Cistanche Tubulosa feniletanoidiniai glikozidai sukelia apoptozę Eca-109 ląstelėse per nuo mitochondrijų priklausomą kelią

Įvadas

Stemplės vėžys yra vienas iš labiausiai paplitusių vėžio tipų, kurio sergamumas yra 11-as ir mirtingumas yra 6-as pasaulyje. 2015 m. jis sukėlė ~439,000 mirtingumą. Sergamumas stemplės vėžiu labai skiriasi skirtinguose regionuose, o rytų Azijoje ir Rytų bei Pietų Afrikoje 2012 m. buvo didžiausias sergamumas, o Vakarų Afrikoje – mažiausias. Kinijoje apskaičiuoti stemplės vėžio atvejai ir mirtingumas atitinkamai buvo 477,000 ir 375,000 , 2015 m. Nors sergamumas stemplės vėžiu vidutinio ir aukšto vidutinio sociodemografinio indekso šalyse 2005–2015 m. sumažėjo, mirtingumas išlieka aukštas dėl prastos prognozės. Chirurginės rezekcijos derinys su chemoterapija ar radioterapija buvo naudojamas stemplės vėžiui gydyti, tačiau buvo pranešta, kad 2003–2014 m. 5-metų išgyvenamumas išliko<20% in China, USA and Europe. For these reasons, it is urgent to develop novel therapeutic agents to treat esophageal cancer. used to treat various cancer types, including non Traditional Chinese herbal medicine (CHM) -small cell lung cancer, colorectal cancer, and hepatocellular carcinoma. Recently, clinical trials reported that the combination of CHM with chemotherapy or radiotherapy not only demonstrated several benefits on the quality of life and alleviating side effects induced by chemotherapy or radiotherapy but also improved the survival rate of patients with non-small cell lung, liver, gastric, colorectal, nasopharyngeal or cervical cancer. However, there is conflicting evidence regarding the efficacy of CHM treatment on esophageal cancer. Numerous studies determined that several herbal medicines or components could inhibit the growth of esophageal cancer cells in vitro and in vivo, including Andrographis paniculata, Daikenchuto, icariin, Rosa Roxburghii Tratt and Fagopyrum Cymosum, Jaridonin, Marsdenia tenacissima, OP16 (a novel ent-kaurene diterpenoid), Qigesan and Tonglian decoction. Cistanche is a type of CHM and exerts various biological functions, including anti‑oxidation, anti‑inflammation, and neuroprotection. Our previous studytai pademonstravoCistanche tubulosa feniletanoidiniai glikozidai(CTPG) gali slopinti melanomos B16-F10 ląstelių augimą in vitro ir in vivo (24). Tačiau prastas anksčiau naudoto CTPG tirpumas vandenyje riboja vaistų kūrimą. Todėl buvo naudojamas vandenyje tirpus CTPG (CTPG-W) ir ištirtas priešnavikinis poveikis stemplės vėžio ląstelėms (Eca-109). Nustatyta, kad CTPG-W, priklausomai nuo dozės, gali slopinti Eca-109 ląstelių gyvybingumą, indukuodamas apoptozę per mitochondrijų priklausomą kelią.

NATŪRALUS CISTANCHE TUBULOSA LYTINEI FUNKCIJAI GERINTI PHGS75% ECH 30% ACT 12%

medžiagos ir metodai

Gyvūnai.

C57BL/6 pelių patelės (6-8 sav., ~25 g) buvo įsigytos iš Pekino laboratorinių gyvūnų tyrimų centro (Pekinas, Kinija) ir laikomos kontroliuojamos temperatūros (25˚C), šviesos ciklo patalpose (12/ 12) Sindziango universiteto gyvūnų kompleksas (Urumčis, Kinija). Visi gyvūnai gavo patogenų neturintį vandenį ir maistą.

Ląstelių linija ir kultūra.

Žmogaus stemplės karcinomos ląstelių linija (Eca-109) buvo išsaugota Sindziango pagrindinėje biologinių išteklių ir genų inžinerijos laboratorijoje (Gyvybės mokslų ir technologijų kolegija, Sindziango universitetas, Urumčis, Kinija) ir išauginta RPMI{{1} } terpė (Gibco; Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA, JAV), papildyta 10% termiškai inaktyvuotu galvijų vaisiaus serumu (FBS; MRC, EN MOASAI Biological Technology Co., Ltd, Jiangsu, Kinija), 1% L. -glutaminas (100 mM), 100 U/ml penicilino ir 100 µg/ml streptomicino esant 37 ˚C drėgnoje atmosferoje, kurioje yra 5 % CO2.

Aukštos kokybės skysčių chromatografija (HPLC).

CTPG-W (kat. Nr. SGJG20170410) įsigytas iš Shanghai Upbio Tech Co., Ltd. (Šanchajus, Kinija). Pagrindiniai CTPG junginiai buvo kvalifikuoti ir kiekybiškai įvertinti HPLC pagal ankstesnį mūsų tyrimą (24). Trumpai tariant, HPLC buvo atlikta naudojant ZORBAX SB-C18 kolonėlę (250x4,6 mm; 5 µm) 30 °C temperatūroje ir eliuuojama 0,2% skruzdžių rūgšties tirpalu ir metanolio gradientu, pradedant nuo 23%, nes kas minutę buvo pilama 1 ml. 45 min., kol pasieksite 31%. Iš viso buvo įšvirkšta 10 µl mėginio ir aptikta 330 nm. Echinakozido standartas buvo nupirktas iš Shanghai Baoban Biotech Co., Ltd. (Šanchajus, Kinija), o akteozido standartas buvo nupirktas iš Sigma-Aldrich (Merck KGaA, Darmštatas, Vokietija). Standartai buvo naudojami analizuojant CTPG-W komponentus.

MTT tyrimas.

Ląstelių proliferacija buvo matuojama MTT tyrimu. Eca{{0}} ląstelės buvo pasėtos į 96-šulinėlių plokšteles, kurių tankis 5x103 ląstelės 100 µl RPMI{{5 }} terpė/šulinėlis ir kultivuojama 37 ˚C temperatūroje 24 val., po to apdorojama skirtingomis koncentracijomis (0, 200, 400, 600 ir 800 µg/ml) CTPG-W arba 0,4 % dimetilsulfoksidu (DMSO) 24 val. 48 ir 72 val. DMSO buvo naudojamas kaip tirpiklio kontrolė (800 µg/ml CTPG-W, kuriame yra 0,4 % DMSO). Cisplatina (20 µg/ml) buvo naudojama kaip teigiama kontrolė. Po to supernatantas buvo išmestas po centrifugavimo 225 xg 5 minutes kambario temperatūroje ir į kiekvieną šulinėlį įpilta 100 µl MTT tirpalo (0,5 mg/ml RPMI-1640 terpėje be FBS) ir inkubuojama 37 ˚C temperatūroje 3 h. Susidarę formazano kristalai buvo ištirpinti 200 µl DMSO. Optinio tankio (OD) reikšmės buvo išmatuotos esant 490 nm bangos ilgiui, naudojant 96-šulinėlių mikroplokštelių skaitytuvą (Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, JAV). Santykinis ląstelių gyvybingumas buvo apskaičiuotas pagal formulę: Ląstelių gyvybingumas (%)=(ODtreated/ODuntreated)x100%. Eca-109 ląstelių morfologija buvo stebima naudojant apverstą fluorescencinį mikroskopą (didinimas, x 200) (Nikon Eclipse Ti-E; Nikon Corporation, Tokijas, Japonija).

Splenocitų dauginimuisi C57BL/6 pelės buvo eutanazuotos išnirstant gimdos kakleliui, o blužniai buvo izoliuoti. Pagaminta vienaląstė suspensija, splenocitai buvo pasėti į 96-šulinėlių plokšteles, kurių tankis 1x105 ląstelės/šulinėlyje 100 µl RPMI-1640 terpėje, po to apdoroti skirtingomis koncentracijomis. (0, 200, 400, 600 ir 800 µg/ml) CTPG-W 24, 48 ir 72 valandas 37 ˚C temperatūroje su 5 % CO2. Splenocitų proliferacija buvo matuojama MTT tyrimu pagal pirmiau minėtą protokolą. Stimuliavimo indeksas=ODapdorotas / ODnegydytas.

Apoptozės ir ląstelių ciklo matavimas. Eca{{0}} ląstelės buvo kultivuojamos 60 mm lėkštelėse, kurių tankis buvo 2,5x105 ląstelės/lėkštelėje 24 valandas ir apdorotos skirtingomis koncentracijomis ({{31} }, 200, 400, 600 ir 800 µg/ml) CTPG-W arba 0,4 % DMSO 24 valandas 37 ˚C temperatūroje su 5 % CO2. Ląstelės buvo surinktos ir nudažytos aneksino V-fluoresceino izotiocianato (FITC) / propidžio jodido (PI) apoptozės aptikimo rinkiniu (Shanghai Shengsheng Biotechnology Co., Ltd., Šanchajus, Kinija) pagal gamintojo protokolus. Mėginiai buvo paimti naudojant srauto citometriją (BD FACSCalibur; BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, JAV) ir analizuojami naudojant FlowJo 7.6 (Tree Star, Inc., Ashland, OR, JAV). Norint išanalizuoti CTPG-W poveikį ląstelių ciklui, 2,5x105 Eca-109 ląstelės buvo pasėtos į 60 mm auginimo lėkštes ir apdorotos CTPG-W (0, 100, 200 ir 400 µg/ml) arba 0,4 % DMSO 24 valandas 37 ˚C temperatūroje su 5 % CO2. Visos ląstelės buvo surinktos ir du kartus plaunamos lediniu PBS (Gibco; Thermo Fisher Scientific, Inc.), tada fiksuojamos 70% ledo šaltame etanolyje 4 °C temperatūroje 30 min. Du kartus nuplovus lediniu PBS, ląstelės buvo resuspenduojamos 300 µl PI/RNazės dažymo buferyje (BD Biosciences, San Chosė, CA, JAV) 10 minučių kambario temperatūroje. Ląstelių ciklo pasiskirstymas buvo analizuojamas naudojant ModFit LT 3.0 programinę įrangą srauto citometrijos metodu (BD FACSCalibur).

NATŪRALUS CISTANCHE TUBULOSAKovos su nuovargiuApsaugokite kepenis PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Mitochondrijų membranos potencialo (Δψm) ir reaktyviųjų deguonies rūšių (ROS) analizė.Norint išanalizuoti Δψm, Eca{0}} ląstelės buvo apdorotos CTPG-W (0, 400, 600 ir 800 µg/ml) arba 0,4 % DMSO. 24 val. 37 °C temperatūroje su 5 % CO2 ir nudažytas Mitochondrijų membranos potencialo tyrimo rinkiniu su JC-1 (Beyotime Biotechnologijos institutas, Šanchajus, Kinija), pagal gamintojo protokolą, 20 min. 37 ° temperatūroje C. Du kartus nuplovus JC-1 plovimo buferiu (Beyotime Institute of Biotechnology), mėginiai buvo resuspenduojami 300 µl JC-1 plovimo buferiu ir analizuojami srauto citometrija (BD FACSCalibur). JC-1 dažų fluorescencija Eca-109 ląstelėse taip pat buvo stebima naudojant apverstą fluorescencinį mikroskopą (didinimas, x 200; Nikon Eclipse Ti-E). ROS analizei Eca-109 ląstelės buvo apdorotos CTPG-W (0, 400, 600 ir 800 µg/ml) 2, 4, 6, 12 ir 24 valandas ir nudažytos reaktyviųjų deguonies rūšių tyrimu. rinkinys (Beyotime Institute of Biotechnology), pagal gamintojo protokolą, 20 min 37˚C temperatūroje. Tris kartus nuplovus lediniu PBS, mėginiai buvo paimti srauto citometrijos metodu (BD FACSCalibur) ir analizuojami naudojant FlowJo 7.6 programinę įrangą.

1 pav. Kvalifikuota CTPG-W kontrolė. CTPG-W komponentai buvo kokybiškai ir kiekybiškai išanalizuoti naudojant aukštos kokybės skysčių chromatografiją ir palyginti su echinakozido ir akteozido standartais. CTPG-W, vandenyje tirpūs feniletanoidiniai glikozidaiC. kanalėlių.

2,2-difenil-1-pikrilhidrazilo (DPPH) radikalų šalinimo aktyvumas. CTPG-W laisvųjų radikalų pašalinimo aktyvumas buvo nustatytas naudojant DPPH laisvųjų radikalų tyrimą pagal paskelbtą protokolą su nedideliais pakeitimais, nes metanolis buvo pakeistas etanoliu, kad ištirptų DPPH (25, 26). Atliekant pastovios būsenos matavimus, 150 µl DPPH (100 mmol/l) etanolyje buvo sumaišyta su skirtingų koncentracijų CTPG-W (25, 50, 75, 100, 250, 300, 400, 500 ir 600 µg/ml) 50 µl PBS ir inkubuojamas tamsoje 30 min. kambario temperatūroje. Absorbcija ties 517 nm buvo aptikta esant ir nesant CTPG-W. Iš viso 50 µl vitamino C buvo naudojama kaip teigiama kontrolė. DPPH radikalų pašalinimo aktyvumas buvo apskaičiuotas naudojant formulę: pašalinimas (%) =[1-(Asample-Ablank)/A0] x100, kur tuščias yra kontrolinės medžiagos absorbcija (be DPPH), Asample yra mėginio absorbcija, o A0 yra PBS su DPPH absorbcija.

Western blot analizė. Eca{{0}} ląstelės buvo apdorotos CTPG-W (0, 200, 600 µg/ml) arba 0,4 % DMSO 24 valandas 37 ˚C temperatūroje su 5 % CO2. Tolesnis plovimas du kartus su PBS, ląstelės 

2 pav. CTPG-W poveikis Eca-109 ląstelių ir splenocitų augimui. (A) Eca-109 ląstelės buvo apdorotos skirtingomis koncentracijomis CTPG-W 24, 48 ir 72 valandas, o tada ląstelių gyvybingumas buvo nustatytas naudojant MTT tyrimą. (B) Eca-109 ląstelių morfologiniai pokyčiai po gydymo CTPG-W 24 val. (C) C57BL / 6 pelių splenocitai buvo gydomi skirtingomis CTPG-W koncentracijomis 24, 48 ir 72 valandas, o tada proliferacija buvo analizuojama naudojant MTT tyrimą.**P<0.01 and ***P<0.001, compared with the control. CTPG-W, water-soluble phenylethanoid glycosides of C. kanalėlių.

buvo lizuojami Radioimunoprecipitation Assay Lizės buferyje (Beijing ComWin Biotech Co., Ltd., Pekinas, Kinija) 20 minučių ant ledo. Po centrifugavimo 10, 000 xg 10 minučių 4 °C temperatūroje, supernatantai buvo surinkti ir baltymų koncentracija buvo aptikta naudojant bicinchonino rūgšties rinkinį (Thermo Fisher Scientific, Inc.) pagal gamintojo protokolus. Western blot analizė buvo atlikta pagal mūsų ankstesnį aprašymą (24). Antikūnai prieš kaspazę-7 (kat. Nr. D120077), kaspazę-8 (kat. Nr. D155240), kaspazę-9 (kat. Nr. D220078), B ląstelių limfomą{ {13}} (Bcl-2) susijęs X (Bax) (kat. Nr. D220073) ir Bcl-2 (kat. Nr. D260117) ir antipelės IgG krienų peroksidazė (HRP) ) (kat. Nr. D111050) ir anti-triušių IgG-HRP (kat. Nr. D110058) buvo įsigyti iš BBI Life Sciences (Šanchajus, Kinija). Antikūnai prieš kaspazę-3 (kat. Nr. E-AB-10050) ir aktyviąją kaspazę-3 (kat. Nr. E-AB-22115) buvo įsigyti iš Elabscience ( Uhanas, Kinija). Kiti antikūnai prieš kaspazę-7 (kat. Nr. 9492), poli (ADP-ribozės) polimerazę (PARP) (kat. Nr. 9542), citochromą c (kat. Nr. AC909), c-Jun NH{ {37}}galinė kinazė (JNK) (kat. Nr. 9252S) ir -aktinas (kat. Nr. 58169) buvo gauti iš Cell Signaling Technology, Inc. (Danvers, MA, JAV). Visi pirminiai ir antriniai antikūnai buvo atskiesti santykiu 1:1,000. Pirminiai antikūnai buvo inkubuojami 4 °C temperatūroje per naktį, o antriniai antikūnai – 37 °C temperatūroje 1 valandą.

3 pav. Eca-109 ląstelių apoptozė, sukelta CTPG-W. Ląstelės buvo apdorotos skirtingomis CTPG-W koncentracijomis 24 valandas. (A) Apoptotinės ir nekrozinės Eca-109 ląstelės buvo analizuojamos srauto citometrija. Viršutiniame skydelyje pavaizduoti atskiri taškų brėžiniai, o apatiniame skydelyje vaizduojami suvestinės duomenys. *P<0.05 and ***P<0.001, compared with the control. (B) Total protein was isolated and the expression levels of Bax and Bcl-2 were detected with western blot analysis. Bcl-2, B-cell lymphoma-2; Bax, Bcl-2-associated X; DMSO, dimethyl sulfoxide; CTPG-W, water-soluble phenylethanoid glycosides of C. kanalėlių.

Tiksliniai baltymai buvo aptikti naudojant patobulintą chemiliuminescencijos tyrimo rinkinį (Beyotime Institute of Biotechnology), pagal gamintojo protokolą.

Statistinė analizė. Statistinis reikšmingumas buvo apskaičiuotas atliekant vienpusę dispersijos analizę naudojant Tukey post hoc testą, o rezultatai buvo analizuojami naudojant GraphPad Prism 5.{2}} programinę įrangą (GraphPad Software, La Jolla, CA, JAV) tarp gydymo ir kontrolinių grupių. Visi duomenys buvo pateikti kaip vidurkis ± standartinis nuokrypis. P<0.05 was considered to indicate a statistically significant difference.

CISTANCHE TUBULOSA EKSTRAKTAS INKSTU FUNKCIJAI GERINTI PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Rezultatai

CTPG-W slopina Eca-109 ląstelių augimą.

CTPG-W komponentai buvo kvalifikuoti ir kiekybiškai įvertinti HPLC (1 pav.), kurie buvo lyginami su echinakozido ir akteozido standartais. Pagal smailės sulaikymo laiką ir smailės plotus CTPG-W buvo 39,16% echinakozido ir 2,44% akteozido. Pirma, CTPG-W poveikis Eca-109 ląstelių gyvybingumui buvo nustatytas naudojant MTT tyrimą. CTPG-W buvo ištirpintas DMSO 200 mg/ml ir praskiestas RPMI-1640 terpe, turinčia 10% termiškai inaktyvuoto FBS iki nurodytos koncentracijos. Eca-109 ląstelės buvo apdorotos CTPG-W, o ląstelių gyvybingumas buvo analizuojamas naudojant MTT tyrimą nurodytais laiko momentais. Gydymas CTPG-W reikšmingai sumažino Eca-109 ląstelių gyvybingumą priklausomai nuo dozės ir laiko (P<0.001; Fig. 2A). The morphology of Eca-109 cells was observed with an inverted fluorescence microscope (magnification, x200) following CTPG‑W treatment for 24 h, which changed notably in a dose-dependent manner, with the cells shrinking and becoming round following CTPG-W treatment (Fig. 2B). These results indicate that CTPG-W suppresses the growth of Eca-109 cells. The effect of CTPG-W on the proliferation of splenocytes was also detected with an MTT assay. CTPG-W significantly promoted the proliferation of splenocytes in a dose-dependent manner (Fig. 2C), indicating that it has no cytotoxic effect on splenocytes. 

4 pav. CTPG-W poveikis ląstelių ciklo pasiskirstymui Eca-109 ląstelėse. Skirtingos koncentracijos CTPG-W buvo naudojamos Eca-109 ląstelėms gydyti 24 valandas, o ląstelių ciklo pasiskirstymas buvo analizuojamas srauto citometrijos metodu. *P<0.05 and **P<0.01, compared with the control. DMSO, dimethyl sulfoxide; CTPG-W, water-soluble phenylethanoid glycosides of C. kanalėlių.

CTPG-W sukelia apoptozę Eca-109 ląstelėse. Norint ištirti, ar CTPG-W slopino Eca-109 ląstelių augimą, sukeldamas apoptozę arba nekrozę, ląstelės buvo apdorotos skirtingomis CTPG-W koncentracijomis. Po 24 valandų Eca-109 ląstelių apoptozė ir nekrozė buvo aptikta dažant aneksinu V/PI. Kaip pavaizduota 3A pav., aneksino V-/PI+ ląstelės buvo uždarytos kaip nekrozinės ląstelės, o aneksino V+/PI+ ir aneksino V+/PI- ląstelės buvo suvarytos kaip apoptotinės ląstelės. CTPG-W pirmiausia sukėlė Eca-109 ląstelių apoptozę priklausomai nuo dozės, nors nekrozinių Eca-109 ląstelių taip pat labai padaugėjo, kai buvo gydoma 600 ir 800 µg/ml CTPG-W (P<0.001 at 600 µg/ml and P<0.05 at 800 µg/ml). Consistently, the levels of pro-apoptotic Bax and anti-apoptotic Bcl-2 in Eca-109 cells were upregulated and downregulated, respectively, upon CTPG-W treatment (Fig. 3B). The results indicated that CTPG-W primarily inhibited the growth of Eca-109 cells through the induction of apoptosis.

CTPG-W sukelia ląstelių ciklo sustabdymą S fazėje Eca-109 ląstelėse. Vėžinių ląstelių ciklo sutrikimas slopins ląstelių augimą ir skatins apoptozę (27). Ląstelių ciklo pasiskirstymas Eca-109 ląstelėse buvo aptiktas dažant PI po 24 val. apdorojimo CTPG-W. Pastebėta, kad S fazės ląstelės padidėjo, o ląstelės G0/G1 fazėse parodė bendrą reikšmingą sumažėjimą po gydymo CTPG-W (P<0.05;Fig. 4), indicating that CTPG-W arrests the Eca-109 cell cycle at the S phase.

CTPG-W sumažina Δψm ir skatina citochromo c išsiskyrimą. Apoptozę gali sukelti nuo mitochondrijų priklausomas kelias (28, 29). Pro- ir anti-apoptotiniai BCL-2 baltymų šeimos nariai atlieka svarbų vaidmenį reguliuojant mitochondrijų membranos vientisumą (30, 31). Po 24 valandų apdorojimo CTPG-W, Δψm buvo įvertintas naudojant JC-1 dažymą. JC-1 agregatas (raudona fluorescencija aptikta FL-2) suirs į monomerą (žalia fluorescencija aptikta FL-1), kai Δψm mažėja (32). Kaip parodyta 5A pav., FL-1+ FL-2-/+ ląstelių dažnis labai padidėjo priklausomai nuo dozės, o tai rodo, kad sumažėjo Eca-109 ląstelių Δψm. Fluorescencijos pokyčiai Eca-109 ląstelėse taip pat buvo stebimi naudojant apverstą fluorescencinį mikroskopą (5B pav.). Didėjant CTPG-W koncentracijai, raudona fluorescencija sumažėjo, o žalia fluorescencija padidėjo, o tai atitinka srauto citometrijos duomenis. Taip pat buvo pastebėta, kad citozolyje pastebimai padidėjo citochromo c lygis (5C pav.), kuris yra dėl Δψm sumažėjimo. Tai patvirtina išvadą, padarytą iš padidėjusio FL-1+ FL-2-/+ ląstelių skaičiaus, kad Δψm sumažėjo dėl gydymo CTPG-W. Buvo pranešta, kad JNK gali reguliuoti BCL-2 baltymų šeimos aktyvaciją, dėl kurios išsiskiria citochromas c (33-35). Taip pat buvo nustatyta, kad po gydymo CTPG-W JNK lygis buvo žymiai padidintas (5C pav.). Rezultatai parodė, kad CTPG-W gali sukelti Eca-109 ląstelių apoptozę per nuo mitochondrijų priklausomą kelią.

5 pav. Δψm sumažinimas ir citochromo c bei JNK reguliavimas. Eca-109 ląstelės buvo apdorotos skirtingomis koncentracijomis CTPG-W 24 valandas. (A) Δψm buvo aptiktas JC-1 dažymu, o mėginiai buvo analizuojami srauto citometrija. Atskiruose taškiniuose diagramose pavaizduoti JC-1 fluorescencijos pokyčiai. FL-1+ FL-2-/+ langelių dažniai pavaizduoti apatiniame skydelyje. ***P<0.001, compared with the control. (B) The changes in JC‑1 fluorescence were observed with an inverted fluorescence microscope. (C) The levels of cytochrome c and JNK were detected with western blot analysis. The different bands of JNK represent 54 and 46 kDa proteins. DMSO, dimethyl sulfoxide; CTPG-W, water-soluble phenylethanoid glycosides of C. tubulosa; JNK, c-Jun NH2-terminal kinase.

6 pav. ROS lygiai Eca-109 ląstelėse po apdorojimo CTPG-W ir CTPG-W antioksidacinis aktyvumas. (A) Eca-109 ląstelės buvo apdorotos skirtingomis koncentracijomis CTPG-W, o ROS lygiai buvo analizuojami srauto citometrija nurodytais laiko momentais. *P<0.05, **P<0.01 and ***P<0.001, compared with the control. (B) The free radical scavenging activity of CTPG-W was determined with a 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl assay. CTPG-W, water-soluble phenylethanoid glycosides of C. tubulosa; ROS, reactive oxygen species; MFI, mean fluorescence intensity.

CTPG-W poveikis tarpląstelinei ROS susidarymui.ROS gali sumažinti Δψm, kad sukeltų apoptozę (36). Norint ištirti, ar CTPG-W gali padidinti ROS gamybą, Eca-109 ląstelės buvo apdorotos skirtingomis CTPG-W koncentracijomis. Ląstelės buvo surinktos nurodytais laiko momentais ir nudažytos DCFH-DA. Intraląstelinės ROS gamyba Eca-109 ląstelėse buvo nustatyta srauto citometrija. Kaip parodyta 6A pav., 800 µg/ml CTPG-W žymiai padidino ROS gamybą nuo 2-6 val., o sumažėjo nuo 12-24 val. Be to, 400 µg/ml CTPG-W žymiai padidino ROS gamybą nuo 12-24 val. Be to, 200 µg/ml CTPG-W reikšmingai nepakeitė ROS gamybos. Dinaminiai ROS gamybos pokyčiai gali būti susiję su Eca{15}} ląstelių apoptoze. Taip pat buvo nustatyta, kad CTPG-W pasižymėjo laisvųjų radikalų šalinimo aktyvumu (6B pav.), kuris gali būti susijęs su sumažėjusia ROS gamyba Eca-109 ląstelėse, apdorotose 800 µg/ml CTPG-W po 12 val.

7 pav. Skaldytų kaspazių ir suskaldytų PARP lygiai po gydymo CTPG-W. Baltymai buvo išskirti iš Eca-109 ląstelių, apdorotų CTPG-W 24 valandas, o suskaldytų kaspazių ir suskaldytų PARP lygiai buvo nustatyti Western blot analize. DMSO, dimetilsulfoksidas; CTPG-W, vandenyje tirpūs feniletanoidiniai glikozidaiC. kanalėlių; PARP, poli (ADP-ribozės) polimerazė.

CTPG-W padidina kaspazės-3, kaspazės-7, kaspazės-9 ir PARP aktyvumą. Citochromo c išsiskyrimas dėl Δψm sumažinimo gali suaktyvinti kaspazės proteazes, kad sukeltų apoptozę (29, 30, 37). Po 24 valandų gydymo CTPG-W, kaspazės -3, 7, 8, 9 ir PARP aktyvacija buvo aptikta Western blot analize. Palyginti su kontroline medžiaga, suskaidytos kaspazės-9, suskaidytos kaspazės-7, suskaidytos kaspazės-3 ir suskaidytos PARP lygiai, bet ne skaldytos kaspazės{20 }}, buvo padidintos gydant CTPG, priklausomai nuo dozės (7 pav.). Šie rezultatai parodė, kad CTPG-W sumažino Δψm ir skatino citochromo c išsiskyrimą, kad suaktyvintų kaspazes, kurios sukelia Eca-109 ląstelių apoptozę.

Diskusija

Tradicinis CHM gali sukelti stemplės vėžio ląstelių apoptozę įvairiais būdais, įskaitant išorinį mirties receptorių ir vidinį mitochondrijų bei endoplazminio tinklo streso kelius (29). Mūsų ankstesnis tyrimas parodė, kad CTPG, kaip pagrindinis C. tubulosa komponentas, slopino melanomos B16-F10 ląstelių augimą, indukuodamas apoptozę nuo mitochondrijų priklausomu keliu (24). Šiame tyrime buvo ištirtas priešnavikinis CTPG-W poveikis Eca-109 ląstelėms ir nustatyta, kad CTPG-W slopina Eca-109 ląstelių augimą, sukėlė apoptozę ir ląstelių ciklo sustabdymą. sumažino Δψm, padidino citochromo c ir aktyvuotų kaspazių išsiskyrimą. CTPG ir CTPG-W gali sukelti apoptozę ir ląstelių ciklo sustabdymą vėžio ląstelėse. Tačiau tikslūs mechanizmai skiriasi dėl skirtingų CTPG (26,64 % echinakozido, 10,19 % akteozido ir 1,71 % izoakteozido) ir CTPG-W (39,16 % echinakozido ir 2,44 % akteozido) komponentų. CTPG sulaikė B16-F10 ląsteles G0/G1 fazėse, bet CTPG-W sulaikė Eca-109 ląsteles S fazėje (24). ROS gamyba buvo priklausomai nuo dozės padidinta vartojant CTPG, tačiau tai rodo, kad nuo laiko priklauso pokytis dėl didelės CTPG-W dozės, kuri žymiai padidėjo gydymo CTPG-W pradžioje (2-6 val.) ir žymiai sumažėjo po 12 valandų, palyginti su kontroline grupe. Galima priežastis yra ta, kad pagrindinis CTPG-W komponentas yra echinakozidas. Keli tyrimai pranešė, kad echinakozidas gali slopinti ROS gamybą ir ROS sukeltą apoptozę, kad galėtų turėti neuroprotekcinį ir senėjimą stabdantį poveikį (38-40). Panašiai, šiame tyrime buvo pastebėtas laisvųjų radikalų šalinimo aktyvumas. Todėl buvo spėjama, kad kai kurie komponentai, įskaitant verbaskozidą, izo-verbaskozidą ir salidrozidą, esantį didelėje CTPG-W dozėje, gali nedelsiant paskatinti ROS susidarymą ir sukelti Eca-109 ląstelių apoptozę (41, 42), o tada. ROS sunaikino echinakozidas. Kita galima CTPG ir CTPG-W ROS gamybos skirtumų priežastis yra ta, kad šiame ir ankstesniame tyrime buvo naudojamos skirtingos ląstelių linijos (24). Dong ir kt. (43) pranešė, kad echinakozidas gali sukelti žmogaus SW480 gaubtinės ir tiesiosios žarnos vėžio ląstelių apoptozę, sukurdamas oksidacinį DNR pažeidimą, nepadidindamas ROS.

Gydymas CTPG-W sumažino Δψm ir sukėlė citochromo c išsiskyrimą, kuris skatina kaspazės -9 skilimą (28). Nuosekliai suskaidytos kaspazės -9 lygis buvo padidintas gydant CTPG-W. Vėliau aktyvi kaspazė-9 gali suaktyvinti kaspazę-3, kad sukeltų apoptozę (44). Skaldytos kaspazės{10}} lygis taip pat buvo padidintas gydant CTPG-W. Tačiau kaspazės -8 neaktyvavo CTPG-W, o tai rodo, kad išorinis mirties receptorių kelias nebuvo susijęs su CTPG-W sukelta apoptoze. Šie stebėjimai rodo, kad CTPG-W sukelia Eca-109 ląstelių apoptozę aktyvindamas nuo mitochondrijų priklausomą kelią.

PARP vaidina svarbų vaidmenį užtikrinant genomo stabilumą ir gali būti skaidomas aktyvių kaspazių, ypač kaspazės -3 ir -7 (45). Nustatyta, kad gydymas CTPG-W aktyvavo kaspazę-3 ir -7, kurios gali suskaldyti PARP, kad slopintų DNR atstatymą ir sukeltų apoptozę.

CTPG-W taip pat, priklausomai nuo dozės ir laiko, slopina žmogaus kepenų ląstelių karcinomos BEL-7404 ląstelių augimą (neskelbti duomenys). Nors CTPG-W slopina Eca-109 ir BEL-7404 ląstelių augimą, jis skatina splenocitų dauginimąsi, o tai gali būti dėl polisacharidų kiekio (~50%) CTPG-W (46). ). Be to, keli tyrimai parodė, kad polisacharidai gali skatinti splenocitų dauginimąsi (46-49). Pelės modelyje nustatyta, kad CTPG-W reikšmingai padidino blužnies indeksą, palyginti su kontroline grupe, tačiau neturėjo įtakos kūno svoriui ir kitų organų indeksams, įskaitant širdį, kepenis, inkstus ir plaučius (neskelbti duomenys). tai rodo, kad CTPG-W neturi citotoksinio poveikio normalioms ląstelėms.

Visi duomenys parodė, kad CTPG-W slopina Eca-109 ląstelių augimą, indukuodamas apoptozę per nuo mitochondrijų priklausomą kelią.

NATŪRALUS CISTANCHE TUBULOSA LYTINEI FUNKCIJAI GERINTI PHGS75% ECH 30% ACT 12%