Chalcone sintazės iš Cistanche Tubulosa klonavimas, funkcinis identifikavimas ir ekspresijos analizė

Santrauka: Tikslas

Norėdami ištirti funkcijąchalkono sintazė iš Cistanche tubulosair CtCHS geno ekspresijos modelis baltose, raudonose ir violetinėse gėlėse.

MetodaiCtCHS genas buvo klonuotas RT-PGR ir atlikta bioinformatinė analizė. PET-28a-CtCHS plazmidė buvo perkelta į Escherichia coli, kad sukeltų baltymų ekspresiją IPTG. CtCHS rekombinantinis baltymas buvo inkubuojamas su substratais p-kumaroil CoA ir malonilo CoA, o produktai buvo aptikti HPLC ir MS. pCAMBIA1300-35S-GFP-CtCHS plazmidė buvo perkelta į Arabidopsis thaliana protoplastą, kad būtų galima stebėti CtCHS baltymo lokalizaciją tarpląstelėje. CtCHS geno ekspresijos modelis trijų spalvų C. tubulosa žieduose buvo aptiktas qRT-PGR.

RezultataiCtCHS genas buvo klonuotas. Atvirojo skaitymo rėmelio (ORF) ilgis buvo 1173 bp, koduoja 390 aminorūgščių, o baltymo molekulinė masė buvo 42 8000.

EKOLOGIŠKAS CISTANCANŲ EKSTRAKTAS, SU 30% ECHINAKOZIDU IR 12% AKTEOZIDU

CtCHS buvo katalizinės liekanos Cys164, His303, Asn336, kurios buvo konservuotos chalkono sintazėje. CtCHS baltymas buvo ekspresuojamas E. coli ir išgrynintas, kad gautų rekombinantinį baltymą. CtCHS baltymas gali katalizuoti p-kumaroilo CoA ir malonilo CoA, kad susidarytų naringenino chalkonas. CtCHS baltymas daugiausia buvo lokalizuotas citoplazmoje. CtCHS genas buvo labai išreikštas purpurinėse ir raudonose gėlėse, o santykinis ekspresijos lygis buvo atitinkamai 8, 44 ir 3, 21 karto didesnis nei baltose gėlėse.

Išvada Iš C. tubulosa žiedo buvo klonuotas CtCHS genas ir ekspresuojamas baltymas. CtCHS baltymas turi chalkono sintazės funkciją, o tamsesnėse gėlėse CtCHS geno ekspresija yra didesnė, o tai rodo, kad CtCHS genas gali reguliuoti C. tubulosa žiedų spalvą, o tai sudaro pagrindą tolesniems C žiedų spalvos reguliavimo mechanizmo tyrimams. .

Pagrindiniai žodžiai: Cistanche tubulosa (Schenk) Wight; chalkono sintazė; fermentų aktyvumo analizė; tarpląstelinė lokalizacija; išraiškos analizė

Cistanche Tubulosa(SCHENK) WIGHT yra pyreal augalų gentis, natūraliai paplitęs pietinėje Sindziango dalyje [1] Sindziango Hetiano srityje [2]. Vamzdžių gėlės turi didelę gydomąją vertę. Jo mėsos stiebai yra vienas iš 2020 m. versijos šaltinių.Kinijos farmakopėja". [3] Padaugėjo pypkių žiedų cordonus mėsos stiebų tyrimų, tačiau jų žiedų biologinių tyrimų atlikta palyginti nedaug. Vamzdžių žiedų žydėjimo laikotarpis yra nuo balandžio iki gegužės [4], daugiausia Yra trys baltos spalvos , raudonos ir violetinės spalvos ir genetiniai veiksniai [5]. Pigmentas augalų gėlėse daugiausia apima tris kategorijas: flavonoidus, karotiną ir beetiną, plačiausia spalvų diapazoną [7] kaip trys Paeonia Lactiflora Pall veislės.

Jis atrodo kaip baltas, o pagrindinėje spalvos spalvoje yra raudonos spalvos, o gražios kompetencijos dėka gėlės yra violetinės-raudonos [8]. Gėlių spalva yra svarbi daugelio dekoratyvinių augalų savybė, ji taip pat yra pagrindinis veiksnys, pritraukiantis rožinius vabzdžius [9]. Tyrimai parodė, kad jis perduodamas. Dažniausias vabzdžių apsilankymas yra giliai violetinis cistansinis augalas [10]. Biologiniams tyrimams, susijusiems su cistanoidų sintetiniais genetiniais vamzdžių gėlės cistanozauro žieduose, padeda išsiaiškinti vamzdžių žiedų kordono spalvos valdymo mechanizmą, suteikiant teorinį pagrindą genų inžinerijos technologijos spalvoms tobulinti, sodresnėms jos spalvoms skatinti, gerinti žiūrimumą, išplėsti taikomųjų programų sritį.

Biosintezės keliasflavonoidųprasideda nuofenilpropanoido kelias. Fenilalaninas pirmiausia paverčiamas cinamono rūgštimi, veikiant fenilalanino amonialiazei (PAL), o cinamono rūgštis 4-hidroksilinama cinamono rūgštimi. Fermentas (cinamono rūgšties-4-hidroksilazė, C4H) ir 4-kumarato kofermento A ligazė (4-kumarato kofermento A ligazė, 4CL) katalizuoja reakciją, kad susidarytų 4-kumaroil-CoA [11]. Vieną 4-kumaroil-CoA molekulę ir tris malonil-CoA molekules katalizuoja chalkono sintazė (CHS), kad susidarytų naringenino chalkonas,flavonoidiniai junginiai.Pagrindinis chalkono izomerazės, flavanono-3-hidroksilazės, dihidroflavonolio 4-reduktazės ir kt. skeletas gamina įvairius flavonoidus, tokius kaip izoflavonai, flavonoliai, antocianinai ir kt. [12]. Kaip pagrindinis fermentas flavonoidų biosintezės kelyje, CHS reguliuoja flavonoidų kiekį augaluose ir taip pat atlieka svarbų vaidmenį reguliuojant augalų žiedų spalvą [13]. Pavyzdžiui, Gentiana scabra Bunge CHS genų nutildymas po transkripcijos gali slopinti antocianinų biosintezę ir sukelti specifinį vainikinių skilčių balinimą [14]. CHS geno nutildymas Actinidia eriantha Benth. CHS sumažina antocianino kiekį žiedlapiuose ir sukelia. Raudonų žiedlapių spalva tampa šviesesnė [15]. Todėl šiame tyrime CtCHS genas buvo klonuotas iš Cistanche deserticola žiedų ir jame buvo atlikta bioinformatinė analizė, prokariotų ekspresija ir gryninimas, fermentų aktyvumo analizė, tarpląstelinės lokalizacijos analizė ir trijų spalvų gėlių ekspresijos analizė, siekiant ištirti CtCHS funkciją. baltymas ir CtCHS geno ekspresijos modelis buvo naudojami preliminariai ištirti CtCHS ir Cistanche deserticola gėlių spalvos ryšį, kuris padėjo pagrindą Cistanche deserticola gėlių spalvos reguliavimo mechanizmo tyrimui.

1 Medžiagos ir instrumentai

1.1 Medžiagos

Cistanche tuberosa žiedai buvo surinkti iš Yutian apskrities, Hotano prefektūros, Sindziango 2018 m. gegužės mėn. Imant mėginius buvo vadovaujamasi atsitiktiniu principu ir buvo atrinktos geros fiziologinės būklės ir pastovaus augalo aukščio Cistanche tuberosa žiedai. Pekino universiteto Farmacijos mokyklos profesorius Tu Pengfei paėmė tris Cistanche deserticola padermes su trimis baltos, raudonos ir violetinės spalvos žiedais ir identifikavo juos kaip Cistanche tubulosa (Schenk) Wight. Jie buvo greitai užšaldyti skystame azote, laikomi ant sauso ledo ir gabenami į Pekiną. E. coli DH5 chemiškai kompetentingos ląstelės buvo įsigytos iš Nanjing Novezan Biotechnology Co., Ltd., o E. coli BL21 (DE3) chemiškai kompetentingos ląstelės buvo nupirktos iš Beijing Quanshijin Biotechnology Co., Ltd.; pET-28a, pCAMBIA1300-35S-GFP Vektorius buvo pirktas iš Wuhan Transduction Biology Laboratory Co., Ltd. Malonyl-CoA pirktas iš Sigma Company, 4-kumaroil-CoA, naringeninas - chalkonas buvo nupirktas iš Shanghai Yuanye Biotechnology Co., Ltd., o naringeninas - iš Shanghai McLean Biochemical Technology Co., Ltd.

1.2 Prietaisai

Nanodrop 2000C spektrofotometras (Thermo Fisher Company, JAV); gradiento PGR instrumentas (Eppendorf Company, Vokietija); CFX 96 fluorescencinis kiekybinis PGR prietaisas, UVP gelio vaizdavimo įrenginys, gelio elektroforezės prietaisas, baltymų elektroforezės prietaisas (BioRad Company, JAV); EnSpire

Mikroplokštelių skaitytuvas („PerkinElmer Company“, JAV); pastovios temperatūros inkubatorius (Shanghai Jinghong Experimental Equipment Co., Ltd.); DHZ-D didelės talpos visos temperatūros osciliatorius (Taicang Experimental Equipment Factory); THZ-82Vandens vonios pastovios temperatūros osciliatorius (Jiangsu Kexi Instrument Co., Ltd.); AIRTECH itin švarus darbastalis (Suzhou Antai Air Technology Co., Ltd.); aukšto slėgio garų sterilizatorius („TOMY Company“, Japonija); Milli Q gryno vandens instrumentas (Millipore, JAV); LC-20Aukšto efektyvumo skysčių fazės chromatografas (Shimadzu Company, Japonija); UPLC-Q-Exactive-Orbitrap didelės skiriamosios gebos masių spektrometrija (Thermo Fisher Company, JAV); FV1200 lazerinis konfokalinis mikroskopas (Olympus Company, Japonija).

2 Eksperimentiniai metodai

2.1 RNR ekstrahavimas ir cDNR sintezė. Cistanche deserticola gėlės buvo sumaltos skystame azote ir po to tiriamos RNR ekstrahavimo testas.

Bendra RNR buvo ekstrahuota naudojant rinkinį (Norgen, Cat 17200), RNR koncentracija ir kokybė buvo aptikta NanoDrop 2000C, o RNR mėginiai, kurių A260/A280 santykis yra nuo 1,8 iki 2,1, buvo atrinkti atvirkštinei cDNR transkripcijos sintezei. M-MLV atvirkštinė transkriptazė (Promega, M170B) buvo naudojama kvalifikuotai bendrai RNR atvirkštiniam perrašymui į cDNR. Eksperimentinės operacijos buvo atliekamos pagal instrukcijas.

2.2 CtCHS geno klonavimas

Remiantis mūsų tyrimų grupės Cistanche deserticola gėlių transkripto duomenimis [16], buvo atrinktas CtCHS su visu atviru skaitymo rėmeliu, o SnapGene programinė įranga buvo naudojama specifiniams pradmenims pagal genų seką sukurti (1 lentelė). PGR amplifikacija buvo atlikta naudojant Cistanche deserticola gėlių cDNR kaip šabloną. Amplifikacijos sistema buvo 2 × Phanta Max Buffer 25 μL, dNTP Mix (10 mmol/L) 1 μL, prieš ir pasroviniai pradmenys (10 μmol/L) po 2 μL, cDNR 2 μL, Phanta Max Super Fidelity

DNR polimerazė 1 μL, ddH2O 17 μL. Reakcijos sąlygos buvo: išankstinis denatūravimas 95 laipsnių temperatūroje 3 min.; 25 denatūravimo ciklai 95 laipsnių temperatūroje 15 s, atkaitinimo 55 laipsnių temperatūroje 15 s ir pratęsimo 72 laipsnių temperatūroje 1 min.; ir reakcijos pratęsimas 72 laipsnių temperatūroje 5 min. PGR produktas buvo aptiktas 1 % agarozės gelio elektroforeze, o DNR gryninimo rinkinys (Novizan, Cat DC301-01) buvo naudojamas geliui atgauti, o po to gauta DNR buvo išgryninta greitojo klonavimo rinkiniu (Novizan, Cat. C601-01). DNR fragmentas buvo susietas su pCE2 TA/Blunt-Zero vektoriumi, transformuotas į Escherichia coli DH5 kompetentingas ląsteles ir po kultivavimo per naktį 37 laipsnių temperatūroje buvo atrinktos vieno klono padermės ir išsiųstos į bendrovę sekvenavimui.

1 lentelė Pradmenų sekos

2.3 Bioinformatinė analizė

Naudokite ProtParam internetinę programinę įrangą baltymų fizinėms ir cheminėms savybėms analizuoti; naudoti Prot Scale internetinį įrankį baltymų hidrofiliškumui/hidrofobiškumui analizuoti; naudoti internetinį įrankį SOPMA baltymų antrinei struktūrai numatyti; naudoti internetinę analizės programinę įrangą SWISS-MODEL, kad būtų galima numatyti baltymų tretinę struktūrą; naudoti internetinę programinę įrangą TMHMM Nuspėti transmembraninę baltymo struktūrą; naudoti DNAMAN programinę įrangą, kad palygintumėte CtCHS homologiją su kitų rūšių CHS aminorūgščių sekomis; naudokite MEGA-X programinę įrangą filogenetiniam medžiui konstruoti, naudojant kaimynų sujungimą (NJ) ir Puasono korekciją. Evoliucinis atstumas apskaičiuojamas naudojant Bootstrap metodą, o Bootstrap pakartojimų skaičius yra 1000 kartų.

Tolesniam aptikimui buvo naudojamas UPLC-Q-Exactive-Orbitrap MS. Skystos fazės sąlygos buvo Waters Acquity UPLC BEH Sheild RP18 kolonėlė (100 mm × 3.0 mm, 1,7 μm), kolonėlės temperatūra 40 laipsniai, naringeninas , chalkonas ir naringeninas. Kontrolinės medžiagos įkrovimo tūris yra 4 μL, o fermento reakcijos produkto įkrovimo tūris yra 7 μL. Vanduo (A)-acetonitrilas (B) naudojamas kaip judanti fazė. Eliuavimo gradientas yra: nuo 0 iki 5 min., 30% B; nuo 5 iki 15 min. , 30% ~ 60% B; 15-20 min., 60%~100% B; 20–25 min., 100 % B; 25-31 min., 100%~30% B. Tūrinis srautas yra 0,3 ml/min. Masių spektrometrijos sąlygos yra elektropurškimo jonų šaltinis, azotas kaip nešančiosios dujos, apvalkalo dujų slėgis 3,5 MPa, pagalbinių dujų slėgis 1,0 MPa, purškimo slėgis 3500 V, kapiliarų temperatūra 350 laipsnių, pagalbinių dujų šildymo temperatūra 200 laipsnių, teigiamų ir neigiamų jonų režimai, skenavimas jonų diapazonas m/z yra 100-1500, visa MS skiriamoji geba yra 35 000, dd-MS2 skiriamoji geba yra 17 500, (N)

CE/pakopinis nce nustatytas į 35, 60.

2.6 CtCHS baltymo lokalizacija tarpląstelėje

Remiantis CtCHS seka ir besiūlio klonavimo principu, buvo sukurti pradmenys su fermentų pjovimo vietomis Kpn Ⅰ ir BamH Ⅰ, o atitinkami tiksliniai fragmentai buvo amplifikuoti PGR. pCAMBIA1300-35S-GFP plazmidė buvo suardyta restrikcijos endonukleazėmis Kpn Ⅰ ir BamH Ⅰ, o tikslinis fragmentas ir vektorius buvo sujungti per besiūlį klonavimo rinkinį (Novizan, Cat C115-01), o tada perkelta. į E. coli DH5 kompetentingas ląsteles. , atrinkti atskirų klonų padermes sekvenavimui ir iš atitinkamų padermių išgauti plazmides. Plazmidės pCAMBIA1300-35S-GFP-CtCHS ir pCAMBIA 1300-35S-GFP buvo transformuotos į Arabidopsis thaliana protoplastus naudojant PEG4000 ir kultivuojamos esant silpnam apšvietimui 8–10 valandų. CtCHS baltymo subląstelinė lokalizacija buvo stebima lazeriniu konfokaliniu mikroskopu.

2.7 CtCHS išraiškos modelio analizė

Remiantis CtCHS seka, DNAMAN buvo naudojamas realaus laiko fluorescencijos kiekybiniams pradmenims projektuoti su F-box kaip vidiniu etaloniniu genu. Pradmenų sekos parodytos 1 lentelėje. Santykinė CtCHS ekspresija skirtingų spalvų Cistanche deserticola žieduose buvo aptikta realaus laiko fluorescencine kiekybine PGR. Naudokite TransStart Green qPCR SuperMix (visas auksas, AQ101-02), kad pamatytumėte SYBR Green fluorescencinių dažų metodu, reakcijos sistema: 2×TransStart Green qPCR SuperMix 5 μL, pradmenys prieš ir pasroviui (10)

m Dong Xianjuan ir kt. [18]. Kiekviename mėginyje buvo 3 biologiniai pakartojimai ir eksperimentas buvo pakartotas tris kartus. Eksperimentiniai duomenys buvo analizuojami naudojant Excel to 2

Santykinė CtCHS išraiška buvo apskaičiuota naudojant −ΔΔCt metodą, o GraphPad Prism 8 naudota reikšmingumo analizei atlikti ir histogramoms braižyti.