Dendrimer-tesaglitazar konjugatas sukelia mikroglijos fenotipo pokytį ir sustiprina amiloidinę fagocitozę† 2 dalis

Biologiniai tyrimai in vitro

Ląstelių kultūra. BV2 pelių mikroglijų ląstelių linija buvo gauta iš Mičigano vaikų ligoninės ląstelių kultūros centro.

Pastaraisiais metais mokslininkai nustatė, kad ląstelių kultūra yra glaudžiai susijusi su žmogaus atmintimi. Tyrimai parodė, kad tiriant ląstelių kultūrą galima atrasti molekulinius atminties ir mokymosi proceso mechanizmus, taip pagerinant žmogaus pažinimo gebėjimus ir atmintį.

Ląstelių kultūra reiškia biologinių ląstelių patalpinimą į auginimo terpę, kurioje yra būtinų maistinių medžiagų, kad galėtų augti ir daugintis in vitro sąlygomis. Ląstelės yra pagrindiniai gyvybės vienetai, o ląstelių kultūra suteikia mokslininkams platformą ląstelių elgsenai ir gyvenimo veiklai tirti. Tyrinėdami ląsteles, mokslininkai atrado daug informacijos apie neuronų augimą ir sinaptinius ryšius. Šios išvados gali ne tik padėti žmonėms geriau suprasti, kaip veikia smegenys, bet ir padėti sukurti naujus gydymo būdus ir vaistus.

Pastarųjų metų tyrimai parodė, kad ląstelių kultūra taip pat glaudžiai susijusi su žmogaus atmintimi. Mokslininkai išsiaiškino, kad žmogaus atminties formavimas ir palaikymas reikalauja daug molekulinio reguliavimo ir signalų perdavimo. Šie signalo perdavimo ir reguliavimo mechanizmai turi daug panašumų su ląstelių kultūros mechanizmais. Tyrinėdami signalų perdavimo ir reguliavimo mechanizmus ląstelių kultūroje, mokslininkai gali geriau suprasti žmogaus atminties ir mokymosi mechanizmus.

Be to, kai kurie tyrimai taip pat parodė, kad ląstelių kultūra tam tikrais būdais gali pagerinti žmogaus atmintį ir mokymosi gebėjimus. Pavyzdžiui, naudojant metodą, vadinamą „elektrine stimuliacija“, galima stimuliuoti ląstelių veiklą ir ryšį tarp neuronų, taip pagerinant žmogaus pažinimo gebėjimus ir mokymosi poveikį. Nors šis metodas dar tik laboratorinių tyrimų stadijoje, tikimasi, kad ateityje jis taps nauju kognityvinio lavinimo metodu.

Apibendrinant galima pasakyti, kad tarp ląstelių kultūros ir žmogaus atminties yra glaudus ryšys. Tyrinėdami ląsteles galime geriau suprasti žmogaus pažinimo ir atminties mechanizmus, taip pat padėti kurti naujus gydymo metodus ir pažinimo mokymo metodus. Tikimės ląstelių kultūros technologijų indėlio į žmoniją ateityje! Matyti, kad turime gerinti atmintį, o Cistanche gali žymiai pagerinti atmintį, nes Cistanche turi antioksidacinį, priešuždegiminį ir senėjimą stabdantį poveikį, kuris gali padėti sumažinti oksidaciją ir uždegimines reakcijas smegenyse ir taip apsaugoti žmogaus sveikatą. nervų sistema. Be to, Cistanche taip pat gali skatinti nervų ląstelių augimą ir taisymą, taip pagerindamas neuroninių tinklų ryšį ir funkciją. Šis poveikis gali padėti pagerinti atmintį, mokymosi gebėjimus ir mąstymo greitį, taip pat gali užkirsti kelią pažinimo sutrikimams ir neurodegeneracinėms ligoms.

Norėdami pagerinti atmintį, spustelėkite žinokite papildus

BV2 ląstelės buvo kultivuojamos Dulbecco modifikuotoje EaglesMedium (DMEM) terpėje su 10% termiškai inaktyvuotu galvijų vaisiaus serumu (HI FBS) ir 1% penicilino / streptomicino (P/S) 37 laipsnių ir 5% CO2.

Kai ląstelės susiliejo kultivavimo kolboje, ląstelės buvo perkeltos į naują kolbą, naudojant 0,05 % tripsino-etilendiamino tetraacto rūgštį (EDTA). Eksperimentams BV2 ląstelės buvo pasėtos į DMEM su 5% HIFBS ir 1% P/S. Po 24–48 valandų ląstelės buvo stimuliuojamos 100 ng ml-1 (300 EU ml-1) LPS 3 valandas, kad ląstelės galėtų patekti į priešuždegiminį (M1) fenotipą ir imituoti neurouždegiminę aplinką, esančią daugelyje neurologinių ligų.

Tada ląstelės buvo kartu apdorotos LPS ir laisvu Tesa arba D-Tesa skirtingomis koncentracijomis 48 rankoms, tada supernatantas ir ląstelės buvo surinktos apdorojimui. Ląstelės, kurios niekada nebuvo apdorotos LPS (be LPS), ir ląstelės, visą laiką apdorotos tik LPS (tik LPS), buvo kontrolinės grupės. Laisvieji Tesa ir D-Tesa pradiniai tirpalai buvo sterilizuoti naudojant poli(eterio sulfonus) 0,2 µm filtrus.

D-Tesa buvo tirpus ląstelių terpėje. Tesa buvo tirpinamas naudojant dimetilsulfoksidą (DMSO), kurio galutinė koncentracija mažesnė nei 0,1 % (v/v). Citotoksiškumas, azoto oksido tyrimas ir TNF-ELISA. Atliekant citotoksiškumo tyrimą, ląstelės buvo apdorotos, kaip aprašyta aukščiau, šulinėlių plokštelėje, o tada laisvųjų Tesa ir D-Tesa citotoksiškumas buvo įvertintas MTT tyrimu pagal gamintojo instrukcijas.

Atliekant azoto oksido tyrimą, ląstelės buvo apdorotos, kaip aprašyta aukščiau, 12-šulinėlių plokštelėse, tada iš apdorotų ląstelių buvo surinkti supernatantai ir nedelsiant išmatuotas azoto oksido kiekis pagal gamintojo pateiktą Griess reagento protokolą.

Atliekant TNF-ELISA, ląstelės buvo apdorotos, kaip aprašyta aukščiau, 12-šulinėlių plokštelėse, o tada apdorotų ląstelių supernatantai buvo surinkti ir laikomi –80 laipsnių temperatūroje, kol buvo paruošti tolesniam apdorojimui.

Tada mėginiai buvo atšildyti ant ledo ir TNF-ELISA buvo atlikta pagal gamintojo protokolą. Šiems tyrimams tiek D-Tesa, tiek laisva Tesa buvo apdorojami ultragarsu ir maišomi, kol jie abu visiškai ištirpo. Norint ištirpinti laisvą Tesa, ji pirmiausia buvo ištirpinta DMSO prieš skiedžiant, kur galutinė DMSO koncentracija buvo mažesnė nei 0,1 % (v/v) visuose laisvuose Tesa mėginiuose.

Kadangi D-Tesa buvo tirpus ląstelių kultūros terpėje, DMSO į šiuos mėginius nebuvo pridėta. Atliekant allin vitro tyrimus, tiek laisvųjų Tesa, tiek D-Tesa grupių ląstelėms buvo pritaikytas lygiavertis laisvo arba konjuguoto vaisto kiekis.

Kiekybinė realaus laiko PGR (qRT-PGR). Ląstelės buvo apdorotos, kaip aprašyta aukščiau, 12-šulinėlių plokštelėse, o surinkus supernatantą, ląstelės buvo surinktos į Invitrogen™ TRIzol™ reagentą (iš Fisher Scientific), o RNR buvo išskirta laikantis gamintojo protokolo. Gautos RNR koncentracija ir grynumas buvo analizuojami naudojant Nanodrop.

Ekvivalentiški kiekiai RNR iš kiekvieno mėginio buvo konvertuoti į cDNR, vadovaujantis gamintojo protokolu, skirtu High CapacitycDNA atvirkštinės transkripcijos rinkiniui (iš Applied Biosystems, Thermo Fisher Scientific).

Gauta cDNR buvo panaudota QRT-PGR analizei naudojant FAST-SYBR žalią reagentą ir laikantis gamintojo protokolo. Ct vertės buvo apskaičiuotos mašina, o duomenys buvo analizuojami naudojant 2-ΔΔCt metodą.

Kiekvienam skirtingam žymeniui ΔΔCt vertė buvo apskaičiuota atimant be LPS grupės ΔCt iš kiekvieno mėginio ΔCt. ΔCt vertė buvo dominančio geno Ct vertė, atėmus GAPDH Ct kiekvienam duotam mėginiui.

Kai buvo apskaičiuotas 2−ΔΔCt visoms grupėms, jos visos buvo normalizuotos į grupę be LPS, taip suteikiant santykinį raiškos lygį be LPS grupės 1.0 visiems žymenims. Pirmyn ir atgal pradmenų sekos buvo naudojamos QRT. -PCR parodyta žemiau esančioje lentelėje. Visos sekos perrašomos iš 5′→3′.

Be to, iš BIORAD buvo įsigyti pradmenys, skirti iNOS/Nos2 (qmmuCID0023087), TLR4 (qmmuCID0023548), CD206/Mrc1 (qmmuCID0012670), TGF- 1 (qmmuCID0017), qmmuCID0017 (qmmuCID0017). 1 (qmmucid0024846), CD36 (qmmucid0014852), Ide(qmmucid0049796), MMP9 (qmmucid0021296), CCL1 (qmmuced0038249), TLR8 (qmmuced0039837), CD6mucid06m060002 404) ir PPAR (qmmucid0018821). Fagocitozės tyrimas.

Laisvosios Tesa ir D-Tesa -amiloido onfagocitozės poveikis buvo nustatytas naudojant anksčiau aprašytą metodą.47 Trumpai tariant, HiLyte™ miltai 488-pažymėti -amiloidu1–42 (iš Anaspec Inc.) buvo ištirpinti DMSO (galutinė DMSO koncentracija). mažiau nei 0,5 % (v/v)) ir praskiedžiama iki 5 µg ml-1 PBS.

Apdorojus ląsteles Tesa ir D-Tesa pagal aukščiau aprašytą gydymo schemą, ląstelėms 2 valandas buvo taikomas -amiloido tirpalas. Tada ląstelės tris kartus buvo plaunamos Hanko subalansuotu druskos tirpalu su dvivalenčiais katijonais (kalciu ir magniu), pašalinamos iš šulinių naudojant tripsiną ir pakartotinai suspenduotos FACS buferyje (iš Invitrogen).

Mėginiai buvo laikomi ant ledo ir nedelsiant buvo paleisti Sony Cell Sorter SH800 srauto citometrine mašina, o duomenys buvo analizuojami naudojant susijusią programinę įrangą.

Vartai buvo nustatyti naudojant ląsteles, neapdorotas fluorescenciniu amiloidu, o parodyti rezultatai yra kiekvienos grupės ląstelių, kurios fluorescencija buvo didesnė už fono fluorescenciją, procentas.

Kiekvienai grupei taip pat buvo pranešta apie HiLyte™ 488-pažymėto amiloido vidutinį fluorescencinį intensyvumą (MFA). Šis tyrimas buvo atliktas dviem egzemplioriais.Statistika. Visi rodomi duomenys yra trijų atskirų eksperimentų, kurių kiekvienas buvo atliktas trimis egzemplioriais, jei nenurodyta kitaip, rezultatas. Statistiniams tyrimams atlikti buvo naudojamos „GraphPad Prism 5“ ir „Microsoft Excel“.

Buvo atlikti dviejų uodegų suporuoti Studento t testai su BonferroniCorrection. Grubbso testas buvo naudojamas nukrypimams nustatyti. „GraphPad Prism 5“, skirta „Windows“, buvo naudojama duomenims braižyti (San Diegas, Kalifornija). Rodomi duomenys yra vidurkis + SEM.

Rezultatai ir diskusija

D-Tesa sintezė ir apibūdinimas

Kad būtų galima tikslingai, į ląstelę patekti į aktyvuotas smegenų mikroglijų ląsteles, Tesa buvo kovalentiškai konjuguota ant G4-PAMAM-OH paviršiaus su skaidomais esterio ryšiais tarp vaisto ir dendrimerinio jungiklio (1 pav.).

Pirmajame etape Tesa (1) buvo reaguojama su tetrametilenglikolio azidu (TEG-azidu) (2), kad gautų Tesa-TEG-azidą (3), kuris turi esterio ryšį tarp vaisto ir jungties (1A pav.).

Junginio (3) HPLC parodė, kad sulaikymo laikas yra 13,4 minutės, o grynumas didesnis nei 99 % (S1B† pav.). (3) masės spektras parodė smailę 610,13 [M + 1]+, atitinkančią Tesa-TEG-azido molekulinę masę, dar labiau patvirtinantį produkto susidarymą (S2† pav.). Atskirai G4-PAMAM-OH dendrimeras (4) buvo reaguojamas su 5-heksino rūgštimi, naudojant esterinimo reakciją, kad susidarytų D-YNE (5) (1B pav.).

Galiausiai Tesa-TEG-azidas (3) ir D-YNE (5) buvo sureagavę labai efektyvios vario-katalizido-alkino cikloaddicijos (CuAAC) paspaudimo reakcijos būdu, kad susidarytų D-Tesa (6) (1B pav.).48 1H BMR. patvirtino sėkmingą visų tarpinių produktų ir galutinio produkto sintezę; D-Tesa (6) turi būdingas dendrimerio ir vaistų jungiklio protonų smailes, rodančias sėkmingą D-Tesa sintezę (2A pav.).

Galutinio D-Tesa konjugato BMR atskleidė, kad prie kiekvieno dendrimero buvo prijungta vidutiniškai dešimt Tesa molekulių. HPLC patvirtino sėkmingą kovalentinę konjugaciją, nes D-Tesa pasislinko ir nuo D-YNE, ir nuo TesaTEG-azido (2B pav. ir S1†).

Tesa tirpumas vandenyje yra prastas, apskaičiuotas kaip 0,0035 mg ml–1,49 Tesa onhidroksilo dendrimerio konjugacija pagerino jo tirpumą vandenyje keliais dydžiais, palyginti su šiuo įvertinimu. D-Tesa buvo tirpumo vandenyje esant 22 mg ml-1, o kadangi Tesa sudaro ~19% D-Tesa masės, 4,2 mg ml-1 Tesa ekvivalentas buvo ištirpintas (3A pav.).

Padidėjęs dendrimero tirpumas palengvina formulavimą ir pašalina potencialiai toksiškų pagalbinių medžiagų poreikį.50 Visi šie privalumai yra be didesnio dendrimerio gebėjimo tiekti laisvus vaistus per BBB į mikroglijas in vivo ir galbūt sumažinti terapiniam poveikiui pasiekti reikalinga dozė.18–28 Galiausiai D-Tesa vidutinis dydis buvo 7,75 ± 0,29 nm (S3† pav.), o zeta potencialas 2.86 ± 0,38 mV (atitinkamai N=5 ir N=3 matavimas).

Vaistų išleidimas

Sukūrėme D-Tesa, kad išlaisvintų Tesa į ląstelę, esant žemo pH ir didelės esterazės koncentracijos aplinkos inendosomoms / lizosomoms aktyvuotos mikroglijos. Anksčiau pranešėme, kad PAMAM dendrimerai daugiausia patenka į ląsteles per skysčio fazės endocitozę, o pūslelės, kuriose yra konjugatų, virsta lizosomomis.

Mes inkubavome D-Tesa 37 laipsnių temperatūroje natrio citratiniame buferyje (pH 5,5) esant esterazėms, kad imituotų lizosomų sąlygas, kaip buvo atlikta anksčiau.52–54 Taip pat ištyrėme išsiskyrimą tokiomis sąlygomis, kurios imituoja plazmos sąlygas (fosfatiniu buferiniu tirpalu [PBS) ] buferis, pH 7,4).

Plazmos sąlygomis tik apie 1,5 % Tesa išsiskiria po 48 valandų, o mažiau nei 20 % Tesa išsiskiria iki 25 dienos, o tai rodo konjugato stabilumą plazmoje (3B pav.).

Lizosominėmis sąlygomis per pirmąsias 48 valandas iš D-Tesa išsiskiria apie 60 % Tesa, o per 19 dienų – beveik 100 % Tesa. Šie rezultatai rodo, kad D-Tesa užtikrina ilgalaikį, suaktyvintą laisvo vaisto išsiskyrimą pirmąsias dvi savaites, inkubuojamas fiziologiškai svarbiomis lizosominėmis sąlygomis.

Be to, minimalus Tesa išsiskyrimas imituojamomis plazmos sąlygomis (pH 7,4 grupėje) per pirmąsias 48 valandas yra reikšmingas, nes tai yra tipiškas G4-PAMAM-OH cirkuliacijos laikas prieš inkstų klirensą, tikėtina, kad sominimalus Tesa išsiskirs iš konjugatai dar nepasiekdami mikroglijos.24

D-Tesa sumažino M1 žymenų ekspresiją ir padidino M2 žymenis

Norėdami įvertinti D-Tesa gebėjimą sukelti M1 į M2 fenotipo poslinkį, įvertinome D-Tesa gebėjimą pakeisti M1 ir M2 žymenų ekspresiją in vitro naudojant pelių mikroglijų ląstelių liniją (BV2).

BV2 ląstelės buvo sukurtos įamžinus pelių mikroglijos ląsteles ir buvo įrodyta, kad jos yra tinkama alternatyva pirminėms mikroglijos ląstelėms tirti mikroglijos uždegiminį atsaką.55,56 Atlikdami eksperimentus, siekdami imituoti neurouždegiminę aplinką, esančią sergant daugeliu neurologinių ligų, iš anksto apdorojome mikrogliją 100 ng ml−1 (300 endotoksino vienetų (EU) ml) LPS 3 valandas.

Tada ląsteles kartu apdorojome LPS ir laisvu Tesa arba D-Tesa 48 valandas, tada paėmėme mėginius. Mes apdorojome ląsteles 1,5, 15 ir 150 µM laisvo Tesa arba D-Tesa koncentracijomis, lygiaverčiu vaistu.

MTT tyrimas parodė, kad laisva Tesaor D-Tesa tokiomis koncentracijomis nesukelia citotoksiškumo (S4† pav.). Pradinis dozės nustatymo tyrimas buvo atliktas su Tesa ir D-Tesa, siekiant nustatyti efektyviausią Tesa ir D-Tesa dozę.

Apdorojimas 1,5 ir 15 µM laisvaisiais Tesa ir D-Tesadid nekeičia azoto oksido arba TNF- sekrecijos, kaip nustatyta atitinkamai Grieso reagentu ir TNF-ELISA (S5† pav.). Remdamiesi šiais rezultatais, mes neanalizavome šių žemesnių koncentracijų mūsų qRT-PGR tyrimuose.

Sergant daugeliu neurodegeneracinių ligų, viena iš pagrindinių priešuždegiminių M1 mikroglijų neurotoksinių funkcijų yra jų išskyrimas reaktyviųjų deguonies rūšių (pvz., azoto oksido), kurios tiesiogiai naikina neuronus.57,58 Vėliau buvo teigiama, kad viena galima terapinė strategija būtų sumažinti šių molekulių sekreciją.

Įvertinome D-Tesa gebėjimą pasiekti šį efektą. Po LPS stimuliacijos D-Tesa sumažino išskiriamo azoto oksido ir indukuojamos azoto oksido sintazės (iNOS) mRNR lygį 3.7- kartus (p < 0,0001) ir 2- kartus (p {{). 7}}.011), palyginti su ląstelėmis, apdorotomis tik LPS (tik LPS) (4A ir B pav.).

Kita vertus, laisva Tesa vidutiniškai sumažino išskiriamą azoto oksido kiekį (14- karto, p=0,004) ir nesukėlė reikšmingo iNOS mRNR ekspresijos sumažėjimo (4A ir B pav. ).

D-Tesa buvo daug veiksmingesnis nei laisvasis Tesainas, slopinantis azoto oksido sekreciją. Be to, priklausomai nuo to, ar mikroglia yra M1 arba M2 fenotipo, mikroglija padidina arba iNOS, arba Arginase 1 (Arg1) reguliavimą, kad metabolizuotų L-argininą ir gamintų azoto oksidą atitinkamai M1 patogenų naikinimui, orornitiną ir karbamidą atitinkamai M2 žaizdų gijimo reakcijai. 59

Atsižvelgiant į sumažintą iNOS reguliavimą, D-Tesa padidino Arg1 mRNR lygį 2- kartus (p=0,011), palyginti su tik LPS kontroline medžiaga, o laisvoji Tesa ekspresija reikšmingai nepadidėjo (p=0 .40) (4C pav.).

D-Tesa ir, kiek mažesniu mastu, laisva Tesa pakeitė mikroglijas nuo citotoksinio azoto oksido išskyrimo į L-arginino metabolizmą žaizdoms gydyti, o tai turi įtakos mažinant ir galbūt panaikinant neurotoksiškumą, kurį sukelia mikroglijos neurodegeneracijos metu.5–7,10

iNOS ir išskiriamo azoto oksido kiekio sumažėjimas gydant D-Tesa buvo atliktas ankstesniais darbais, kurie parodė, kad natūralus PPAR ligandas (15-deoksi-Δ12,14-prostaglandinas J2) sumažino iNOS ir azoto oksido ekspresiją ir sekreciją gydant LPS. pirminės mikroglijos.60

IL-10, IL-4 ir TGF- 1 yra visi citokinai, kuriuos išskiria alternatyviai aktyvuota M2 mikroglija, galinti sukelti neuroprotekcinę, priešuždegiminę smegenyse aplinką.58, 61, 62. šiuo tikslu D-Tesa padidino IL-105.5-karto (p=0.011) ir IL-4 8.2-karto (p { {15}}.013), palyginti su tik LPS valdikliu (4D ir E pav.).

Nemokama Tesa reikšmingai nepadidino nei IL-10, nei IL-4 lygių, nors vidurkiai buvo 1.7-karto (p=0.066) ir 2.{7} }karto (p=0.11) didesnis, atitinkamai, Tesa gydytų mikroglijų atveju, palyginti su tik LPS kontrolinėmis medžiagomis (4D ir E pav.). Be to, D-Tesa padidino TGF- 1 2.3- kartus (p=0.015) ir laisva Tesa išraiška reikšmingai nepakeitė išraiškos (4F pav.).

Taigi, D-Tesa sukelia priešuždegiminių citokinų sekreciją po mikroglijų gydymo LPS, o tai gali sušvelninti neurotoksinę, priešuždegiminę aplinką sergant neurodegeneracinėmis ligomis.5–7,10

D-Tesa sukelta M2-potipių žymenų išraiška

CD206, Ccl1 ir TLR8 yra specifiniai M2a, M2b ir M2c mikroglijos potipių žymenys atitinkamai.58 D-Tesa padidino CD206 raišką 4.{{10 }}karto (p < 0,001), Ccl1 3.5-karto (p < 0,005) ir TLR8 5-karto (p < 0,01), o laisva Tesa reikšmingai nepadidino bet kuris iš šių trijų žymenų (5A–C pav.).

Šie duomenys rodo, kad D-Tesa apdorotos mikroglijos rodo reikšmingą visų trijų M2 potipių žymenų reguliavimą, o tai sutinka su supratimu, kad mikroglijos fenotipas yra plastikinis, o ne dvejetainis.63–65

M1/M2 nomenklatūra pernelyg supaprastina tai, kad mikroglijos gali egzistuoti aktyvavimo būsenų spektre; išilgai šio kontinuumo buvo apibūdinti trys skirtingi M2 fenotipai (M2a, M2b ir M2c), o D-Tesa sukelia žymenų ekspresiją, atitinkančią kiekvieną iš šių būsenų. 58, 61, 63, 66, 67 M2a mikroglijos yra susijusios su padidėjusia patogeninių mikroorganizmų fagocitoze. baltymai, reguliuodami pašalinančius receptorius, audinių atstatymą ir priešuždegiminį poveikį.

M2b mikroglijos yra kaip M1 mikroglijos, nes jos išreiškia IL-1, TNF- ir IL-6; tačiau M2b skiriasi nuo M1 mikroglijos tuo, kad jie išreiškia IL-10 aukštu lygiu ir sumažina iNOS ekspresiją. M2b makrofagai ir mikroglijos stimuliuoja Th2 T ląsteles, o tai rodo vieną iš M2b vaidmenų, sukeliančių priešuždegiminį atsaką.

M2cmicroglia dalyvauja žaizdų gijime, audinių remodeliavime, geležies sekvestracijoje ir STAT3 aktyvavime, o tai sumažina priešuždegiminį signalizavimą.58, 61, 63, 66 Tesa PPAR aktyvumas stimuliuoja grįžtamąją kilpą, dėl kurios padidėja PPAR ir jo signalinio baltymo (STAT6) ekspresija. kurie abu yra M2a žymenys.58D-Tesa padidino PPAR 2.3-kartą (p=0.0036)ir STAT6 3.4- karto (p < 0,001), o laisvoji Tesa padidino STAT6 1.8-karto (p=0,011) be reikšmingo PPAR išraiškos padidėjimo (1.58-karto padidėjimas, p=0.17) (5D ir E pav.).

Padidėjusi STAT6 ir PPAR ekspresija sukelia priešuždegiminių genų gamybą ir priešuždegiminių signalų slopinimą, slopindama NF-κB aktyvumą. Kadangi M2a mikrogliją galima sukelti apdorojant mikrogliją IL-4, kuri signalizuoja per STAT6 ir PPAR, šių dviejų pasroviui signalizuojančių baltymų reguliavimas gali sukelti M2a poliarizaciją.

Mūsų tyrimuose LPS aktyvinimas padidino IL-6, TNF- ir IL-1 lygį, o gydymas D-Tesa dar labiau padidino šių citokinų ekspresijos reguliavimą (S6A–D† pav.), o tai tikėtina, kad dėl D-Tesa, sukeliančio M2b fenotipą (5B pav.).

„Free Tesa“ padidino IL-6 raišką ir reikšmingai nepakeitė TNF- ir IL-1 raiškos (S6A–D† pav.). Nors šiuos citokinus išskiria M1 mikroglijos, M2b mikroglijos taip pat išreiškia šiuos citokinus. 58,61 CD86 yra M1 ir M2b mikroglijos žymuo ir padidėja gydant D-Tesa (S6E† pav.).

Be to, citokinų signalizacijos slopintuvas (SOCS) yra tarpląstelinių baltymų šeima, reguliuojanti fenotipinę mikroglijų poliarizaciją, slopindama daugybę citokinų aktyvuojamų signalizacijos takų.69 SOCS1 yra vienas šios šeimos narys, ir įrodyta, kad jis slopina LPS/TLR4. tarpininkauja NF-κB ir JAK2 signalizacijai, taip sumažindamas TNF-, IL-1 ir IL-6 kiekį, kurį išskiria M1 mikroglia per LPS/TLR4 kelią.

D-Tesa padidina SOCS1 ekspresiją, palyginti su tik LPS kontroline medžiaga (S6F† pav.), o tai rodo, kad D-Tesa rodomas IL-6, TNF- ir IL-1 padidėjimas gali atsirasti dėl M2b fenotipas, o ne sustiprintas LPS/TLR4, M{10}}indukuojantis fenotipas.

Be to, LPS signalizuoja per TLR4 ir, kad būtų išvengta pernelyg didelio ląstelių aktyvavimo, mikroglia turi neigiamą grįžtamojo ryšio mechanizmą, pagal kurį TLR4 aktyvinimas sumažina TLR4.70 ekspresiją.

Gydymas laisvu Tesa ir D-Tesa padidino TLR4 lygius atitinkamai 3.6- kartus (p < 0.001) ir 3.{7}} kartus (p < 0,001) (5F pav.), o tai rodo, kad Tesa ir D-Tesa pakeitė tipišką LPS/TRL4 neigiamo grįžtamojo ryšio signalizacijos kelią.

For more information:1950477648nn@gmail.com