Ciklopentanonas turi anti-melanogenezę ir raukšles mažinančią veiklą sergant B16F10 melanoma

Kontaktas:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Hee Jin Jung 1, A Kyoung Lee 1,2, Yeo Jin Park 1,2, Sanggwon Lee 1,2, Dongwan Kang 1,2, Young Suk Jung 1,2, Hae Young Chung 1,2 ir Hyung Ryong Moon 1, 2,*

Santrauka:Ultravioletinės (UV) spinduliuotės poveikis yra pagrindinė išorinio odos senėjimo, dėl kurio atsiranda odos hiperpigmentacija ir raukšlėjimas, priežastis. Šiame tyrime ištyrėme (2E,5E)-2,5-bis(3-hidroksi-4-metoksibenziliden)ciklopentanono (BHCP) balinamąjį poveikį B16F10 melanomai ir jos anti- raukšlių aktyvumas ant Hs27 fibroblastų ląstelių. Nustatyta, kad BHCP stipriai slopina tirozinazę, o 50 procentų slopinimo koncentracijos (IC50) reikšmės yra 1,10 μM ir 8,18 μM formikofenolato (L-tirozino) ir difenolazės (L-DOPA), o fermentų kinetikos tyrimas atskleidė, kad BHCP yra konkurencinio tipo inhibitorius. . Be to, BHCP reikšmingai slopino melanino kiekį ir ląstelių tirozinazės aktyvumą ir sumažino su mikroftalmija susijusio transkripcijos faktoriaus (MITF), fosforilinto cAMP atsako elementą surišančio (CREB) baltymo ir melanocitus stimuliuojančio hormono (-MSH) sukelto tirozinazės lygį. B16F10 melanomos ląstelės. Be to, BHCP slopino p65 fosforilinimą ir matricos metaloproteinazių (MMP-1, MMP-9, MMP-12 ir MMP-13) ekspresiją Hs27 fibroblastuose. Todėl mūsų rezultatai rodo, kad BHCP gali būti geras kandidatas kuriant terapines medžiagas nuo ligų, susijusių su hiperpigmentacija ir raukšlėjimu.

Raktiniai žodžiai: (2E,5E)-2,5-Bis(3-hidroksi-4-metoksibenziliden)ciklopentanonas (BHCP); tirozinazės inhibitorius;anti-melanogenezė; nuo raukšlių

Cistanche yranuo raukšlių.

1. Įvadas

Odos senėjimas yra sudėtingas ir progresuojantis procesas, lemiantis funkcinius ir estetinius odos pokyčius, dėl kurių yra atsakingi tiek vidiniai, tiek išoriniai veiksniai [1]. Išorinį odos senėjimą sukelia aplinkos agresoriai, tokie kaip ultravioletinė (UV) spinduliuotė, stresas ar rūkymas. Tačiau tai daugiausia sukelia pakartotinis saulės UV spindulių poveikis, vadinamas fotosenėjimu. Odos fotosenėjimui būdingos stambios ir gilios raukšlės, storis, šiurkštumas, dispigmentacija ir histologiniai pokyčiai [2–4].

Tirozinazė (EC 1.14.18.1), kuri taip pat žinoma kaip polifenoloksidazė, yra vienas iš daugiafunkcinių vario turinčių fermentų, dalyvaujančių melanino sintezėje ir plačiai randamas gamtoje [5]. Tirozinazės paprastai yra daugumoje mikroorganizmų, augalų, ir gyvūnai. Augaluose tirozinazė veikia oksiduodama monofenolius į difenolius (mikofenolato aktyvumas) ir dalyvauja oksiduojant o-difenolius į o-chinonus (difenolazės aktyvumas), po to chinonus oksiduojant į tamsiai rudus pigmentus [6].

Melanogenezė yra L-tirozino pavertimas 3,4-dihidroksifenilalaninu (L-DOPA), kurio metu L-DOPA virsta DOPA chininu [7]. Taigi tirozinazė vaidina svarbų vaidmenį melanino gamyboje melanocituose, o tirozinazės slopinimas yra patrauklus tikslas gerinant su pigmentacija susijusius sutrikimus ir kuriant balinančias medžiagas [8, 9]. Melanino sintezę skatina keli dirgikliai, tokie kaip UV ir cheminės medžiagos, įskaitant izobutilmetilksantiną (IBMX) ir alfa melanocitus stimuliuojantį hormoną (-MSH). -MSH jungiasi prie savo receptoriaus melanokortino 1 receptoriaus (MC1R), vėliau padidindamas citoplazminio ciklinio AMP (cAMP) lygį. Padidėjęs cAMP lygis suaktyvina baltymų kinazę A (PKA), kuri skatina su mikroftalmija susijusio transkripcijos faktoriaus (MITF) ekspresiją fosforilinant cAMP atsako elementą surišantį baltymą (CREB). MITF skatina tirozinazės, su tirozinaze susijusio baltymo (TRP)-1 ir TRP-2 ekspresiją, o tai galiausiai padidina melanino sintezę [10]. MITF laikomas pagrindiniu melanogenezės transkripcijos faktoriumi; todėl buvo atlikta daug tyrimų, siekiant kontroliuoti MITF ekspresiją, kad slopintų melanogenezę [11].

Yra žinoma, kad raukšlių susidarymas yra glaudžiai susijęs su odos ekstraląstelinės matricos irimu, o UV spinduliuotė suaktyvina branduolinį faktorių κB (NF-κB), taip padidindama kolageno fragmentacijos ir matricos metaloproteinazių (MMP) gamybą [2]. MMP yra nuo cinko priklausomos endopeptidazės, kurios yra svarbios tarpląstelinės matricos struktūros atstatymui odoje. Todėl pernelyg didelis kolageno ir matricos skaidymas UV sukeltų MMP yra būdingas fotopažeistos odos požymis, o MMP naudojami kaip pagrindinis UV sukelto fotosenėjimo ir odos uždegimo žymuo [12].

Į kurkuminą panašūs diarilheptanoido skeleto dariniai buvo antioksidantai, priešvėžinė veikla, karkasai, įskaitant (2E,5E)-2,5-bis(3-hidroksi-4-metoksibenziliden)ciklopentanoną (BHCP) (1 pav.),parodyti platų priešuždegiminių, anti-melanogenezės spektrą, ypač Leow ir kt. [19], apie biologinį aktyvumą ir antitirozinazę [13–18] dibenzilideno ciklopentanoną 2014 m., kurie gali prisidėti prie apsauginio poveikio žmogaus osteosarkomai, reguliuojant Wnt/-kateninsignalizacijos kelią. Tačiau BHCP anti-melanogenezės ir raukšlių poveikį dar reikia atrasti, o jo aktyvumo molekuliniai mechanizmai dar nėra aiškiai nustatyti.

1 pav. (2E,5E)-bis(3-hidroksi-4-metoksibenziliden)ciklopentanono (BHCP) struktūra.

Šiame tyrime ištyrėme BHCP anti-melanogenezės ir raukšlių potencialą ir siekėme nustatyti mechanizmą, ypač atsižvelgiant į melanino kiekį ir ląstelių tirozinazės aktyvumą, kurie buvo ištirti naudojant tirozinazės slopinimo tyrimą ir fermentų kinetikos analizę. Be to, mes parodėme, kad BHCP slopina melanogenezę ir raukšles, susijusias su CREB / MITF / tirozinazės sumažėjimu -MSH sukeltose B16F10 pelės melanomos ląstelėse ir p65 fosforilinimo bei MMP ekspresijos slopinimu UV sukeltuose žmogaus fibroblastuose Hs27.

drakono žolelių cistanche

2. Rezultatai ir aptarimas

2.1. (2E,5E)-2,5-Bis(3-hidroksi-4-metoksibenziliden)ciklopentanono (BHCP) sintezė

{{0}}hidroksi-4-metoksibenzaldehido (100 mg, 0,66 mmol, izovanilino) ir ciklopentanono (0,03 ml, 0,33) tirpalas mmol) 1 N HCl-acto rūgšties tirpale (0,02 ml) maišoma 25 °C temperatūroje 2 valandas. Po 1 paros pastovėjimo reakcijos mišinys apdorojamas šaltu vandeniu, esant nedideliam kiekiui metanolio, filtruojamas ir plaunamas šaltu vandeniu, kad gautų BHCP (65,9 mg) su 56,9 proc. išeiga. BHCP buvo nustatytas spektroskopiniais metodais, įskaitant 1H ir 13C-BMR, taip pat palyginimas su publikuotais spektriniais duomenimis ir plonasluoksnės chromatografijos (TLC) analize [19]. Struktūra parodyta 1 paveiksle.

BHCP: geltoni amorfiniai milteliai (CHCl3); 1H-BMR (500 MHz, DMSO-d6) 8: 9,25 (s, 2H, 2 × OH), 7,28 (s, 2H, 2 × vinilo H), 7,14 (d, 2H) , J=2.0 Hz, 2 × 2-H), 7,11 (dd, 2H, J=8,5, 2,0 Hz, 2 × 6- H), 7,01 (d, 2H, J=8,5 Hz, 2 × 5-H), 3,81 (s, 6H, 2 × OMe), 3,01 (s, 4H, 2 × CH2) ; 13C-BMR (100 MHz, DMSO-d6) 8: 195,5, 149,9, 147,2, 136,0, 133,1, 129,1, 124,3, 117,5, 112,8, 56,3, 26,6; ESI-MS: m/z 351 (M-H)-.

2.2. BHCP slopinamasis poveikis grybų tirozinazės aktyvumui

Kaip parodyta 1 lentelėje, BHCP slopino tirozinazę, kai IC50 vertės buvo 1,10 ± 0,12 μMand 8,18 ± 0,44 μM, o kojinės rūgšties (teigiama kontrolė) IC50 vertės buvo 18,68 ± 3,8 ± 1,40 ± 1,8 Mand. μM atitinkamai monofenolazei ir difenolazei. Ankstesniame sintetinių potencialių tirozinazės inhibitorių tyrime, atlikdami molekulinio modeliavimo tyrimus, nustatėme mechanizmą, pagal kurį benzilideno 3-hidroksi ir 4-metoksi grupės turėjo didelę jungimosi tendenciją prie tirozinazės aktyvios vietos [20]. Iš šio tyrimo rezultato buvo įrodyta, kad jo funkcinės grupės (3-hidroksi ir 4-metoksi grupės) buvo susijusios su reikšmingu tirozinazę slopinančio aktyvumo padidėjimu.

1 lentelė. BHCP tirozinazę slopinantis aktyvumas ir fermentų kinetinė analizė.

Be to, šiame tyrime mechanizmas, atsakingas už tirozinazės slopinimą BHCP, buvo ištirtas atliekant fermentų kinetinę analizę (1 lentelė ir 2 pav.). Lineweaver-Burk diagramos buvo sudarytos naudojant duomenis, gautus iš kinetinių tyrimų, o slopinimo konstanta (Ki) buvo gauta iš Dixon diagramų. Lineweaver–Burk dvigubos abipusės diagramos rodė konkurencinio tipo slopinimą. Kaip parodyta 2a–c paveiksluose, BHCP veikė kaip konkurencinis L-tirozino ir L-DOPA inhibitorius. Be to, Diksono diagramų x ašyje dažniausiai yra pertraukos. naudojamas fermentų slopinimo konstantų (Ki) tipams nustatyti fermentų ir inhibitorių kompleksui [21,22], kur x ašies reikšmė rodo –Ki reikšmę. Kaip parodyta 2b – d paveiksluose, BHCP Ki reikšmės buvo atitinkamai 1,7 μMand 10,5 μM kaip L-tirozino ir L-DOPA substratai. Kadangi Ki reikšmė rodo koncentraciją, reikalingą fermento ir inhibitorių kompleksui susidaryti, mažesnė Ki vertė rodo veiksmingesnį tirozinazės slopinimą.

2 pav. Lineweaver-Burk (a, c) ir Dixon (b, d) diagramos tirozinazės fermento slopinimui BHCP.

2.3. BHCP poveikis B16F10 melanomos ir Hs27 fibroblastų ląstelių gyvybingumui

Prieš nustatydami, ar BHCP veikia prieš melanogenezę ir raukšles, ištyrėme BHCP citotoksiškumą B16F10 ląstelėms ir Hs27 ląstelėms, skirtingais laiko intervalais apdorojant skirtingomis koncentracijomis BHCP, o ląstelių gyvybingumas buvo matuojamas naudojant EZ-Cytox tyrimą. Kaip parodyta 3a, b paveiksluose, iki 10 μM BHCP 48 valandas nesumažino nei B16F10 ląstelių, nei Hs27 ląstelių išgyvenimo. Vėliau buvo atlikti tolesni BHCP anti-melanogenezės ir raukšlių slopinimo in vitro tyrimai su 1, 5 ir 10 μM.

2.4. BHCP slopinimas prieš melanino kiekį ir ląstelių tirozinazės aktyvumą B16F10 melanomos ląstelėse

Norint nustatyti, ar BHCP slopina melanino kiekį -MSH sukeltose B16F10 ląstelėse, ląstelės buvo iš anksto apdorotos nurodytomis skirtingomis koncentracijomis (1, 5 ir 10 μM) BHCP arba kojinės rūgšties (5 mM) 24 valandas ir tada stimuliuojamos. su -MSH 48 val. Kaip parodyta 4a paveiksle, melanino kiekis ląstelėse, apdorotose BHCP, esant -MSH, sumažėjo priklausomai nuo koncentracijos: 113 proc., kai 1 μM, 106 proc., kai 5 µM, ir 102 proc., kai 10 µM, lyginant su kontrolinė grupė, gydyta tik -MSH (186 proc.). Įdomu tai, kad BHCP (1 μM) slopino melanino kiekį stipriau nei kojinė rūgštis (5 mM). Be to, buvo atliktas ląstelių tirozinazės aktyvumo tyrimas, siekiant išmatuoti slopinamąjį BHCP poveikį B16F10 ląstelėms. Kaip parodyta 4b paveiksle, BHCP sumažėjo priklausomai nuo koncentracijos, tirozinazės aktyvumas sumažėjo 120 proc., kai 1 μM, 116 proc., kai 5 µM, ir 105 proc., kai 10 µM, lyginant su kontroline grupe, gydyta tik -MSH (181). procentų ).BHCP slopinamasis poveikis buvo daug stipresnis nei kojinės rūgšties; BHCP slopinimas esant 1 μM buvo geresnis už kojinės rūgšties slopinimą esant 5 mM (131 proc.). Šie rezultatai rodo, kad BHCP turi balinamąjį poveikį, nes slopina melanino biosintezę ir tarpląstelinę tirozinazės sintezę B16F10 melanocituose.

4 pav. Melanino kiekio (a) ir BHCP ląstelių tirozinazės aktyvumo (b) slopinimas B16F10 melanomos ląstelėse.

2.5. BHCP poveikis MITF/tirozinazės ir fosforilinto CREB ekspresijai B16F10 ląstelėse

MITF, specifinis transkripcijos faktorius, atlieka pagrindinį vaidmenį efektyviai suaktyvinant melanogeninius genus, įskaitant tirozinazę, katalizuojantį greitį ribojantį melanino biosintezės etapą: TRP-1 ir TRP-2. MITF ekspresija gali padidinti dėl CREB fosforilinimo [23]. CREB yra svarbus MITF promotorius [24, 25], o CREB fosforilinimas melanocituose padidina MITF ekspresiją, prisijungdamas prie CREB (c-AMP atsako elementą surišančio baltymo) melanocituose [26]. Norėdami išsiaiškinti molekulinius kelius, atsakingus už anti-melanogeninį BHCP poveikį B16F10 ląstelėms, Western blot analize ištyrėme pagrindinių molekulių, įskaitant CREB ir MITF, baltymų lygius, kurie vaidina svarbų vaidmenį melanogenezėje. Ląstelės buvo apdorotos BHCP arba kojic rūgštimi ir 48 valandas stimuliuojamos -MSH. Laiko intervalas matavimams buvo atliktas pagal ankstesniuose tyrimuose aprašytą metodiką [27]. Kaip parodyta 5 paveiksle, tirozinazės ir MITF lygiai padidėjo naudojant -MSH, tačiau BHCP sumažino šių baltymų kiekį. Be to, BHCP žymiai slopino CREB fosforilinimą. Yra žinoma, kad -MSH sukelto CREB fosforilinimo reguliavimas gali būti svarbus reguliuojant pigmentaciją [28]. Šie rezultatai rodo, kad anti-melanogeninis BHCP poveikis atsiranda dėl sumažėjusio MITF ir tirozinazės reguliavimo dėl fosforilinto CREB. Šis tyrimas rodo, kad BHCP tirozinazės ir melanogenezės slopinimo mechanizmo išaiškinimas yra labai svarbus ir turi būti toliau tiriamas ateityje. Nors B16F10 melanomos ląstelių linija paprastai yra tinkamesnė signalizacijos mechanizmams tirti in vitro, B16F10 ląstelių linija yra graužikų melanomos. Todėl, norint patvirtinti išvadas, reikės atlikti tolesnius žmogaus melanocitų tyrimus.

2.6. BHCP poveikis UV sukeltai NF-κB p-p65 aktyvacijai Hs27 ląstelėse

Toliau ištyrėme BHCP poveikį UV sukeltai uždegiminių mediatorių, naudojant Hs27 fibroblastus, ekspresijai. Anksčiau buvo pranešta, kad p65 (Ser536) fosforilinimas yra būtinas jo gebėjimui transaktyvuoti genus [29]. Todėl p-p65 (Ser536) ir p65 baltymų kiekis buvo ištirtas branduolio frakcijoje Western blot metodu. Kaip parodyta 6a, b paveiksluose, Hs27 ląstelėse UV padidino p-p65 (Ser536) baltymų kiekį branduolyje, o gydymas BHCP sumažino branduolio p-p65 (Ser536) baltymų kiekį. Atitinkamai bendras p65 kiekis citoplazmoje sumažėjo UV spinduliais ir atkurtas BHCP (6c, d pav.). Nors po UV indukcijos p65 baltymų ekspresijos lygis sumažėjo citoplazmoje ir padidėjo branduolyje, išankstinis gydymas BHCP pakeitė šias tendencijas priklausomai nuo dozės. Taigi šie rezultatai rodo, kad p-p65 slopinimas BHCP gali prisidėti prie apsauginio poveikio odos pigmentacijai ir kolageno sunaikinimui nuo UV.

6 pav. BHCP poveikis p-p65 (Ser536) ekspresijos lygiams UV sukeltose Hs27 žmogaus fibroblastų ląstelėse.

2.7. BHCP poveikis MMP ekspresijai Hs27 ląstelėse

MMP vaidina gyvybiškai svarbų vaidmenį odos senėjimui. UV spinduliavimas keičia jungiamuosius odos audinius, padidindamas MMP ekspresijos reguliavimą [30, 31]. MMP-1 yra kolageną skaidantis fermentas, kuris pagreitina kolageno, susintetinto iš I tipo prokolageno, skaidymą. MMP-9 yra želatiną skaidantis fermentas, kuris skaido kolageno skaidulas, perpjautas MMP-1, didindamas raukšlių susidarymą ir elastingumo praradimą. Norėdami ištirti BHCP priešraukšles prieš UV indukciją, Western blot metodu nustatėme MMP-1 ir MMP-9 baltymų kiekį. Be to, UV sukeltos ląstelės parodė žymiai padidėjusį MMP-13 lygį, kuris inicijuoja I ir III tipo kolageno, o ne MMP-1 skilimą [32]. Ištyrėme MMP (MMP1, MMP9, MMP12 ir MMP13) padidėjimą po UV sukeltų Hs27 ląstelių apdorojimo BHCP 1 ir 10 μM. Kaip parodyta 7 paveiksle, MMP-1, MMP-9, MMP-12 ir MMP-13 ekspresijos lygiai padidėjo po UV indukcijos; tačiau gydymas BHCP sumažino ekspresiją dozėje. - priklausomas būdas. Mūsų rezultatai rodo, kad BHCP gali prisidėti prie raukšlių susidarymo prevencijos sumažindamas nenormalią MMP gamybą, kurią sukelia UV spinduliuotė. Šie rezultatai rodo, kad BHCP slopina MMP ekspresiją Hs27fibroblastuose, kad būtų išvengta kolageno skilimo, taigi ir raukšlių susidarymo. Todėl BHCP gali būti naudojamas kaip su oda susijusių ligų profilaktikos ir gydymo vaistas.

cistanche stiebo privalumai

3. Medžiaga ir metodai

3.1. Chemija ir instrumentai

Grybų tirozinazė (EC 1.14.18.1), -MSH, L-tirozinas, 3,4-dihidroksifenilalaninas (L-DOPA), dimetilsulfoksidas (DMSO) ir kojinė rūgštis buvo įsigyti iš Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, JAV). Dulbecco modifikuota Eagle terpė (DMEM), vaisiaus galvijų serumas, streptomicinas ir amfotericinas buvo įsigyti iš Gibco Life Technologies Inc. (Karlsbadas, CA, JAV). Antikūnai prieš MITF, CREB, p-CREB, p-p65 (Ser536), p65, tirozinazę, MMP-1, MMP-9, MMP-12, MMP-13, TFIIB , ir -actin buvo įsigyti iš Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, JAV). Polivinilideno difluorido (PVDF) membranos buvo gautos iš Millipore Corporation (Bedford, MA, JAV). Sterileplastiniai indai audinių kultūroms buvo įsigyti iš SPL Labware (Seulas, Korėja). UV šviesos šaltinį suteikė Crosslinker 800 serijos (UVP, CA, JAV) 6 lempų blokas (8 vatai vienai lempai). Plonasluoksnė chromatografija ir silikagelis 60 (tinklelis 230–400) buvo atliktas naudojant silikagelįF{{27} }iš anksto padengtos plokštės iš Merck Millipore (Darmštatas, Vokietija). BMR spektrai buvo įrašyti naudojant Varian Unity INOVA 400 (400 MHz 1H, 100 MHz 13C) ir Varian Unity AS 500 (500 MHz 1H) prietaisus. Cheminio poslinkio reikšmės (δ) pateikiamos atsižvelgiant į atitinkamas likutinio tirpiklio arba deuteruotas smailes (δH 2,50 ir δC 39,51 DMSO). Mažos skiriamosios gebos masės spektrometrijos duomenys buvo gauti naudojant Expression CMS masės spektrometrą (Advion, Ithaca, NY, JAV).

3.2. Grybų tirozinazės slopinimo tyrimas

Grybų tirozinazę slopinantis aktyvumas buvo nustatytas naudojant L-tirozino ir L-DOPA substratus, remiantis Jung ir kt. aprašyta procedūra. [23]. Trumpai tariant, buvo pridėta 190 μL tirozinazės fermento (1000 V, praskiestų grybų tirozinazės buferiu, įskaitant 1 mM L-tirozino ir L-DOPA tirpalą), esant junginiams arba jų nesant (galutinė koncentracija svyruoja nuo 1 iki 20 μM, ištirpinta 100 procentų DMSO), į kiekvieną 96-šulinėlio plokštelės šulinį, kad galutinis tūris būtų 200 μL. Plokštelė buvo inkubuojama 37 ◦ C temperatūroje 30 min. Tirozinazės aktyvumas buvo kiekybiškai įvertintas išmatuojant absorbciją ties 492 nm naudojant mikroplokštelių skaitytuvą (TECAN, Zalcburgas, Austrija), o procentinis slopinimas (procentais) buvo gautas pagal šią lygtį:

procentinis slopinimas=(Ac – As)/Ac × 100 (1)

kur Ac yra kontrolinės medžiagos absorbcija, o As yra mėginio absorbcija. IC50 reikšmės buvo apskaičiuotos pagal logaritmines tiesines kreives ir jų lygtis. Rodomi trijų nustatymų vidutiniai rezultatai. Kojic rūgštis buvo naudojama kaip teigiama kontrolė.

3.3. Tirozinazės slopinimo kinetinė analizė

Kinetiniams mechanizmams nustatyti buvo naudojami du kinetiniai metodai (Lineweaver-Burk ir Dixon diagramos) [21, 22, 33]. Lineweaver-Burk dvigubos abipusės diagramos (1/fermento greičio (1/V) ir 1/substrato koncentracijos (1/[S]) diagrama) slopinimo tipas buvo nustatytas naudojant įvairias L-tirozino koncentracijas (1, 2, ir 4 mM) ir L-DOPA (0,5, 1 ir 2 mM) kaip substratai, esant skirtingoms BHCP koncentracijoms. BHCP koncentracijos buvo tokios: 0, 0.5, 1.{{20}} ir 2.0 μM L-tirozinui; ir 0, 2,5, 5 ir 10 μM L-DOPA. Diksono diagrama yra grafinis metodas (1/fermento greičio (1/V) ir inhibitorių koncentracijos (I) diagrama), skirtas fermento slopinimo tipui nustatyti ir buvo naudojamas fermento ir inhibitorių komplekso disociacijos konstantai arba Ki nustatyti. Diksono diagramos (vienos abipusės grafikos) buvo gautos, kai buvo L-tirozino substratas 1, 2 ir 4 mM ir {{40}}, 0.5, 1.{101} {47}} ir 2.{49}} μM BHCP; ir L-DOPAsubstratas {{50}},5, 1.{56}} ir 2,0 mM ir 0, 2,5, 5,0 ir 10,0 μM BHCP.

cistanche augalasyra tirozinazės inhibitorius.

3.4. Ląstelių linijos ir ląstelių kultūra

Pelės B16F10 melanomos ląstelės buvo gautos iš Korėjos ląstelių linijos banko. Žmogaus odos fibroblastų ląstelių linija Hs27 buvo įsigyta iš Amerikos tipo kultūros kolekcijos (ATCC, Manassas, VA, JAV). Šios ląstelės buvo laikomos DMEM, papildytu 10 procentų vaisiaus galvijų serumo, 100 V/mL penicilino ir 100 mg/mL streptomicino, drėgname 5 procentų CO2 inkubatoriuje 37 ◦C temperatūroje. Odos fibroblastai ant 100 mm lėkštelės buvo apdoroti BHCP ir veikiami 50 mJ/cm2UV DMEM be serumo (UV šviesos šaltinis, UVP). Hs27 ląstelės buvo kultivuojamos iki 70–80 procentų susiliejimo 100 mm skersmens plokštelėje ir buvo naudojamos tarp 5 ir 15 pasažų.

3.5. Ląstelių gyvybingumo tyrimas

Ląstelių gyvybingumas buvo įvertintas naudojant EZ-Cytox rinkinio testą. Trumpai tariant, B16F10 ląstelės ir Hs27fibroblastai buvo sėjami į 96-šulinėlių plokštelę 1 × 104 ląstelių/šulinėlių tankiu ir inkubuojami 37 ◦ C temperatūroje 24 valandas. Ląstelės buvo maitinamos šviežiu, be serumo DMEM, kuriame buvo skirtingos koncentracijos (0, 1, 2, 5 ir 10 μM) BHCP, ir inkubuojamos 24 ir 48 valandas. Vėliau į kiekvieną šulinėlį buvo įpilta 10 μL EZ-Cytox tirpalo ir ląstelės buvo inkubuojamos 2–4 valandas. Ląstelių absorbcijos matavimas be jokio gydymo buvo laikomas 100 procentų ląstelių išgyvenimu. Kiekvienas gydymas buvo atliktas tris kartus ir kiekvienas eksperimentas buvo pakartotas tris kartus.

3.6. Melanino kiekio nustatymas

BHCP poveikis -MSH sukeltai melanogenezei B16F10 ląstelėse buvo pagrįstas anksčiau naudotu metodu su nedideliais pakeitimais [34]. Trumpai tariant, B16F10 ląstelėms (5 × 104 ląstelių/šulinėlių) 6-šulinėlių plokštelėse buvo leista augti iki 70–80 procentų susiliejimo. Tada ląstelės buvo apdorotos skirtingomis koncentracijomis BHCP (1, 5 ir 10 μM) arba kojic rūgštimi (5 mM) 24 valandas, o po to stimuliuojamos -MSH (5 μM) 48 valandas. Po apdorojimo ląstelės du kartus plaunamos lediniu PBS, ištirpintos 90 μL 1 M NaOH tirpale, įskaitant DMSO (5 proc.), 60 °C temperatūroje 1 val., o absorbcija matuojama esant 405 nm mikroplokštelės spektrofotometru (TECAN, Zalcburgas). , Austrija). Norint išmatuoti melanino kiekį eksperimente, slopinimo greitis gydymo grupėse buvo apskaičiuotas pagal žinomų sintetinio melanino koncentracijų absorbciją, kuri buvo pakoreguota pagal bendrą baltymų kiekį, kuris buvo ląstelių lizatų supernatante. Neapdorotų ląstelių absorbcija buvo matuojama trimis egzemplioriais.

3.7. Ląstelių tirozinazės aktyvumo tyrimas

Ląstelių tirozinazės aktyvumo tyrimas buvo atliktas matuojant L-DOPA oksidacijos greitį [35]. B16F10 ląstelės, kurių tankis 5 × 104/ląstelė, buvo dedamos į 6-šulinėlių indus ir inkubuojamos per naktį. Tada ląstelės buvo apdorotos įvairiomis koncentracijomis BHCP (1, 5 ir 10 μM) arba kojinės rūgšties (5 mM) 24 valandas, o po to stimuliuojamos -MSH (5 μM) 48 valandas. Ląstelės buvo plaunamos PBS ir lizuojamos tirpale, kuriame yra 100 μL 50 mM fosfatinio buferio (pH 6,5), 0,1 mM fenilmetilsulfonilfluorido (PMSF) ir 1 procento Triton X-100. Tada ląstelės buvo dedamos į giluminį šaldiklį (–80 ◦ C) 30 minučių. Atitirpdžius ląsteles, ląstelių ekstraktai buvo išgryninti centrifuguojant 12, 000 aps./min. 30 min. 4 ◦C temperatūroje. Iš viso 80 μL supernatanto ir 20 μL L-DOPA (2 mg/mL) buvo įpilta į 96-šulinėlių plokštelę, o absorbcija, esant 492 nm bangos ilgiui, buvo matuojama kas 10 minučių 1 valandą 37 ◦ C su ELISA plokštelių skaitytuvu (TECAN, Zalcburgas, Austrija).

3.8. Hs27 ląstelių citozolinių ir branduolinių ekstraktų paruošimas

Hs27 ląstelės buvo plaunamos lediniu PBS ir surenkamos. Citozolinėms frakcijoms ekstrahuoti buvo naudojamas buferis, kuriame yra 10 mM Tris(pH 8.0), 1,5 mM MgCl2, 1 mM DTT, 0,1 proc. NP-40 ir proteazės inhibitorių. centrifuguojama 12, 000 aps./min 4 ◦C temperatūroje 15 min., o branduolinės frakcijos ekstrahuojamos iš granulių naudojant buferį, kuriame yra 10 mM Tris, 50 mM KCl, 100 mM NaCl ir proteazės inhibitorių, inkubuojamos ant ledo 30 min. ir tada centrifuguojamas 13,000× g 30 min 4 ◦C temperatūroje, kad būtų gautos branduolinės frakcijos.

3.9. Western blotavimas

Lizato mėginiai buvo virti 10 min gelio užpildymo buferyje (125 mM Tris-HCl, 4 proc. natrio dodecilsulfato (SDS), 10 proc. 2-merkaptoetanolio ir 0,2 proc. bromfenolio). mėlyna; pH 6,8) tūrio santykiu 1:1. Bendri kiekvieno mėginio baltymų ekvivalentai buvo atskirti naudojant SDS-poliakrilamido gelio elektroforezę (PAGE), naudojant akrilamido gelius, remiantis Laemmli [36] aprašyta procedūra, ir 2 valandas perkelta į PVDF membranas esant 80 V įtampai, naudojant šlapio perdavimo sistemą. Membranos buvo nedelsiant dedamos į blokuojantį buferį (5 proc. neriebaus pieno) 10 mM Tris, pH 7,5, 100 mMNaCl ir 0,1 proc. Tween-20. Blotai buvo užblokuoti, kad būtų išvengta nespecifinio prisijungimo 25 ◦ C temperatūroje 2 valandas. Vėliau membranos buvo inkubuojamos su specifiniu pirminiu antikūnu 4 ◦ C temperatūroje per naktį, po to inkubuojamos su krienų peroksidaze konjuguotu antriniu antikūnu 25 ◦ C 1 val. . Antikūnų žymėjimas buvo aptiktas sustiprinta chemiliuminescencija pagal gamintojo instrukcijas. Baltymų kiekybinis nustatymas buvo atliktas naudojant Davinch-Chemi TM. Chemiluminescence Imaging System CAS-400SM (Core Bio, Seulas, Korėja). Molekulinei masei nustatyti buvo naudojami dažyti baltymų žymenys.

3.10. Statistinė analizė

Visi duomenys pateikiami kaip vidurkis ± SEM. Duomenys buvo analizuojami naudojant vienpusę dispersijos analizę (ANOVA), siekiant nustatyti skirtumus tarp gydymo būdų, po to buvo atliktas Bonferroni post-hoc testas. Vertė p < 0,05="" buvo="" laikoma="" statistiškai="">

4. Išvados

Apibendrinant, šio tyrimo išvados parodė, kad BHCP turi odą balinantį poveikį, nes slopina tirozinazę, kuri yra pagrindinis melanino biosintezės fermentas -MSH sukeltuose B16F10 melanocituose. Be to, BHCP sumažino MMP baltymų kiekio ekspresiją UV sukeltuose fibroblastuose, o tai, kaip tikimasi, turės raukšlių poveikį. Norint patvirtinti BHCP balinimo ir raukšlių poveikį, reikia atlikti tolesnius tyrimus su gyvūnais ir klinikiniais tyrimais. Galiausiai buvo nustatyta, kad BHCP turi ir balinamąjį, ir priešraukšlinį poveikį, o tai rodo, kad jis gali sukurti terapines medžiagas ligoms, susijusioms su hiperpigmentacija ir raukšlėjimu.

kas yra cistanche

Norėdami gauti daugiau informacijos, spustelėkite čia.