Susisiekite:jerry.he@wecistanche.com

Yuto Mitsuhata1, Takaya Abe2, Kazuyo Misaki3, Yuna Nakajima1, Keita Kiriya1,

Miwa Kawasaki4, Hiroshi Kiyonari2, Masatoshi Takeichi4*, Mika Toya1,4,5,6*&

Masamitsu Sato1,6,7

Cistanche gali pagerinti inkstų funkciją

Epitelio ląstelės organizuoja tvarkingą necentrosominių mikrotubulių masyvą, kurių minusinius galus reguliuoja CAMSAP3. Tačiau šių mikrotubulių vaidmuo epitelio funkcijoms yra menkai suprantamas. Čia parodome, kadinkstusišsivysto pelių, kuriose Camsap3 yra mutavęscistosproksimaliniuose vingiuotuose kanalėliuose (PCT). PCT mutante buvo labai išsiplėtęinkstus, ir jie taip pat parodė sustiprintą ląstelių dauginimąsi. Šiuose PCT epitelio ląstelės tapo nutukusios kartu su mikrotubulų matricų ir tam tikrų tarpląstelinių struktūrų, tokių kaip susikertantys baziniai procesai, trikdymas. Be to, šiose mutantinėse PCT ląstelėse buvo suaktyvinti YAP ir PIEZO1, kurie yra žinomi kaip mechaniškai jautrūs ląstelių formavimo ir proliferacijos reguliatoriai. Šie stebėjimai rodo, kad CAMSAP3 tarpininkaujantys mikrovamzdelių tinklai yra svarbūs palaikant tinkamas mechanines PCT ląstelių savybes, o jų praradimas sukelia ląstelių deformaciją ir proliferaciją aktyvuojant mechaninius jutiklius, todėl PCT išsiplečia.

Epitelio ląstelės yra pagrindiniai įvairių organų komponentai. Jie rodo viršūninį ir bazinį poliškumą, susijusį su jų funkcijomis, tokiomis kaip absorbcija ir sekrecija. Diferencijuotose epitelio ląstelėse dauguma mikrotubulių yra necentrosominiai ir yra išlyginti išilgai viršūnės ir bazinės ašies1–3. CAMSAP3 yra kalmodulinu reguliuojamo su spektru susijusio baltymo (CAMSAP) / Nezha / Patronin baltymų šeimos narys ir yra svarbus epitelio mikrotubulų organizavimui4–8. CAMSAP3 suriša ir stabilizuoja minusinius mikrotubulių galus4,6,9. Pelių plonosios žarnos ląstelėse CAMSAP3 yra sutelktas viršūninėse žievės srityse, pritvirtindamas necentrosominių mikrotubulių minusinius galus prie šių vietų 10, 11, todėl susidaro mikrotubulų matricos, orientuotos į apikobazinę kryptį, o pliusiniai galai nukreipti iš esmės. . Tačiau ši būdinga mikrotubulų organizacija prarandama pelėms, turinčioms mutantinį geną, koduojantį sutrumpintą Camsap3 (Camsap3dc / dc pelės), kuriose ištrintas C-galo mikrotubulius surišantis domenas. Šių pelių žarnyno epitelio ląstelės turi įvairių citologinių defektų, įskaitant sumažėjusį ląstelių aukštį ir netinkamai išdėstytas organeles, tokias kaip branduolys ir Golgi10. Nepaisant tokių didelių intracelulinės architektūros trikdžių, epitelio ląstelės išlaiko normaliai atrodančius dvimačius lakštus 10, 12, o mutavusios žarnos neturėjo akivaizdžių fiziologinių defektų.

kanalėliai (PCT), Henlės kilpa, distaliniai vingiuoti kanalėliai ir surinkimo kanalas. Nefrono struktūras sudaro vienas epitelio sluoksnis, kuris atlieka filtravimo, reabsorbcijos ir sekrecijos funkciją.

A inkstų cistayra dažnas patologinis pažeidimasinkstus. Te cistinis pažeidimas yra įvairus; židininės arba daugybinės cistos formuojasi vienoje arba abipusio inksto pusėje, pasireiškiančios skirtingu simptomų laipsniu13–15. Keletas įgimtų cistųinkstųligos, įskaitant policistinęinkstasligos (PKD), glomerulocistinė inkstų liga (GCKD) ir medulinė cistinėinkstasliga (MCKD), sukelianti daugybęinkstųcistos dvišaliuose inkstuose. Sergant PKD, cistos pasiskirsto tolygiai visame organe, įskaitant PCT, o GCKD ir MCKD cistos susidaro atitinkamai Bowmano kapsulėse ir surinkimo kanaluose (daugiausia medulos srityje)16–19.

Kalbant apie PKD, žinomos dvi pagrindinės priežastys: 1) mutacijos genuose Pkd1 arba Pkd2 ir 2) mutacijos genuose, reikalinguose pirminei ciliumo biogenezei. Pkd1 ir Pkd2 koduoja atitinkamai polycystin1 ir polycystin2, kurie yra neselektyvūs katijonų kanalai, kurie lokalizuojasi keliuose ląstelių skyriuose, įskaitant pirminius blakstienas21, 22 . Pelėms, turinčioms mutantinę PKD1 arba PKD2 formą, policistino baltymai nėra lokalizuoti blakstienose23. Pirminių blakstienų biogenezei reikalingi genai apima If88 ir Kif3a, kurie dalyvauja intrafageliniame transporte24–26. Šių genų mutacijos taip pat sukeliainkstųcistinės ligos 24–27 . Nors ryšys tarp šių dviejų priežastinių būdų yra sudėtingas23, vienas būdas, kuris, kaip įrodyta, sukelia PKD, apima Hippo signalizacijos efektorių Yap28 . Pkd1 mutantinėse pelėse transkripcijos koaktyvatorius YAP / TAZ ir jo efektorius c-Myc yra aktyvuojami ir skatina cistogenezę28. Nepaisant to, mechanizmai, kuriais grindžiamas policistozėinkstusiš esmės lieka nežinomi.

Šiame tyrime ištyrėme CAMSAP3 vaidmenisinkstasstruktūra ir funkcija. Mūsų stebėjimai rodo, kad viršūniškai lokalizuotas CAMSAP3 prisideda prie tinkamos necentrosominių mikrotubulių orientacijos, taip pat tarpląstelinės epitelio ląstelių architektūros sukūrimo PCT, kaip pastebėta plonojoje žarnoje. Tačiau skirtingai nuo žarnyno epitelio, CAMSAP3disfunkcijasukėlė organų lygio anomalijas dvišaliuose inkstuose, ty cistų susidarymą PCT. Praradus CAMSAP3 funkciją, suaktyvėjo mechaniškai jautrūs reguliatoriai, kurie paprastai padeda išsaugoti audinių vientisumą. Mūsų tyrimas rodo, kad CAMSAP3-tarpininkaujama necentrosominių mikrotubulų organizacija yra svarbi norint išlaikyti mechanines PCT savybes, o šios sistemos praradimas sukelia regioninių cistų susidarymą inkstuose.

Rezultatai

Cistaformavimas ininkstusCamsap3 mutantų pelių. Camsap3dc / dc mutantų pelių fenotipinė analizė atskleidė taiinkstussenyvo amžiaus (~ 2 metų amžiaus) Camsap3dc/dc pelės buvo hipertrofinės ir pakitusi spalva (1a pav.). Norėdami toliau analizuoti Camsap3dc/dc anomalijasinkstus, mes ištyrėme jaunesnes peles. 21 dieną po gimdymo (P21) Camsap3dc/dc inkstai atrodė normaliai. Tačiau inksto padalinimas atskleidė cistines struktūras žievės srityse (1b pav. ir papildomas S1a pav.), ką patvirtino apskaičiuojant cistinį indeksą, kuris yra cistos turinčių sričių ir bendro inkstų ploto santykis (1 pav.). 1c). Mes ištyrėme mutantinius embrionus, kad nustatytų, kada cistos pradeda formuotis vystymosi metu, o tai atskleidė padidėjusio cistų susidarymo požymį maždaug 17.5 embriono dieną (E17.5) (papildomas S1a pav., rodyklės). Ties P 0 žievės cistos tapo lengvai pastebimos (papildomas S1a pav., rodyklės), o jų dydis ir skaičius padidėjo P21 (1b pav., papildomas S1a pav., rodyklės). Pelėms senstant, cistiniai fenotipai tapo ryškesni, nors cistų susidarymo laipsnis tarp asmenų skyrėsi (1c pav. ir papildomas S1b pav.). Be to, Camsap3dc/dc pelių inkstų ir kūno svorio santykis buvo didesnis nei laukinio tipo (WT) pelių per visą gyvenimą (1d pav. ir papildomas S1c, d pav.). Tus, Camsap3dc / dc inkstuose susiformavo cistos, kurios laikui bėgant sustiprėjo, todėl seniems inkstams atsirado hipertrofija.

Camsap3dc / dc pelės išreiškia sutrumpintą C-galo domeną CAMSAP3 (CAMSAP{3}}dc)10, kuris gali būti susijęs su stebimu pelių inkstų cistiniu fenotipu. Norėdami ištirti šią galimybę, sukūrėme Camsap3–/– (Camsap3-null) pelę (papildomas S2a, b pav.) (taip pat išsamiai žr. metodus). Šios pelės taip pat turėjoinkstussu daugybe cistų, o jų fenotipas nesiskyrė nuo Camsap3dc/dc pelių fenotipo; Visų pirma, heterozigotinės (Camsap3 plius /-) pelės neparodė policistinių inkstų požymių (papildomas S2c pav.).

Cistų susidarymas Camsap3dc/dc PCTinkstus. Nustatyti, kurios struktūros mutante tapo cistinėmisinkstus, atlikome trijų nefrono segmentų imuninį dažymą trims baltymams, ty Megalinui (lokalizuojasi į PCT), Na plius / Cl– kotransporteriui (distaliniams vingiuotiems kanalėliams) ir akvaporinui -2 (surinkimo kanalams). Rezultatai parodė, kad išsiplėtimas įvyko tik megalino teigiamuose kanalėliuose ties P21 (1e pav. ir papildomas S1e pav.), o tai rodo, kad cistogenezė apsiribojo PCT. PCT yra suskirstyti į tris segmentus, būtent S1, S2 ir S3, ir mes juos išskyrėme imuniniu dažymu gliukozės transporteriams SGLT1 ir SGLT2, kurie lokalizuojasi atitinkamai S3 ir S1 / S2 segmentuose29, 30 . Išsiplėtę kanalėliai buvo pažymėti tik SGLT2 (1f pav.), o tai rodo, kad cistogenezė vyksta S1/S2 segmentuose. Tačiau senesnėse mutantinėse pelėse cistos susidarymas taip pat išplito iki Bowmano kapsulės (1g pav.).

Netvarkinga ląstelių architektūra cistinėse PCT. Norėdami ištirti ląstelių lygio cistinių PCT defektus, pirmiausia juos ištyrėme skenuojančia elektronine mikroskopija ir nustatėme, kadinkstųCamsap3dc/dc inkstuose kanalėliai labai išsipūtė (2a pav.), nors patinimo mastas įvairiose kanalėlių padėties skyrėsi. Skersiniai pjūviai atskleidė, kad išsipūtusiose kanalėlių dalyse jo spindis išsiplėtė kartu su plonėjimu kanalėlius sudarančio epitelio sluoksniu (2a pav.). Kiekybinis nustatymas naudojant hematoksilinu ir eozinu nudažytus mėginius patvirtino, kad ląstelių aukštis sumažėjo išsiplėtusiuose kanalėliuose (2b pav.), o kiekvienos ląstelės viršūninis perimetras buvo padidintas (2c pav.), o tai rodo, kad mutantinės ląstelės buvo riebesnės nei WT ląstelės.inkstus.

Toliau ištyrėme, ar ląstelių architektūra ir (arba) tarpląstelinės PCT struktūros buvo paveiktos Camsap3 mutacijos. DPP IV, viršūninio membranos žymeklio, ir Na plus /K plus -ATPazės, bazolaterinio membranos žymeklio, imuninis dažymas parodė, kad bendras ląstelių poliškumas buvo normalusinkstųCamsap3dc/dc kanalėlių ląstelė

1 pav. Cistos susidarymas proksimaliniuose vingiuotuose Camsap3dc/dc kanalėliuoseinkstus. a ) WT (plius / plius) ir Camsap3 mutantų (Camsap3dc / dc) pelių inkstų morfologija esant P666. b) WT ir Camsap3dc / dc inkstų dažymas H&E esant P21. Camsap3dc/dc inkstų žievėje susidarė kelios cistos. c ) WT ir Camsap3dc / dc pelių cistinio indekso pasikeitimas laikui bėgant. 9 pelės buvo ištirtos dėl WT arba Camsap3dc/dc. Žr. MEDŽIAGOS IR METODAI cistinio indekso apibrėžimą. d) inkstų ir kūno svorio santykis. 11 pelių buvo ištirta dėl WT arba Camsap3dc/dc. (e) Proksimalinių vingiuotų kanalėlių (PCT) (Megalin), distalinių vingiuotų kanalėlių (DCT), NaCl bendro transporterio ir surinkimo kanalų (CD) (akvaporino-2; AQP2) žymenų imuninis dažymas WT ir Camsap3dc/ dcinkstusprie P21. Padidinto Megalino vaizdo vaizdai rodo delokalizuotą Megaliną Camsap3dc / dc inkstų cistinėse ląstelėse, kaip rodo rodyklės galvutė. Nutrūkusios ir ištisinės linijos rodo atitinkamai ląstelės viršūnę ir bazinę kraštą. (f) S1 / S2 segmentų (SGLT2, žalias) ir S3 segmentų (SGLT1, raudonas) žymenų imuninis dažymas WT ir Camsap3dc / dc inkstuose esant P21. Padidinto SGLT2 vaizdo vaizdai rodo sumažėjusį SGLT2 signalo intensyvumą cistinėse ląstelėse Camsap3dc / dc inkstuose, kaip rodo rodyklių galvutės. g) P21 ir P487 glomerulų morfologija. Rodyklės rodo išsiplėtusį glomerulą. Taip pat žr. S1 ir S2 paveikslus.

2 pav. Netvarkinga ląstelių architektūra cistinėse PCT ląstelėse. (a) Skenavimo elektroninės mikroskopijos vaizdai ▸

Cistanche gali pagerinti inkstų funkciją

WT ir Camsap3dc/dcinkstusprie P21. Inkstų kanalėliai Camsap3dc/dcinkstusyra dalinai patinę. (b) Ląstelių aukščio žievėje kiekybinis įvertinimas [ plius / plius , n=121 ląstelių; dc/dc (išsiplėtęs), n=128 langelių; dc/dc (neišsiplėtusios), n=66 langelių]. Klaidų juostos rodo SD ***p<0.001, t-test.="" see="" materials="" and="" methods="" for="" the="" defnition="" of="" dilated="" and="" non-dilated="" tubules.="" (c)="" quantifcation="" of="" cell="" width="" in="" the="" cortex="" [+="" +="" ,="" n="26" tubules;="" dc/="" dc="" (dilated),="" n="8" tubules;="" dc/dc="" (non-dilated),="" n="14" tubules].="" error="" bars="" indicate="" s.d.="" ***p=""><0.001, t-test.="" (d)="" cell="" polarity="" markers="" were="" visualized:="" dpp="" iv="" (apical="" marker)="" and="" na+/k+-atpase="" (basal="" marker).="" te="" localization="" of="" cell="" polarity="" markers="" in="" camsap3dc/dc="" kidney="" is="" overall="" normal.="" te="" arrowhead="" indicates="" basal="" plasma="" membranes,="" whose="" invagination="" is="" not="" normal.="" (e)="" apical="" structures="" (actin="" and="" ezrin)="" and="" the="" golgi="" were="" visualized.="" arrowheads="" indicate="" disrupted="" structures="" such="" as="" the="" lack="" of="" actin="" signal="" and="" misplacement="" of="" the="" golgi.="" broken="" and="" continuous="" lines="" indicate="" the="" apical="" and="" basal="" margin="" of="" the="" cell,="" respectively,="" in="" d="" and="" e.="" (f)="" transmission="" electron="" microscopy="" images="" of="" wt="" and="" camsap3dc/dc="" kidneys="" at="" p21.="" subcellular="" defects="" such="" as="" a="" fattened="" nucleus="" and="" misaligned="" mitochondria="" are="" observed="" in="" camsap3dc/dc="" kidneys.="" arrowheads="" indicate="" invaginated="" basal="" membranes.="" note="" that="" their="" extensive="" invagination="" is="" suppressed="" in="" camsap3dc/dc.="" asterisks="" denote="" mitochondria.="" drawings="" are="" the="" traced="" invagination="" in="" electron="" microscopy="" images.="" (g)="" quantifcation="" of="" the="" shape="" of="" the="" nucleus="" [+="" +="" ,="" n="72" cells;="" dc/dc="" (dilated),="" n="72" cells;="" dc/dc="" (non-dilated),="" n="71" cells].="" (h)="" immunostaining="" for="" acetylated="" tubulin,="" a="" marker="" for="" the="" primary="" cilium,="" in="" wt="" and="" camsap3dc/dc="" kidneys="" at="" p21.="" te="" primary="" cilium="" was="" present="" in="" both="" wt="" and="" camsap3dc/dc="">inkstus. i) pirminių blakstienų skaičius PCT. Pirminių blakstienų skaičius buvo apskaičiuotas naudojant PCT skerspjūvių viršūninio apskritimo ilgį, taip pat pirminių blakstienų ir branduolių skaičių. [ pliusas / pliusas , N=340 langeliai, 63 PCT skerspjūviai, pirminių blakstienų skaičius=268; dc/dc, N=221 ląstelės, 29 PCT skerspjūviai, pirminių blakstienų skaičius=133].

pelėms (2d pav.). Priešingai, nors megalinas kaupėsi WT ląstelių viršūninėse srityse, kai kuriose cistinėse Camsap3dc/dc ląstelėse jis pasklido citoplazmoje (1e pav. padidintas vaizdas ir 2d pav.). F-aktino, kuris kaupiasi dideliu tankiu viršūniniuose mikrovilliuose, dažymas fluorescenciniu būdu leido manyti, kad mikrovileliai retkarčiais buvo išsidėstę nutukusiose mutanto ląstelėse.inkstus(2e pav. rodyklės galvutė), kaip patvirtinta transmisijos elektronų mikroskopu (2f pav.). Ezrinas, ERM komplekso dalis, susijusi su viršūnine plazmos membrana31, buvo sumažinta arba prarasta Camsap3dc / dc cistinėse ląstelėse.inkstus(2e pav.), o tai rodo, kad mutantinėse ląstelėse citoarchitektūra buvo nenormali. Be to, nors Giantino teigiamas Golgi aparatas WT ląstelėse paprastai yra paskirstytas kaip plonos sruogos, esančios greta branduolio, Golgi retkarčiais kondensavosi Camsap3dc / dc ląstelėse (2e pav.). Perdavimo elektronų mikroskopija atskleidė papildomų subląstelinių defektų išsiplėtusiuose Camsap3dc / dc PCTinkstus. WT PCT ląstelėse mitochondrijos buvo pailgos, parodydamos tvarkingą orientaciją išilgai apikobazinės ląstelės ašies, o cistinėse PCT ląstelėse mitochondrijos buvo apvalios – neberodo jokios tvarkingos orientacijos (2f pav.). Šiose ląstelėse bazinės juostelės taip pat buvo neorganizuotos, praradusios lygiagrečias ir gilias invaginacijas, kurios yra dažnos WT ląstelėse (2f pav. rodyklių galvutės ir atsektas piešinys), kaip taip pat parodyta imuninis dažymas Na plius /K plius -ATPaze (1 pav.). . 2d rodyklių antgaliai). Be to, cistinėse ląstelėse branduoliai buvo nutukę, palyginti su jų apvalia forma WT ląstelėse (2f, g pav.). Pirminės blakstienos buvo aptinkamos PCT ląstelių luminalinėje pusėje tiek WT, tiek mutantiniuose inkstuose (2h, i pav.), skirtingai nei pelių mutantų, kurių ciliogenezė yra nepakankama, o tai sukelia policistinius inkstus24–27 atveju, o tai rodo, kad ciliogenezės pažeidimas yra nėra tikėtina priežastis

pastebėjo policistinius fenotipus Camsap3dc / dc pelėse. Visi šie stebėjimai parodė, kaddisfunkcijaCAMSAP3 trikdo PCT cistinių ląstelių tarpląstelinę architektūrą.

Camsap3dc / dc pelėms yra keletas fiziologinių defektų. Toliau ištyrėme, ar Camsap3dc / dc inkstai turėjo kokių nors fiziologinių defektų. Pirmiau minėti imunocitologiniai tyrimai parodė, kad megalinas, veikiantis kaip daugialigandinis endocitinis receptorius32, 33, buvo linkęs difuzuoti į Camsap3dc/dc PCT ląstelių citoplazmą (1e pav. rodyklės galvutė ir 2d pav.), priešingai nei jo aiški viršūninė lokalizacija WT PCT ląstelės. Be to, nors gliukozės pernešėjas SGLT2, atsakingas už 90 procentų gliukozės reabsorbcijos29, daugiausia lokalizuotas Camsap3dc/dc ląstelių viršūniniuose regionuose (kaip ir WT ląstelėse), jo signalo intensyvumas sumažėjo tam tikruose cistinių kanalėlių regionuose. 1f pav. rodyklių antgaliai), o tai rodo, kad mutantinių kanalėlių fiziologija galėjo būti neigiamai paveikta. Todėl atlikome šlapimo ir kraujo tyrimus naudodami P396-–P{15}}senas peles. Šlapimo tyrimai parodė, kad Camsap3dc/dc pelėms būdingas per didelis K plus , Mg2 plus ir karbamido azoto nutekėjimas (papildomas S3a pav.). Kraujo tyrimai įtikinamiau parodė, kad Camsap3dc / dc pelių K plus ir Mg2 plus lygis buvo žymiai mažesnis, palyginti su WT arba Camsap3 plus / dc pelėmis, nors karbamido azoto ir gliukozės kiekio pokyčių nenustatyta (papildomas S3b pav.). . Šlapimo ir kraujo kreatinino kiekis nesiskyrė tarp WT ir mutantų pelių (papildomas S3c pav.). Mes pastebėjome tik dalinius fiziologinius Camsap3dc / dc pelių defektus.

Mikrotubulų organizavimasinkstųkanalėlių epitelio ląstelės. Kadangi Camsap3 mutacija sukelia mikrotubulių dezorientaciją plonosios žarnos epitelio ląstelėse10, 12, ištyrėme, ar tai taip pat vykstainkstasepitelinės ląstelės. Pirmą kartą kartu su Megalinu nusidažėme imuniniu tubulinu. Pažymėtina, kad tiek WT, tiek Camsap3dc/dc inkstuose megalino neigiami kanalėliai, ty distaliniai susisukę kanalėliai arba surinkimo kanalai, pasižymėjo stipresniu -tubulino imuninės dažymosi intensyvumu, nei buvo stebimas -tubulinas megalino teigiamuose PCT (3a, b pav.). . Kaip nustatyta plonojoje žarnoje10, CAMSAP3 lokalizuotas viršūnėje visose WT epitelio ląstelėseinkstus, sutampa su apikaliniu mikrotubulių galu, kurie yra išlyginti išilgai apikobazinės ašies (3c pav. kairėje). Camsap3dc/dc inkstų epitelio ląstelės taip pat buvo šiek tiek imunopozityvios CAMSAP3, bet netaisyklingose ​​padėtyse (3c pav. dešinėje, rodyklių galvutės), o tai rodo, kad mutavęs CAMSAP3 išlieka ląstelėse, pritvirtintas prie kai kurių neatpažintų struktūrų. Mutantinių inkstų cistinėse ląstelėse mikrotubulių masyvas buvo susipainiojęs ir neorganizuotas (3c pav. dešinėje), kaip pastebėta Camsap3dc/dc pelių žarnyno ląstelėse10. Tačiau ne cistinėse ląstelėse mikrotubulų organizavimas nebuvo paveiktas

3 pav. Mikrovamzdeliai inkstų kanalėlių epitelio ląstelėse. a ) -tubulino, megalino ir branduolių imuninis dažymas WT ir Camsap3dc / dc inkstuose esant P21. b) -tubulino intensyvumo kiekybinis WT inkstų PCT ir DCT/CD (PCT, n=28 kanalėlių; DCT/CD, n=18 kanalėlių) ir Camsap3dc/dc inkstų (PCT, n { {8}} kanalėlių; DCT/CD, n=9 kanalėlių). Klaidų juostos rodo SD ***p<0.001, t-test.="" (c)="" immunostaining="" for="" α-tubulin,="" camsap3,="" and="" dapi="" in="" wt="" and="" camsap3dc/dc="" kidneys="" at="" p21.="" arrowheads="" indicate="" camsap3-dc="" proteins="" anchoring="" to="" unidentifed="" structures.="" te="" apical="" localization="" of="" camsap3="" was="" absent="" in="" camsap3dc/dc="" cells.="" see="" also="" figure="">

net ir nesant funkcinio CAMSAP3, o tai gali paaiškinti, kodėl šios ląstelės neparodė citologinių anomalijų. Be to, Camsap3-nulinės inkstų epitelio ląstelės taip pat turėjo panašių mikrotubulų defektų, bet tik cistinėse ląstelėse (papildomas S2d pav.). Visi šie rezultatai parodė, kad CAMSAP3 vaidina svarbų vaidmenį palaikant apikobazinę mikrotubulių organizaciją tik inkstų epitelio ląstelių pogrupiui.

Padidėjęs ląstelių proliferacija Camsap3dc / dc PCT. Cistų susidarymas inkstuose yra glaudžiai susijęs su padidėjusiu inkstų ląstelių proliferacija34. Norėdami patikrinti, ar Camsap3dc / dc inkstuose nepakito ląstelių proliferacija, palyginome PCT ląstelių proliferaciją tarp WT ir mutantinių inkstų, bendrai imunizuodami Megalin ir Ki -67, ląstelių proliferacijos žymenį. Ki-67-teigiamos ląstelės buvo retai pastebėtos WT inkstų PCT, tuo tarpu Camsap3dc/dc inkstų PCT ląstelėse jos buvo lengvai matomos. Tačiau Ki-67 buvo aptiktas tiek neišsiplėtusiuose, tiek išsiplėtusiuose kanalėliuose (4a, b pav.), neparodo jokio ryšio tarp ląstelių proliferacijos ir cistų susidarymo. Tus, CAMSAP3disfunkcijaskatino ląstelių dauginimąsi, tačiau šis procesas ne visada buvo susijęs su cistų susidarymu.

YAP ir ne raumenų miozino lokalizacijos pokyčiai, susiję su ląstelių deformacija. YAP yra transkripcijos aktyvatorius, reguliuojantis ląstelių proliferaciją35, taip pat nuo mechaninės įtampos priklausomą ląstelių formavimą36. YAP aktyvuojamas kartu su jo branduoline lokalizacija pelių, kurių Pkd1- trūkumas, inkstuose, PKD37 modelis, o Yap aktyvinimas skatina ląstelių dauginimąsi ir inkstų kanalėlių išsiplėtimą28. Todėl išbandėme, ar YAP taip pat buvo suaktyvintas Camsap3dc / dc inkstų PCT. YAP imuninis dažymas atskleidė jo citoplazminę lokalizaciją WT inkstų PCT. Pažymėtina, kad YAP susikoncentravo Camsap3dc/dc PCT branduoliuose, bet tik išsiplėtusiose jų dalyse (5a pav.), kaip patvirtina kiekybinis įvertinimas (5b pav.), o tai rodo, kad stebimas YAP persiskirstymas įvyko reaguojant į ląstelės pasikeitimą. morfologija, o ne CAMSAP3disfunkcijaper se.

YAP yra Hippo kelio, reguliuojamo mechaniniais ženklais38, pasroviui. Tiesą sakant, Camsap3dc / dc inkstų cistinės ląstelės atrodė ištemptos, o tai rodo, kad jos galėjo būti veikiamos padidėjusios įtampos.

4 pav. Ląstelių proliferacija Camsap3dc/dc PCT. a) Ki-67, Megalino ir DAPI imuninis dažymas WT ir Camsap3dc/dc inkstuose esant P22. Rodyklės rodo Ki-67 – teigiamas ląsteles cistiniuose kanalėliuose. (b) Ki-67 teigiamų ląstelių procentas PCT epitelio ląstelėse [ plius / plius , n=700 ląstelių; dc/dc (išsiplėtęs), n=224 langelių; dc/dc (neišsiplėtęs), n=396 langelių]. Klaidų juostos rodo SD *p<0.05,>

Todėl ištyrėme, ar kartu su cistų susidarymu įvyko kokių nors mechaninių pokyčių. Kadangi ne raumenų miozino II aktyvinimas yra įtampai jautrus procesas39, įvertinome miozino lengvosios grandinės 2 (MLC2), kuri yra susijusi su miozino II aktyvavimu, pasiskirstymą inkstuose. Nors MLC2 išsisklaidė į citoplazmą WT kanalėlių ląstelėse, jis susikoncentravo netoli Camsap3dc/dc inkstų cistinių ląstelių viršūninių dalių (5c pav. rodyklės galvutė), o tai rodo, kad šios ląstelės buvo veikiamos tempimo jėgos. Neišsiplėtusiose PCT ląstelėse tokios MCL2 koncentracijos nebuvo. Šie radiniai atitiko idėją, kad YAP patenka į branduolį, kai ląstelės yra mechaniškai ištemptos40,41.

PIEZO1 paskirstymo pokyčiai Camsap3dc/dc PCT. Norėdami toliau patikrinti, ar cistinės ląstelės yra veikiamos tempimo jėgos, ištyrėme PIEZO1, mechaniškai jautraus jonų kanalo42–45, tarpląstelinį pasiskirstymą, nes tai yra tipiškas mechaninio tempimo žymeklis; PIEZO1 lokalizacija pasislenka iš plazmos membranos / citoplazmos į branduolio apvalkalą, kai jaučia tempimo signalus46. Imuninis dažymas PIEZO1 parodė, kad PIEZO1 dažniausiai lokalizuojasi WT PCT ląstelių citoplazmoje, o jo lokalizacija sutapo su Camsap3dc/dc PCT cistinių ląstelių branduoliu (6a pav.). YAP ir PIEZO1 imuninis dažymas nuosekliuose skyriuose taip pat rodo, kad jų branduolinė lokalizacija sutapo ties išsiplėtusiais PCT (papildomas S4 pav., rodyklių galvutės). Kita vertus, neišsiplėtusiuose Camsap3dc/dc PCT PIEZO1 pasiskirstymas atrodė citoplazminis (6a pav.). Tačiau atidūs imunofluorescencinių vaizdų stebėjimai ir kiekybinis įvertinimas parodė, kad jo branduolinė lokalizacija tam tikru mastu padidėjo, palyginti su WT ląstelėmis (6a, b pav.). Tus, skirtingai nei YAP, atrodo, kad PIEZO1 pradeda aktyvuotis prieš aptinkamą ląstelių deformaciją Camsap3dc / dc PCT.

Diskusija

Šiame tyrime mes nustatėme, kad CAMSAP3 mutacija arba jos praradimas lėmė PCT ląstelių išsiplėtimą, dėl kurio kanalėlių skerspjūviai įgavo cistinę išvaizdą. Cistogenezės požymis buvo pastebėtas jau E17.5, kai senėjimo metu palaipsniui didėjo išsiplėtimas ir galiausiai išsiplėtė iki Bowmano kapsulės. Epitelio ląstelės išsiplėtusiuose regionuose tapo plonesnės ir turėjo įvairių citologinių defektų, kaip pastebėta Camsap3dc / dc pelių plonosios žarnos ląstelėse 10, 12 . Taip pat buvo pastebėti kai kurie specifiniai inkstų defektai, įskaitant mitochondrijų derinimo ir bazinės plazmos membranos modeliavimo sutrikimus. Šie pokyčiai sutapo su mikrotubulių išsidėstymo sutrikimu, o tai rodo, kad CAMSAP3-tarpininkaujantys mikrotubulių tinklai yra atsakingi už normalų šių tarpląstelinių struktūrų organizavimą PCT ląstelėse, kaip ir kitų tipų ląstelėse. Kita vertus, nors atrodė, kad CAMSAP3 buvo išreikštas visose inkstų kanalėlių epitelio ląstelėse, nenormalūs struktūriniai fenotipai buvo pastebėti tik PCT, o tai rodo, kad egzistuoja perteklinis (-i) mechanizmas (-ai) palaikyti mikrovamzdelių tinklus, jei nėra CAMSAP3. Gali būti, kad kitos nei CAMSAP3 molekulės, tokios kaip kiti CAMSAP, gali dalyvauti palaikant šių ląstelių mikrotubulų tinklų vientisumą. PCT ląstelių mikrotubulų tankis buvo santykinai mažesnis nei kitų kanalėlių ląstelių. Tikriausiai tai palengvino ląstelių deformaciją, nes mikrotubulų tinklų, kurie išliktų po CAMSAP3 praradimo, galėjo nepakakti palaikyti

tinkama ląstelių architektūra. Tačiau atrodo, kad net PCT ląstelėse egzistuoja mechanizmai, kurie kompensuoja CAMSAP3 praradimą, nes PCT išsiplėtimas nebuvo vienodas.

5 pav. YAP ir ne raumenų miozino lokalizacija, susijusi su ląstelių deformacija. a ) YAP, Megalino ir DAPI imuninis dažymas WT ir Camsap3dc / dc inkstuose esant P22. DAPI ir YAP fluorescenciniai signalai buvo nuskaityti palei liniją, nubrėžtą padidintuose vaizduose, o erdviniai fluorescencijos intensyvumo pokyčiai rodomi mėlyna spalva DAPI ir žalia spalva YAP. Brūkšninės linijos rodo apytikslį branduolio plotą. Rodyklės rodo branduolio padėtį reprezentacinėse ląstelėse. (b) Branduolinio YAP intensyvumo ir citoplazminio YAP intensyvumo santykis [ plius / plius , n=81 ląstelių; dc/dc (išsiplėtęs), n =43 langelių; dc/dc (neišsiplėtusi), n=53 langelių]. Dėžutės diagramos rodo pirmojo kvartilio, medianos ir trečiojo kvartilio reikšmes. ***p<0.001, t-test.="" (b)="" immunostaining="" for="" mlc2,="" actin,="" and="" dapi="" in="" wt="" and="" camsap3dc/dc="" kidneys="" at="" p22.="" arrowheads="" indicate="" apical="" accumulation="" of="" mlc2="" in="" cystic="">

6 pav. PIEZO1 pasiskirstymo pasikeitimas Camsap3dc/dc PCT. a ) PIEZO1, Megalino ir DAPI imuninis dažymas WT ir Camsap3dc / dc inkstuose esant P22. DAPI ir PIEZO1 fluorescenciniai signalai buvo nuskaityti palei liniją, nubrėžtą padidintuose vaizduose, o erdviniai fluorescencijos intensyvumo pokyčiai rodomi mėlyna spalva DAPI ir žalia spalva PIEZO1. Brūkšninės linijos rodo apytikslį branduolio plotą. Rodyklės rodo branduolio padėtį reprezentacinėse ląstelėse. (b) Branduolinio pjezo1 intensyvumo ir citoplazminio pjezo1 intensyvumo santykis [ plius / plius , n=66 ląstelių; dc/dc (išsiplėtęs), n =44 langelių; dc/dc (neišsiplėtusios), n=81 langelių]. Dėžutės diagramos rodo pirmojo kvartilio, medianos ir trečiojo kvartilio reikšmes. ***p<0.001, **p=""><0.01, t-test.="" see="" also="" figure="">

Kaip tada PCT buvo išplėsti regioniniu būdu, kartu su epitelio ląstelių penėjimu? Pažymėtina, kad cistų susidarymas tapo aptinkamas ties E17.5, ir šis laikas koreliuoja su primityvios šlapimo gamybos atsiradimu pelėse47. Todėl galime daryti prielaidą, kad „šlapimo tekėjimas“ yra galimas mechaninis veiksnys, skatinantis inkstų kanalėlių išsiplėtimą. Tikėtina, kad PCT ląstelės, praradusios CAMSAP3-tarpininkaujantį mikrotubulinį citoskeletą, buvo mechaniškai jautresnės išorinėms jėgoms, tai yra, labiau deformuojasi, palyginti su WT PCT ląstelėmis. Tus, jėgos, kurias sukelia šlapimo pūslė inkstų kanalėliuose, gali sukelti kanalėlių išsiplėtimą, sukeldami jų penėjimą. Tokios jėgos gali būti nevienodos, todėl išilgai PCT gali atsirasti įvairaus laipsnio išsiplėtimo. Nereikia nė sakyti, kad ši idėja neatmeta kitų galimų PCT išsiplėtimo mechanizmų.

Mūsų stebėjimai parodė, kad PIEZO1 yra perkeltas iš citoplazmos į branduolinį regioną išsiplėtusiose Camsap3dc / dc inkstų PCT ląstelėse, o tai rodo, kad šis mechaninis jutiklis buvo aktyvuotas reaguojant į ląstelių deformaciją, greičiausiai ląstelių „tempimą“, kaip buvo pranešta anksčiau46. Išsiplėtusių PCT ląstelių ištemptą būseną patvirtino stebėjimas, kad MLC2 padidėjo jų žievės regionuose. Mūsų analizė taip pat parodė, kad PIEZO1 jau buvo tam tikru mastu aktyvuotas neišsiplėtusiose PCT ląstelėse, o tai rodo, kad net šios ląstelės patyrė mechaninius pokyčius, nepaisant jų normalios išvaizdos. Kitas mechaninis jutiklis, YAP, taip pat buvo aktyvuotas PCT ląstelėse, tačiau atrodė, kad jis suaktyvėjo tik ištemptose ląstelėse.

Kaip tada šie mechaniškai jautrūs reguliatoriai prisideda prie ląstelių deformacijos, taip pat ląstelių proliferacijos, kuri buvo skatinama nesant CAMSAP3? Buvo įrodyta, kad tempimo sukeltas PIEZO1 aktyvinimas skatina ląstelių proliferaciją epitelio ląstelėse46, o tai rodo, kad šis mechanizmas taip pat veikia Camsap3dc / dc inkstų PCT ląstelėse. Ši idėja atitinka mūsų pastebėjimą, kad padidėjęs ląstelių proliferacija ir dalinis PIEZO1 aktyvavimas įvyko kartu, net ir neišsiplėtusiose Camsap3dc / dc PCT ląstelėse. Kalbant apie YAP, jo aktyvavimas buvo atidėtas, o tai neparodė aiškios koreliacijos su ląstelių proliferacijos padidėjimo pradžia. YAP yra žinomas ne tik kaip ląstelių augimo faktorius, bet ir kaip mechaninės homeostazės reguliatorius, kaip buvo parodyta anksčiau36, 48 . Todėl gali būti, kad YAP, kuris buvo perkeltas į branduolį kartu su PCT ląstelių deformacija, gali reguliuoti jų formą, ty atkurti pažeistą šių ląstelių formą. Priešingu atveju YAP gali bendradarbiauti su PIEZO1, kad padidintų išsiplėtusių ląstelių dauginimąsi, nes žinoma, kad YAP dalyvauja policistinių inkstų formavime, stiprindamas ląstelių proliferaciją28.

Mes nustatėme, kad Camsap3dc/dc pelių K+ ir Mg2+ kiekis kraujyje buvo žymiai mažesnis, o tai rodo, kad jų inkstai galėjo nukentėti dėl tam tikro nenormalaus veikimo. Sunkūs citologiniai defektai, kuriuos pastebėjome PCT ląstelių viršūninėse ir bazinėse plazminėse membranose, kur yra aktyvioji transportavimo mašina, gali būti susiję su šia anomalija. Tačiau negalime atmesti galimybės, kad kitos inkstų kanalėlių dalys ar kiti organai taip pat gali turėti funkcinių defektų, sukeldami šį fenotipą. Be to, negavome jokių įrodymų, kad būtų pažeistos glomerulų sklandymo funkcijos, nes kreatinino ir šlapalo azoto, kurie išsiskiria per glomerulą, kiekis kraujyje buvo normalus.

Pirminės ciliumo biogenezės sutrikimas sukelia PKD24–27. Camsap3 mutacijos atveju pirminių blakstienų susidarymas atrodė nepakitęs. Neseniai atliktas tyrimas parodė, kad CAMSAP3 praradimas nosies daugiasluoksnėse epitelio ląstelėse paveikė centrinių mikrotubulių porų susidarymą aksoneme, sukeldamas nenormalų judrių blakstienų judrumą49. Nors pirminės epitelio ląstelių blakstienėlės yra nejudrios ir joje trūksta centrinių mikrotubulių porų50, lieka neaišku, ar Camsap3 mutantų pelių pirminė blakstiena vis dar veikia. Nepaisant šio neapibrėžtumo, PKD ir Camsap3 mutantų anomalijos yra gana skirtingos, nes pirmojoje cistos susidaro tolygiai visame inkste, o pastarajame tai yra vietinis įvykis. Tikėtina, kad šis skirtumas yra susijęs su skirtingomis molekulinėmis cistų formavimosi aplinkomis.

Apibendrinant, mūsų tyrimas atskleidžia, kad CAMSAP3 yra svarbus palaikant inkstų kanalėlių struktūrą ir funkciją proksimaliniuose regionuose, greičiausiai reguliuojant necentrosominių mikrotubulų surinkimą. Tačiau reikės atlikti tolesnius tyrimus, kad būtų galima išsamiai suprasti, kaip šios mikrotubulų organizavimo sistemos praradimas trukdo fiziologinėms inkstų funkcijoms.

medžiagos ir metodai

Visi eksperimentai buvo atlikti pagal atitinkamas gaires, reglamentus ir patvirtinti RIKEN Biosistemų dinamikos tyrimų centro ir (arba) Wasedos universiteto Institucinio biologinės saugos komiteto.

Pelės. Šiame tyrime naudotos Camsap3 mutantinės (Camsap3dc/dc) pelės buvo sukurtos mūsų ankstesniame tyrime10 (prisijungimo Nr. CDB0716K; http://www2.clst.riken.jp/arg/mutant procent 20 mice procent 20list.html). Tose pelėse buvo pašalintas Camsap3 C-galinis regionas, būtent 14–17 egzonai, ir anksčiau patvirtinome, kad pelių ląstelės išreiškia nefunkcinį C galą sutrumpintą CAMSAP3 (CAMSAP3-dc)10. Šiame tyrime eksperimentuose buvo naudojamos N4 ir 5 kartos pelės.

Camsap3 knockout (Camsap3–/–) pelės (prijungimo Nr. CDB0033E), kurioms trūksta viso 22-kb Camsap3 koduojančio regiono, buvo sukurtos naudojant CRISPR/Cas9-tarpininkaujantį genomo redagavimą per zigotų elektroporaciją51. Trumpai tariant, buvo sukurtos dvi orientacinės RNR ir vienos grandinės oligodeoksinukleotidas (ssODN), kad ištrintų 22- kb sritį, o EcoRI vieta buvo pridėta siekiant atpažinti sėkmingą įterpimą į mutantines peles. Elektroporacijai cRNR, tracrRNR, ssODN ir Cas9 baltymai buvo įvesti į C57BL / 6 zigotus. Po elektroporacijos zigotos buvo perkeltos į pseudonėščias ICR pelių pateles, o pelės įkūrėjos buvo patikrintos PGR ir DNR sekos nustatymu. Buvo gautos medžio išmuštos pelės (#4, #10, #23), o viena iš jų (#23) turėjo suprojektuotą EcoRI knock-in alelį. Vadovo RNR sekas sukūrė CRISPRdirect (//crispr.dbcls.jp). Te crRNR, tracrRNR ir ssODN sekos, naudotos genomo redagavimui, buvo susintetintos taip: 5′-cRNR, 5′-UGA UCC CAC ACA UAU GCA GGg uuu uag agc uau gcu guu uug-3′-cRNA , 5′-CAGCCACCUCUGAUC UGACCguuuuagagcuaugcuguuuuug-3′; tracrRNA, 5′-AAACAGCAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCC

GUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCU-3′; ssODN, 5′-TAGAACTTACTGTATAGTAAT

AGCCACAAACTCCATATGCATATGTGAACTCCACCTGAATTCACCTGGCAAGAGATTCCAGACCAG

CTCTCCTCTCCTGGGCCTCCTCCACCCCCACAT-3′ . Didžiosios ir mažosios raidės atitinkamai nurodo kodavimo ir pagalbines sekas. Pelės Nr. 23 linija buvo tris kartus kertama su C57BL/6, o eksperimentuose buvo naudojamos N3 kartos pelės.

Eksperimentus su pelėmis patvirtino RIKEN Biosistemų dinamikos tyrimų centro arba Wasedos universiteto Institucinis gyvūnų priežiūros ir naudojimo komitetas ir jie buvo atlikti pagal tų komitetų pateiktus protokolus. Tyrimas buvo atliktas laikantis ARRIVE gairių: https://arriveguidelines.org.

Genotipavimas. Pelių genotipų nustatymas buvo atliktas PGR. Camsap3dc / dc pelėms naudojome pradmenis, aprašytus Toya ir kt. (2016). Camsap3–/– pelėms naudojome šiuos pradmenis, kad aptiktume laukinio tipo (WT) (P1/P2, 411 bp) arba Camsap3–/– (P1/P3, 614 bp) alelį (papildomas S2a, b pav.) : P1, 5′- CATGTACCTACCACC ATCC-3′; P2, 5′- GGACCCTGGAGAGGCTTAG-3′; P3, 5′- GCAAGGCTGTAGTGAGCC-3′ . Te P1 / P3 sritis WT nebuvo amplifikuota naudojant PGR sąlygas.

Histologija: šaldytų audinių pjūvių paruošimas. Išpjaustytas inksto audinys 1 valandą kambario temperatūroje buvo sumaišytas 2 procentų paraformaldehido (Termo Fisher) / 0,1 M sorbitolio (Nacalai Tesque) / PEM buferyje. PEM receptas yra: 100 mM VAMZDŽIŲ (Nacalai Tesque), 5 mM EGTA (Nacalai Tesque) ir 5 mM MgCl2 (Wako), sureguliuotas iki 6,9 pH su 2 M KOH. Po operacijos inkstų audinys tris kartus skalaujamas PEM 10 minučių. Dešimt, krioapsauga buvo atlikta sacharoze / PEM: 15 procentų sacharozės PEM tirpale 2 valandas 4 laipsnių temperatūroje, po to 20 procentų sacharozės PEM tirpale per naktį 4 laipsnių temperatūroje ir pakeitimas 30 procentų sacharozės PEM tirpale ~ 2 valandas. prie 4 laipsnių. Inkstų audinys buvo užšaldytas UŠT junginyje įterpimo formoje (Polysciences, Inc.) skystame azote ir laikomas –80 laipsnių temperatūroje. Sušaldyti mėginiai buvo supjaustyti 5 µm storio CM1850 kriostatu (Leica). Pjūviai ant stiklelių buvo laikomi –80 laipsnių temperatūroje iki dažymo.

Histologija: parafno įterptų audinių pjūvių paruošimas. Išpjaustytas inkstų audinys 2 valandas kambario temperatūroje buvo sumaišytas Super Fix tirpale (Kurabo), po to per naktį perkeltas į 4 laipsnius. Kiekvienas mėginys kambario temperatūroje buvo veikiamas trimis didėjančios koncentracijos vandeniniais etanolio tirpalais: 30 proc. etanolio 3{{20}} min. du kartus, 50 proc. etanolio 3{ {35}} min. ir galiausiai 70 proc. etanolio 30 min. Kiekvienas mėginys buvo apdorotas naudojant ASP300 audinių procesorių (Leica). Dešimt, inkstų audinių mėginiai buvo įterpti į parafno vašką (Sakura Finetek) su EG116{58}} (Leica) ir laikomi 4 laipsnių temperatūroje. Į parafną įterpti mėginiai buvo supjaustyti 6 µm storio sukamuoju mikrotomu RV24{61}} (Yamato Kohki). Pjūviai ant stiklelių buvo laikomi 4 laipsnių temperatūroje iki dažymo. Imunofluorescencinis dažymas. Užšaldytos inkstų dalys buvo panardintos į 0,1 procento Triton X-100 (Nacalai Tesque) / PEM 10 minučių kambario temperatūroje. Dešimt, mėginiai buvo pralaidūs naudojant 0,2 procento Triton X-100 / PEM 10 minučių kambario temperatūroje. Dar kartą mėginiai buvo panardinti į 0,1 procento Triton X-100 / PEM 10 minučių kambario temperatūroje. Tada mėginiai buvo blokuojami 3 procentų galvijų serumo albuminu (BSA; Roche) / 0,1 procento Triton X-100 / PEM 30 minučių kambario temperatūroje, po to pirminė antikūnų reakcija per naktį 4 laipsnių temperatūroje. Pirminiai antikūnai buvo atskiesti 3 procentais BSA / 0,1 procento Triton X-100 / PEM. Pirminiams antikūnams, atsiradusiems pelėse, buvo atliktas papildomas blokavimas naudojant MOM blokavimo reagentą (Vector Laboratories), prieš blokuojant 3 procentų BSA / 0,1 procento Triton X-100 / PEM. MOM blokuojantis reagentas buvo praskiestas 0,1 procento Triton X-100 / PEM ir 30 minučių užteptas ant mėginių kambario temperatūroje. Po apdorojimo MOM mėginiai buvo plaunami 0,1 procento Triton X-100 / PEM tris kartus 5, 10 ir 15 minučių kambario temperatūroje. Po pirminės antikūnų reakcijos mėginiai buvo plaunami 15 minučių kambario temperatūroje su 0,1 % Triton X-100 / PEM tris kartus. Antrinė antikūnų reakcija buvo vykdoma 2 valandas kambario temperatūroje tamsoje. Antriniai antikūnai buvo atskiesti 3 procentais BSA / 0,1 procento Triton X-100 / PEM. Pasibaigus reakcijai, mėginiai buvo plaunami 0,1 procento Triton X-100 / PEM tris kartus 5, 10 ir 15 min. kambario temperatūroje ir užsandarinami VECTASHIELD montavimo terpe (Vector Laboratories). Antikūnai ir reagentai. DNR buvo nudažyta DAPI tirpalu (Dojindo, D523, 1:1000). F-aktinas buvo nudažytas Alexa Fluor 594 faloidinu (Termo Fisher, A12381, 1:400). Mikrotubulai buvo nudažyti pelių anti- -tubulinu-FITC (DM1A; Sigma Aldrich, F2168, 1:200). Buvo naudojami šie pirminiai antikūnai: ožkos anti-megalinas (P-20; Santa Cruz Biotechnology, sc-16478, 1:200), triušio anti-NaCl kotransporteris (MERCK, AB3533, 1:500). ), triušio anti-akvaporinas-2 (abcam, AB3274, 1:400), ožkų anti-SGLT1 (M-19; Santa Cruz Biotechnology, sc-20582, 1:200) , triušio anti-SGLT2 (Novus Biologicals, NBP1-92384, 1:200), pelių anti-ezriną (3C12; abcam, ab4069, 1:500), triušio anti-giantiną (Covance, PRB-114 C, 1:700), triušio anti-aPKC (Santa Cruz Biotechnology, sc{121}}, 1:400), ožkų anti-DPP IV (R&D Systems, AF954, 1:100), pelės anti-Na plius /K plius -ATPazė (abcam, ab7671, 1:100), pelės antiacetilintas tubulinas (Sigma Aldrich, T6793, 1:200), triušio anti-CAMSAP3 (Tanaka ir kt., 2012, 1:400), pelė antitirozinuotas tubulinas (Sigma Aldrich, T9028, 1:200), triušio anti-Ki-67 (SP6; abcam, ab16667, 1:250), triušio anti-YAP (ląstelių signalizacija, #4912, 1:100) ), triušio anti-miozino lengvoji grandinė 2 (Cell Signaling, #8505, 1:100), triušio anti-pjezo1 (Novus Biologicals, N BP1-78446, 1:100), žiurkės anti-E-kadherinas (52, 1:400) ir triušio antimerlinas (Sigma Aldrich, HPA003097, 1:100). Buvo naudojami šie antriniai antikūnai: asilo Dylight 594 – konjuguotas anti-ožkų IgG (Jackson, 1:500), ožkos Alexa Fluor 488/594 – konjuguotas anti-triušio IgG (Termo Fisher, A-11034, A -11037, 1:500), ožkos Alexa Fluor 488/594 – konjuguotas antipelės IgG (Termo Fisher, A-11029, A-11032, 1:500) ir ožkos Alexa Fluor 488 – konjuguotas anti-žiurkės IgG (Termo Fisher, A-11006,

1:400). Tyrime naudotų anti-YAP (Cell Signaling, #4912) ir anti-PIEZO1 (Novus Biologicals, NBP1-78446) antikūnų surišimo specifiškumas buvo patikrintas ankstesniais darbais46,53. Dažymas hematoksilinu ir eozinu (H&E). Stiklinės plokštelės su inkstų dalimis buvo dedamos ant 55 laipsnių plokštelės 30 minučių, kad parafnas ištemptų. Tada mėginiai du kartus panardinami į ksileną 15 min., po to panardinami į 70–100 procentų etanolį: 100 procentų etanolį 5 minutes du kartus, 90 procentų etanolį 5 minutes, 80 procentų etanolį 5 minutes ir 70 procentų. etanolyje 5 min. Po skalavimo vandenyje 20 minučių ir distiliuotame / dejonizuotame H2O (ddH2O) 1 minutę, mėginiai buvo nudažyti Mayer hematoksilino tirpalu (Wako) 5 minutes. Mėginiai buvo du kartus panardinti į ddH2O, po to 10 minučių plaunami ddH2O. Mėginiai vėl buvo panardinti į ddH2O ir 2 minutes nudažyti eozino tirpale (Merck). Išplovimui mėginiai buvo panardinami į ddH2O 30 s, po to panardinami į 70–100 procentų etanolio ir ksileno seriją: 70 procentų etanolio 5 s, 80 procentų etanolį 5 s, 90 procentų etanolį 5 s, 100 procentų etanolį. 5 s du kartus ir ksileną 10 min. Galiausiai mėginiai buvo užplombuoti gliceroliu. Mikroskopija. Vaizdai buvo gauti naudojant BZ-X710 all-in-one fluorescencinį mikroskopą (Keyence) arba LSM880 lazerinį skenavimo konfokalinį mikroskopą (Zeiss). BZ-X710 objektyvai buvo naudojami Nikon CFI Plan Apo λ 2 × , 10 × , 40 × , 100 × ir Nikon CFI Plan Fluor 4 × . Gauti vaizdai buvo apdoroti BZ-X Analyzer programine įranga. Te LSM880 buvo įrengtas Axio Observer Z1 apverstas mikroskopas su Plan-Apochromat 63 × /1,40 NA alyvos imersinio objektyvo objektyvu (Zeiss). Vaizdai buvo apdoroti ir analizuojami naudojant „ImageJ“ ir „Adobe Photoshop CC2019“. Cistinės indekso analizė. Cistinis indeksas buvo analizuojamas ImageJ, naudojant H&E dažytus horizontalios inksto dalies vaizdus. Matuojant plotą, kuriame yra cistos, išsiplėtusio vamzdinio spindžio perimetras buvo atsektas naudojant funkciją „Freehand Selects“, o jo plotas matuojamas naudojant funkciją „Matuoti“. Buvo atliktas visų cistų tyrimas inkstų skyriuje, o visų cistų plotai buvo sudėti, siekiant nustatyti cistos turinčią sritį. Bendras inkstų plotas buvo matuojamas tokiu pačiu būdu. Išorinė inksto perimetras buvo atsektas naudojant funkciją „Freehand Selects“ ir įvertintas jo plotas. Galiausiai, mes apskaičiavome cistinį indeksą, padaliję cistos turinčią sritį iš viso inkstų ploto.

Išsiplėtusių ir neišsiplėtusių kanalėlių apibrėžimas. Šiame tyrime kanalėliai, kurių spindžio plotas yra didesnis arba lygus 500 µm2, buvo apibrėžiami kaip "išsiplėtę", o tie, kurių spindžio plotas yra<500 µm2="" have="" been="" defned="" as"non-dilated".="" when="" selecting="" a="" "dilated"="" tubule="" in="" camsap3dc/dc="" samples,="" we="" frst="" visually="" picked="" up="" a="" cyst="" that="" was="" not="" recognized="" in="" wt="" samples="" and="" then="" roughly="" measured="" its="" lumen="" area="" using="" imagej.="" if="" the="" value="" was="" ≧500="" µm2,="" it="" was="" regarded="" as="">

Elektroninė mikroskopija. Elektroninei mikroskopijai buvo ištirtos P21 pelių patinai. Mėginiai nuskaitymui elektroninei mikroskopijai buvo paruošti pagal Takahashi-Iwanaga54 su tam tikromis modifikacijomis, kaip nurodyta toliau. Pelės buvo anestezuotos izofuranu ir perfuzuotos 2 % (m/v) formaldehidu ir 2,5 % (tūrio/tūrio) glutaraldehidu 0,1 M kakodilato buferyje, pH 7,4. Kiekvienas inkstas buvo išpjautas ir supjaustytas kubeliais, kurie per naktį buvo panardinti į tą patį fxative, o tada nuplauti 0,1 M kakodilato buferiu. Surinkti mėginiai buvo perkelti per 3 0 procentų vandeninį dimetilsulfoksido tirpalą į 6 0 procentų dimetilsulfoksidą, o po to suskaidyti skystame N2. Sulaužyti mėginiai buvo nuplauti 0,1 M kakodilato buferiu ir patalpinti į 6 N NaOH 1{{30}}–20 min. 60 laipsnių temperatūroje. Po maceracijos NaOH tirpale kiekvienas mėginys buvo nuplaunamas 0, 1 M kakodilato buferiu, kuriame yra 0, 05 procento Tween 20, ir 2 valandas po 1 procento OsO4 0, 1 M kakodilato buferyje ant ledo. Padėti mėginiai buvo: (1) nuplauti ddH2O ir patalpinti į 1 procentą vandeninį tiokarbohidrazido tirpalą 20 min. kambario temperatūroje ir (2) nuplauti ddH2O ir vėl po 1 val. kambario temperatūroje 1 procento OsO4 0,1 M kakodilato buferyje. . Pakartojus (1) ir (2) veiksmus, mėginiai buvo nuplauti ddH2O ir nudažyti 0,5 procento uranilo acetato tirpalu per naktį kambario temperatūroje. Audinių blokai buvo nuplauti ddH2O ir dehidratuoti per graduotą etanolio seriją, perkelti į izopentilo acetatą ir kritinėje vietoje išdžiovinti naudojant skystą CO2. Išdžiovinti bandiniai buvo padengti osmiu ir tiriami JSM{54}}LV skenuojančiu elektroniniu mikroskopu, esant 10 kV greitinimui. Nuotraukos apdorotos Adobe Photoshop programa.

Transmisijos elektronų mikroskopijai išpjaustytų inkstų kubeliai mažiausiai 2 valandas buvo maišomi 2 % (m/tūrio) formaldehido ir 2,5 % (tūrio/tūrio) glutaraldehido 0,1 M kakodilato buferyje kambario temperatūroje. Mėginiai buvo plaunami 0,1 M kakodilato buferiu ir 2 valandas po 1% OsO4 {{10}},1 M kakodilato buferyje. Tada mėginiai buvo plaunami ddH2O ir per naktį dažomi 0,5 procento vandeniniu uranilo acetatu kambario temperatūroje. Dažyti mėginiai buvo dehidratuoti su rūšiuota etanolio serija, perkelti į propileno oksidą ir įterpti į Polybed 812 (Polysciences). Itin plonos sekcijos buvo nupjautos deimantiniu peiliu, dvigubai nudažytos uranilo acetatu ir švino citratu ir stebimos esant 100 kV greitinimui, naudojant perdavimo elektronų mikroskopą (JEM-1010; JEOL), turintį įkrovimo įrenginio kamerą ( BioScan modelis 792; Gatan). Nuotraukos apdorotos Adobe Photoshop programa.

Šlapimo ir kraujo tyrimas. Palyginimui su Camsap3dc / dc pelėmis, WT (plius / plius) ir heterozigotinės (plius / dc) pelės buvo naudojamos kaip kontrolė šiuose tyrimuose. Heterozigotinėse pelėse nėra Camsap3 požymiųdisfunkcija 10ir suorganizavo apikobazinius mikrotubulių matricas. Pelės buvo 56–60 savaičių amžiaus.

Pelės buvo laikomos metaboliniame narve (TECNIPLAST). Šlapimo mėginiai buvo renkami kiekvieną dieną penkias dienas iš eilės, o surinkti mėginiai buvo laikomi –80 laipsnių temperatūroje. Galiausiai visi penki kiekvienos pelės mėginiai buvo sumaišyti taip, kad galutinis mišinys atspindėtų vidutinę kiekvienos pelės būklę per tą laikotarpį.

Kraujo paėmimui pelėms buvo skirta {{0}},02 ml anestezijos vienam kūno svorio gramui. Anestezijos sudėtis buvo Domitor (ZENOAQ) 30 µL, Midazolamas (Sandoz) 80 µL, Vetorphale (Meiji Seika Pharma) 100 µL ir 0,9 procento vandeninis NaCl iki 1 ml. Kraujas buvo paimtas širdies punkcija. Siekiant išvengti hemolizės, švirkštas buvo švelniai įkištas ir ištrauktas. Kiekvienas kraujo mėginys buvo laikomas kambario temperatūroje 1 valandą, kad krešėtų. Tada kiekvienas mėginys buvo centrifuguojamas (10,000 × g, 25 laipsniai, 15 min.), o serumas buvo surinktas ir laikomas –80 laipsnių temperatūroje. Visus šlapimo ir kraujo mėginius ištyrė Oriental Yeast Co.