Dendrimer-tesaglitazar konjugatas sukelia mikroglijos fenotipo pokytį ir sustiprina amiloidinę fagocitozę† 1 dalis

Mikroglijos pakeitimas iš ligą paūminančios, „priešuždegiminės“ būsenos į neuroprotekcinį, „priešuždegiminį“ fenotipą yra perspektyvi strategija sprendžiant daugybę neurodegeneracinių ligų.

Mikroglijos yra centrinės nervų sistemos ląstelių tipas, kuris pirmiausia yra atsakingas už neuronų sveikatos ir funkcijos palaikymą. Jie gali išskirti įvairius augimo faktorius ir neurotrofinius veiksnius ir gali palaikyti normalią neuronų metabolinę veiklą, išvalydami aplink neuronus esančias atliekas. Pastaraisiais metais atlikti tyrimai parodė, kad mikroglijos yra glaudžiai susijusios su atmintimi. Pažvelkime į tai kartu.

Pirma, mikroglia gali stimuliuoti neuronus ir skatinti neuronų aktyvavimą, taip pagerindama atmintį. Išskirdama daugybę neurotransmiterių, tokių kaip glutamatas ir alaninas, mikroglija gali skatinti signalo perdavimą tarp neuronų ir gali sustiprinti glialinio neurono signalo rezonansą tarp presinapsinių membranų, toliau skatindama neuronų jaudrumą ir atminties formavimąsi.

Antra, mikroglija taip pat gali išvalyti atliekas aplink neuronus, palaikyti normalią neuronų metabolinę veiklą ir sumažinti neuronų mirtingumą, taip skatindama atminties gerinimą. Kai aplink neuronus susikaupia per daug šiukšlių, tai paveiks normalią neuronų metabolinę veiklą, sukeldama neuronų mirtį ir susilpnėjusią funkciją, taip sumažindama atminties efektyvumą. Microglia gali palaikyti normalią neuronų medžiagų apykaitos aplinką ir sumažinti neuronų mirtingumą, suardydama ir skaidydama aplinkines atliekas, taip pagerindama atmintį.

Apibendrinant galima pasakyti, kad mikroglijos yra glaudžiai susijusios su atmintimi. Skatindama neuronų sužadinimą ir pašalindama aplinkines atliekas, mikroglijos gali dar labiau pagerinti atmintį ir išlaikyti mūsų smegenis sveikas ir aktyvias. Turėtume atkreipti dėmesį į mikroglijos sveikatos apsaugą, kad pagerintume atmintį. Matyti, kad turime pagerinti atmintį, o Cistanche gali žymiai pagerinti atmintį, nes Cistanche yra tradicinė kinų vaistinė medžiaga, turinti daug unikalių poveikių, iš kurių vienas yra pagerinti atmintį. Cistanche veiksmingumą lemia įvairios jame esančios veikliosios medžiagos, įskaitant tanino rūgštį, polisacharidus, flavonoidinius glikozidus ir kt. Šie ingredientai gali įvairiais būdais skatinti smegenų sveikatą.

Spustelėkite žinoti 10 būdų, kaip pagerinti atmintį

Priešuždegiminės mikroglijos prisideda prie ligos progresavimo, išskirdamos neurotoksines medžiagas ir pagreitindamos patogeninių baltymų kaupimąsi. Įrodyta, kad PPAR ir PPAR agonistai perkelia mikrogliją iš priešuždegiminio („M1-panašaus“) į alternatyviai aktyvuotą („M2-panašų“) fenotipą. Tokios strategijos buvo ištirtos atliekant klinikinius neurologinių ligų, tokių kaip Alzheimerio ir Parkinsono liga, tyrimus, tačiau greičiausiai jos nepavyko dėl prasto kraujo ir smegenų barjero (BBB) ​​prasiskverbimo.

Nustatyta, kad hidroksilo galą turintys poliamidoamino dendrimerai (be jokių taikinių ligandų prijungimo) kerta pažeistą BBB neurouždegimo vietoje ir kaupiasi aktyvuotose mikroglijose.

Todėl PPAR / dvigubo agonisto dendrimerio konjugacija gali leisti tikslingai pakeisti aktyvuotos mikroglijos fenotipą. Čia pristatome naujo dendrimer-PPAR / dvigubo agonisto konjugato (D-tesaglitazaro) sintezę ir apibūdinimą.

In vitro D-tesaglitazaras sukelia „M1 į M2“ fenotipo pokytį, sumažina reaktyviųjų deguonies rūšių sekreciją, padidina fagocitozės genų ekspresiją ir patogeninių baltymų (pvz., amiloido, -sinukleino) fermentinį skaidymą ir padidina amiloido fagocitozę.

Šie rezultatai patvirtina tolesnį D-tesaglitazaro vystymąsi, kad jis būtų nukreiptas į daugybę neurodegeneracinių ligų, ypač Alzheimerio ir Parkinsono ligų.

Įvadas

Vien Jungtinėse Amerikos Valstijose šiuo metu daugiau nei 5,3 milijono žmonių serga Alzheimerio liga (AD) ir 1 milijonas žmonių, sergančių Parkinsono liga (PD).1 Kadangi padidėjęs amžius yra didžiausias daugelio neurodegeneracinių ligų rizikos veiksnys, šių ligų paplitimas ir gydymo kaina. ir toliau didės, nes gyventojų skaičius ir toliau sensta.

Be to, tai, kad pastaruoju metu nepavyko sukurti naujų vaistų šioms ligoms gydyti, išryškėjo būtinybė kurti naujoviškus gydymo būdus.2,3 Šios klinikinės nesėkmės išryškina sunkumus kuriant vaistą, įskaitant pakankamai didelės vaisto koncentracijos tiekimą į smegenis, kad jos būtų veiksmingos be jo. sukeliantis neigiamą šalutinį poveikį.

Neurodegeneracinės ligos, tokios kaip AD ir PD, turi tris pagrindinius neuropatologinius komponentus: neurouždegimą, patogeninių baltymų kaupimąsi ir neuronų mirtį.4–7 Nesveiki žmonės, įgimta smegenų imuninė ląstelė (temikroglija) nuolat fagocituoja netinkamai susilanksčiusius baltymus (pvz., -amiloidą, -sinukleiną). ), kurios sukelia neuronų mirtį jiems gaminant, o tai neleidžia susidaryti skiriamiesiems agregatams.

Tačiau žmonėms, kuriems galiausiai išsivysto neurodegeneracinės ligos, mikroglijos šių baltymų nebepašalina efektyviai ir pereina į ligą paūminantį, priešuždegiminį fenotipą (paprastai žymimą M1).

Nors vyraujanti priešuždegiminė / priešuždegiminė (M1/M2) mikroglijos aktyvacijos klasifikacija yra pernelyg supaprastintas makrofagų poliarizacijos spektras, ji vis dar naudojama kaip plati nomenklatūra, apibūdinanti dominuojantį mikroglijos fenotipą neurouždegimo ir atsako į gydymą.

M1-kaip mikroglijos išskiria reaktyviąsias deguonies rūšis ir kitus uždegiminius mediatorius, kurie ir sukelia neuronaldeatą, ir pablogina ligos patologiją, padidindami patogeninių baltymų (pvz., amiloido, -sinukleino) gamybą.

Be to, pagrindiniai genetiniai rizikos veiksniai, sukeliantys AD (TREM2 ir APOE) išsivystymą, yra išreiškiami dideliu kiekiu mikroglijų, ir įrodyta, kad TREM2 / APOE kelias sukelia amikroglijos fenotipo pokytį sergant AD, amiotrofinę šoninę sklerozę (ALS) ir išsėtinę sklerozę. gyvūnų modeliai.8

Šie atradimai dar labiau parodo mikroglijos vaidmenį daugelio žmogaus neurodegeneracinių ligų patologijoje. Mikroglijos fenotipo manipuliavimo metodas leistų tyrėjams suprasti jų vaidmenį neurodegeneracinėse ligose, be to, gali būti veiksmingas gydymas.

Mikroglijos pakeitimas iš M1 į priešuždegiminį ir neuroprotekcinį (M2) fenotipą buvo pasiūlytas kaip terapinė strategija, skirta gydyti daugybę neurodegeneracinių ligų.5,6 Įrodyta, kad du šiuo metu FDA patvirtinti PPAR agonistai, II tipo diabeto vaistai roziglitazonas ir pioglitazonas, sukelia M1 į M2 fenotipo pokytis makrofaguose ir mikrogliuose in vitro ir in vivo.

Įrodyta, kad 9,10 PPAR agonistai sumažina LPS sukeltą reaktyviųjų deguonies rūšių sekreciją, sumažindami NF-κB aktyvumą, skatindami NF-κB skaidymą ir eksportą iš branduolio, taip pat nuo ligandų priklausomą transrepresiją.

Be to, epidemiologiniai tyrimai parodė, kad diabetu sergantiems pacientams, vartojantiems rosiglitazoną arba pioglitazoną, yra mažesnė rizika susirgti AD ir PD.12 Vėliau roziglitazonas ir pioglitazonas buvo tiriami III fazės klinikiniais AD tyrimais, bet nepavyko.13

Vienas iš galimų pirmiau minėtų klinikinių tyrimų nesėkmės paaiškinimų yra prastas šių vaistų pernešimas per kraujo ir smegenų barjerą (BBB), todėl ribojamas į šiuos klinikinius tyrimus įtrauktų pacientų smegenis pasiekiančių vaistų skaičius.

Iš tiesų, apskaičiuota, kad BBB neleidžia maždaug 98 % visų mažų molekulių vaistų pasiekti smegenis, o tik dalis vaisto, patenkančio į smegenis, pasiekia mikrogliją.15

Be to, PPAR yra dar vienas PPAR šeimos branduolinis receptorius.16 Jis vaidina lipidų homeostazę ir reguliuoja uždegimą, taip pat buvo įrodyta, kad PPAR agonistai turi priešuždegiminį poveikį mikroglijoms.

Klinikiniai tyrimai, naudojant neurovaizdavimą, pomirtinę audinių analizę ir CSF biomarkerius, parodė, kad BBB yra sutrikusi sergant AD ir PD, taip pat kitomis neurodegeneracinėmis ligomis.

17 Įrodyta, kad -4 kartos hidroksilo galą turintys poliamidoamino (G4-PAMAM-OH) dendrimerai iš esmės apeina sutrikusią BBB ir kaupiasi aktyvuotose mikrogliose, nereikalaujant tikslinių ligandų, po sisteminio vartojimo keliuose skirtinguose neurouždegiminių ligų modeliuose. , įskaitant graužikus, triušius, šunis ir nežmoginius primatus.18–28 Svarbu, kad G4-PAMAM-OH gali būti skiriamas sistemiškai ir prasiskverbti per BBB sergant ligos modeliais, kuriems yra nedidelis BBB sutrikimas, pvz., Retto sindromas.29

Be to, G4-PAMAM-OH patekimo į smegenis mastas yra tiesiogiai proporcingas ligos sunkumui pagal triušio modelį, sergantį cerebriniu paralyžiumi.30 Hidroksilo galą turintys dendrimerai turi pranašumą, nes jie pristatomi neinvaziniu būdu, palyginti su labai invaziniu vietiniu pernešimu per smegenis. kaukolė, reikalinga atliekant ankstesnius tyrimus su kitomis nanodalelėmis, tokiomis kaip poli-εkaprolaktonas ir PEG, neigiamo krūvio PAMAM dendrimeriai, kvantiniai taškai ir nanoformulės, sudarytos iš polietilenimino (PEI) ir dekstrano sulfato.31–35

Be to, šie hidroksilo PAMAM dendrimerai yra idealiai išdėstyti vertimui dėl savo mastelio ir gerai toleruojamo in vivo saugumo profilio.36–38 Dėl teigiamų ikiklinikinių veiksmingumo duomenų a (G4-PAMAM-OH)-N- acetilcisteino konjugatas šiuo metu vertinamas ankstyvųjų klinikinių tyrimų metu dėl vaikystės smegenų adrenoleukodistrofijos (NCT03500627) ir sunkios koronavirusinės ligos 2019 m. (COVID{11}}) sukelto uždegimo (NCT04458298).

Ištyrėme tesaglitazaro (Tesa) dendrimerio ir vaisto konjugatą, prijungtą prie -4 kartos hidroksilo pabaigos PAMAMdendrimero. Tesaglitazaras yra stiprus PPAR / dvigubas agonistas, kuris sujungia teigiamą PPAR ir PPAR agonistų poveikį. Jame yra karboksirūgšties funkcinė grupė kovalentinei konjugacijai su dendrimeriu ir vėlesniam išsiskyrimui.

Papildomos gitaros buvo sukurtos ir išbandytos kliniškai, tačiau Tesa buvo pasirinkta dėl didesnio PPAR ir PPAR aktyvumo santykio, palyginti paprastos cheminės struktūros ir saugumo profilio.39–43

Tesa anksčiau buvo pasiekusi III fazės klinikinius 2 tipo diabeto tyrimus Jungtinėse Amerikos Valstijose, bet nepavyko dėl nuo dozės priklausomo toksiškumo, kurio galima išvengti sumažinus reikiamą dozę, naudojant kontroliuojamą dendrimerį.39,40,44Kadangi Tesa yra PPAR / dvigubas agonistas, jo tikslingas tiekimas į aktyvuotas mikroglijas neurouždegimo vietoje gali būti labai naudingas.

Čia demonstruojame dendrimerio – tesaglitazaro konjugato (D-Tesa) sintezę ir apibūdinimą bei parodome šio junginio gebėjimą sukelti „M1–M2“ fenotipo poslinkį mikroglijoje ir sustiprinti fluorescenciniu būdu pažymėto amiloido fagocitozę.

Medžiagos ir metodai

Medžiagos

1-[3-(dimetilamino)propil]-3-etilkarbodiimido metiodidas (EDC), 4(dimetilamino)piridinas (DMAP), CuSO4·5H2O, natrio askorbatas, heksino rūgštis ir galvijų serumo albuminas (BSA) buvo nupirkti iš Sigma Aldrich US ir panaudoti gavus (St Louis, MO).

Tesaglitazaras buvo gautas iš AstaTech Inc. (Bristolis, PA). Etilendiamino šerdies PAMAM dendrimeras (4 kartos su 64 hidroksilo galinėmis grupėmis) buvo gautas iš Dendritech Inc. (Midland, MI) kaip tirpalas metanolyje.

Dendrimeris buvo laikomas metanolyje 4 laipsnių temperatūroje, o prieš naudojimą metanolis išgarinamas. Dializės membrana, kurios molekulinės masės ribinė vertė (MWCO) yra 1 kDa, buvo nupirkta iš Spectrum Laboratories Inc. (New Brunswick, NJ).

Visi kiti tirpikliai buvo naudojami bevandenėje formoje. Visos reakcijos, išskyrus vario (I), katalizuojamo alkino ir azido cikloaddicijos (CuAAC) paspaudimo reakcijas, buvo vykdomos bevandenėmis sąlygomis organinėje terpėje su orkaitėje džiovintais stikliniais indais inertiniame azoto atmosferoje. atmosfera.

Ląstelių kultūrai: Dulbecco modifikuota erelio terpė (DMEM), vaisiaus galvijų serumas (FBS), penicilinas-streptomicinas (P/S), 0,05 % tripsino-EDTA ir MTT reagentas buvo gauti iš Invitrogen (Carlsbad, CA). , JAV).

Grieso reagentas buvo gautas iš Promega (Madison, WI), o TNF-ELISA buvo gautas iš R&D Systems (Mineapolis, MN). Analitinės kokybės metanolis buvo įsigytas iš Sigma-Aldrich. Tripano mėlyna buvo gauta iš Corning (Manassas, VA, JAV).

D-Tesa konjugatų sintezės procedūros
Tetraetilenglikolio monoazidas (2) buvo susintetintas naudojant anksčiau paskelbtą protokolą.45

Tesa-TEG-azido sintezė ir gryninimas (3).
Tesa (950 mg, 2,32 mmol) buvo ištirpinta 10 ml dimetilformamido (DMF). Į šį maišomą tirpalą buvo lašinamas tetrametilenglikolio monoazido (2 662,1 mg, 3,02 mmol) DMF (1 ml). Tada į reakcijos mišinį buvo pridėta DMAP (255,4 mg, 2,09 mmol) ir EDC (577,5 mg, 3,02 mmol) ir 24 valandas maišoma, praleidžiant azotą kambario temperatūroje.

Reakcija buvo stebima naudojant plonasluoksnę chromatografiją ir didelio efektyvumo skysčių chromatografiją (HPLC). Reakcijos mišinys buvo praskiestas 100 ml dichlormetano (DCM), o neapdorotas reakcijos mišinys buvo perkeltas į dalijamąjį piltuvą, o organinis sluoksnis tris kartus plaunamas prisotintu natrio bikarbonato tirpalu, po to sočiu amonio chlorido tirpalu ir galiausiai sūrymu.

Tada organinis sluoksnis džiovinamas bevandeniu natrio sulfatu. Tirpiklis organiniame sluoksnyje buvo pašalintas naudojant sukamąjį garintuvą, o tirpalas vėl ištirpinamas 3 ml DCM ir absorbuojamas į silikagelį, kad būtų išgrynintas CombiFlash® chromatografijos sistema, naudojant gradiento metodą su etilo acetatu/heksanu kaip tirpikliais, kad būtų gautas skaidrus 3. - geltonas aliejus.

Norimas, grynas produktas eliuuojamas esant maždaug 30–40 % etilo acetato. (Išeiga: 70 %) 1H BMR (500 MHz, CDCl3) 8 7,27 (d, J=8,6 Hz, 2H), 7,15 (d, J=1,9 Hz, 2H), 7,08 (d, J=8,6 Hz, 2H), 6,73 (d, J=8,6 Hz, 2H), 4,25–4,14 (m, 2H), 4,07 (t, J {{ 33}},8 Hz, 2H), 3,94 (dd, J =7,8, 5,2 Hz, 1H), 3,67–3,47 (m, 14H), 3,30 (dd, J=8,7) , 3,8 Hz, 2H), 3,06 (s, 3H), 3,02 (t, J=6,7 Hz, 2H), 2,91–2,84 (m, 2H), 1,08 (t, J=7 0,0 Hz, 3H). ESI-MS: teorinis C28H39N3O10S: 609,24, gautas (M + 1): 610,13.

D-YNE sintezė ir gryninimas (5).

(480 mg, 4,22 mmol) buvo pridėta į maišomą G4-PAMAM-OH (2,5 g, 0,176 mmol) tirpalą 20 ml bevandenio DMF. Į šį mišinį buvo pridėta DMAP (430 mg, 3,52 mmol) ir EDC (1 g, 5,28 mmol).

Reakcijos mišinys 24 valandas maišomas azotu kambario temperatūroje. Pasibaigus reakcijai, reakcijos mišinys buvo perkeltas į 1000 MWCO dializės vamzdelį. DMF dializė buvo atliekama 24 valandas, o DMF buvo keičiamas maždaug kas šešias valandas.

Tada 24 valandas buvo atliekama dializė dejonizuotu (DI) vandeniu, vanduo buvo keičiamas maždaug kas šešias valandas. Galiausiai gautas dializės mėgintuvėlio turinys buvo liofilizuojamas 48 valandas ir gaunami balti purūs milteliai. (Išeiga: 61 %) 1H BMR (500 MHz, DMSO) δ 8,10–7,67 (m, dendrimerinis vidinis amidas H), 4,72 (s, dendrimero paviršius OH), 4,01 (t, esteris –CH2), 3,32 (m, dendrimeris –CH2), 3,06 (m, dendrimeras ir jungtis –CH2), 2,85–2,58 (m, dendrimeris –CH2), 2,56–1,89 (m, dendrimeris ir linkeris –CH2), 1,78–1,61 (m, linkeris –CH2).D-Tesa sintezė ir gryninimas (6).

Tesa-TEG-azido (3 177,8 mg, 0,3{{10}}3 mmol) buvo pridėta į maišomą D-YNE(5, 35{{2{{27}) mišinį. }}} mg, 0,023 mmol) 5 ml tetrahidrofurano (THF) ir vandens santykiu 1:1 mišinio su 0,5 ml DMF mikrobangų reaktoriui atspariame 20 ml buteliuke. CuAAC paspaudimo reakcijai į reakcijos mišinį buvo pridėta vario sulfato pentahidrato (11,6 mg, 0,0467 mmol) ir (+)-natrio-laskorbato (9,3 mg, 0,0467 mmol).

Buteliukas buvo sandariai uždarytas, o reakcijos indas buvo patalpintas į Biotage® Initiator mikrobangų reaktorių ir 8 valandas 50 laipsnių temperatūroje reaguojama 20 W mikrobangų spinduliuote. Reakcijos mišinys buvo perkeltas į 1000 MWCO dializės vamzdelį, o DMF dializė buvo atliekama 24 valandas, o DMF buvo pakeistas šviežiu tirpikliu maždaug kas 4 valandas.

Tada dializės mėgintuvėlio turinys buvo perkeltas į afalcon mėgintuvėlį ir įpiltas lygiavertis DI vandens kiekis. Be to, į falcon mėgintuvėlio turinį įpilta 200 µl etilendiaminotetraacto rūgšties dinatrio druskos tirpalo.

Tada šis mišinys buvo patalpintas į naują 1000 MWCO dializę ir 12 valandų buvo dializuojama 1000 ml DI vandens, pridėjus EDTA tirpalo, po to 12 valandų vandens dializė.

Tada mišinys buvo liofilizuojamas 48 valandas ir gavosi balti purūs milteliai. (Išeiga: 64 %) 1H BMR (500 MHz, DMSO) 8 8,2–7,6 (m, dendrimero vidinis amidas H), 7,36 (d, Tesa ArH), 7,21 (d, Tesa ArH), 7,03 (d, TesaArH), 6,76 (d, Tesa ArH), 4,37 (s, Tesa H), 4,18–4,04 (m, linkeris H), 3,96 (dd, Tesa ir jungtis H), 3,70 (m, Tesa ir jungtis H) ,3,58–3,14 (m, dendrimeris –CH2), 3,14–2.86 (m, dendrimeris – CH2), 2,87–2,49 (m, dendrimeris ir jungtis –CH2), 2,25 (m, dendrimeris –CH2) , 1,82–1,67 (m, linkeris –CH2), 0,97 (t, Tesa –CH3).

Charakteristikos metodai

Branduolinis magnetinis rezonansas (BMR). BMR spektrai buvo įrašyti Bruker 500 MHz spektrometru kambario temperatūroje. Protonų cheminiai poslinkiai (δ) pateikiami ppm.

1H BMR buvo naudojamas Tesa molekulių, prijungtų prie kiekvienos D-Tesa molekulės, skaičiui nustatyti protonų integracijos metodu, lyginant dendrimerio vidinių amido protonų smailes esant δ 7,6–8,2 ppm su aromatiniais Tesa protonais, kai δ ​​7,36–6,76 metilo protonų pps. Tesa alifatinėje srityje. Aukštos kokybės skysčių chromatografija (HPLC).

Buvo naudojamas HPLC (Waters Corporation, Milfordas, Masačusetsas), turintis 1525 dvejetainį siurblį, linijinį degazatorių AF, 717 plius automatinį mėginių ėmiklį, 2998 fotodiodų matricos detektorių ir 2475 kelių λ fluorescencijos detektorių, susietą su Waters Empower programine įranga.

Naudota Symmetry C18 atvirkštinės fazės kolonėlė (Tosoh, Japonija), kurios dalelių dydis yra 5 μm, ilgis 25 cm ir vidinis skersmuo 4,6 mm. Junginiai buvo stebimi esant 210 nm ir 254 nm, naudojant PDA detektorius.

Tirpiklis A plaunamas HPLC klasės vandeniu su 0,1 % trifluoracto rūgšties (TFA), o tirpiklis B buvo acetonitrilas (ACN) su 5 % vandens ir 0,1 % TFA. Naudotas metodas buvo pradėtas nuo 1{ {7}}0 : 0 (ACN: vanduo), sumažėjo iki 10:90 (vanduo: ACN) per 5 minutes, išliko tokio poliškumo 15 minučių ir grįžo iki 100 : 0 (ACN: vanduo) per 5 minučių.Srauto greitis buvo palaikomas 1 ml min−1.Masių spektroskopija.

ESI-MS buvo atliktas BrukermicroTOF-II masės spektrometru, naudojant acetonitrilo/vandens (9:1) tirpiklio sistemą. Empirinei formulei patvirtinti buvo naudojami molekuliniai jonai kaip protonuotos smailės [M + nH]n+ arba aduktai [M + nX] n+ (X=Na, K arba NH4).

Dinaminis šviesos sklaida ir ζ-potencialas. Dalelių dydžiui ir ζ-potencialų pasiskirstymui nustatyti buvo naudojamas Zetasizer NanoZS (Malvern Instrument Ltd, Worchester, JK), turintis 50 mW He-Ne lazerį (633 nm). D-Tesa buvo ištirpinta DI vandenyje iki 0,2 mg ml-1 koncentracijos DLS ir 10 mM natrio chloride iki 0,1 mg ml-1 koncentracijos ζ potencialui.

Matavimai buvo atlikti 25 laipsnių kampu, naudojant 173 laipsnių sklaidos kampą, kaip aprašyta anksčiau.27,46 Vaistų išsiskyrimo tyrimas. D-Tesa buvo ištirpinta 1 mg ml-1 koncentracijos fosfatiniame buferiniame tirpale (pH 7,4), imituojančiame plazmos sąlygas, arba natrio citrato tirpale (pH 5,5), kad būtų imituojamos lizosominės sąlygos.

Kiaulių kepenų esterazės (iš Sigma Aldrich) buvo pridėtos į natrio citrato tirpalą išleidimo tyrimo pradžioje ir buvo papildytos maždaug kas 3 dienas tyrimo metu.

Kiekviename buteliuke buvo 15 ml mėginio ir jie buvo nuolat kratomi 37 laipsnių kampu visą eksperimento laiką. Skirtingais laiko momentais buvo paimti dubliuoti 200 µl kiekvieno pH mėginiai, o esterazės aktyvumas vėliau buvo sustabdytas pridedant 200 µl metanolio. Nulinės valandos laiko taško mėginiai buvo kontrolė.

Mėginiai buvo laikomi –80 laipsnių temperatūroje, kad būtų išvengta bet kokios hidrolizės. Mėginiai buvo toliau analizuojami HPLC ir buvo apskaičiuotas plotas po kreive (esant 210 nm) laisvo vaisto smailei. Plotas po kreive buvo koreliuojamas su išsiskyrusio vaisto kiekiu, naudojant kalibravimo kreivę, kurioje žinomos laisvos Tesa koncentracijos buvo tiriamos HPLC esant 210 nm.

For more information:1950477648nn@gmail.com