Komplemento aktyvumą sergant C3 glomerulopatija reguliuoja IgG faktoriaus H sulieti baltymai su Properdin tiksliniais domenais ir be jų

Kontaktas:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Alyssa C. Gilmore, Yuchun Zhang, H. Terence Cook, Deborah P. Lavin, Suresh Katti, YiWang2, Krista K. Johnson, SungKwon Kim² ir Matthew C. Pickering

„Uždegiminių ligų centras, Londono imperatoriškasis koledžas, JK; and²Alexion Pharmaceuticals, New Haven, Konektikutas, JAV

C3 glomerulopatijabūdingas komplemento C3 kaupimasis glomeruluose. Priežastys apima, bet tuo neapsiribojant, H faktoriaus, pagrindinio neigiamo alternatyvaus komplemento kelio reguliatoriaus, anomalijas. Pelėms, kurioms trūksta H faktoriaus (Cfh-/-), išsivysto C3glomerulopatijakartu su C3 koncentracijos plazmoje sumažėjimu. Naudodami šį modelį įvertinome dviejų sulietų baltymų, turinčių H faktoriaus alternatyvaus kelio reguliavimo domenus (FH1-5), veiksmingumą.

susietas arba su netiksliniu pelės imunoglobulinu (IgG-FH1-5) arba su antikūnu prieš pelės propidiną (Anti-P-FH1-5). Abu baltymai padidino C3 plazmoje ir sumažino C3 nusėdimą glomeruluose lygiaverčiu mastu, o tai rodo, kad FH1-5 nereikėjo taikyti tinkamo dino, kad pakeistų C3 aktyvaciją nei plazmoje, nei glomeruluose. Paskyrus IgG-FH1-5, C3 koncentracija plazmoje laikinai koreliavo su B faktoriaus koncentracijos pokyčiais, o C5 koncentracija plazmoje – su plazmos megfelelődino kiekio pokyčiais. Visų pirma, plazmos padidėjimas

C5 ir propedino koncentracija išliko ilgiau nei C3 ir faktoriaus B padidėjimas. Cfh-/- pelėms IgG-FH1-5 sumažino inkstų pažeidimą paūmėjus serumo nefrotoksiniam nefritui. Taigi, mūsų duomenys rodo, kad IgG-FH1-5 atkūrė cirkuliuojančio alternatyvaus kelio aktyvumą ir sumažino Cfh-/- pelių glomerulų C3 nusėdimą, o plazmos procidino kiekis yra jautrus C5 konvertazės aktyvumo žymuo, kai trūksta H faktoriaus. Imunoglobulinu konjuguotas FH1-5 baltymas dėl savo palyginti ilgo pusinės eliminacijos laiko plazmoje gali būti galimas C3 gydymas.glomerulopatija.

Cistanche gali padėti sergant glomerulopatija

Vertimo pareiškimas

C3 glomerulopatija(C3G) yra inkstų liga, kuriai būdingas nenormalus komplemento C3 kaupimasis glomeruluose ir glomerulų pažeidimas. Taip yra dėl nekontroliuojamo alternatyvaus komplemento kelio aktyvavimo. Sulieti baltymai, sudaryti iš alternatyvaus kelio reguliatoriaus, faktoriaus H (FH), funkcinių domenų, susietų su antikūnu, atkūrė komplemento reguliavimą ir sumažino glomerulų C3 C3G pelės modelyje. Dėl netikslinio antikūnų konjugacijos buvo palyginti ilgas sulieto baltymo pusinės eliminacijos laikas plazmoje, ir šis arba panašūs konjugacijos metodai gali būti naudojami FH funkcijai padidinti gydant C3G.

C3 glomerulopatija(C3G) yra komplemento sukeltas inkstų sutrikimas, kuriam būdingas nenormalus C3 kiekis glomeruluose.1 Jis gali progresuoti iki inkstų nepakankamumo ir nebūna galutinai gydomas.2 C3G yra susijęs su nenormaliu komplemento alternatyvaus kelio (AP) aktyvavimu. Dėl AP aktyvinimo susidaro C3bBb (C3 konvertazė), fermentas, skaldantis C3. Pridėjus kitą C3b molekulę, susidaręs C3bBbC3b kompleksas (C5 konvertazė) gali suskaidyti komplementą C5. Nekontroliuojamas

AP aktyvacija C3G gali būti susijusi su cirkuliuojančių C3, C5, B faktoriaus (FB) ir propedino kiekio sumažėjimu. Nekontroliuojamos AP aktyvacijos priežastys yra komplemento reguliatorių funkcijų pokyčių praradimas ir komplemento aktyvatorių funkcijų pokyčių padidėjimas.2 Pagrindinis neigiamas AP reguliatorius yra faktorius H (FH), o FH trūkumas žmonėms, kiaulėms ir pelėms yra susijęs su C3G. 3 C3 nefritinis faktorius, antikūnas, stabilizuojantis AP C3 konvertazę, yra dažnas C3G.4 C3 nefritinis faktorius gali sumažinti vien tik C3 (nuo tinkamo C3 nefritinio faktoriaus) arba sumažėti ir C3, ir C5 (properdin- priklausomas C3 nefritinis faktorius).5,6

Nors procedino trūkumas nepagerino C3 koncentracijos plazmoje, C5 kiekis padidėjo, o tai rodo, kad propedinas buvo būtinas C5, bet ne C3 konvertazės veiklai.8,9

Pelės10 arba žmogaus FH11,12 skyrimas Cfh–/– pelėms sumažino glomerulų C3 dažymąsi ir padidino cirkuliuojančio C3 lygį. Šiame modelyje taip pat veiksmingos konstrukcijos, kuriose yra tik FH reguliavimo ir tikslinės domenai (mini-FH molekulės).13 Kiti metodai apima baltymus, nukreiptus į komplemento aktyvacijos vietas. Tai apima TT30,14 baltymą, turintį FH (FH1-5) komplemento reguliavimo domenus, susietus su komplemento receptoriaus 2 komplementą surišančiais domenais, ir homodimerines FH molekules, 15 mini-FH molekulių, kuriose yra komplementą surišančių domenų. su faktoriumi H susijusio baltymo 1.

Kadangi C3G komplemento C3 aktyvacijos slopinimo terapinis naudingumas yra tiriamas, svarbu suprasti glomerulų C3 nusėdimo kinetiką ir jos ryšį su AP aktyvacija tiek glomeruluose, tiek kraujotakoje. Imuninio komplekso sukelto glomerulonefrito modeliuose glomerulų C3c pasišalino per 24 valandas nuo komplemento aktyvacijos prevencijos, o glomerulų C3d išliko kelias savaites.16 Panašiai, Cfh–/– pelėms dėl egzogeninio FH sumažėja glomerulų C3c dažymas po 24 valandų. , tuo tarpu glomerulinis C3d išlieka nepakitęs.11

Šiame tyrime mes ištyrėme 2 naujų sulietų baltymų, turinčių komplemento reguliavimo aktyvumą, veiksmingumą Cfh–/– pelės C3G modelyje. Baltymai turėjo pelės FH (FH1-5) reguliavimo domenus, kurie buvo konjuguoti su pelės Ig, kad pailgėtų biologinis pusinės eliminacijos laikas. Vienas iš sulietų baltymų, vadinamas IgG-FH1-5, buvo konjuguotas su netiksliniu pelės monokloniniu antikūnu. Kitas, vadinamas anti-P-FH1-5, buvo konjuguotas su monokloniniu antikūnu prieš pelės propidiną. Tai buvo padaryta siekiant patikrinti hipotezę, kad šio sulieto baltymo nukreipimas į komplemento aktyvacijos vietas, sąveikaujant su megfelelődino nusėdimu, sustiprintų audinių komplemento reguliavimą. Mūsų duomenys rodo, kad tiek netaikantieji (IgG-FH1-5), tiek į produkciją nukreipiantys (anti-P-FH1-5) baltymai atkūrė Cfh–/– pelių plazmos ir glomerulų C3 reguliavimą. Laiko trukmės tyrimai parodė, kad C3 ir FB lygių atkūrimas atspindėjo sulietų baltymų kiekį kraujyje. Priešingai, plazmos C5 padidėjimas išliko po to, kai sulieti baltymai buvo pašalinti iš kraujotakos. Parodome, kad IgG-FH1-5 palengvino glomerulų pažeidimą Cfh–/– pelių pagreitėjusio serumo nefrotoksinio nefrito metu.

cistanche gali gydyti inkstų ligas, pagerinti inkstų funkciją

REZULTATAI

Sulietų baltymų generavimas ir aktyvumo įvertinimas in vitro ir in vivo Sulieti baltymai buvo sukurti susiejant pirmuosius 5 trumpus konsensuso kartotinius (SCR) pelės FH (FH1-5) domenus su antikūnu prieš pelės propidiną (anti. -P-FH1-5) arba antikūnas su netiksliniu Ig domenu (IgG-FH1- 5, papildomas S1 paveikslas). Baltymų aktyvumas buvo įvertintas naudojant AP specifinį hemolizinį tyrimą (1a pav.). Anti-P-FH1-5 ir IgG-FH1-5 slopino hemolizę priklausomai nuo dozės, o anti-P-FH1-5 buvo stipresnis. Anti-properdinas (anti-P) taip pat sumažino hemolizę priklausomai nuo dozės, tačiau IgG kontrolė neturėjo jokio poveikio. Po ekvimolinių baltymų injekcijų Cfh–/– pelėms, IgG-FH1-5 baltymas buvo aptinkamas iki 11 dienų po injekcijos, o anti-P-FH1-5 buvo aptinkamas iki 4 dienų po injekcijos. injekcija (papildomas S2 paveikslas). Norėdami nustatyti, ar IgG-FH1-5 ir anti-P-FH1-5 gali atkurti Cfh–/– pelių plazmos AP reguliavimą, pirmiausia išmatavome C3 koncentraciją plazmoje po sulietų baltymų injekcijos (1b pav.). . Paskyrus IgG-FH1-5 arba anti-P-FH1-5, praėjus 24 valandoms ir kiek mažesniu mastu, praėjus 96 valandoms po injekcijos, plazmos C3 reikšmingai padidėjo (1b pav.). Šie duomenys parodė, kad tiek IgG-FH1-5, tiek anti-P-FH1-5 gali laikinai atkurti plazmos AP reguliavimą Cfh–/– pelėms. Toliau atlikome išsamią šių pokyčių analizę, apibūdindami ne tik plazmos C3, bet ir plazmos C5 bei alternatyvaus kelio baltymų FB ir megfelelődino pokyčių laiką. Cfh–/– pelėms suleidus IgG-FH1-5 ir anti-P-FH1-5, cirkuliuojančio C5 ir propidino koncentracijos padidėjimas išlieka ilgiau nei C3 ir FB padidėjimas.

Palyginome C3, C5, FB ir megfelelődino pokyčių kinetiką, matuodami baltymus kas 27 dienas po vienos IgG-FH1-5 arba anti-P-FH1-5 injekcijos ( 2 pav.). Paskyrus IgG-FH{10}}, didžiausias C3, C5, FB ir megfelelődino padidėjimas įvyko 1 dieną po injekcijos. Laikas, per kurį šie pokyčiai sumažės iki prieš gydymą buvusio lygio, skyrėsi. Grąžinimas į pirminio gydymo lygį įvyko tarp 1 ir 4 dienų FB, nuo 7 iki 11 dienų C3 ir nuo 14 iki 21 dienų tiek procedinui, tiek C5 (2a, c, e ir g paveikslai). Paskyrus anti-P-FH1-5, didžiausias C3 lygis buvo 1 dieną, bet nukrito iki lygio prieš gydymą tarp 4 ir 7 dienų (2b pav.). Didžiausias C5 lygis atsirado 4 dieną ir grįžo į prieš gydymą buvusius lygius nuo 7 iki 11 dienų (2d pav.). Didžiausias FB padidėjimas įvyko 1 dieną ir sumažėjo iki priešgydymo lygio tarp 1 ir 4 dienų (2f pav.). Kaip ir tikėtasi, po anti-P-FH1-5 arba anti-P injekcijos laisvo plazmos megfelelődino kiekis buvo išeikvotas (2h pav.). Laisvo propidino koncentracija plazmoje išliko žema iki 7 dienų po anti-P-FH{50}} ir iki 14 dienų po anti-P (2h pav.). Nors abu sulieti baltymai laikinai atkūrė plazmos AP reguliavimą, C3, FB ir C5 lygių pagerėjimo trukmė atspindėjo jų aptikimo plazmoje trukmę, kuri buvo trumpesnė anti-P-FH1-5 (papildomas S2 paveikslas) . Apibendrinant galima pasakyti, kad C3 ir FB lygių pokyčiai po kurio nors baltymo injekcijos buvo trumpesni nei C5 ir propidino. Šie duomenys rodo, kad plazmos FB yra jautrus C3 konvertazės aktyvumo žymuo šioje aplinkoje, o propidinas yra C5 konvertazės aktyvumo žymuo. Pažymėtina, kad po anti-P injekcijos C5 padidėjo 24 ir 96 valandas ir 7 dieną

1 pav.| a) Papildykite alternatyvų nuo kelio priklausomą hemolizės tyrimą. Antikūnai buvo titruoti 2-kartais praskiedimais nuo 60 nM iki 0,5 nM. IgG-FH1-5, anti-P-FH1-5 ir anti-P reagentai sumažino triušio eritrocitų hemolizę priklausomai nuo dozės. IgG kontrolinis baltymas slopinamas nebuvo. Horizontalios juostos žymi vidutines reikšmes, o klaidų juostos – SD. (b) Cfh–/– pelių plazmos komplementas C3 po sulietų baltymų injekcijos. Plazmos C3 buvo matuojamas prieš ir 24 valandas bei 96 valandas po IgG-FH1-5 (raudoni trikampiai, n ¼ 5) Anti-P-FH1-5 (violetinės trikampės, n ¼ 6), anti -P (žalieji taškai, n ¼ 5) ir IgG kontrolė (mėlyni taškai, n ¼ 5). Horizontalios juostos žymi vidutines reikšmes, o ūsai – SD. ***P # 0,001, palyginti su išankstinio apdorojimo verte ir gauta iš 2-būdo ANOVA su Bonferroni kelių palyginimų testu. FH, faktorius H; P, propedinas.

(2d pav.). Kaip pranešta, 8, 9 rodo, kad Cfh–/– pelių C5 konvertazė priklauso nuo propidino.

IgG-FH1-5 ir anti-P-FH1-5 sumažino glomerulų C3c, bet nepakeitė C3d dažymo Cfh–/– pelėms

Toliau įvertinome IgG-FH1-5 ir anti-P-FH1-5 įtaką glomerulų C3b/iC3b/C3c, C3d, propedinui ir su FH susijusiems (FHR) baltymams. Praėjus 96 valandoms po IgG-FH1-5 injekcijos, glomerulų C3b/iC3b/C3c dažymas sumažėjo, bet glomerulų C3d (3a pav.) ir FHR dažymas (3b pav.) – ne. Glomerulinis C3b/iC3b/C3c išliko nepakitęs naudojant IgG kontrolę arba anti-P. Nenormalus linijinis glomerulų prodino dažymo modelis neapdorotose Cfh–/– pelėse9 išliko 96 valandas po IgG kontrolės. Cfh–/– pelėms, kurioms buvo sušvirkšta anti-P arba IgG-FH1-5, glomerulų propedino kiekis buvo beveik nenustatomas po 96 valandų (3b pav.). Netikėtai suleidus anti-P-FH1-5, naudojant anti-properdin, anti-FH/FHR ir anti-IgG antikūnus, susidarė granuliuotas glomerulų dažymas (3b pav.). Šis atradimas leido manyti, kad anti-P-FH1-5 baltymas nusėdo glomeruluose. Sušvirkštus anti-P-FH1-5 baltymo laukinio tipo pelėms, po 96 valandų glomerulų dažymas anti-properdin, anti-FH/FHR ir anti-IgG antikūnais (papildomas S3 paveikslas). reagentas sąveikauja su įprastais glomerulais. Tačiau spėliojome, kad anti-P-FH1-5 baltymas taip pat gali sąveikauti su Cfh–/– pelių jau egzistuojančiu glomerulų propedinu. Sušvirkštus reagento Cfh–/– pelėms, kurios buvo iš anksto apdorotos anti-P, kad pašalintų glomerulų properdiną, sumažėjo granulių dažymosi modeliai, naudojant anti-properdin, anti-FH/FHR ir anti-IgG antikūnus ( Papildomas paveikslas S4). Šie stebėjimai rodo, kad anti-P-FH1-5 baltymo glomerulų sąveika Cfh–/– pelėse iš dalies priklauso nuo glomerulų propedino.

IgG-FH1-5 pagerino inkstų pažeidimą dėl pagreitėjusio nefrotoksinio nefrito Cfh–/– pelėms

Pacientams, sergantiems C3G, ūminis inkstų pažeidimas gali išsivystyti dėl tarpinių infekcijų. Pavyzdžiui, inkstų funkcijos praradimas sergant FHR5 nefropatija yra susijęs su sinfaringinės makroskopinės hematurijos epizodais.17 Dėl pagrindinės C3 reguliavimo disreguliacijos C3G pacientams gali padidėti komplemento sukeltas inkstų pažeidimas po trigerio, sukeliančio inkstų uždegimą. Norėdami tai modeliuoti, mes sukėlėme pagreitintą serumo nefrotoksinį nefritą, imuninį kompleksą

2 pav| Plazmos komplemento profilio trukmė Cfh–/– pelėms, kurioms buvo suleista IgG-FH1-5 ir anti-P-FH1-5. Plazma C3 (a,b), C5 (c,d), FB (e,f) ir propedinas (P; g,h) nuo eksperimento pradžios iki 27 dienų po vienos IgG-FH{{1{{21 }}}} (a, c, e, g; raudoni trikampiai, n ¼ 5) arba anti-P- FH1-5 (b, d, f, h; purpuriniai trikampiai, n ¼ 6). Kontrolė apėmė anti-P (žalieji taškai, n ¼ 5) ir izotipą atitinkantį monokloninį antikūną (IgG kontrolė; mėlyni taškai, n ¼ 5). Horizontalios juostos žymi vidutines reikšmes, o ūsai – SD. *P # 0.05, **P # 0,01, ***P # 0,001, palyginti su išankstinio apdorojimo verte ir gauta iš 2-variacijos analizės naudojant Bonferroni kelių palyginimų testą. FB, faktorius B; FH, faktorius H.

glomerulonefrito modelis, apimantis komplemento ir Fc receptorių sukeltus kelius, 18, 19 Cfh–/– pelėms. Anksčiau parodėme, kad Cfh–/– pelės yra itin jautrios inkstų pažeidimui, ir iškėlėme hipotezę, kad FH1-5 baltymas, stiprindamas AP reguliavimą, gali pagerinti komplemento sukeltą inkstų pažeidimą šiame modelyje. Kadangi mūsų duomenys parodė, kad anti-P-FH1-5 baltymas buvo nusėdęs normaliuose glomeruluose, mes naudojome IgG-FH1-5 pagreitėjusio serumo nefrotoksinio nefrito metu. Likus 24 valandoms iki avių nefrotoksinio serumo injekcijos, pelėms į veną buvo sušvirkšta arba IgG kontrolinė (n ¼ 7) arba IgG-FH1-5 (n ¼ 8). Eksperimento protokolas pavaizduotas 4a paveiksle. Pelės buvo sunaikintos praėjus 6 dienoms po avių nefrotoksinio serumo suleidimo. Visi 3 histologiniai glomerulų patologijos rodikliai (sunkumo balas, bendras ląstelių skaičius ir makrofagų skaičius) buvo žymiai mažesni IgG-FH1-5 grupėje (4b pav.). Tubulointersticinis pažeidimas taip pat buvo mažesnis IgG-FH1-5 grupėje (4b pav.). Šlapalo kiekis serume buvo žymiai padidėjęs

3 pav.| Glomerulinio komplemento imuninis dažymas Cfh–/– pelėms praėjus 96 valandoms po IgG-FH1-5 arba anti-P-FH1-5 injekcijos. a) Reprezentatyvūs vaizdai kartu su glomerulų C3b/iC3b/C3c ir C3d kiekybiniu įvertinimu 4 eksperimentinėse grupėse: IgG-FH1-5 (raudoni trikampiai, n ¼ 5), anti-P-FH1-5 (purpuriniai trikampiai, n ¼ 6), anti-P (žali taškai, n ¼ 5) ir IgG kontrolė (mėlyni taškai, n ¼ 5).PlazmosC3 lygis 1 pav. (b) Duomenų taškai reiškia vidutines reikšmes, o ūsai reiškia tarpkvartilinį diapazoną. P reikšmės, gautos iš Kruskal-Wallis testo su Dunn kelių palyginimų testu. (b) Reprezentatyvūs glomerulų IgG, FHR ir dažymo 4 eksperimentinėse grupėse vaizdai. Juosta ¼ 100 mm. AFU, savavališki fluorescenciniai vienetai; FH, faktorius H; P, propedinas. Norėdami optimizuoti šio vaizdo peržiūrą, žr. šio straipsnio internetinę versiją adresuwww.kidney-international.org.

IgG kontrolinė grupė, tačiau serumo albumino ir šlapimo albumino ir kreatinino santykio pokyčiai nesiskyrė (4b pav.). Kaip ir tikėtasi, glomerulų C3b/iC3b/C3c IgG-FH1-5 grupėje (4b pav.) žymiai sumažėjo, tačiau glomerulų pelių IgG (4b pav.) ir avių IgG (duomenys nerodomi) grupėse nesiskyrė. .

4 pav.| Išankstinis gydymas IgG-FH1-5 sumažino inkstų pažeidimą Cfh–/– pelių pagreitėjusio nefrotoksinio nefrito metu. a) Pagreitinto serumo nefrotoksinio nefrito protokolo schema. Pelės, iš anksto imunizuotos avių IgG, gavo arba IgG-FH1-5 (gydomoji grupė, n ¼ 8) arba IgG kontrolinė grupė (kontrolinė grupė, n ¼ 7) 24 valandas prieš skiriant avių nefrotoksinį serumą. (b) Inkstų funkcija ir histologija praėjus 6 dienoms po pagreitėjusio serumo nefrotoksinio nefrito sukėlimo pelėms, gydomoms IgG-FH1-5 (gydymas; raudoni trikampiai, n ¼ 8) arba IgG kontrole (kontrolė; mėlyni apskritimai, n). ¼ 7). Horizontalios juostos žymi vidutines vertes, o ūsai – tarpkvartilinį diapazoną. *P # 0.05, **P # 0,01, ***P # 0,001, palyginti su kontrole ir gauta iš Mann-Whitney testo. FH, faktorius H; P, propedinas.

DISKUSIJA

Tiek IgG-FH1-5, tiek anti-P-FH1-5 Cfh–/– pelių C3, FB ir C5 lygius normalizavo. Šis atradimas atitinka faktą, kad pelės FH komplemento reguliavimo domenai yra SCR domenuose nuo 1 iki 5 (C3b surišimo vieta ir kofaktoriaus aktyvumas I faktoriaus sukeltam C3b skilimui).20 Paviršiaus atpažinimo domenai, kurie įtakoja prisijungimą prie heparino ir endotelio ląstelių ir turi antrą C3b surišimo vietą, yra SCR domenuose nuo 18 iki

20 (FH18-20), todėl jų nėra sulietuose baltymuose.20 Nepaisant to, abu baltymai sumažino glomerulų iC3b/C3b/C3c, o tai rodo, kad FH18-20 šiuo atveju nereikalingas. Šis atradimas atitinka ankstesnius duomenis, rodančius, kad Cfh–/– pelėms, ekspresuojančioms mutantinį FH baltymą, sudarytą iš 1–15 SCR domenų (Cfh–/– .FHD16-20), nenormalus glomerulų C3 nusėdimas.21,22 Tačiau Cfh–/–.FH D16-20 gyvūnai nesugebėjo reguliuoti C3 aktyvacijos inkstų endotelyje ir jiems išsivystė trombozinė mikroangiopatija. Gali būti, kad dėl to, kad trūksta į paviršių nukreiptų FH18-20 domenų, sulietų baltymų, kurių sudėtyje yra FH1-5 FH trūkumas, vartojimas gali sukelti jautrumą trombozinei mikroangiopatijai. Taip pat gali būti, kad padidėjęs C3b surišimo avidumas, esant dimerinei sulietų baltymų struktūrai, yra pakankamas, kad kompensuotų į paviršių nukreiptų FH18-20 domenų nebuvimą. Tačiau C3b paviršiaus atpažinimui įtakos turi ir FH konformaciniai pokyčiai.23 Streptococcus pneumoniae FH surišantis baltymas (PspCN, jungiantis SCR domeną 9), sukelia FH konformacinį pokytį, o FH-PspCN kompleksas padidino C3b surišimą ir sustiprintas irimą greitinantis aktyvumas. FH20 C3d surišimo vieta nėra veikiama FH, bet tampa atvira FH-PspCN komplekse. Tai gali paaiškinti, kodėl FH19-20 sąveikauja su paviršiumi C3d, o FH – ne.24,25 Mes spėliojame, kad mūsų agentai dėl konformacinių pokyčių gali veiksmingai sąveikauti tiek su skysta faze, tiek su paviršiumi C3b. Pažymėtina, kad tiek IgG-FH1-5, tiek anti-P-FH1-5 apsaugojo eritrocitus nuo lizės atliekant nuo AP priklausomą hemolizės tyrimą.

Nė vienas sulietas baltymas nesumažino glomerulų C3d dažymo, galbūt dėl ​​nuolatinio glomerulų C3d pobūdžio. Eksperimentinio imuninio kompleksinio nefrito atveju glomerulų C3c išnyko per 24 valandas po komplemento aktyvacijos nutraukimo, tačiau C3d išliko savaites.16 Be to, glomerulinis C3d yra nuolatinis sergant vilkligės nefritu.26 Tai greičiausiai atspindi jo kovalentinę sąveiką su glomerulų paviršiais. Pakartotinės žmogaus FH injekcijos Cfh–/– pelėms parodė glomerulų C3d sumažėjimą per 10 dienų.11 Tikėtina, kad pakartotinis IgG-FH1-5 dozavimas gali sumažinti glomerulų C3d šiame modelyje. Taip pat nebuvo jokių glomerulų FHR dažymo pokyčių. Mažai žinoma apie pelių FHR baltymų funkcijas, tačiau jie gali sąveikauti tiek su C3b27,28, tiek su C3d.27 Tiesą sakant, FHR-A ir FHR-B tariamas afinitetas su C3d yra stipresnis nei FH.27 Mes spėliojame, kad glomerulų FHR baltymai greičiausiai išsivalys iš glomerulų tik pašalinus C3d. Šiame kontekste pažymėtina, kad žmogaus C3G su faktoriumi H susijęs baltymas 5 asocijuojasi su glomerulų C3d.29

Anti-P-FH1-5 baltymas sumažino laisvojo plazmos megfelelődino kiekį, kaip tikėtasi, nes šio sulieto baltymo anti-properdin dalis gali blokuoti AP aktyvumą (dėl properdino išeikvojimo) 8 dienas po vienos injekcijos.30 Tačiau, mūsų duomenys parodė, kad FH1-5 veiksmingumas didinant C3 koncentraciją plazmoje ir sumažinant glomerulų C3b/iC3b/C3c dažymą buvo panašus tarp dviejų sulietų baltymų (ty nepriklauso nuo prodidino taikymo). Be to, pavartojus anti-P arba IgG-FH{14}}, nenormalus glomerulų dažymasis buvo žymiai sumažintas. Akivaizdu, kad, priešingai nei C3d ir FHR baltymai, atkūrus C3 reguliavimą, glomerulų propedinas lengvai pašalinamas. Paskyrus anti-P-FH1-5 baltymą, pasikeitė glomerulų prodino modelis, tačiau tai apsunkino pastebėjimas, kad aptikome šio sulieto baltymo nusėdimą tiek Cfh–/–, tiek laukinio tipo glomeruluose. Tai iš dalies lėmė sąveika su glomerulų propedinu, tačiau nusėdimas laukinio tipo glomeruluose parodė, kad jis taip pat iš dalies visiškai nepriklauso nuo glomerulų komplemento ir greičiausiai buvo susijęs su sulieto baltymo fizikinėmis ir cheminėmis savybėmis.

Mūsų kinetikos duomenys parodė naujus atradimus dėl laikinų FB, C5 ir propedino pokyčių, kurie lydi C3 padidėjimą Cfh–/– pelėms po sulietų baltymų injekcijos. Po injekcijos FB lygis greitai pakilo

ir grįžo į pradinį lygį tuo metu, kai tiek C5, tiek propidino kiekis išliko padidėjęs. Suleidus IgG-FH1-5, Cfh–/– pelių properdino kiekis sumažėjo iki normalaus lygio (20 mg/ml30) ir išliko toks mažiausiai 14 dienų. Panašus laikas buvo stebimas ir C5 koncentracijos plazmoje padidėjimui. Stebėtina, kad 11 dienų IgG-FH1-5 dažniausiai nebuvo iš kraujotakos, o tai rodo, kad Cfh–/– pelėse C5 konvertazės formavimasis yra lėtesnis nei C3 konvertazės (nes C3 lygis grįžo į pradinį tarp 7 ir 11 dienų). Plazmos C5 padaugėjo po gydymo anti-P ir toliau padidėjo vartojant anti-P-FH1-5 baltymą. Vadinasi, tiek taikymas pagal prodiną, tiek FH{20}} poveikis prisidėjo prie padidėjusio C5 lygio ir rodo, kad Cfh–/– pelių C5 konvertazė iš dalies priklauso nuo propidino. Šis atradimas atitinka C5 disreguliacijos pagerėjimą pelėms, turinčioms bendrą FH ir propidino trūkumą.8,9 Cirkuliuojantis megfelelődino kiekis gali būti sumažintas C3G ir atrodo, kad jis koreliuoja su paviršiaus C5 konvertazės aktyvumu, priešingai nei plazmoje C5 arba tirpus C5b{ {30}}.31,32 Mūsų duomenys patvirtina glaudų ryšį tarp megfelelődino lygio ir C5 konvertazės aktyvumo ir palaiko propedino lygių naudojimą kaip nuolatinio glomerulų C5 aktyvacijos biomarkerį.

Pažymėtina, kad IgG-FH1-5 baltymas vis dar buvo aptinkamas kraujotakoje iki 11 dienų po vienos injekcijos. Tai yra daug ilgiau, nei anksčiau pranešėme apie nekonjuguotą pelės FH1-5 baltymą, kuris buvo pašalintas iš kraujotakos per 24 valandas.14 Šis radinys rodo, kad ilgesnis IgG-FH{ pusinės eliminacijos laikas plazmoje. {9}} baltymas yra gautas iš antikūnų konjugacijos. IgG-FH1-5 baltymo pusinės eliminacijos laikas plazmoje taip pat buvo ilgesnis, nei anksčiau stebėjome viso ilgio FH.10,11 Pavyzdžiui, žmogaus FH buvo pašalintas iš kraujotakos praėjus 96 valandoms po vienos injekcijos. Cfh–/– pelėms.11 Kartu su mūsų duomenimis, rodančiais IgG-FH1-5 baltymo veiksmingumą reguliuojant komplementą, manome, kad FH1-5 baltymo konjugacija, siekiant pailginti jo farmakokinetinį profilį, gali turėti terapinį poveikį. naudingumas C3G.

Apibendrinant, parodome, kad nepaisant paviršiaus atpažinimo domenų trūkumo, FH1-5 sulieti baltymai buvo veiksmingi mažinant glomerulų C3 aktyvaciją ir atkuriant plazmos komplemento reguliavimą esant FH trūkumui. FH1-5 domenų konjugavimas su antipropordinu nebuvo akivaizdaus pranašumo, o IgG-FH1-5 baltymas sumažino inkstų pažeidimą sergant eksperimentiniu nefritu. Skirtingai nuo iššūkių gaminant didelio masto FH preparatus, skirtus terapiniam naudojimui, didelio masto antikūnų pagrindu pagamintų terapijų gamyba yra gerai žinoma, todėl IgG-FH{10}} yra patraukli potenciali C3G gydymo priemonė.

METODAI

Sulieti baltymai

IgG-FH1-5. Pirmieji 5 susieti pelės FH SCR domenai (mFH1-5)

to a non-targeting IgG1 mouse Ig (an anti-idiotypic antibody raised against a mouse monoclonal antibody).

Anti-P-FH1-5. Pelės FH1-5, susietas su pelės anti-properdin antikūnu (anti-P),30 pateikė Alexion W. Song, Pensilvanijos universitetas).

Valdikliai. Kontrolės buvo pagal izotipą suderintos netikslinės pelės Ig (IgG kontrolė) ir pelės antiproperdinas (anti-P) (papildomas S1 paveikslas). Baltymai buvo generuojami naudojant pVEK vektorius ir Expi293 ląsteles (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA), išgrynintos naudojant baltymą A (MabSelect SuRe, Cytiva, Marlborough, MA).

AP specifinis hemolizinis tyrimas

Dvidešimt procentų normalaus pelių serumo, titruoto nuo 60 nM iki 0,5 nM, buvo inkubuojamas su triušio eritrocitais (15 106 ląstelės/ml) 37 C temperatūroje 30 minučių. Hemo išsiskyrimas buvo kiekybiškai įvertintas spektrofotometriškai (optinis tankis 415 nm); 100 procentų lizė buvo serumas be inhibitorių.

Plazma FB ir FH

Plazma buvo gauta centrifugavus kraują, surinktą į mėgintuvėlius su etilendiamino tetraacto rūgštimi (Sarstedt, Nordrhein-Westfalen, Vokietija). Baltymai buvo matuojami kapiliarinės elektroforezės imunologiniu tyrimu (WES, ProteinSimple, San Chosė, CA). Naudoti antikūnai buvo polikloniniai anti-pelės FH antikūnai (Alexion Pharmaceuticals, Boston, MA) ir anti-pelės FB antikūnai (Abcam, Kembridžas, JK); Buvo naudojamas WES anti-zuikio aptikimo modulis (ProteinSimple, San Chosė, CA). Chemiliuminescenciniai signalai buvo analizuojami naudojant Compass for SW programinę įrangą (ProteinSimple, versija 5.{6}}.1), kiekybiškai įvertinti kaip smailės plotai ir normalizuoti pagal tyrimo kontrolę.

Pelės

Visos pelės buvo laikomos tam tikromis sąlygomis, kuriose nėra patogenų; procedūros buvo atliekamos pagal institucines gaires ir patvirtintos Jungtinės Karalystės vidaus tarnybos. C57BL/6 laukinio tipo pelės buvo įsigytos iš Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME), o Cfh–/– pelės buvo sukurtos, kaip aprašyta anksčiau.7 Pelės buvo suderintos pagal amžių ir lytį; ekvimolinės baltymų dozės buvo skiriamos ip injekcijomis (1 mg antiproperdinui ir IgG kontrolei; 1,4 mg IgG-FH1-5 ir anti-P-FH1-5). Pagreitintas serumo nefrotoksinis nefritas buvo sukeltas į veną suleidus avių nefrotoksinio serumo pelėms, iš anksto imunizuotoms avies IgG.7 Sulietų baltymų vartojimas buvo atliktas likus 24 valandoms iki avių nefrotoksinio serumo indukcijos (4a pav.).

C3, C5 ir laisvasis prodidinas Plazma C3 buvo išmatuota naudojant fermentų susietą imunosorbentą.14 „Laisvojo“ propidino ir C5 lygiai plazmoje buvo išmatuoti naudojant elektrochemiliuminescencinius imunologinius tyrimus (Meso Scale Discovery [MSD], Meso Scale Diagnostics, Rockville, MD) su anti. - Produkdinas arba pritaikytas anti-pelės C5, padengtas didelio surišimo MSD plokštelėse. Surištas „laisvas“ properdinas ir C5 buvo aptikti naudojant anti-properdiną (iš W. Song) arba biotinilinto monokloninio anti-C5 (Alexion) kartu su streptavidinu-SULFO (MSD, Meso Scale Diagnostics). Chemiliuminescencinis signalas buvo gautas naudojant SECTOR S 6000 vaizdų įrenginį (MSD, Meso Scale Diagnostics) ir buvo analizuojamas naudojant MSD Discovery Workbench programinę įrangą (Meso Scale).

Diagnostika, 4 versija.{1}}.12.1). Rekombinantinis pelių propidinas ir C5 buvo naudojami kaip standartai.

Inkstų funkcija ir histologija

Hematurija ir proteinurija buvo įvertinti naudojant Hema-Combistix (Bayer, Reading, JK); plazmos karbamidas buvo išmatuotas ir inkstų audinys apdorotas, kaip aprašyta anksčiau.9 Kreatinino kiekis šlapime buvo nustatytas taškiniuose šlapimo mėginiuose, naudojant Creatinine Companion Protocol testą (#1012; Excell, Philadelphia, PA) ir taškinį šlapimą/ plazmos albuminas buvo matuojamas su fermentu susietu imunosorbentu (#E99-134; Bethyl Laboratories, Montgomery, TX). Periodinės rūgšties – Šifo dažytos inkstų pjūviai buvo vertinami aklu būdu ir suskirstyti pagal glomerulų ir tubulointersticinio pažeidimo sunkumą (0 [nėra], 1 [lengvas], 2 [vidutinio sunkumo]). Siekiant nustatyti vidutinį glomerulų ląstelių skaičių, vienoje sekcijoje buvo įvertinta dešimt glomerulų. Imunofluorescencinis dažymas buvo atliktas naudojant 5- mm kriosekcijas, sumontuotas naudojant Vectashield terpę su DAPI (Vector Laboratories, Burlingame, CA). Naudoti antikūnai buvo su fluoresceino izotiocianatu (FITC) konjuguotas polikloninis ožkos anti-pelės C3b/C3c/iC3b (1:200; #55500; MP Biomedical, Santa Ana, CA)9; Figos grandinės specifinis FITC konjuguotas polikloninis ožkų anti-pelės IgG (1:400; #F5387; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO); FITC konjuguotas monokloninis pelės anti-ožkos/avies IgG (1:100; #F5137; Sigma-Aldrich); arba su FITC konjuguotas ožkos anti-žmogaus propidinas (1:50; #GAHu/PPD/FITC, Nordic Immu- no logic Laboratories, Kopenhaga, Danija).9 Biotinilintas ožkas prieš pelę C3d (1:10; # BAF2655; R&D sistemos , Mineapolis, MN) buvo naudojamas biotinu blokuotose sekcijose (Biotino blokavimo sistema; Agilent Dako, Santa Clara, CA) su streptavidino AF488 antriniu antikūnu (1:200; #S-32354; Thermo Fisher Scientific). FH buvo vizualizuotas išgrynintose žiurkių antipelės CD16/CD{52}}užblokuotose sekcijose (1:100; BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ), naudojant ožkų anti-žmogaus FH (1:1000; #A312; Quidel, San Diego). , CA) ir monokloninis anti-ožkos IgG-FITC antrinis antikūnas (1:100; klonas GT-34; F4891; Sigma-Aldrich). Glomeruliniai makrofagai buvo identifikuoti naudojant FITC konjuguotą žiurkių anti-pelės CD68 (FA-11 klonas GTX43518; GeneTex, Irvine, CA). Kiekybinė imunofluorescencinė analizė buvo atlikta naudojant Leica DM4B optinį mikroskopą, sujungtą su Leica DFC700T skaitmenine kamera (Leica Microsystems, Wetzlar, Vokietija) ir Image-Pro Plus programine įranga (Media Cybernetics, Rockville, MD, 7 versija). Viename skyriuje buvo ištirta dešimt glomerulų, o vidutinis intensyvumas buvo išreikštas savavališkais fluorestikos vienetais.

Statistinė analizė

Statistinei analizei buvo naudojama GraphPad Prism, 8 versija.{1}} (GraphPad, San Diego, CA). Laiko eigos analizei buvo naudojama kartotinių matavimų 2-variacijos analizė naudojant Bonferroni kelių palyginimų testą (veiksniai buvo laikas ir gydymas). Lyginant kelias grupes buvo naudojamas Kruskal-Wallis ir Dunn kelių palyginimų testas, o Mann-Whitney testas buvo naudojamas 2 grupėms.

ATSKLEIDIMAS

MCP gavo konsultacijų mokesčius iš Alexion, ChemoCentryx, Novartis, Gyroscope ir Achillion Pharmaceuticals. HTC gavo konsultacijų mokesčius iš Alexion, Novartis, Aurinia ir Achillion Pharmaceuticals. YZ, YW, KKJ ir SK-K yra Alexion Pharmaceuticals darbuotojai. SK yra buvęs Alexion Pharmaceuticals darbuotojas ir šiuo metu dirba Gemini Pharmaceuticals. Visi kiti autoriai nedeklaravo konkuruojančių interesų.

PADĖKA

MCP yra „Wellcome Trust“ klinikinių mokslų vyresnysis bendradarbis (stipendijos numeris 212252/Z/18/Z), o ši stipendija remia ACG ir DPL. YZ, SK, YW, KKJ ir SK-K finansavo Alexion Pharmaceuticals.

PAPILDOMA MEDŽIAGA

Papildomas failas (PDF)

S1 paveikslas. Šiame tyrime panaudotas sintezės baltymas.IgG-FH1-5 turi pirmuosius 5 pelės faktoriaus H (FH1-5) domenus, susietus su netiksliniu pelės Ig. Anti-P-FH1-5 susideda iš mFH1-5, susieto su neutralizuojančiu pelių anti-pelės antikūnu (anti-P; žr. Miwa et al.30). Kontroliniai baltymai apėmė izotipą atitinkantį netikslinį pelės Ig (IgG kontrolė) ir neutralizuojantį pelės anti-pelės antikūną (Anti-P). S2 paveikslas. WES blot analizė, skirta aptikti FH1-5 plazmos mėginiuose iš pelių, kurioms FH trūkumas buvo sušvirkštas (A) IgG-FH1-5 arba (B) Anti-P-FH1-5. 94-kDaIgheavychainlinkedtomouseFH1-5 (HC-FH1-5) aptinkamas iki 11 dienų po IgG-FH1-5 injekcijos ir iki 4 dienų po anti-P-FH1-5 baltymo injekcijos (raudonos dėžutės). ).Kontroliuojama plazma iš laukinio tipo pelių, kuriose aptinkamas viso ilgio H faktoriaus baltymas (FH, juodosios dėžės, C1 juosta) ir pelių, kurioms nebuvo sušvirkšta FH trūkumas, kai FH nėra akivaizdus (juodosios dėžės, C2 juosta). Kaip ir tikėtasi, pelių, kurioms buvo sušvirkšta anti-P arba IgG kontrolė, plazmos mėginiuose neaptinkama nei FHnorFH{43}}.

S3 pav. Glomerulinio komplemento imuninis dažymas praėjus 96 valandoms po IgG kontrolinio arba anti-P-FH1-5 suleidimo laukinio tipo pelėms. Rodomi tipiniai glomerulų vaizdai (juosta ¼ 100 mm).

S4 pav. Prodidino vaidmuo anti-P-FH1-5 nusėdimui pelių, kurioms trūksta FH, glomeruluose. Cfh–/– pelėms buvo sušvirkšta arba IgG-kontrolė, arba anti-P (1 gydymas), po to 24-po valandų - IgG-kontrolė arba anti-P-FH1-5 (2 gydymas). Gyvūnai buvo skerdžiami praėjus 120 valandų po pirmojo gydymo ir buvo įvertintas glomerulų dažymas IgG, megfelelődinui ir FH / FHR. Rodomi reprezentatyvūs vaizdai. Anti-P injekcija žymiai sumažino propidino (1 eilutė, 2 stulpelis), bet ne FH/FHR (nelieka nepakitusi) ar IgG (nėra) dažymą. Suleidus anti-P-FH{20}}praėjus valandoms po IgG kontrolės, atsirado granuliuotas dažymas anti-IgG, anti-FH/FHR ir anti-P antikūnais, kaip matyti po anti-P-FH injekcijos. 1-5 vienas (žr. 3b pav.). Šis granuliuotas dažymas sumažėjo, kai prieš anti-P-FH1-5 injekciją buvo atlikta anti-P injekcija, kuri išeikvoja tiek cirkuliaciją (žr. 1h pav.), tiek glomerulus (žr. 3b pav.). Glomerulų dažymas anti-IgG buvo akivaizdus tik pelėms, kurioms buvo sušvirkštas anti-P-FH1-5 (3 eilutė, 3 ir 4 stulpeliai), o pelių, kurios gavo anti-P-FH1-5, buvo žymiai mažesnis. prieš tai buvo anti-P. Padarėme išvadą, kad anti-P-FH1-5 nusėdimas Cfh–/– pelių glomeruluose iš dalies priklausė nuo propedino. Horizontalios juostos žymi vidutines vertes, o ūsai – tarpkvartilinį diapazoną. P vertė buvo gauta iš Mann-Whitney testo. Strypas ¼ 100 mm.

NUORODOS

1.FakhouriF, Frémeaux-Bacchi V, Noöl LH ir kt. C glomerulopatija∶ nauja dassifikacija. Nat Rev Nephrol.20106:494-499.

2 SmithRH.AppeG8.BlomAMet aLC3gkomeripatija – retos komplemento sukeltos tikros ligos supratimas. Nat ReyNephrol.201915129-143

3. Pickering MC, Cook HT. Translational mini apžvalgų serija apie komplemento faktorių H: inkstų ligos, susijusios su komplemento faktoriumi H, naujos žmonių ir gyvūnų įžvalgos. Cin Exp Immunol.2008;151:210-230.

4. Daha MR Fearon DT Austen KF, C3nechritinis faktorius （C3NeF）∶skysčio fazės ir su ląstelėmis susietos alternatyvaus kelio konvertazės stabilizavimas. J Immunol 1976; 116: 1-7.

5. Mollnes TE, Ng YC, Peters DK, et al nefritinio faktoriaus poveikis C3 ir galutiniam komplemento keliui in vivo ir in vitro. Oin Exp Immunol. 1986;65:73-79.

6. Nq YC, Peters DK. G3 nefritinis faktorius (C3NeF): su ląstelėmis susietos ir skystosios fazės stabilizavimo alternatyvaus kelio C3 konvertazės disociacija. Cn Exp Imunol.19865:450-457.

7. Pickering MC, Cook HT, Warren J ir kt. Nekontroliuojama C3 aktyvacija sukelia membranoproliferacinį glomerulonefritą pelėms, kurioms trūksta komplemento faktoriaus H. Nat Genert.2002:31;424-428.

8. Lesher AM, Zhou L, Kimura Y ir kt. H faktoriaus mutacijos ir megfelelődino trūkumo derinys sukelia sunkų C3 glomerulonefritą. J Am Soc Nephrol. 2013;24:53–65.

9. Ruseva MM, Veron KA, Lesher AM ir kt. Prodidino praradimas sustiprina C3 glomerulopatiją, atsirandančią dėl H faktoriaus trūkumo. J Am Soc Nephrol. 2013;24:43-52.

10. Paixao-Cavalcante D, Hanson S, Botto M ir kt. H faktorius palengvina GBM surišto iC3b pašalinimą, kontroliuodamas C3 aktyvavimą skysčio fazėje. Mol Immunol.2009;46:1942-1950.

11Fakhouri F, de Jorge EG. Brune F ir kt., Gydymas žmogaus komplemento faktoriumi H greitai pakeičia inkstų komplemento nusėdimą pelėms, kurioms trūksta H faktoriaus. Kidney Int.2010:78:279-286.

12. Michelfelder S, Parsons J, Bohlender Ll ir kt. Moss pagamintas, pagal glikozilinimą optimizuotas žmogaus faktorius H, skirtas gydyti komplemento sutrikimus. JAm Soc Nephrol.201728:1462-1474.

13. Nichols EM, Barbour TD, Pappworth Y ir kt. Išplėstinė mini komplemento faktoriaus H molekulė pagerina eksperimentinę C3 glomerulopatiją. Kidney Int. 201588:1314-1322.

14. Ruseva MM, Peng T, Laser MA ir kt. Tikslinio komplemento slopinimo efektyvumas eksperimentinėje C3 glomerulopatijoje. J Am Soc Nephrol. 2016;27:405-416.

15. Yang Y, Denton H, Davies OR ir kt. Sukurtas komplemento faktoriaus H konstruktas, skirtas gydyti C3 glomerulopatiją. J Am Soc Nephrol. 2018;29:1649-1661.

16. Schulze M, Pruchno CJ, Burns M ir kt. Glomerulinė C3 klokalizacija rodo nuolatinį imuninių nuosėdų susidarymą ir komplemento aktyvavimą eksperimentinio glomerulonefrito atveju. Am J PatholL. 1993:142179-187.

17. Athanasiou Y, Voskarides K Gale DP ir kt. Šeiminė C3 glomerulopatija, susijusi su CFHRS mutacijomis, 91 paciento klinikinės charakteristikos iš 16 kilmės dokumentų. CTn JAm Soc Nephrol.20116:1436-1446.

18. Kaneko Y, Nimmer动hn F, Madaio MP ir kt. Patologija ir apsauga sergant nefrotoksiniu nefritu yra nulemta selektyvaus specifinių Fc receptorių įsitraukimo. J Exp Med.2006;203:789-797.

19. Sheerin NS, Springall T, Carroll MC ir kt. Apsauga nuo antiglomerulinės bazinės membranos (GBM sukelto nefrito pelėms, kurioms trūksta C3-ir C4-. C Exp Immunol. 1997;110:403-409.

20. Cheng ZZ Hellwae J, Seeberger H ir kt. Pelės ir žmogaus komplemento faktoriaus paviršiaus atpažinimo ir C3b surišimo savybių palyginimas H.Mol Immunol.2006;43.972-979.

21dp ikrai EG. Macor P.Paixao-Caakante D. et al Tipinio hemolizinio ureminio sindromo išsivystymas priklauso nuo komplemento C5.J Am Soc Nephrol.2011;22:137-145.

22.Pdkering MC, de Jorge EG.Martinez-Barricarte Ry ir kt. Spontaninis hemolizinis ureminis sindromas, sukeltas komplemento faktoriaus H, kuriam trūksta paviršiaus atpažinimo domenų. J Exp Med.2007;204:1249-1256.

23Herbertas AP. Mike E, Chen ZAet al. Komplemento vengimas, susijęs su užfiksuoto faktoriaus H sustiprinimu: pasekmės savarankiškų paviršių apsaugai nuo komplemento. J Immunol. 2015; 195:4986-4998.

24. Goicoechea de Jorge E Caesar JJ, Malik TH ir kt. Su komplemento faktoriumi H susijusių baltymų dimerizacija moduliuoja komplemento aktyvaciją. Proc Natl Acad Sci US A.2013;110:4685-4690.

25. Schmidt CQ, Bai H Lin Z ir kt.. Racionali minimalizuoto imuninio inhibitoriaus su unikaliomis trigubomis taikymo savybėmis inžinerija. J Immunol. 2013; 190:5712-5721.

26. Wilson HR, Medjera-Thomas NR, Gilmore AC ir kt. Glomerulinės membranos atakos kompleksas nėra patikimas nuolatinio C5 aktyvacijos žymeklis sergant vilkligės nefritu. Kidney Int. 2019.{4}}.

27. Antonioli AH White J, Crawford F ir kt. Alternatyvaus komplemento kelio moduliavimas pelių faktoriumi H susijusiais baltymais. J Immunol. 2018;200:316-326.

28. Cserhalmi M, CsincsiALMezei Z ir kt. Su pelių faktoriumi H susijęs baltymas FHR-B skatina komplemento aktyvaciją. Front Imunol.20178:1145.

29. Medjeral-Thomas NR, Moffett H, Lomax-Browne HJ ir kt. Glomerulinio komplemento faktoriaus H susijęs baltymas 5 (FHR5) yra labai paplitęs sergant C3 glomerulopatija ir susijęs su inkstų nepakankamumu Kdney Int Ren. 2019;4:1387-1400.

30. Miwa T, Sato S, Gullipalli D ir kt. Produktoriaus, alternatyvaus kelio, ir anafilatoksino receptorių blokavimas pagerina inkstų išemijos ir reperfuzijos pažeidimus skilimą greitinančio faktoriaus ir CD59 dvigubo išmušimo pelėse. J Immunol. 2013; 190:3552-3559.

31. Corillo F, Bravo Garcia-Morato M, Nozal P ir kt. Serumo, kaip C5 konvertazės disreguliacijos C3 glomerulopatijos biomarkerio, suvartojimas. Clin Exp Immunol.2016;184:118-125.8. Lesher AM, Zhou L Kimura Y ir kt. H faktoriaus mutacijos ir megfelelődino trūkumo derinys sukelia sunkų C3 glomerulonefritą.JAm Soc Nephrol.2013;2453-65.

32. Zhang Y, Nester OM Martin B.et al C3 glomerulopatijos komplemento biomarkerio profilio apibrėžimas. Clin J Am Soc Nephvol.20149:186-1882.