė diagrama, nurodanti, kaip pasiekiamumo regionams buvo suteikta pirmenybė galimam miRNR ekspresijos reguliavimui. B) Kiekvienos patikrintos miRNR genominės vietos, palyginti su jų kandidato stiprikliu (oranžinė vertikali juostelė). Jų log2 kartos pokyčio skalė parodyta y ašyje, o miRNR su didėjančia arba mažėjančia ekspresija yra paryškinta atitinkamai žalia ir raudona spalva.

7 pav. Keturios potencialaus stipriklio – tikslinės miRNR poros. TAD yra paryškinti pilkai, sulygiuoti pagal pradinius taškus ir nupiešti ta pačia skale, kad būtų parodytas santykinis dydis. Žinomi Ensembl genai rodomi purpurine spalva, o tamsesni regionai rodo egzonus. Santykinis pasiekiamumas ties E14.5 ir P0 rodomas kaip stulpelių diagramos atitinkamai virš ir žemiau horizontalios juodos linijos, taip pat įterptose diagramose, iliustruojančiose krūvą nurodytame DAR kartu su ChIP-seq duomenimis, paskelbtais Guo et. . al. (Guo ir kt., 2021). HINT identifikuoti transkripcijos faktoriaus pėdsakai yra išvardyti oranžinėse reklamjuostėse. Stulpelių diagramos atskirose plokštėse dešinėje rodo miRNR ekspresiją (žalia) ir normalizuotus Tn5 įterpimo įvykius siūlomuose stipriklio regionuose (oranžinė). A) Let-7 šeimos narys let-7c-5p yra labai išreikštasnefrono progenitorinės ląstelėsir atitinka "peak{0}}" 119 kb atstumu tarpgeniniame regione. B) miR-9-3p atitinka DAR už 249 kb. C) miR-181a 2-3p yra 131 kb atstumu nuo „piko_5887“, galimo tarpgeninio stipriklio.

Diskusija

Šiame tyrime siekėme vienu metu nustatyti naują miRNR, kuri prisideda prie nefrogenezės nutraukimo, kartu su galimomis cis reguliavimo ypatybėmis. Mes nustatėme 114 miRNR, kurios skirtingai ekspresuojamos nefrono progenitorinėse ląstelėse, taip pat 2,103 DAR, E14.5 lyginant su P0.inkstus. Stebime keletą savybių, kurios numato naujus numanomus genų Eya1 ir Pax8 stiprikliusnefrono progenitorinės ląstelės. Galiausiai nustatėme nuoseklųchromatino prieinamumasir miRNR ekspresijos pokyčiai 33 poroms miRNR ir DAR, įskaitant let-7-5p, miR-125b-5p, miR-181a-2-3p ir miR-9-3p ir pateikia numanomus tikslinius genus, išreikštus nefrono pirmtakuose, skirtus skirtingai išreikštoms miRNR. Kartu mūsų duomenys rodo, kad pokyčiai, būdingi nefrono progenitoriams ir priklausantys nuo nefrogenezės stadijos, atsispindi progenitorinės ląstelės chromatino aplinkoje ir jos miRNR transkripte.

Tarp pokyčių, kuriuos stebime nefrono pirmtakų miRNR transkripte, pastebime didelį ekspresijos padidėjimą let{{0}} šeimoje, senstant pirmtakams. Tai atitinka ankstesnes ataskaitas: Lin28b baltymas ir let-7 miRNR šeima yra vienas kitam antagonistiški ir sudaro stabilų jungiklį, kuris valdo let-7 ekspresiją žinduoliuose (Zhu ir kt., 2011). nefrono pirmtakai, perėjimas prie padidėjusios let-7 ekspresijos tiesiogiai veikia nefrogenezės nutraukimo laiką (Yermalovich ir kt., 2019). Taip pat stebime padidėjusią miR-125b-5p ekspresiją, kuri, kaip žinoma, slopina Lin28b raišką kituose ląstelių kontekstuose (Chaudhuri ir kt., 2012; Potenza ir kt., 2017). Let-7 šeima ir miR-125b-5p yra tarp 114 miRNR, kurios nefrono pirmtakuose yra skirtingai ekspresuojamos tarp E14.5 ir P0, o tai rodo miRNR vaidmenį nefrono pirmtakų vystymuisi. neapsiriboja let-7/Lin28b. Pavyzdžiui, miRNR, kurių ekspresija sumažėja, yra du miR-200 šeimos nariai, kurie, kaip pranešta, vaidina podocitų diferenciaciją (Z. Li ir kt., 2016): miR-200b -3p ir miR-429-3p. Toliau stebime miR-126a 5p raiškos sumažėjimą, kuris, kaip žinoma, skatina vaskulogenezę (Schober ir kt., 2014; S. Wang ir kt., 2008). Tai gali atspindėti bendrą vaskulogeninių ir nefrono pirmtakų mezenchiminę liniją ir šių ląstelių pogrupio įsipareigojimą tapti nefrono pirmtakais.

Numatytų miRNR kintančių genų taikinių kelių analizė naudojant DIANA miRPath (Vlachos ir kt., 2015) rodo, kad MAPK ir TGF-signalizacijos praturtėja – abu pagrindiniai nefrono pirmtakų reguliatoriai (Hilliard ir kt., 2019; Ihermann-Hella ir kt., 2018). ). Kai kurie kiti KEGG keliai taip pat yra per daug atstovaujami tarp numatytų aukštyn reguliuojamų miRNR genų taikinių, įskaitant kelius, susijusius su ekstraląsteline matrica, aktino citoskeletu ir židinio adhezija: visi pagrindiniai ląstelių migracijos, diferenciacijos, šakojimosi, prisitvirtinimo, poliarizacijos ir proliferacijos aspektai. (Rozario ir Desimone, 2010). Su ECM susiję genai yra nukreipti į kai kurias labiausiai išreikštas ir žymiai didėjančias miRNR, kurias aptinkame, įskaitant didžiausią aptiktą transkriptą: miR-196a-5p. Yra žinoma, kad miR-196a-5p taikosi į Col1a1, Col1a2 ir Col3a1 – genus, kurie yra labiau reguliuojami Pax2-nefrono pirmtakuose, kurie transdiferenciuojasi į inkstų stromą (Naiman ir kt. al., 2017). Taigi, padidėjusi miR-196a-5papildoma raiška gali turėti įtakos giminės riboms stiprinant senstant pirmtakams. Be to, nustatome naujas galimas miRNR ir mRNR taikinių sąveikas, kurios gali prisidėti prie nefrogenezės nutraukimo, įskaitant let-7 šeimos, kuri gali būti nukreipta į Hmga2 ir Meis2 (susijusius su ląstelių proliferacija), reguliavimą (Abruzzese ir kt. ., 2019; Fusco ir Fedele, 2007; Lam ir kt., 2014; Mugford ir kt., 2009), nes nefrono pirmtakai sensta. Hmga2 neturi žinomo vaidmensinkstasplėtra. Tačiau manoma, kad Meis2 funkcinis sutapimas su susijusiu transkripcijos faktoriumi Meis1, kuris, kaip žinoma, reikalingas inkstų vystymuisi (Hisa ir kt., 2004). Taip pat stebime mažesnį miR (miR-34b-5p, miR-983p ir miR-200a-3p), kurie gali būti taikomi Jag1, kuris, kaip žinoma, yra reguliuojamas ir svarbus nefronų diferenciacijai (Chung ir kt., 2016).

Kartu su kintančia miRNR transkriptu, mes tuo pačiu metu matavome pokyčius nefrono pirmtakinės ląstelės chromatino aplinkoje tarp E14.5 ir P 0. Mes aprašome du tariamus naujus Eya1 ir Pax8 stipriklius, remiantis (i) jų artumu šiems genų promotoriams, (ii) atitinkamais jų pokyčiaischromatino prieinamumasvystymosi metu derinant su pseudotime genų ekspresijos pokyčiais diferenciacijos metu, (iii) pėdsakaiinkstasvystymosi transkripcijos faktoriai, (iv) sekos išsaugojimas, (v) stiprintuvo funkcijos įrodymai kituose audiniuose / ląstelių tipuose iš Enhancer Atlas2.0 (Gao ir Qian, 2020) ir (vi) ChIP-seq duomenys E16. .5 nefrono pirmtakai, skirti aktyvių stiprintuvų (H3K27ac) ženklui ir Ctnnb1, Lef1, Six2 ir Tcf7 transkripcijos faktoriaus surišimui. Stebime Eya1 stiprintuvo chromatino prieinamumo sumažėjimą, o tai atitinka Eya1 vaidmenį skatinant nefrono pirmtakų daugiafunkciškumą ir pranešimus, kad Eya1 praradimas sukelia ankstyvą pirmtakų populiacijos epitelizaciją (J. Xu ir kt., 2014; PX Xu ir kt., 1999). Pax8 ir jo homologas Pax2 prisideda prie nefrono pirmtakų linijos specifikacijos (Bouchard ir kt., 2002), o nefrono progenitoriams, neturintiems bent vieno iš šių genų, MET nebus taikomas (Narlis ir kt., 2007). Padidėjęs chromatino prieinamumas, kurį aptinkame tariamam Pax8 stiprikliui, atitinka padidėjusią Pax8 ekspresiją inkstų epitelyje, nes diferencijuojasi nefronai.

DAR sodrinimo analizė (McLean ir kt., 2010) atskleidė "Epitelio diferenciacijos reguliavimą" kaip labiausiai praturtintą terminą tarp atidaromų chromatino regionų, o tai rodo, kad mūsų aptinkamose DAR gali būti reguliavimo ypatybių, skatinančių arba reaguojančių į signalus, skirtus diferencijuoti ir vystyti.nefrono progenitorinės ląstelėsį epitelio ląstelių tipus. Notch signalizacija yra vienas iš labiausiai praturtintų GO terminų, nustatytų atidarant DAR, o nefrono pirmtakuose šis kelias slopina Six2 ekspresiją ir skatina nefrono pirmtakų ląstelių diferenciaciją (Chung ir kt., 2016). Tarp su šiuo keliu susijusių genų yra Jag1, pagrindinis Notch signalizacijos ligandas, kurio ekspresija, kaip pranešta, yra atvirkščiai koreliuojama su Six2 ir Hes1 ekspresija (Chung ir kt., 2016). Atkreipiame dėmesį, kad Jag1 yra anotuotas trijų miRNR, kurių išraiška didėja, taikinys (miR34b-5p, miR98-3p ir miR200a-3p, 2 pav.). Galiausiai, atidarant DAR, stebime genų, susijusių su kraujagyslių remodeliavimu ir morfogeneze, praturtėjimą, nors atrodo, kad tai yra genų, pasidalijusių tarp šių vystymosi takų ir epitelio ląstelių diferenciacijos, pasekmė, įskaitant Jag1, Eya1, Hes1, Foxc1 ir Hey2.

Pakeitimai įchromatino prieinamumastarpnefrono progenitorinės ląstelėsbuvo išmatuoti ankstesniuose tyrimuose (Guo ir kt., 2021; Hilliard ir kt., 2019).

Apskritai mūsų rezultatai atitinka šiuos ankstesnius tyrimus, išryškinančius Notchsignaling ir Pax{0}}susijusius genus. Vis dėlto, palyginti su šia ataskaita, šiuose ankstesniuose tyrimuose yra keletas eksperimentinių skirtumų. GFP ekspresuojančių nefronų pirmtakų išskyrimas naudojant fluorescencija aktyvuotą ląstelę iš Six2-TGC transgeno reporterio pelės gali būti supainiotas dėl to, kad šio alelio nefronų skaičius sumažėjo maždaug 45 procentais (Hilliard ir kt. , 2019; Volovelsky ir kt., 2018). Be to, buvo įrodyta, kad kultivuoti nefrono pirmtakai (auginami su maža arba didele CHIR doze) turi skirtingus transkriptus nuo pirminių nefronų pirmtakų, o tai rodo, kad jų prieinamumas chromatinui taip pat būtų skirtingas (Guo ir kt., 2021; Hilliard ir kt., 2019). Kadangi mūsų tyrimo tikslas buvo suprasti, kaip chromatino kraštovaizdžio pokyčiai įtakoja miRNR ekspresiją ankstyviems ir vėlyviesiems nefrono pirmtakams, reikėjo atlikti pirminių nefrono pirmtakų analizę.

Cistanche geriau veikia inkstus

Sujungdami šiuos pastebėtus chromatino aplinkos pokyčius su atitinkamais miRNR ekspresijos pokyčiais, mes įtraukiame keletą naujų spėjamų miRNR stiprinimo priemonių porų nefrogenezės nutraukimui tolesniam tyrimui. Pavyzdžiui, miRNR miR-125a-5p ir let-7c-5p pastebi reikšmingą išraiškos padidėjimą tarp E14.5 ir P0 , ir tai apibendrina didėjantis DAR (chr16:77,719,058 77,720,407) neprieinamumas tame pačiame TAD. Šis DAR taip pat yra susijęs su Six2 surišimo vieta (Guo ir kt., 2021) ir gali reikšti stipriklį, kuris veikia miR-125a-5p ir (arba) let{{18} }c-5p, o tai savo ruožtu galėtų skatinti diferenciaciją represuojant Lin28b. Panašiai stebime galimą miR 181a stipriklį, kuris, kaip žinoma, moduliuoja renino ekspresiją žmonėms (Marques ir kt., 2015) ir buvo laikomas terapiniu taikiniu, siekiant sumažinti nefrotoksiškumą dėl gebėjimo slopinti BIRC6 ir apoptozę (Liu ir kt. al., 2018). Galiausiai stebime uždarymo DAR, susijusį su miR-9-3p, kuris turi Wnt signalizacijai reaguojančių baltymų Snai1 ir Snai2.miR-9-3p atvirkštinio komplemento, miR-9-5p transkripcijos faktoriaus pėdsakus, žinoma, kad apsaugo nuoinkstasNustatyta, kad fibrozė (Fierro‐Fernández ir kt., 2020), Snai1 ir Snai2 skatina karcinomos metastazes pelių odos vėžio ląstelėse (Olmeda ir kt., 2008) ir vėžiu sergantiems pacientams skatina epitelio-mezenchiminį perėjimą (EMT). (Sundararajan ir kt., 2019), o žinoma, kad miR-9 skatina angiogenezę ir naviko endotelio ląstelių migraciją (Zhuang ir kt., 2012). Gali būti mechanizmas, pagal kurį padidėjęs Wnt signalizavimas sumažina Snai1 ir Snai2 ekspresiją, o tai savo ruožtu sumažina miR-9-3p ekspresiją, kad palaikytų nefrono pirmtakų diferenciaciją.

Mūsų tyrimas išsamiai nustatė nefrono progenitorių chromatino kraštovaizdžio ir miRNR transkripto pokyčius embriono vystymosi metu, taip pat nustatėme kandidatų cis-reguliacinius regionus ir miRNR, kurie gali turėti įtakos nefrogenezės nutraukimui. Tiek mRNR-seq, tiek ATAC-seq duomenų praturtinimo analizė suteikia viliojančių užuominų apie mechanizmus, kurie gali būti įtraukti, pavyzdžiui, kelius, reguliuojančius nefrono pirmtakų diferenciaciją, įskaitant Notch ir TGF-. Taip pat pranešame apie du naujus tariamus reguliavimo elementus, skirtus Eya1 ir Pax8, genams, kurie, kaip žinoma, yra svarbūsinkstasvystymasis ir galimos pagrindinės miRNR reguliavimo sekos, kurios yra susijusios su nefrogenezės nutraukimu.

Metodai

Pelės padermės

Laukinio tipo CD{0}} laiko poruotos patelės buvo gautos iš Charles River Laboratories, Inc. (Wilmington, MA, JAV, RRID: MGI: 5659424) irinkstusbuvo paimti iš vadų embriono dieną E14.5 arba P0. Visi gyvūnai buvo laikomi vivariume Rangos tyrimų centre Pitsburgo UPMC vaikų ligoninėje (Pitsburgas, PA, JAV), o visi eksperimentai su gyvūnais buvo atlikti pagal Institucinio gyvūnų priežiūros ir naudojimo komiteto politiką. Pitsburgas. Kiekvieno embriono ar jauniklio lytis buvo nustatyta atliekant PGR genominėje DNR, išskirtoje iš uodegos atkarpų, naudojant šiuos Y-chromosomos geno Sry pradmenis: SryF 5ʹ-GATGATTTGAGTGGAAATGTGAGGTA-3ʹ ir SryR 5ʹ-CTTATGTTTATAGGCAT,{{GCACCAT}}GTA', anksčiau paskelbtas (McFarlane ir kt., 2013).

Mažos RNR sekos nustatymas ir analizė

Bendra RNR, išskirta išnefrono progenitorinės ląstelėsLikusios po ATAC-seq ląstelių frakcijos pašalinimo buvo pateiktos Pitsburgo UPMC vaikų ligoninės sveikatos mokslų sekvenavimo šerdies bibliotekai paruošti naudojant QIAseq miRNR bibliotekos paruošimo rinkinį (Qiagen 3315{{10}}2). Vieno galo mRNR-seq bibliotekų seka buvo atlikta naudojant Illumina NextSeq500, o bibliotekos buvo suskirstytos iki maždaug 50 mln. vieno galo nuskaitymų vienoje bibliotekoje. Tada sekvenuoti skaitymai buvo suderinti su pelės mm10 genomu naudojant Rsubread paketą (Liao ir kt., 2019) (2.0.1 versija) ir anotuoti į žinomą miRNR, nurodytą miRBase (22 versija) (Kozomara ir Griffiths-Jones, 2014). su Rsubread paketo funkcijaCounts funkcija. Diferencinė žinomos miRNR ekspresija buvo išmatuota naudojant DESeq2 R paketą (1.26.0 versija) (Love ir kt., 2014). Išlygintų skaitymų dalis, anotuota prie žinomos miRNR, taip pat moterų embrionų dalis viename mėginyje buvo įtraukti kaip kofaktoriai į DESeq2 pateiktą testavimo modelį. Tada buvo identifikuota skirtingai išreikšta miRNR, kontroliuojant klaidingų atradimų dažnį ties 5 procentais, o jų kitimo kryptis (didėjanti ar mažėjanti) buvo nustatyta remiantis jų kartojimo pokyčio verte („didėjimas“, o tai rodo didesnę ekspresiją esant P0, palyginti su E14.5). . Reguliavimo takų praturtėjimas tarp numatytų miRNR genų taikinių su žymiai didėjančia ir mažėjančia ekspresija buvo apskaičiuotas naudojant DIANA įrankius miRPath 3.0 versiją (Vlachos ir kt., 2015). Numatyti tiksliniai miRNR nuorašai buvo gauti iš TargetScan (Agarwal ir kt., 2015) ir miRDB (Y. Chen & Wang, 2020) saugyklų.

Nefrono pirmtakų izoliacija

Inkstaibuvo išpjaustyti iš {{0}} E14.5 embrionų arba P0 jauniklių vadų, ir kiekviena vada buvo laikoma vienu mėginiu. Viename mėginyje buvo naudojamas vienas inkstas visai RNR izoliacijai, kad būtų galima naudoti kaip „viso inksto kontrolę“ tolesnėse analizėse (žr. toliau). Iš viso buvo paimti trys mėginiai kiekvienu laiko momentu. Tada iš kiekvieno mėginio buvo išskirtos žievės ląstelės, naudojant magnetiniu būdu aktyvuotą ląstelių rūšiavimą (MACS), kaip buvo paskelbta anksčiau (Brown ir kt., 2011). Trumpai tariant, inkstai buvo iš dalies virškinami 2 mM kolagenaze A (Roche 11088793001) ir 3,5 mM pankreatinu (Sigma P1625) fosfatiniu buferiniu tirpalu (PBS) 15 minučių 37 laipsnių temperatūroje. Virškinimo reakcija buvo sustabdyta naudojant šaltą 100 procentų galvijų vaisiaus serumą (FBS), o ląstelių suspensija buvo surinkta ir resuspenduota šaltame Dulbecco fosfatiniu buferiniu tirpalu (DPBS) su 1 mM fenilmetilsulfonilfluorido (PMSF) proteazės inhibitoriumi1 (Sigma-Aldrich 10803). Ląstelės buvo plaunamos ir resuspenduojamos lediniame izoliaciniame buferyje, susidedančiame iš 2 procentų FBS PBS, po to inkubuojamos su magnetinėmis granulėmis (Dynabeads FlowComp Flexi rinkinys, ThermoFisher 11061D), biotiniluotais prieš Integrin alfa 8, AF R&D078 (AF4 R&D078) antikūnus. naudojant DSB-X Biotin Protein Labeling Kit (ThermoFisher D-20655). Nefrono pirmtakai, prijungti prie šių karoliukų, buvo išskirti, kaip buvo paskelbta anksčiau (Hemker ir kt., 2020), ir sujungti per inkstus kiekvienam mėginiui. 50,{29}} nefrono pirmtakų ląstelių alikvotinė dalis buvo nedelsiant apdorota perchromatino prieinamumasbibliotekos paruošimo protokolą (žr. toliau), o visa RNR buvo išgauta iš likusios ląstelių suspensijos naudojant Qiagen miRNeasy Mini Kit (Qiagen 217004).

Norėdami patvirtinti sodrinimąnefrono progenitorinės ląstelėspalyginti su kitais ląstelių tipais, bendra RNR buvo išskirta iš nefrono pirmtakų, taip pat iš visosinkstus(viso inkstų kontrolė, žr. aukščiau), ir atlikta kiekybinė atvirkštinės transkripcijos PGR (qRT-PGR) šiems žymenims: nefrono pirmtakų žymenims Six2 ir Cited1 (L. Huang ir kt., 2016), o Lhx1, Pdgfr, Pekano riešutas ir Caleb, žymintys inkstų pūslelę (Brunskill ir kt., 2014), inkstų stromą (S. Chen ir kt., 2015), endotelį (Kobayashi ir kt., 2008) ir šlapimtakio pumpurą (Cebrian ir kt., 2014a). ) ląstelės atitinkamai; taip pat žr. 1 papildomą paveikslą. Gapdh (Barber ir kt., 2005) buvo naudojamas kaip namų tvarkymo genas, o santykinis kiekybinis įvertinimas buvo apskaičiuotas naudojant 2-ΔΔCt metodą (Livak ir Schmittgen, 2001). Šių nuorašų pradmenys yra įtraukti į 2 lentelę.

2 lentelė. RT-PGR pradmenys.

Chromatino prieinamumasbibliotekos paruošimas

Maždaug 50,000nefrono progenitorinės ląstelėsbuvo naudojami kiekvienai ATAC-seq sekos bibliotekai generuoti naudojant Nextera DNA Flex Library Prep Kit (Illumina FC-121-1030) su modifikacijomis pagal anksčiau paskelbtą metodą (Buenrostro ir kt., 2013). Trumpai tariant, ląstelės buvo suspenduotos lediniame nejoniniame lizės buferyje, kurį sudaro 10 mM Tris, 10 mM NaCl, 3 mM MgCl2, 1 mM PMSF proteazės inhibitorius ir 0,05 tūrio procento Triton X-100, kad ląstelė lizuotų. membranas, paliekant nepažeistas branduolines membranas. Nepažeisti nefrono pirmtakų branduoliai buvo pakartotinai suspenduoti transpozicijos buferyje, kuriame yra transpozazės fermento, ir inkubuojami 37 laipsnių temperatūroje 30 minučių. Laisva genominė DNR, išleista perkėlimo proceso metu, buvo išgryninta naudojant MinElute PCR gryninimo rinkinį (Qiagen 28004), o po to indeksuojama naudojant priekinio (i7) ir atvirkštinio (i5) indekso pradmenis iš Nextera indekso rinkinio (Illumina FC{19}}). Indekso ligavimas ir fragmentų amplifikacija buvo pasiekti naudojant metodo PGR amplifikacijos terminio ciklo programą.

Norint nustatyti optimalų amplifikacijos ciklų, reikalingų ATAC-seq bibliotekai skaičių, buvo atlikta qPCR šalutinė reakcija naudojant SsoAdvanced SYBR Supermix (BioRad 1725274) ir 96-šulinėlį C100 Thermal Cycler (Bio-Rad), kad būtų galima apskaičiuoti normalizuotą. reporterio vertė (Rn) kiekvienam ciklui. Ciklo skaičius, kuriam esant reakcija pasiekė trečdalį didžiausios fluorescencijos, buvo nustatytas kaip optimalus likusių amplifikacijos ciklų skaičius, o likusiam indeksuotos ATAC-seq transpozicijos reakcijos kiekiui buvo taikomas toks papildomų ciklų skaičius galutiniame amplifikacijoje. programa. Galutinės bibliotekos buvo išgrynintos naudojant Ampure XP magnetinius karoliukus (Beckman Coulter A63881).

Chromatino prieinamumasseka

ATAC-seq bibliotekos suporuotas galas buvo atliktas Illumina NextSeq500, kurį atliko Pitsburgo UPMC vaikų ligoninės Health Sciences Sequencing Core, susumavus bibliotekos koncentracijas, kurios, kaip tikimasi, atneš 90 mln. . Skaitymai buvo kokybiškai apkarpyti naudojant „TrimGalore“ („BabrahamLab“, 2014 m.) (0.4.3 versija) „--suporuotu“ režimu ir kitais numatytais nustatymais. Skaitymai buvo suderinti su mm10 genomu (Church ir kt., 2011) naudojant Bowtie2 (Langmead ir kt., 2009) (2.3.1 versiją) su nustatymais „--local -q -X 2000 -- m". Skaitymai, gauti iš to paties DNR fragmento PGR dublikatų, buvo pažymėti naudojant Picard Tools (Broad Institute, 2016) funkciją MarkDuplicates (2.10.9 versija) su numatytaisiais nustatymais. Skaitymai, kurie dviprasmiškai susieti su daugiau nei viena genomo vieta, buvo atsitiktinai priskirti vienai iš šių vietų, jei buvo mažiau nei keturios galimybės, ir kitu atveju buvo pašalintos (ENCODE, nd) (naudojant Python scenarijų, pasiekiamą https://github. com/kundajelab/atac_dnase_pipelines, (Lee, 2017) su nustatymais „--paired-end -k“). „Samtools“ (H. Li ir kt., 2009) (1.3.1 versija) buvo naudojamas filtruojant pasikartojančius, nesusijusius, našlaičių ir mitochondrijų skaitymus, taip pat rūšiuojant ir indeksuojant BAM failus. ATAC-seq duomenų kokybės kontrolė buvo vykdoma pagal ENCODE projekto ATAC-seq gaires (ENCODE, nd), o pavyzdinės bibliotekos buvo atsitiktinai atrinktos, kad kiekvienoje būtų 31 milijonas suporuotų nuskaitymų, siekiant normalizuoti bibliotekų dydžių skirtumus.

Cistanche gali užkirsti kelią inkstų infekcijai

Prieinamų chromatino regionų nustatymas

BAM failai su filtruotais ATAC-seq skaitymais buvo konvertuoti į suporuotą BED formatą, naudojant „Bedtools“ (Quinlan & Hall, 201{{20}}) (2.26.0 versija) 'bombarduota ' funkcija su nustatymais "- bed pe -mate1". Prieinamo chromatino regionai buvo nustatyti naudojant modeliu pagrįstą ChIP-seq analizės įrankį (MACS2, versija 2.1.1.20160309) plačiajuosčio skambučio algoritmą (Zhang ir kt., 2008), su nustatymais „--format BEDPE {{ 18}}g mm -p 0.{21}}platus --shift 37 --teksto dydis 75 --keep-dup all --model". Siekiant nustatyti didelio pasitikėjimo pasiekiamus regionus, buvo atliktas porinis palyginimas (kiekvienas pakartojimų derinys iš tam tikro laiko momento) ir, naudojant viešai prieinamą, buvo apskaičiuotas neatkuriamo atradimo dažnis (IDR) (Q. Li ir kt., 2011). „Python“ diegimas (GitHub https://github.com/nboley/idr) (Boleu ir kt., 2015) su nustatymais „--input-file-type wide peak --rank p.value {{ 35}}soft-IDR-threshold 0.1 --output-file-type bed". Tiksliau, kiekvienu laiko tašku buvo pateiktas visų pasiekiamų regionų sujungtas BED failas naudojant kiekvieno palyginimo argumentą „--peak-list“ (pavyzdžiui, lyginant du E14.5 pavyzdžius, visos E14.5 plačios smailės naudojami tarp visų trijų pakartojimų). Pasiekiamumo regionai, kurie atitiko IDR bent dviejuose kartotiniuose palyginimuose (su mažiausiai 20 procentų sutapimo), buvo sujungti į vieningą didelio patikimumo pasiekiamų regionų rinkinį („IDR regionai“).

Prieinamų chromatino sričių pokyčiai

Kiekvienos IDR srities pasiekiamumas tam tikrame mėginyje buvo kiekybiškai įvertintas skaičiuojant perkėlimo įvykių, kurie įvyksta normalizuojant sekos GC turinį mėginiuose, skaičių. Tai buvo pasiekta naudojant pasirinktinį scenarijų (galima rasti pridedamoje programinės įrangos saugykloje, žr. papildomus duomenis). Tada šio pasiekiamumo pokyčiai buvo nustatyti lyginant šias vertes įvairiais laiko taškais, naudojant „Limma-voom“ (3.42.2 versija) programinės įrangos paketą (Ritchie ir kt., 2006). Siekiant atsižvelgti į embriono lytį, moterų embrionų dalis kiekviename mėginyje buvo įtraukta kaip kofaktorius linijiniuose modeliuose, naudojamuose diferencinio prieinamumo analizei, ir ji buvo pašalinta kaip paketinis efektas vizualizacijose, naudojant Limma paketo pašalinimo paketo efekto funkciją. Laikoma, kad skirtingai pasiekiami chromatino regionai (DAR) žymiai atsidaro (padidėja pasiekiamumas tarp E14.5 ir P0) arba užsidaro (sumažėjo pasiekiamumas tarp E14.5 ir P0), kai buvo kontroliuojamas 10 proc. . Genominių regionų atidarymo ir uždarymo funkcinės sodrinimo analizės buvo nustatytos pateikiant atitinkamas koordinates Genominių regionų anotacijų praturtinimo įrankiui (GREAT, prieinama adresu http://great.stanford.edu/public/html/) (McLean ir kt., 2010). ). Žinomų ir numatomų stiprintuvų anotacijos buvo paimtos iš FANTOM5 (Andersson ir kt., 2014), VISTA (Visel ir kt., 2007) ir EnhancerAtlas 2.0 (Gao ir Qian, 2020) saugyklų.

Transkripcijos faktoriaus pėdsakai

Transkripcijos faktoriaus pėdsakai buvo nustatyti sujungiant visus BAM failus iš to paties laiko momento, tada paleidžiant Reguliavimo genomikos įrankių rinkinio Hmm pagrindu sukurtą TF pėdsakų identifikavimo (HINT) programinę įrangą (versija 0.12.3), ypač ATAC pėdsakų modelį. -seq duomenys (galima rasti adresu www.regulatory-genomics.org ) (Z. Li ir kt., 2018). Ši programinė įranga buvo paleista su nustatymais „right-hint footprinting --organism=mm10 --at-seq --paired-end“. Tada pėdsakai buvo anotuoti žinomais pelių surišimo motyvais iš HOCOMOCO 11 duomenų bazės (Kulakovskiy ir kt., 2018), naudojant HINT motyvų atitikimo funkciją su nustatymais „dešiniojo motyvo analizė atitinka --organizmo{18}}mm10“. Pėdsakai, kurių HINT balai mažesni nei 10, buvo neįtraukti. Galiausiai, skirtingos veiklos modeliai tarp motyvų suderintų pėdsakų buvo išmatuoti naudojant RGT-HINT programos diferencialinę funkciją su nustatymais „dešinės užuominos diferencialas --organizmas=mm10 --bc {{27} }NC 12 --išvesties profiliai“. Žymiai besikeičiantys aktyvumo lygiai buvo nustatyti remiantis p-vertės riba 0,05 (Friedman-Nemeny metodas).

Cistanche gali pagerinti inkstų funkciją

Nukleosomų konfigūracija

Sulygiuoti to paties laiko taško skaitymai buvo sujungti į vieną BAM failą, o NucleoATAC paketas (versija 0.3.4) buvo naudojamas norint nustatyti skaitymo ilgių modelius, rodančius ir surištas nukleozomines diadas, ir sritis be nukleozomų ( NFR) (Schep ir kt., 2015). Ši programinė įranga buvo paleista naudojant numatytuosius nustatymus. Nukleosomos buvo pažymėtos kaip 146 bp sritis, sutelkta aplink kiekvieną vadinamą nukleosomų diadu.

Vienos ląstelės RNR ekspresija

Vienos ląstelės genų ekspresijos duomenys buvo apdoroti ankstesniam rankraštiui (BioRxiv https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2020.09.16.300293v1) (Bais ir kt., 2020) ir buvo gauti iš Gene Expression Omnibus (GEOID GSE158166). Apdoroti duomenys, įtraukti į 7 papildomą paveikslą, apima ląstelių tipus, genų ekspresijos lygius, mažo matmens (tSNE) įterpimus ir pseudolaikines anotacijas, susijusias su trajektorija, nustatyta tarp proliferuojančių ir diferencijuojančių nefrono pirmtakų grupių. Duomenys buvo pasiekti ir tvarkomi naudojant SingleCellExperiment R paketą (Lun & Risso, 2019).

miRNR-mRNR sąveika senstant ir diferencijuojant nefrono progenitorines ląsteles

Genai su besikeičiančia išraiška tarp savęs atsinaujinimo, pradėjimo ir diferencijavimonefrono progenitorinės ląstelėsbuvo gauti iš 3 ir 4 papildomų lentelių, paskelbtų Bais ir kt. (FDR< 0.1="" for="" all="" genes,="" 99="" genes="" total).="" mirtarbase="" v8.0="" for="" the="" mouse="" was="" downloaded="" (https://mirtarbase.cuhk.edu.cn/~mirtarbase/mirtarbase_2022/cache/download/8.0/mmu_mt="" i.xls)="" while="" mirdb="" version="" 6.0="" predictions="" were="" obtained="" from="" the="" mid="" b="" website="" (y.="" chen="" &="" wang,="" 2020);="" high-quality="" mirna-to-target-gene="" predicted="" interactions="" with="" a="" minimum="" score="" of="" 90="" were="" considered.="" annotated="" mir="" target="" genes="" and="" differentially="" expressed="" genes="" were="" then="" intersected="" using="" the="" r="" programming="" environment="" to="" generate="" figure="" 2="" and="" supplemental="" table="">

Chromatino imunoprecipitacijos sekos nustatymas pirminiuose nefrono pirmtakuose

Chromatino imunoprecipitacijos sekos (ChIP-seq) duomenys apie -katenino, Lef1, Six2 ir Tcf7 surišimą pirminiuose nefrono pirmtakuose buvo gauti iš BedGraph failų, esančių GEO saugykloje (GSE131119) Guo ir kt., 2021 m. Sulenkimo signalo vertės buvo vidutinės. kartotiniuose mėginiuose.

Reguliavimo elementų, turinčių įtakos miRNR ekspresijai, atranka

Norėdami patikrinti galimus miRNR stipriklius, anotavome miRNR ir DAR su topologiškai susijusiais domenais (TAD), kuriuose jie yra, remiantis mm10 anotacijomis iš pelių embrioninių kamieninių ląstelių, atsisiųstų iš 3D genomo naršyklės (galima rasti adresu http://3dgenome .fsm.northwestern.edu/) (Y. Wang ir kt., 2018). Regionaichromatino prieinamumasir miRNR buvo laikomi kandidatais stiprikliais - miRNR poromis, jei jos užėmė tą patį TAD ir parodė nuoseklius prieinamumo ir ekspresijos pokyčius (didėja prieinamumas didėjant miRNR ekspresijai ir atvirkščiai). DAR buvo laikomi tik galimomis „reguliacinėmis savybėmis“, jei jie nesutampa su žinomu promotoriumi ar egzono galu. Potencialios miRNR ir tariamų reguliavimo elementų poros buvo teikiamos pirmenybė, jei jos 1) pateko į tą patį TAD ir 2) patyrė reikšmingų pokyčių tarp E14.5 ir P0 (padidino miRNR ekspresiją ir padidino IDR regiono prieinamumą ir atvirkščiai). .

Padėkos

Shelby Hemker ir Abha Bais prisidėjo prie eksperimentinio dizaino. ATAC-seq ir mRNA-seq seką atliko Pitsburgo UPMC vaikų ligoninės Health Sciences Sequencing Core.

Konkuruojantys interesai

Konkurencingi interesai nebuvo deklaruoti

Finansavimas

AC buvo remiamas Nacionalinio diabeto ir virškinimo instituto dotacijomis irInkstasLigos pagal Nacionalinį sveikatos institutą (T32DK061296-17). DK buvo remiamas Nacionalinio bendrųjų medicinos mokslų instituto prie Nacionalinio sveikatos instituto dotacijų (R01GM115836). JH buvo remiamas Nacionalinio diabeto ir virškinimo bei inkstų ligų instituto prie Nacionalinio sveikatos instituto dotacijų (R01DK103776 ir 125015). DMC rėmė nefrozinio sindromo studijų tinklo (NEPTUNE) karjeros plėtros apdovanojimas ir Pitsburgo vaikų ligoninės Mokslinių tyrimų patariamoji tarybos podoktorantūros stipendija. YP rėmė dotacijos iš Pitsburgo UPMC vaikų ligoninės ir Šiaurės Amerikos mitochondrijų ligų konsorciumo.

Duomenų prieinamumas

Numatyti pelės stiprintuvai buvo gauti iš FANTOM5 (DOI: 10.1038/nature12787; failas pasiekiamas čia), Vista (DOI: 10.1093/var/gkl822; failas pasiekiamas čia) ir EnhancerAtlas (DOI: 10.1093/var/gkz980 galima rasti čia); duomenų bazės. Pelės mm10 genomas ir jo anotacijos buvo atsisiųsti per Illumina genomų projektą (galima rasti čia). Virš grandinės failas, skirtas mm9 koordinatėms pakelti į mm10, buvo gautas iš UCSC genomo naršyklės (DOI: 10.1101/gr.229102; failą rasite čia). TAD anotacijos iš pelių embrioninių kamieninių ląstelių buvo paimtos iš 3D genomo naršyklės (DOI: 10.1186/s13059-018-1519-9; failas pasiekiamas čia). Numatyti miRNR nuorašo taikiniai buvo gauti iš TargetScan (DOI: 10.7554/eLife.05005, failas pasiekiamas čia) ir iš miRDB 6 versijos (DOI: 10.1093/var/gkz757, failas pasiekiamas čia). ATAC-seq duomenys, įskaitant IDR / DAR vietas, anotacijas ir diferencinio sodrinimo rezultatus, yra prieinami GEO (GSE168339), kaip ir mRNR-seq duomenys, įskaitant anotacijas ir diferencinės išraiškos rezultatus (GSE168342). Kompiuterio kodas, naudojamas duomenims apdoroti ir analizuoti bei skaičiams generuoti, pasiekiamas adresu https://bitbucket.org/clugstonA/mirna_enhancers

Bibliografija

Abruzzese, MP, Bilotta, MT, Fionda, C., Zingoni, A., Soriani, A., Petrucci, MT, Ricciardi, MR, Molfetta, R., Paolini, R., Santoni, A. ir Cippitelli, M. (2019). Homeobox transkripcijos faktorius MEIS2 yra vėžio ląstelių išgyvenimo ir IMiD aktyvumo reguliatorius sergant daugybine mieloma: moduliavimas bromodomeno ir ekstra-terminalinių (BET) baltymų inhibitoriais. Ląstelių mirtis ir ligos, 10(4). https://doi.org/10.1038/s41419-019-1562-9

Agarwal, V., Bell, GW, Nam, JW ir Bartel, DP (2015). Veiksmingų mikroRNR tikslinių vietų numatymas žinduolių mRNR. ELife. https://doi.org/10.7554/eLife.05005

Andersson, R., Gebhard, C., Miguel-Escalada, I., Hoof, I., Bornholdt, J., Boyd, M., Chen, Y., Zhao, X., Schmidl, C., Suzuki, T ., Ntini, E., Arner, E., Valen, E., Li, K., Schwarzfischer, L., Glatz, D., Raithel, J., Lilje, B., Rapin, N., … Sandelin, A. (2014). Žmogaus ląstelių tipų ir audinių aktyvių stipriklių atlasas. Gamta, 507(7493), 455–461. https://doi.org/10.1038/nature12787

Babrahamo laboratorija. (2014). Trim Galore. Bioinformatikoje. http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/trim_galore

Bais, AS, Cerqueira, DM, Clugston, AS, Ho, J. ir Kostka, D. (2020). Vienos ląstelės RNR sekos nustatymas atskleidžia skirtingą ląstelių ciklo aktyvumą pagrindinėse ląstelių populiacijose nefrogenezės metu. BioRxiv. https://doi.org/https://doi.org/10.1101/2020.09.16.300293

Barber, RD, Harmer, DW, Coleman, RA ir Clark, BJ (2005). GAPDH kaip namų tvarkymo genas: GAPDH mRNR ekspresijos analizė 72 žmogaus audinių grupėje. Fiziologinė genomika. https://doi.org/10.1152/physiolgenomics.00025.2005

Bartel, DP (2009). MikroRNR taikinio atpažinimo ir reguliavimo funkcijos. Cell, 136(2), 215–233. https://doi.org/10.1016/j.cell.2009.01.002.MicroRNA

Bertram, JF, Douglas-Denton, RN, Diouf, B., Hughson, MD ir Hoy, WE (2011). Žmogaus nefrono skaičius: poveikis sveikatai ir ligoms. Vaikų nefrologija, 26(9), 1529–1533. https://doi.org/10.1007/s00467-011-1843-8

Boleu, N., Kundaje, A., Bickel, PJ ir Li, Q. (2015). Nepakartojamo atradimo dažnis (2.0.3). https://github.com/nboley/idr

Bouchard, M., Souabni, A., Mandler, M., Neubüser, A. ir Busslinger, M. (2002). Nephric linijos specifikacija pagal Pax2 ir Pax8. Genai ir raida. https://doi.org/10.1101/gad.240102

..............

Iš: Journal Pre-proof

2021 m. išleido Elsevier Inc.