Išsamus vaisiaus ir perinatalinio žmogaus amniono skysčio kamieninių ląstelių sekrecinių formų profiliavimas

Prašau susisiektioscar.xiao@wecistanche.comDaugiau informacijos

Be to, kaip matyti iš 5B ir 6B paveiksluose pateiktų stulpelių diagramų, išskirtinis baltymų pasiskirstymas pagal išskiriančių ląstelių hipoksinį išankstinį kondicionavimą yra pastebimas. Šiuo atveju, norint gauti išsamią informaciją, taip pat buvo pranešta apie baltymus, kurie neviršija DAve ir DCI rinkinio slenksčio. Vaisiaus sekrecijos rezultatai yra praturtinti 60 kDa šilumos smūgio baltymu (HSPD1, 5B pav., kairysis skydelis) jo hipoksinėje formulėje, o pernatalinis atitikmuo labai ekspresuoja lygiųjų raumenų ląsteles susitraukiantį miozino reguliuojantį [52] lengvąjį polipeptidą 9 (MYL9, pav. 5B, dešinysis skydelis). Atrodo, kad didelė skirtumo tarp nėštumo stadijų dalis labiau priklauso nuo hipoksinio išankstinio kondicionavimo hAFS. EV; Nustatyta, kad f-have-EV, gautos iš hipoksinių ląstelių pradėjimo, buvo praturtinti tokiais veiksniais kaip Perlecan (HSPG2), Agrin (AGRN), laminino subvienetas -5 ir -1(LAMA5 ir LAMB1), trombospondinas{17. }} (THBS1, 6B pav., kairysis skydelis). Hipoksiniuose p-hAFS-EV buvo sunkioji feritino grandinė (FTH1), pastolių baltymai, tokie kaip Flotillin{23}}(FLOT1), Fascin (FSCN1), aneksinas A6 (ANXA6), Rab BVP disociacijos inhibitorius beta (GDI2) ir Thy. -1 membranos glikoproteinas (THY1), neuropilinas-1(NRP1) ir matricinis metaloproteinas 14 (MMP14, 6B pav., dešinysis skydelis).

Norėdami sužinoti daugiau, spustelėkite čia

F-hAFS kiekvienoje ištirtoje būsenoje buvo rasta bent 2 baltymų. EV ir p-hAFS-EV buvo toliau lyginami su Vesciclepedia duomenų baze [53]. Kaip ir tikėtasi, dauguma nustatytų baltymų (96 procentai) anksčiau buvo aprašyti EV ir egzosomose etaloninėje duomenų bazėje (S3A pav.).cistanche privalumaiŠiuo atžvilgiu Genų ontologijos (GO) sodrinimo analizė buvo atlikta naudojant FunRich [54]. GO terminų gausa duomenų rinkinyje buvo lyginama su natūraliu jų kiekiu etaloninėje duomenų bazėje, siekiant rasti statistiškai per daug atstovaujamas baltymų grupes, atsižvelgiant į jų dalyvavimą biologiniuose procesuose, molekulinę funkciją ir ląstelių komponentus (šiuo paskutinio aspekto duomenys nėra parodyta, bet galima užsisakyti). Kalbant apie molekulinių funkcijų, susijusių su nustatytais baltymais, analizę, hAFS-CM frakcijos parodė praturtėjimą struktūrine ekstraląstelinės matricos ir citoskeleto sudedamąja dalimi, citoskeleto baltymų prisijungimu ir struktūrinės molekulės aktyvumu (S2 pav.), o hAFS-EV buvo praturtinti struktūrine medžiaga. citoskeleto ir ribosomų, DNR ir RNR surišimo bei GTPazės ir chaperono surišimo faktorių sudedamoji dalis (S3C pav.).

Tiek hAFS-CM, tiek have-EV biologinių procesų sodrinimo analizė parodė, kad dauguma baltymų, moduliuojamų vaisiaus ir perinatalinėse hAFS sekrecijos frakcijose, priklauso ląstelių augimui / palaikymui ir baltymų metabolizmui (5C ir 6C paveikslai). Per hAFS-EV pastebėjome, kad terminas "ekstraląstelinės matricos struktūrinės sudedamosios dalys" buvo siejamas tik su hipoksiniais f-hAF-EV; terminai „kalcio jonų surišimas“ ir „struktūrinis molekulinis aktyvumas“ daugiausia buvo praturtinti hipoksiniais f-hAFS ir p-hAFS mėginiais (S3B pav.).

Figure 6. Comparative proteomics analysis of fetal- and perinatal hAFS-EVs. (A)Venn diagram illustrating the distribution of proteins identified with a frequency of at least 2 within f-hAFS-EVSnormo (dark yellow),f-hAFS-EVSHypo (red), p-hAFS-EVSnormo (light green), and p-hAFS-EVShypo (dark green). (B)Differentially expressed proteins were identified in fetal hAFS-EVs (left panel) and perinatal hAFS-EVs (right panel) by label-free quantification with MAProMa software. Left panel: histogram reporting the differential expression of proteins found upregulated between normoxic control (dark yellow bars and negative DAve values) and hypoxic preconditioning (red bars and positive DAve values) of f-hAFS-EVs over p-hAFS-EVs. Right panel: histogram reporting the differential expression of proteins found upregulated between control normoxic (light green bars and negative DAve values) and hypoxic preconditioning (dark green bars and positive DAve values) of p-hAFS-EVs over f-hAFS-EVs. Proteins with DAve (ratio of protein expression)>10.4I ir DCI (diferencinės išraiškos pasikliovimas) didesnis nei I5I arba lygus jam, praėjo filtrus ir buvo laikomi skirtingai išreikštais; Visą nurodytų baltymų sąrašą ir išsamius parametrus žr. S3 lentelėje. (C) Biologinių procesų praturtinimo analizė baltymų, nustatytų bent 2 dažniu f-hAFS-EV (kairysis skydelis) ir p-hAFS-EV (dešinysis skydelis) po hipoksinio išankstinio kondicionavimo. Remiantis FunRich įrankiu, genų ontologijos terminai rodomi juostinėse diagramose, kuriose nurodomas kiekvienos kategorijos praturtintų genų procentas (tamsiai geltonos juostos f-hAFS-EVsnormo, raudonos juostos f-hAFS-EVShypo, šviesiai žalios juostos p-hAFS -EVsnormo ir tamsiai žalios juostos, skirtos p-hAFS-EVShypo). Tik genų ontologijos terminai su Bonferroni pakoreguoti*p<0.05 are="">

Cistanche gali kovoti su senėjimu

2.6. Vaisiaus ir perinatalinio has-CM ir have-EV citokinų ir chemokinų profiliavimas atskleidė skirtingus pasiskirstymo modelius

Anksčiau mes patvirtinome f-hAFS-CMhypo regeneracinį gebėjimą pažeistose širdies ir kraujagyslių ląstelėse per parakrininį poveikį [34, 35, 49]. Čia palyginome f-hAFS-CMHypo citokinų ir chemokinų kiekį su atitinkamu p-hAFS atitikmeniu (7A paveikslas, S4A paveikslas ir S4 lentelė) ir nustatėme keletą skiriančių veiksnių.

ANGIOGENINAS, ekstraląstelinės matricos metaloproteinazės induktorius (EMMPRIN), interleukinas 8 (IL-8) ir monocitų chemoattraktanto baltymas-1 (MCP-1) buvo rastas išskirtinai praturtintas inf-hAFS-CMNypo ir nebuvo. aptiktas p-hAFS-CMhypo. Insuliną panašaus augimo faktorių surišančio baltymo 2 (IGFBP2) ir osteopontino (OPN) kiekis f-hAFS-CMhypo, palyginti su p-hAFS-CMHypo, žymiai padidėjo 3.{16}}ir 3.{18}} kartus (" p<0.05 and=""><0.01 respectively,="" figure="" 5a).="" plasminogen="" activator="" inhibitor-1(pai-1)="" was="" strongly="" expressed="" in="" both="" f-hafs-cmhypo="" and="" p-hafs-cmnypo="" (figure7a).="" other="" cytokines="" were="" detectable="" at="" low="" levels,="" namely="" cystatin="" c(cst3),="" fibroblast="" growth="" factor="" 19="" (fgf-19)interleukin-17a="" (il-17a),="" macrophage="" migration="" inhibitor="" factor="" (mif),="" pentraxin="" 3="">

Nors vaisiaus, palyginti su perinataliniu have-CM, citokinų ir chemokinų profilis pasižymėjo skirtinga ekspresija, atitinkami vaisiaus ir perinatalinio EV atitikmenys buvo pasiskirstę tolygiau, nors jų ekspresijos profiliai buvo mažesni (7B paveikslas, S4B paveikslas ir S5 lentelė). Nepaisant to, galima pastebėti kai kuriuos skirtumus: DiPeptidyl-Peptidase IV (DPPIV), augimo / diferenciacijos faktorių 15 (GDF-15) ir IL-8 išreiškė tik f-hAFS-EVSHypo, nors ir mažu. lygiai; ANGIOPOIETIN2, CD40 LIGAND ir vitaminą D surišantis baltymas (VDBP) buvo aptikti tik p-hAFS-EVShypo, nepaisant to, kad dar kartą buvo aptikta mažais kiekiais. Kiti citokinai, pvz., iš smegenų gautas neurotrofinis faktorius (BDNF)ENDOGLIN, FGF-19, į insuliną panašus augimo faktorių rišantis baltymas 3 (IGFBP3), IL-17a, MIF OPN, PTX3, stromos kilmės faktorius{ {23}} alfa (SDF-1a), buvo rasta ir f-hAFS-EVShypo, ir p-hAFS-EVSHvpo, o PAI-1 ir EMMPRIN buvo labiau išreikšti (7B pav.)

BDNF, ENDOGLIN, IGFBP3 ir SDF-lo buvo išskirtinai praturtinti visais hipoksiniais EV, palyginti su atitinkamu hAFS-CM, neatsižvelgiant į nėštumo stadiją. Be to, nors EMMPRIN nebuvo aptiktas p-hAFS-CMhypo, buvo nustatyta, kad jis yra praturtintas atitinkama EV frakcija; Ir atvirkščiai, OPN buvo gausesnis f-have-CMhypo nei f-have-EVShypo, tuo tarpu jis buvo palyginamas tarp atitinkamų p-hAFS sekrecijos frakcijų. FGF-19, MIF ir PTX3 buvo panašiai išreikšti tiek vaisiaus, tiek perinataliniame has-CM ir atitinkamuose hAFS-EV. PAI-1 buvo labai praturtintas hipoksinėmis sekrecijos frakcijomis.

7 pav. Citokinų ir chemokinų profiliavimas vaisiaus ir perinatalinio hAFS sekrecijos formulėse. (A) Citokinų ir chemokinų ekspresija, aptikta hipoksiniame vaisiaus ir perinataliniame turi-CM (f-hAFS-CMHypo vs p-hAFS-CMHypo), nurodyta pikselių tankiu pagal savavališką vienetą [AU]. Vertės išreiškiamos kaip nepriklausomų eksperimentų vidurkis ± sem ir pateikiamos S4 lentelėje;*p=0.0485;**p=0.006.(B) Citokinų ir chemokinų kiekis, nustatytas hipoksiniame vaisiaus palyginti su perinataliniais hAFS-EVs (f-hAFS-EVSHypo vs p-hAFS-EVSHypo) ir išreikštas pikselių tankiu savavališkais vienetais [AU].cistanche cholesterolioVertės išreiškiamos kaip n=3 nepriklausomų eksperimentų vidurkis±se ir pateikiamos S5 lentelėje. CST3: cistatinas C; EMMPRIN: ekstraląstelinės matricos metaloproteinazės induktorius; FCFF-19: fibroblastų augimo faktorius-19; IGFBP2: į insuliną panašus augimo faktorius (IGF) rišantis baltymas 2; IL-8: interleukinas -8;IL-17a:Interleukinas-17a; MCP-1: monocitų chemoattraktanto baltymas-1;MIF: makrofagų migraciją slopinantis faktorius; PTX3: Pentraxin 3; PAI-1: plazminogeno aktyvatoriaus inhibitorius-1; BDNF: iš smegenų išvestas neurotrofinis faktorius; DPPIV: dipeptidilpeptidazė IV; GDF-15: augimo diferenciacijos faktorius-15;IGFBP3: į insuliną panašus augimo faktorius (IGF) rišantis baltymas 3;SDF-1a: Stromos kilmės faktorius-1 alfa; VDBP: vitaminą D surišantis baltymas.

2.7. Vaisiaus ir perinatalinio laikotarpio EV yra praturtintas RNR informacija savo krovinyje

Kadangi mažos nekoduojančios RNR buvo laikomos pagrindiniais EV parakrininės įtakos tikslinėms ląstelėms reguliatoriais [4, 55], daugiausia dėmesio skyrėme RNR sekos analizei mikroRNR (miRNR) kiekiui f-hAFS-EV ir p-hAFS-EV. Mažas RNR profiliavimas parodė miRNR praturtėjimą tiek vaisiaus, tiek perinataliniame hAFS-EV (apie 35-36 proc.), palyginti su bendru mažu RNR kiekiu (8A pav.). MiRNR komponentas iš tikrųjų buvo tarp dviejų labiausiai atstovaujamų RNR rūšių abiejose EV kompozicijose kartu su rRNR(***p) p < 0.0001).="" šios="" mirnr="" buvo="" labiausiai="" praturtintos="" analizuotuose="" ev="" mėginiuose:="" mir-31-5p;="" mir-196a-5p;="" mir-93-5p;="" mir-100-5p;="" mir-125a-5p;="" mir-27b-3p,let-7a-5p,let-7b-5p,let-7f{="" {27}}p,let-7i-5p,mir-16-5p,mir-21-5p,mir-29a-3p,="" mir30a-5p,="" mir-125b-5p,="" mir-155-5p,="" mir-191-5p="" ir="" mir-221-3p.="" pažymėtina,="" kad="" vaisiaus="" ir="" perinatalinės="" ev="" turi="" daugumą="" tokių="" mirnr="" (būtent="" tegul-7a-5p,="" let-7b-5p,="" let{{47="" }}f-5p,="" let-7i-5p,="" mir-16-5p,="" mir-21-5p,="" mir-29a{{54="" }}p,="" mir30a-5p,="" mir-125b-5p,="" mir-155-5p,="" mir-191-5p="" ir="" mir-221-3p,="" 15="" labiausiai="" praturtintų="" mirnr="" rūšių="" apėmė="" daugiau="" nei="" 60="" procentų="" viso="" mirnr="" kiekio="" kiekviename="" mėginyje.="" kita="" vertus,="" likusiuose="" 30="" procentų="" vezikulinės="" mirnr="" kiekio="" buvo="" rasta="" apie="" 100="" mirnr="" (8c="">

Norėdami toliau apibūdinti miRNR kiekį hAFS-EV, ištyrėme, ar hAFS nėštumo stadija arba hipoksinis ląstelių kondicionavimas in vitro gali turėti įtakos specifinių miRNR praturtėjimui. Stipriausias moduliavimas buvo nustatytas tarp nėštumo etapų, kai beveik visos moduliuotos miRNR buvo praturtintos f-hAFS-EV perinataliniu atitikmeniu (9A pav. ir 1 lentelė). Hipoksinis išankstinis kondicionavimas turėjo švelnesnį poveikį miRNR kroviniams, tuo tarpu šiame palyginime moduliacija buvo bet kuria kryptimi, kai kurios miRNR buvo praturtintos hipoksinėmis, o kitos - normaliomis kontrolės sąlygomis (9A pav.).

Kaip papildomą analizę, mes sutelkėme dėmesį į tiriamų miRNR, turinčių mažiausią kintamumą tarp skirtingų donorų, ir kultūros išankstinio kondicionavimo nustatymą, skirtą EV, gautų iš abiejų tirtų nėštumo etapų. Šios analizės metu gautos miRNR svyravo nuo aukšto iki žemo ekspresijos lygio (9B pav.). Stabiliausiame hAFS-EV krovinių miRNR šerdyje buvo identifikuota dalis bendrų miRNR tarp f-hAFS-EV ir p-hAFS-EV (miR-21-5p, miR-29a-3 p, miR-16-5p esant aukštam lygiui; miR-221-3p, miR-221-5p ir miR-22-3p esant silpnam lygiui, 2 lentelė).

9 pav. Diferencinio miRNR sodrinimo vaisiaus ir perinataliniuose hAFS-EV analizė. (A) Ugnikalnių brėžiniai skirtingam hAFS-EV miRNR krovinio sodrinimo pagal nėštumo stadiją (kairysis skydelis) ir išskiriančių ląstelių hipoksinį kondicionavimą in vitro (dešinysis skydelis). Išsamią miRNR informaciją rasite 1 lentelėje. (B) Koreliacijos tarp stabilių miRNR kintamumo (X ašis) ir sodrinimo lygio (Y ašis) vaisiaus hAFS-EV (kairysis skydelis) ir perinatalinio hAFS-EV (dešinysis skydelis) koreliacijos sklaidos diagrama pagal aukštą (geltoni taškai), silpnas (žali taškai) ir mažas (tamsiai violetiniai taškai) sodrinimas. Išsamią miRNR informaciją rasite 2 lentelėje. RPM: skaitymai milijonui.

3. Diskusija

Likę išmesti žmogaus amniono skysčio mėginiai buvo nustatyti kaip vertingas stromos ląstelių šaltinis, turintis daug žadančio regeneracinės medicinos ir audinių inžinerijos potencialą. Su jų izoliavimu susiję etiniai rūpesčiai yra minimalūs, nes juos galima gauti iš likusių įprastinės prenatalinės patikros amniocentezės mėginių, per II nėštumo trimestrą (vaisiaus hAFS), arba iš vaisiaus vandenų, išmestų kaip klinikinės atliekos III trimestro suplanuotame C skyriuje. procedūrų (perinatalinės hAFS). Pastaraisiais metais hAFS buvo pasiūlytas kaip galimas gydymo būdas žmogaus audinių atstatymui ir regeneracijai, atsižvelgiant į vilčių teikiančius įrodymus, gautus iš eksperimentinių ligų modelių. Įdomu tai, kad jie taip pat buvo pasiūlyti vaisiaus ir naujagimio neurologinių ligų gydymui gimdoje; iš tiesų, ikiklinikiniai tyrimai parodė, kad hAFS, vartojamas prieš gimdymą per vaisiaus vandenis, apsaugojo nugaros smegenis nėštumo metu dėl parakrininio aktyvumo žiurkės mielomeningocelės modelyje [56-58] ir sumažino atviros žarnos pažeidimą eksperimentinės graužikų gastroschizės metu[59]. ]. Vertinant iš transliacijos perspektyvos, hAFS transplantacija gimdoje gali būti pakeista tinkamiausio jų sekreto preparato (hAFS-CM arba hAFS-EV) skyrimu.cistanche deserticola šalutinis poveikisŠi strategija leistų greitai ir laiku įsikišti nėštumo metu, įveikiant kanoninės ląstelių terapijos apribojimus (ty daug laiko reikalaujantį ląstelių išplitimą in vitro), tuo pačiu tiekiant paruoštas naudoti farmacines formules.

Dėl neseniai sukurtų mažiau invazinių prenatalinės diagnostikos metodų artimiausiu metu gali sumažėti amniocentezės procedūrų skaičius, todėl perinatalinis hAFS yra labiau prieinamas pasirinkimas. Nepaisant to, kadangi vaisiaus hAFS yra labiau nesubrendę, jie gali turėti veiksmingesnį parakrininį potencialą. Pagal šį scenarijų mes palyginome vaisiaus ir perinatalinį c-KITt hAFS ir sutelkėme dėmesį į jų sekrecinių frakcijų profiliavimą. Mes pabrėžėme svarbius skirtumus, į kuriuos reikia atsižvelgti siekiant galimo klinikinio jų parakrininio pajėgumo vertimo.

Sutikdami su ankstesniais nepriklausomais tyrimais, parodome, kad nėštumo stadija neturėjo įtakos nevienalytei hAFS morfologijai ir jų mezenchiminiam antigeno profiliui [25, 26]. Tada įvertinome parametrus, kurie labiau paveiks ląstelių sekreciją ir parakrininį aktyvumą, išskyrus kanoninį stromos imunofenotipą. Pažymėtina, kad neseniai buvo įrodyta, kad kaulų čiulpų mezenchiminiuose pirmtakuose yra CD146-teigiamos, CD107a turinčios didelės subpopuliacijos, koreliuoja su nepaprastu moduliuojančiu ir terapiniu parakrininiu aktyvumu [47]. Čia mes atskleidėme, kad tiek vaisiaus, tiek perinatalinio hAFS yra stipriai būdingas šis molekulinis parašas, patvirtinantis jų sekrecinį potenciją ir turintis atitinkamų transliacinių padarinių. Be to, vaisiaus hAFS pasižymėjo neefektyviu aerobiniu metabolizmu, o brandesniems perinataliniams buvo didesnis deguonies suvartojimo greitis ir ATP sintezė. Tai gali reikšti labiau nesubrendusį II trimestro hAFS metabolinį profilį, kuris primena neišnešiotų naujagimių virkštelės stromos ląsteles, kurios parodė tą pačią tendenciją [60].

Siekiant suaktyvinti parakrininį potencialą, hAFS buvo veikiamas 24 valandų hipoksinio pradėjimo be serumo, strategiją, kurią anksčiau sėkmingai sukūrėme [34, 35, 37] vaisiaus ląstelėms ir kurią čia pirmą kartą ištyrėme su jų perinataliniu analogu. Vaisiaus ir perinatalinio hAFS paruošimas hipoksijos metu lėmė teigiamą jų sekrecijos koncentracijos ir išsiskiriančių EV kiekio didėjimo tendenciją, o nėštumo stadija neturėjo jokios įtakos nei ląstelių sekrecijos išeigai, nei EV morfologijai ir dydžio pasiskirstymui.

Pažymėtina, kad hAFS parakrininio krovinio apibūdinimas atskleidė tam tikrus specifinius skirtumus, atsižvelgiant į skirtingas mūsų įvertintas sąlygas. Proteominis vaisiaus hAFS sekrecijos profiliavimas atskleidė pastebimą faktorių pasiskirstymą, pagrįstą nėštumo stadija ir ląstelių hipoksiniu išankstiniu kondicionavimu. Tai rodo, kad hAFS parakrininis potencialas gali įgyti skirtingą tapatumą brendimo metu nuo Ⅱ iki Ⅲ nėštumo trimestro, kuris savo ruožtu gali būti moduliuojamas stimuliuojant sekretuojančias ląsteles in vitro . hAFS-CM ir hAFS-EV biologinių procesų praturtinimo analizė parodė, kad dauguma moduliuojamų baltymų gali atitikti ląstelių augimą / palaikymą ir baltymų metabolizmą, taip palaikydami teigiamą ląstelių parakrininį poveikį, apie kurį pranešta iki šiol. Visų pirma, buvo nustatyta, kad hipoksinis vaisiaus hAFS bendra sekrecija buvo praturtinta šilumos šoko baltymu HSPD1 (HSP60), kuris, kaip įrodyta, palaiko žaizdų gijimą diabetinės pelės odos pažeidimo modelyje ir skatina makrofagų pasiskirstymą į M2 fenotipą [61]. . Taip pat hipoksiniai vaisiaus hAFS-EV buvo praturtinti veiksniais, skatinančiais neurogenezę (HSPG2[62], ląstelių savęs atsinaujinimą, smegenų ir širdies ir kraujagyslių sistemos vystymąsi (LAMA5[63] ir LAMB1[64] bei migraciją (THBS1 [2]).) Proteoglikanas AGRN taip pat buvo rasta EV po hipoksinio vaisiaus hAFS pradėjimo.cistanche dosage redditMūsų išvados atitinka ankstesnius įrodymus, kad AGRN yra reguliuojamas mezenchiminių stromos ląstelių proteomuose, esant uždegiminiams ir hipoksiniams mokomiesiems dirgikliams [65]. Taip pat buvo įrodyta, kad AGRN yra susijęs su imuninės sinapsės signalizavimu [66] ir sutampa su naujagimių pelių širdies regeneracija [67], taip palaikydamas ryškų besivystančio vaisiaus hAFS polinkį į regeneracinį parakrininį poveikį. Be to, patvirtinta, kad vaisiaus hAFS labiau reaguoja į hipoksinį išankstinį kondicionavimą, kaip rodo kraujagyslių regeneracinio veiksmingumo prognozių, tokių kaip ANGIOGENIN, EMMPRIM, IL-8 ir MCP-1 citokinas[68], praturtėjimas. jų sąlygota terpė. Tai patvirtina ankstesnius įrodymus, kad vaisiaus hAFS-CM parakrininė galia skatina endogeninę neoarteriogenezę ikiklinikiniuose graužikų modeliuose, sergant miokardo infarktu, užpakalinių galūnių išemija ir išeminiu fasciokutaniniu atvartu [34,69-71] Be to, vaisiaus hAFS. Nustatyta, kad bendra sekrecija yra žymiai labiau praturtinta IGFBP2 ir OPN, palyginti su perinataliniu, todėl galima daryti išvadą, kad yra ryškesnis senėjimą skatinantis ir senėjimą stabdantis moduliacinis profilis[72-75]. Perinatalinis have-CM, nors ir buvo mažiau sustiprintas parakrininiais veiksniais, buvo panašiai papildytas neurotrofiniais ir imunomoduliuojančiais veiksniais, tokiais kaip CST3[76,77] ir MIF[78].

Palyginti su visu hAFS-CM, atitinkami hipoksiniai vaisiaus ir perinataliniai EV atitikmenys parodė mažesnę citokinų ir chemokinų ekspresiją, išskyrus kraujagyslių remodeliavimo tarpininką EMMPRIN [79], kuris daugiausia buvo praturtintas pūslelių skyriuje. Anksčiau praneštas kardioaktyvus ir pro-regeneracinis vaisiaus hAFS-EV profilis[34,37] buvo patvirtintas įrodymais, kad jie išskirtinai ekspresuoja kardioprotekcinį IL-8 [80] ir GDF-15, pagrindinis parakrininis veiksnys, sukeliantis endogeninę suaugusiųjų hipokampo neurogenezę[81,82], taip pat neutralizuojantis antraciklinų sukeltą kardiotoksiškumą [78]. Tiek vaisiaus, tiek perinatalinio hAFS-EV rodė panašią pirmtakų / kamieninių ląstelių prekybos reguliatoriaus SDF -1 [83-85] išraišką. Proteominė analizė parodė padidėjusią su angiogeneze susijusių baltymų, pvz., NRP1 [86] ir MP14[87], ekspresiją hipoksiniuose perinataliniuose hAFS-EV; toks stimuliuojantis profilis gali paaiškinti ankstesnius rezultatus, susijusius su Ⅲ trimestro hAFS endotelio regeneracinėmis savybėmis taikant ikiklinikinį skeleto raumenų išeminio pažeidimo pelės modelį [25], nepaisant įrodymų, kad jų hAFS-CM yra mažiau proangiogeniškas nei atitinkamas vaisiaus. Pažymėtina, kad nervinio augimo faktoriaus BDNF buvo rasta tiek vaisiaus, tiek perinatalinio EV kroviniuose, nors ir nedideliais kiekiais, todėl galima daryti prielaidą, kad hAFS-EV neurotrofinis aktyvumas vyksta neuronų išgyvenimo ir neurodeformacijos procesuose, kaip ir tarpląstelinėse pūslelėse, kurias išskiria žmogaus kaulas. čiulpų ir virkštelės kraujas-MSC[8889]. Nustatyta, kad abi vaisiaus ir perinatalinio hAFS sekrecinės formulės, kurioms taikoma hipoksinė stimuliacija, yra praturtintos PAI-1, endotelio aktyvacijos palengvinimo priemone [90], kuri taip pat buvo susijusi su M2 makrofagų poliarizacija širdyje ir turi kardioprotekcinių savybių. ir antifibrozinis potencialas [91].

MikroRNR (miRNR) buvo plačiai traktuojamos kaip esminiai kamieninių ląstelių ir mezenchiminių stromos ląstelių-EV parakrininio aktyvumo reguliatoriai [92, 93]. Čia mes nustatėme, kad 15 labiausiai praturtintų miRNR rūšių hAFS-EV apima daugiau nei 60 procentų viso miRNR kiekio kiekviename mėginyje. Buvo pranešta, kad šios miRNR charakterizuoja mezenchiminių stromos ląstelių EVS molekulinį krovinį (tegul -7b-5p, tegul-7f-5p, miR-21-5p ir miR-155-5p [96,97]), reklamuoja žaizdų gijimas reguliuojant keratinocitų funkciją (miR-16-5p [98]) ir neutralizuojamas neuronų mirtis po kaktinės smegenų išemijos (miR-29a-3p [99,100]). Kita vertus, likusiuose 30 procentų vezikulinės miRNR kiekio buvo rasta apie 1000 miRNR. Toks nesubalansuotas pasiskirstymas atitinka ankstesnius tyrimus [4] ir pabrėžia dažniausiai praturtintas miRNR, kaip tariamai atsakingas už pagrindinį hAFS-EV biologinį aktyvumą. Įdomu tai, kad vaisiaus ir perinataliniai hAFS-EV turėjo daugumą 15 miRNR. Pažymėtina, kad mes taip pat pastebėjome, kad tiek vaisiaus hAFS-EV, tiek perinataliniuose buvo labai stabilių miRNR rinkinys skirtinguose sodrinimo lygiuose. Tokie įrodymai gali pasiūlyti daugybę „namų tvarkymo“ kandidatų, kurie gali būti naudojami kaip vidinė kontrolinė kontrolė atliekant qPCR eksperimentus su hAFS-EV. Be to, nuoseklus tokių stabilių miRNR poaibis (miR-16-5p,miR-21-5p,miR-22-3p,miR-29a-3p,miR{ {40}}y miR-221-5p) yra dalijamasi tarp dviejų nėštumo etapų ir sutampa su 15 dažniausiai praturtintų, o tai rodo dar pastovesnį elgesį ir patikimą išankstinį molekulinį parašą ([96,{{45) }}]). Pažymėtina, kad neseniai buvo pranešta apie keletą tokio išskirtinio branduolio kandidatų kaip etaloninės miRNR neuroprotekcinėse EV, gautos iš II trimestro amniono skysčio gautų mezenchiminių stromos ląstelių (miR-29a-3p ir miR{{ 49}}p[95]). Nepaisant to, mes taip pat pastebėjome, kad nėštumo amžius gali moduliuoti miRNR krovinį labiau nei hipoksinis išankstinis kondicionavimas. Vystymosi daugiau nepilnamečių EV, gautų iš III trimestro vaisiaus hAFS, buvo praturtinti miRNR, kurios anksčiau, kaip įrodyta, palaiko embrioninių kamieninių ląstelių gyvybingumą (miR{51}}p [101]), ląstelių proliferaciją ir osteogeninę kaulų čiulpų stromos ląstelių diferenciaciją (miR). -217 [102]), kartu turintis naviko slopinimo potencialą (miR-302-3p[103,104]);miR-383-5p[105,106]).

Remdamiesi savo rezultatais, patvirtiname, kad vaisiaus ir perinatalinis hAFS gali būti patrauklūs parakrininiai šaltiniai, naudojami regeneracinei medicinai. Nors jų fenotipas ir sekrecinis aktyvumas buvo panašūs, mes pabrėžėme kai kuriuos ypatingus jų sekrecinių formulių aspektus kaip naudingą įžvalgą jų būsimam terapiniam vertimui.

4. Medžiagos ir metodai

4.1.Žmogaus amniono skysčio kamieninių ląstelių išskyrimas ir in vitro kultūra

Žmogaus vaisiaus vandenų kamieninės ląstelės (hAFS) buvo išskirtos iš likusių amniono skysčio (AF) mėginių, paimtų atliekant įprastinę prenatalinę patikrą, atliekant Ⅱ trimestro amniocentezę (vaisiaus hAFS, f-hAFS), arba kaip klinikinės atliekos per planuotą gimdymą po cezario pjūvio Ⅲ trimestrą. (perinatalinis hAFS, p-hAFS) Prenatalinės diagnostikos ir perinatalinės medicinos skyriuje, IRCCS San Martino ligoninėje, vaisiaus ir perinatalinės medicinos ir chirurgijos skyriuje bei žmogaus genetikos laboratorijoje IRCCS Istituto Gaslini ligoninėje (Genova, Italija). Iš visų donorų buvo gautas informuotas rašytinis sutikimas pagal vietos etikos komiteto leidimą (protokolas PR428REG2015) ir laikantis Helsinkio deklaracijos gairių. Antrojo trimestro vaisiaus AF mėginiai buvo paimti iš moterų donorių, kurių vidutinis amžius buvo apie 37,42±0,32 metų (n=15 svyruoja nuo 36-iki 41 metų);Ⅲ trimestro perinatalinio AF mėginiai buvo paimti iš moterų donorių, kurių amžiaus vidurkis yra 34,25±1,31 metų (n=10 svyruoja nuo 26- iki 42 metų). Vaisiaus ir perinatalinis hAFS buvo gauti iš mėginių, patvirtintų normaliam kariotipui ir išskirtų imunomagnetiniu būdu rūšiuojant c-KIT ekspresijai (CD117 MicroBead Kit, Miltenyi Biotechnology, Bolonija, Italija) iš prilipusių AF mezenchiminių stromos ląstelių [16].cistanche ekstrakto privalumaic-KIT* hAFS buvo auginami minimalioje esminėje terpėje (MEM)-alfa su 15 procentų FBS (Fetal Bovine Serum, Gibco-Thermo Fisher Scientific, Monza, Italija), 18 procentų Chang B ir 2 procentų Chang C terpės (Irvine Scientific). , Santa Ana, Kalifornija, JAV) su 1 proc. L-glutamino ir 1 proc. penicilino/streptomicino (Gibco-Thermo Fisher Scientific, Monza, Italija), inkubatoriuje 37 laipsnių temperatūroje su 5 proc. CO2 ir 20 proc. Ozo atmosfera ir kultivuojamas. iki 5 pasažų in vitro prieš naudojant jų sekreto izoliacijai.

4.2. Biocheminis hAFS metabolizmo įvertinimas

Cell aerobic metabolism was evaluated in terms of oxygen consumption and ATP synthesis through the FI-Fo ATP synthase. Oxygen consumption rate (OCR) was measured at 37 ℃ in a closed chamber magnetically stirred using an amperometric electrode (Unisense-Microrespiration, Unisense A/S, Denmark). One hundred thousand (10>) ląstelės buvo naudojamos kiekvienam eksperimentui. Norint įvertinti bazinį kvėpavimą, hAFS buvo permeabilizuotas 0,03 mg/mL digitoninu 10 min. ir suspenduotas fosfatiniame buferiniame fiziologiniame tirpale (PBS). Keliam stimuliuoti buvo pridėta 10 mM piruvato ir 5 mM malato arba 20 mM sukcinato. -būdai, sudaryti atitinkamai iš I, II ir IV kompleksų arba Ⅱ ir IV kompleksų [60].

Siekiant įvertinti santykinį glutamino, ilgos grandinės riebalų rūgščių oksidacijos ir gliukozės indėlį į kvėpavimą, po digitonino pralaidumo ląstelės buvo suspenduotos auginimo terpėje ir 4 uM BPTES, 4 uM etomoksiro ir 4 uM UK5{{22} }99 buvo pridėta siekiant slopinti atitinkamai glutaminazę, karnitino palmitoil-transferazę 1A (CPT1A) arba mitochondrijų piruvato nešiklį (MPC). Fi-F.ATP sintazės (ATP sintazės) aktyvumas buvo nustatytas matuojant ATP gamybą labai jautriu luciferino/luciferazės metodu. Tyrimai buvo atlikti 37 laipsnių kampu 2 minutes, o duomenys buvo renkami kas 3 0 s. Pirmajame eksperimentų rinkinyje 10 laipsnio ląstelės buvo inkubuojamos 10 min. terpėje, kurioje yra 50 mM KCl, 1 mMEGTA, 2 mMMEDTA, 5 mMKH2PO4, 2 mMMgC12, 0,6 m Mouabaino, 1 mM P1P5-Di. (adenozin-5')pentafosfatas, 0,040 mg/ml ampicilino ir 10 mM Tris-HCl pH 7,4. Vėliau ATP sintezė buvo sukelta pridedant kvėpavimo substratų (10 mM piruvato plius 5 mM malato arba 20 mM sukcinato) ir 0, 1 mM ADP. Reakcija buvo matuojama naudojant liuciferino/luciferazės ATP bioliuminescencijos tyrimo rinkinį CLSII (Roche, Bazelis, Šveicarija) luminometre (GloMax 20/20 Luminometer, Promega, Milanas, Italija) ATP standartiniuose tirpaluose (Roche, Bazelis, Šveicarija), kurių diapazonas yra {{ 42}}/M buvo naudojami kalibravimui. Antrajame eksperimentų rinkinyje ATP sintezė buvo įvertinta, kai buvo 4 uM BPTES, 4 uM etomoksiro arba 4 uM UK5099. Šiuo atveju 10 ląstelių buvo inkubuojamos 10 minučių auginimo terpėje, kai nebuvo arba nebuvo metabolizmo inhibitorius, o ATP sintezė buvo sukelta 0,1 mM ADP. OxPhos (oksidacinio fosforilinimo) efektyvumas (P/O santykis) buvo apskaičiuotas kaip santykis tarp pagaminto ATP koncentracijos ir suvartoto deguonies kiekio, esant kvėpavimo substratui ir ADP. Kai deguonies suvartojimas yra visiškai skirtas energijos gamybai, P/O santykis turi būti atitinkamai maždaug 2,5 ir 1,5 po piruvato ir malato arba sukcinato pridėjimo. augimo terpėje. Gliukozės suvartojimas buvo įvertintas heksokinazės (HK) ir gliukozės -6-fosfato dehidrogenazės (G6PD) sujungimo sistema, sumažinus NADP ties 340 nm. Tyrimo terpėje buvo 100 mM Tris-HCl, pH 7,4, 2 mM ATP, 10 mMNADP, 2 mMMgC12, 2 TV heksokinazės ir 2 TV gliukozės -6-fosfato dehidrogenazės. Laktato išsiskyrimas buvo tiriamas sumažinus NAD plius 340 nm. Tyrimo terpėje buvo 100 mM Tris-HCl (pH8), 5 mM NAD plius ir 1 IU/ml laktatdehidrogenazės. Mėginiai buvo analizuojami prieš ir po 4 ug išgryninto laktatdehidrogenazės pridėjimo. Abiem atvejais duomenys buvo normalizuoti pagal ląstelių skaičių ir atitinkamai išreikšti kaip mM gliukozės / 10 laipsnių ląstelių arba mM laktato, išleisto / 10 laipsnių ląstelėse [107].

4.3. Srauto citometrija hAFS apibūdinimas

Šimtas tūkstančių (105) vaisiaus ir p-hAFS ląstelių buvo atskirtos ir inkubuojamos su pelių anti-žmogaus-CD107a-Alexa Fluor 647-ir anti-žmogaus CD146-FITC- konjuguoti antikūnai (eBioscience, Thermo Fisher Scientific, Monza, Italija). Ląstelių apoptozė buvo įvertinta naudojant FITC Annexin V Apoptozės aptikimo rinkinį (BD Pharmingen, Becton Dickinson, Mi-lan, Italija), vadovaujantis gamintojo instrukcijomis. Įvykiai buvo gauti naudojant BD Bioscience FACS Aria II rūšiatorių ir analizatorių, aprūpintą FACS Diva programine įranga (BD Bioscience, Bec-ton Dickinson, Milanas, Italija). Duomenys buvo analizuojami naudojant FlowJo V9.0 programinę įrangą (BD Bioscience, Becton Dickinson, Milanas). , Italija). 4.4.Senėjimo dažymas

hAFS, kultivuoto iki 5 pasėjimo standartinėmis in vitro sąlygomis, senėjimo fenotipas buvo įvertintas naudojant Senescence-Galactosidase dažymo rinkinį (Cell Signaling Technology, Danvers, MA, JAV): f-hand p-hAFS buvo fiksuotas 1x Fixative tirpalu, esant 70 proc. susiliejimas ir nudažytas SA- -gal 37 laipsnių temperatūroje per naktį, pagal gamintojo instrukcijas. Senėjimo įvykiai buvo užfiksuoti naudojant „Leica DMil“ mikroskopą (su „Leica Acquire“ programine įranga V3.4.4, „Leica Microsystems“, Milanas, Italija) ir įvertinti kaip SA- -gal teigiamų ląstelių procentas nuo visų ląstelių viename lauke.

4.5. hAFS sekrecijos frakcijų atskyrimas ir koncentracija

f-hAFS ir p-hAFS buvo auginami 24 valandas terpėje be serumo (SF) esant 1 procento O2 hipoksijai, palyginti su 20 procentų O2 normoksija (kontrolė), pastaroji buvo naudojama kaip pradinė atskaita. Ši išankstinio kondicionavimo strategija buvo naudojama siekiant padidinti biologiškai aktyvių parakrininių faktorių išsiskyrimą, kaip anksčiau pranešėme [34, 35, 37, 49]. hAFS buvo kultivuojami 24 valandas terpėje be serumo (SF) (didelės gliukozės koncentracijos Dulbecco modifikuotoje Eagle's Medium, DMEM, su 1 proc. L-glutamino ir 1 proc. penicilino/streptomicino, visi iš Gibco-Thermo Fisher Scientific, Monza, Italija), esant normaliam slėgiui. (20 proc. O2 ir 5 proc. CO2 esant 37 laipsnių) arba hipoksinėms (1 proc. O2 ir 5 proc. CO2 esant 37 laipsnių CellXpert C170i ir Galaxy 48R CO2 inkubatoriams iš Eppendorf, Milano, Italija) sąlygomis.

f-hAFS-CM ir p-hAFS-CM buvo surinkti ir centrifuguoti 4 laipsnių kampu 300x g 10 min. ir 2000x g 20 min., kad būtų pašalintos ląstelių liekanos; hAFS-CM buvo koncentruojamas naudojant ultrafiltravimo membranas su 3 kDa selektyviąja riba (Amicon Ultra-15, Merck Millipore Darmstadt, Vokietija) 4 laipsnių kampu, esant 3000 × g 90 min., ir toliau koncentruojamas 4 laipsnis 3000× g 30 min. hAFS-EV buvo atskirti ir sukoncentruoti serijiniu ultracentrifugavimu iš hAFS-CM. Trumpai tariant, hAFS-CM buvo surinktas ir centrifuguojamas 4 laipsnių kampu 300 x g 10 minučių ir 2000 x g 20 minučių, kad būtų pašalintos ląstelių liekanos. Tada supernatantas buvo apdorotas 10 000 × g 40 minučių. Granulės buvo išmestos, o supernatantas toliau apdorojamas ultracentrifuguojant Optima L-90K (Beckmann Coulter, Milanas, Italija) esant 10 000 × g 120 minučių, naudojant Beckman Coulter svyruojančius kaušo SW55Ti centrifugos rotorius. Granulės, kuriose yra heterogeninių hAFS-EV, buvo plaunamos PBS, galutinai centrifuguojant 100 000 × g greičiu 120 minučių, o po to pakartotinai suspenduojamos PBS, filtruojamame 0,22 um porų filtro membrana. Baltymų koncentracija hAFS-CM ir hAFS-EV paviršiuje buvo matuojama naudojant Bicinchoninic Acid (BCA) testą (Thermo Fisher Scientific, Monza, Italija). Mėginiai buvo paimti naudojant Gen5 mikroplokštelių skaitytuvą esant 570 nm, kad būtų galima įvertinti hAFS-CM ir hAFS-EVs išeigą ug tirpalo / 10 laipsnių gaminančios ląstelės.

4.6. HAFS-EV apibūdinimas naudojant perdavimo elektronų mikroskopiją ir nanodalelių sekimo analizę

Transmisijos elektronų mikroskopijos (TEM) analizė buvo atlikta naudojant Hitachi TEM mikroskopą (HT7800 serija, Hitachi High Technologies, Monza, Italija). Skaitmeniniai vaizdai buvo padaryti naudojant „Mega view 3“ kamerą ir „Radius“ programinę įrangą (EMSIS, Miunsteris, Vokietija). f-hAFS ir p-hAFS buvo fiksuoti 3,7 procentų paraformaldehido (PA) tirpale, praskiestame 1:1 su visa hAFS terpe, išplauti 0,1 M kakodilato buferiu ir po to nedelsiant inkubuoti 1 valandą kambario temperatūroje 0,1 M kakodilato buferis, kuriame yra 2,5 procento glutaraldehido (Electron Microscopy Science, Hatfield, PA, JAV). Ląstelių granulės buvo fiksuotos osmio tetrokside 1 valandą ir 1 procento uranilo acetato tirpale 1 valandą. Mėginiai buvo dehidratuoti 24 valandas 42 laipsnių temperatūroje ir 48 valandas 60 laipsnių temperatūroje per graduotą etanolio seriją ir įterpti į epoksidinę dervą (Poly-Bed; Polysciences Europe GmbH, Mineapolis, Vokietija). Itin plonos sekcijos (50 nm) buvo supjaustytos Leica Ultracut mikrotomu (Leica Microsystems, Milanas, Italija) ir nudažytos 5 procentų uranilo acetatu 50 procentų etanolio tirpale. f-hAFS-EV ir p-hAFS-EV buvo resuspenduojami 20 ul PBS tirpalo ir fiksuojami pridedant vienodą tūrį 2 procentų paraformaldehido 0,1 M fosfato buferiniame tirpale (pH 7,4). Tada EV 10 minučių buvo adsorbuojami ant formvaro anglimi dengtų varinių grotelių, plūduriuojant tinklelius ant 5 μL lašų ant parafilmo. Vėliau tinkleliai su prilipusiais EV buvo nuplauti PBS ir neigiamai nudažyti 2 procentų uranilo acetato tirpalu 5 minutes kambario temperatūroje. Beicuotos grotelės buvo įterptos į 2,5 procento metilceliuliozę, kad būtų geriau išsaugotos, ir prieš tyrimą išdžiovintos ore. HAFS-EV morfometrinė analizė buvo išmatuota 10 atsitiktinai paimtų mikrografijų 40000 × g padidinimu. Dydis buvo apskaičiuotas naudojant savavališką linijos funkciją, įterptą į Radius programinės įrangos matavimo dialogo langą (EMSIS, Muenster Vokietija). Norint vizualizuoti hAFS-EV dydžio pasiskirstymą, rezultatai buvo nubraižyti kaip taško sklaidos diagrama ir kaip dažnio pasiskirstymas, kuriame kiekvienas dydis vaizduojamas kaip taškas kartu su vidutinės vertės ir diapazono linijomis.

f-hAFS-EV ir p-hAFS-EV taip pat buvo analizuojami naudojant nanodalelių sekimo analizę (NTA), siekiant įvertinti daleles, kurias išskiria 10 laipsnių ląstelės. hAFS-EV buvo atskiesti 1:100 PBS tirpalu ir įsigyti naudojant NanoSight LM10 (Malvern Instruments, Malvern, JK), kuris užfiksavo mažiausiai 3 skirtingus kadrus po 60 s. Trys skirtingi kiekvieno mėginio įsigijimai buvo išanalizuoti naudojant programinės įrangos paketinio proceso parinktį. 4.7. LC-MS/MS hAFS-CM ir hAFS-EV analizė 4.7.1. Virškinimas tirpale

Proteominė analizė buvo atlikta su 3 biologiniais hAFS-CM ir hAFS pakartojimais. EV iš f-hAFS ir p-hAFS po normalinio ar hipoksinio kondicionavimo (n=24 skirtingų sąlygų).hAFS-CM ir hAFS-EVs mėginiai buvo suspenduoti 0.1 M NHCO3 pH 7,9 ir apdoroti RapigestIM SF reagentas (Waters Co, Milford, MA, JAV), kai galutinė koncentracija yra 0,25 proc. (m/t). Gautos suspensijos buvo inkubuojamos maišant 100 laipsnių temperatūroje 2{{40}} min. Virškinimas buvo atliktas kiekvienam mėginiui pridedant sekvenavimo laipsnio modifikuoto tripsino (Promega Inc, Madison, WI, JAV) fermento/substrato santykiu 1:50 (m/m) per naktį 37 laipsnių temperatūroje 0,1 M NH4HCO3 pH 7,9. Buferis su 10 procentų CHSCN. Ryte buvo pridėta papildoma tripsino alikvotinė dalis (1:100 w/w) ir virškinimas tęsiamas 4 valandas. Be to, pridėjus 0,5 procento trifluoracto rūgšties (TFA) Gigma-Aldrich Inc., Sent Luisas, MO, JAV) buvo sustabdyta fermentinė reakcija, o vėlesnis inkubavimas 37 laipsnių temperatūroje 45 minutes užbaigė RapiGest rūgšties hidrolizę[108]. Su vandeniu nesimaišantys skilimo produktai buvo pašalinti centrifuguojant 13.000 aps./min. 10 min. Galiausiai pagal gamintojo protokolą iš triptinio skaidymo mišinių buvo pašalinta druska naudojant PierceTM C-18 sukimo kolonėles (Thermo Fisher Scientific, Monza, Italija) ir resuspenduojama 0,1 proc. skruzdžių rūgštyje (Sigma-Aldrich Inc., St. Louis, MO, JAV) vandenyje (LC-MS Ultra CHROMASOLVTM, Honeywell Riedel-de HaenTM, Muskegon, MI, JAV), esant 0,1 ug/μL koncentracijai.

4.7.2.Skysčių chromatografija

Tripsinu skaidomi mišiniai buvo analizuojami naudojant platformą, kurią sudaro nanoskysčių chromatografinė sistema Eksigent nanoLC-Ultra[2]2D sistema (Eksigent, AB SCIEX Dublin, Dublinas, CA, JAV dalis), sukonfigūruota spąstų eliuavimo režimu. kartu su didelės raiškos masės spektrometru. Trumpai tariant, mėginiai (suleisti 0,8 ug) pirmiausia buvo įkelti į peptidų gaudyklę (200 um × 500 um ChromXP C18- CL, 3 um, 120 A) ir plaunama pakrovimo siurbliu, veikiančiu izokratiniu režimu su 0,1 procento skruzdžių rūgštimi vandenyje 10 min., kai srautas yra 3 μL/min. Automatiškai perjungus dešimties angų vožtuvą, įstrigęs mišinys išplautas nano atvirkštinės fazės kolonėlėje (75 um × 15 cm ChromXP C18-CL, 3 um, 120 A) per 150 min. B eliuento gradientą. (eliuentas A, 0,1 proc. skruzdžių rūgštis vandenyje; eliuentas B, 0,1 proc. skruzdžių rūgštis acetonitrile) esant 300 nL/min. Išsamiau, gradientas buvo toks: nuo 5-10 proc. Bin 3 min., 10-40 proc. Bin 130 min, 40-95 proc Bin 10 min ir išlaikant 95 proc. B 7 min. 4.7.3.Masių spektrometrija

MS/MS analizė buvo atlikta naudojant LTQ-OrbitrapXL masės spektrometrą (Thermo Fisher Scientific, Monza, Italija), turintį nanopurškimo jonų šaltinį. Purškimo kapiliarų įtampa buvo nustatyta 1,7 kV, o jonų perdavimo kapiliarų temperatūra buvo palaikoma 22{11}} laipsniais. Visi MS spektrai buvo įrašyti per 400-1600 m/z diapazoną teigiamų jonų režimu, skiriamoji geba buvo 60 000 (visas plotis esant pusei didžiausio) ir nuskaitymo greitis 2 spektrai/s. Po šio etapo sekė penki mažos skiriamosios gebos MS/MS įvykiai, kurie buvo nuosekliai generuojami, atsižvelgiant į duomenis, naudojant penkis geriausius jonus, atrinktus iš viso MS spektro (esant 35 procentų susidūrimo energijai), naudojant dinaminę 0,5 min. MS/MS analizė. Masių spektrometro nuskaitymo funkcijos ir didelio efektyvumo skysčių chromatografijos tirpiklių gradientai buvo valdomi Xcalibur duomenų sistemos 1.4 versija (Thermo Fisher Scientific, Monza, Italija).

4.7.4.Proteominis duomenų apdorojimas ir duomenų gavyba

Visų sugeneruotų duomenų buvo ieškoma naudojant Sequest HT paieškos variklį, esantį Thermo Scientific Proteome Discoverer programinėje įrangoje, 2.1 versija. Eksperimentiniai MS/MS spektrai buvo koreliuojami su triptinių peptidų sekomis, lyginant su teoriniais masės spektrais, gautais in silico skaidant Uniprot Homo Sapiens proteomų duomenų bazę (74600 įrašai), atsisiųsta sausio 2 d. 020 (www.uniprot.org, pasiekta 10 kovo 2 d.021). Peptidų sekoms ir susijusiems baltymams nustatyti buvo naudojami šie kriterijai: tripsinas kaip fermentas, trys praleisti skilimai vienam peptidui, pirmtakų jonų masės tolerancija ±50 ppm ir ±0,8 Da fragmento jonams. Perkoliatoriaus mazgas buvo naudojamas su taikinio apgaulės strategija, kad galutinis klaidingų atradimų dažnis (FDR) peptidų spektro atitikties (PSM) lygyje būtų 0,01 (griežtas), remiantis q reikšmėmis, atsižvelgiant į didžiausią deltaCN 0,05 [109]. Buvo atsižvelgta tik į peptidus, kurių minimalus peptido ilgis yra šešios aminorūgštys ir 1 rangas. Buvo taikomi baltymų grupavimo ir griežti taupymo principai. MS duomenys buvo perkelti į ProteomeXchange konsorciumą per PRIDE [10]partnerių saugyklą (ftp://massive.ucsd.edu/MSV000087013/, pasiekta 2021 m. kovo 10 d.). 48 baltymai, gauti iš SEQUEST algoritmo, buvo sulygiuoti, normalizuoti. , ir palyginti be etikečių. Šiam tikslui buvo naudojamas vidinis algoritmas, ty daugiamatis algoritmo baltymų žemėlapis (MAProMa), naudojant vidutinius peptidų spektro atitikmenis (aPSM) [111 112], kurie atitinka visų baltymui nustatytų spektrų vidurkį ir atitinkamai. , atsižvelgiant į jo santykinį gausumą, kiekvienoje analizuojamoje būsenoje. Siekiant atrinkti skirtingai ekspresuotus baltymus, pogrupiai (tiek vaisiaus, tiek perinatalinio hAFS-CM, ir hAFS-EV, atsižvelgiant ir į hipoksinį ląstelių kondicionavimo stimuliavimą) buvo lyginami poromis, dviem MAProMa taikant 0,4 ir 5 slenksčius. atitinkamai indeksai DAve (diferencinis vidurkis) ir DCI (diferencinis pasitikėjimo indeksas). DAve, įvertinantis baltymų ekspresijos pokyčius, buvo apibrėžtas kaip (XY)/(X＋Y)/0,5, o DCI, įvertinantis diferencinės ekspresijos patikimumą, buvo apibrėžtas kaip (X plius Y) × (XY)/2 X ir Y. terminai reiškia tam tikro baltymo PSM dviejuose palyginamuose mėginiuose. Be to, vidutiniams baltymų sąrašams, gautiems iš kiekvienos ištirtos būklės, buvo atlikta linijinė diskriminacinė analizė (LDA), o baltymams, kurių F santykis didžiausias (didesnis arba lygus 4,5) ir mažiausia p reikšmė (mažesnė arba lygi 0,001) buvo išsaugoti ir apdoroti hierarchiniu klasterizavimu, taikant Wardo metodą ir Euklido atstumo metriką naudojant JMP 15.2 programinę įrangą. Tiksliau, F koeficientas reiškė modelio vidutinį kvadratą, padalytą iš paklaidos vidurkio kvadrato, o p reikšmė parodė tikimybę gauti F vertę, didesnę nei apskaičiuota, jei iš tikrųjų nebuvo skirtumo tarp gyventojų grupės vidurkių. 4.8. HAFS-CM ir have-EV citokinų ir chemokinų profiliavimas

hAFS-CM ir have-EV, gautų f-hAFS ir p-hAFS po hipoksinio kondicionavimo, citokinų ir chemokinų profiliavimas buvo įvertintas naudojant Proteome ProfilerTM Human XL citokinų masyvo rinkinį (R&D sistema, Mineapolis, MN, JAV) pagal gamintojo instrukcijas. Buvo panaudota dvidešimt ug hAFS-CM ir hAFS-EVs mėginių. Membranų vaizdai buvo gauti naudojant „Chemidoc Mini HD9 Auto“ (Uvitec Cambridge, JK). Konkretus citokinų / chemokinų kiekis buvo įvertintas kiekybiškai įvertinus kiekvieno aptinkamo citokino teigiamą pikselių intensyvumą (naudojant savavališką vienetą), naudojant „ImageJ“ programinę įrangą (pasiekiama https: //imagej.nih.gov/ij/,pasiekta 2021 m. kovo 10 d. [13]). 4.9.RNR ekstrahavimas iš hAFS-EV ir Next

Kartų seka

RNR buvo išskirta iš f-hAFS-EV ir p-have-EV naudojant miRNeasy Micro Kit (Qiagen, Milanas, Italija) pagal gamintojo instrukcijas. RNR vientisumas ir dydžio pasiskirstymas buvo įvertintas naudojant Agilent Small RNA Kit su mažu nekoduojančiu RNR lustu, kad būtų galima įvertinti mažų RNR kiekį nuo 6 iki 150 nukleotidų (nt). „Qubit microRNA Assay Kit“ („Thermo Fisher Scientific“, Monza, Italija) buvo naudojamas mikroRNR (miRNR) kiekiui nustatyti pagal gamintojo instrukcijas. miRNR sekos nustatymo bibliotekos buvo paruoštos ir amplifikuotos naudojant QIAseq miRNA Library rinkinį (Qiagen, Milanas, Italija), naudojant 18,5 ng izoliuotų miRNR kaip įvestį ir vadovaujantis gamintojo instrukcijomis. Bibliotekos buvo sujungtos po to, kai TapeStation (Agilent Technologies, Foster City, CA, JAV) atliko kokybės patikrinimą ir kiekybinį įvertinimą naudojant Agilent High Sensitivity D1000 ScreenTape. Sujungtų bibliotekų kokybės kontrolė buvo įvertinta naudojant qPCR realiuoju laiku, vadovaujantis „Sequencing Library qPCR Quantification“ vadovu (Illumina Inc, San Diego, CA, JAV) ir sekvenuotos Illumina NextSeq platforma, naudojant High Output Hit v2.5 (75 ciklai) ( Illumina Inc, San Diegas, CA, JAV). Bazinis iškvietimas buvo atliktas naudojant numatytąją Illumina NextSeq500 darbo eigą.

4.10.MiRNR sekos nustatymo bioinformatinė duomenų analizė

Fastq failai pirmą kartą buvo apdoroti nupjaunant 3' adapterį ir žemos kokybės pagrindus naudojant Cutadapt [114]. Po apipjaustymo buvo nustatytos įterpimo sekos ir UMI sekos. Nuskaitymai be adapterio sekos, skaitymai su mažesnėmis nei 16 bp įterpimo sekomis ir skaitymai su mažiau nei 10 bp UMI sekomis buvo atmesti. Norėdami anotuoti įterpimo sekas, skaitymai buvo suderinti su GRCh38 žmogaus genomo rinkiniu, naudojant Bowtie [15] Kiekvienam mėginiui buvo suskaičiuoti visi tam tikrai miRNR priskirti rodmenys, o susiję UMI buvo sujungti, kad būtų skaičiuojamos unikalios molekulės. Antrinė analizė buvo atlikta naudojant pasirinktinius R scenarijus, prieinamus pagrįstu prašymu. Diferencialinė sodrinimo analizė atlikta naudojant Limma [116] ir EdgeR Bioconductor paketus [117].

4.11. Statistinės analizės

Rezultatai pateikiami kaip mažiausiai trijų (n{{0}}) nepriklausomų eksperimentų vidurkis ± sem. Palyginimai buvo atlikti taikant vienpusį ANOVA, po kurio buvo atliktas posthoc Tukey daugkartinio palyginimo testas arba Stjudento t-testas. Analizės buvo atliktos naudojant Graph-Pad Prism 8.0.2 versiją (GraphPad Software, https://www.graphpad.com, pasiekiama 2021 m. kovo 10 d.), o statistinis reikšmingumas nustatytas * p<0.05. for="" proteomics="" analysis,="" the="" distribution="" of="" proteins="" in="" the="" examined="" conditions,="" functional="" enrichment="" analysis,="" and="" comparison="" of="" data="" versus="" the="" vesiclepedia="" database="" (http:/microvesicles.org,="" accessed="" on="" 10="" march="" 2021)="" were="" achieved="" using="" funrich="" (version="" 3.1.3,http://www.funrich.org,accessed="" on="" 10="" march="" 2021[54]),="" that="" uses="" hypergeometric="" test="" and="" bonferroni="" for="" statistics="" and="" allows="" the="" graphical="" visualization="" of="" data="" with="" venn="" and="" bar="" charts="" [118].="" 5.="">

Apibendrinant, nustatyta, kad vaisiaus ir perinatalinis hAFS yra fenotipiškai lygiavertis panašiam sekrecijos stiprumui ir EV praturtėjimui dydžiu ir pasiskirstymu; vis dėlto kai kurie jų slaptojo profilio skirtumai gali būti įvertinti. Tiksliau, vaisiaus hAFS vystymuisi nesubrendusį profilį gali apibendrinti jų sekrecijos formulės, turinčios ryškesnę provaskulogeninę, regeneracinę ir jauninančią sekreciją. Tačiau perinatalinis hAFS vis dar išlaiko atitinkamą parakrininį profilį dėl veiksnių, susijusių su endotelio ląstelių migracija, imunomoduliaciniu, priešuždegiminiu ir neurotrofiniu potencialu, panašiu į vaisiaus hAFS. Šios išvados gali suteikti naudingų įžvalgų, palaikančių būsimą su traumų ir uždegiminių / išeminių ligų parakrininį gydymą. Todėl vaisiaus arba perinatalinio hAFS pasirinkimas kaip idealiausias ląstelių šaltinis turėtų būti įvertintas atsižvelgiant į konkretų klinikinį scenarijų.

Šis straipsnis yra ištrauktas iš Int. J. Mol. Sci. 2021, 22, 3713. https://doi.org/10.3390/ijms22073713 https://www.mdpi.com/journal/ijms