Mineralinių ir organinių nanodalelių aptikimas ir apibūdinimas žmogaus inkstuose

Tsui-Yin Wong^1,2,*, Cheng-Yeu Wu^1,2,3,* ir kt

Negimdinis kalcifikacija yra susijusi su įvairiomis žmonių ligomis, įskaitant aterosklerozę, vėžį,lėtinisinkstasliga, irdiabetassusirgimas. Nors kalcifikuotose kraujagyslėse buvo aptikta mineralinių nanodalelių, šių dalelių prigimtis ir vaidmuo žmogaus organizme lieka neaiškus. Čia pirmą kartą parodome tą žmogųinkstasaudiniai, gauti iš galutinės stadijoslėtinisinkstasligaarba inkstų vėžiu sergančių pacientų organizme yra apvalių, daugiasluoksnių mineralinių dalelių, kurių ilgis yra 50–1500 nm, o sveikiems kontroliniams gyvūnams dalelių nepastebėta. Mineralinės dalelės daugiausia randamos tarpląstelinėje matricoje, supančioje vingiuotus kanalėlius, Henlės surinkimo kanalus ir kilpas, taip pat kanalėlius apibrėžiančių ląstelių citoplazmoje ir susideda iš polikristalinio kalcio fosfato, panašaus į mineralą, esantį kauluose ir negimdinėse kalcifikacijose. Theinkstasmineralinėse nanodalelėse yra keletas serumo baltymų, kurie slopina negimdinį kalcifikaciją kūno skysčiuose, įskaitant albuminą, fetuiną-A ir apolipoproteiną A1. Kadangi mineralų ir organinių nanodalelių randama ne tik kalcifikuotose nuosėdose, bet ir vietose, kuriose nėra mikroskopinių kalcifikacijų, mūsų stebėjimai rodo, kad nanodalelės gali būti kalcifikacijos ir inkstų akmenų pirmtakai žmonėms.

Kontaktas:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Negimdinis kalcifikacija yra susijusi su ateroskleroze, vėžiu,lėtinisinkstasliga, ir cukrinis diabetas1–3. Naujausi tyrimai rodo, kad aterosklerozė irlėtinisinkstasligapacientų, kuriems yra kraujagyslių kalcifikacijos požymių, padidėja sergamumo ir mirtingumo rizika, o tai rodo, kad negimdinis kalcifikacija kenkia žmonių sveikatai1,3. Nepageidaujamas kalcifikacija taip pat stebima senstantiems asmenims, o daugumai vyresnių nei 60 metų žmonių yra kraujagyslių kalcifikacijos požymių4. Dėl šių priežasčių svarbu iššifruoti veiksnius, sukeliančius negimdinį kalcifikaciją, ir sukurti veiksmingą gydymą.

Negimdinis kalcifikacija gali būti apibrėžiama kaip pusiausvyros sutrikimas tarp kalcifikacijos inhibitorių ir induktorių organizme. Kalcifikacijos inhibitoriai apima serumo baltymus, tokius kaip albuminas, fetuinas-A, osteopontinas ir matricos GLA baltymas, taip pat mažus junginius, tokius kaip pirofosfatas, o hiperfosfatemija ir uždegimas yra pagrindiniai kalcifikacijos induktoriai5–7. Naujausi tyrimai rodo, kad kalcifikacijos induktoriai aktyvina ląstelių procesą, panašų į kaulų formavimąsi kraujagyslių kalcifikacijos metu7,8. Matricos pūslelės, panašios į tas, kurios skatina mineralizaciją besivystančiame kauluose, taip pat buvo aptiktos kalcifikuotuose minkštuosiuose audiniuose7–9. Šias matricines pūsleles tikriausiai išskiria kraujagyslių lygiųjų raumenų ląstelės, kurios diferencijuojasi į osteoblastų tipo ląsteles, kurios sukelia kalcifikaciją7.

Mineralinės nanodalelės (NP) buvo aptiktos minkštuosiuose audiniuose, turinčiose negimdinio kalcifikacijos požymių. Price ir kt. nustatė, kad žiurkių, gydytų bisfosfonato etidronatu arba vitaminu D, serume yra mineralų ir baltymų kompleksų, kuriuose yra kalcifikacijos inhibitorių fetuino-A ir matricos GLA baltymo10,11. Panašiai Jahnen-Dechent ir kt. pastebėjo, kad kalcifikuojančiu peritonitu sergančių pacientų ascitiniame skystyje galima aptikti fetuino A turinčių mineralinių kompleksų, kurie buvo vadinami kalciproteino dalelėmis (CPP). Neseniai atliktas Bertazzo ir kt. parodė mineralinių NP buvimą aortos vožtuvuose ir vainikinėse arterijose tiek aterosklerozei, tiek reumatui sergančių pacientų 13. Nors mineralinių dalelių susidarymo tyrimai dažniausiai buvo skirti žmogaus širdies ir kraujagyslių sistemai, lieka neaišku, ar dalelės gali būti randamos kituose audiniuose ir ar šie subjektai turi įtakos sveikatai ar ligoms.

Anksčiau pastebėjome, kad mineralai-organiniai NPS spontaniškai susidaro žmonių ir gyvūnų kūno skysčiuose14–28. Šie mineraliniai NP iš pradžių buvo apibūdinti kaip nanobakterijos (NB) ir buvo manoma, kad tai ne tik mažiausios ląstelės žemėje29, bet ir galimas daugelio ligų, įskaitant Alzheimerio ligą, aterosklerozę, vėžį, priežastis.inkstasakmuoformavimas, policistinėinkstasliga, ir prostatitas30–32. Tačiau mūsų rezultatai parodė, kad NB iš tikrųjų yra negyvi mineraliniai NP, kurie imituoja įprastas bakterijas pagal jų morfologiją, augimą, dauginimąsi ir subkultūrą15, 18, 22. Dar reikia išnagrinėti galimybę, kad žmogaus audiniuose gali būti mineralinių dalelių, panašių į vadinamąjį NB, ir ar šios dalelės turi įtakos ligai.

Šiame tyrime sukūrėme nanomedžiagų metodą, skirtą aptikti ir analizuoti mineralinius organinius NP sergančiam žmogui.inkstasaudinių. Mes parodome, kad galutinio lėtinės inkstų ligos ir inkstų vėžiu sergančių pacientų inkstų audiniuose yra daugiasluoksnių mineralinių NP, panašių į biomimetines mineralines daleles, kurios spontaniškai nusėda kūno skysčiuose in vitro. Mūsų rezultatai atskleidžia kritines įžvalgas apie šių mineralų-organinių dalelių biocheminę sudėtį, susidarymo mechanizmą ir biologinę funkciją bei atskleidžia negimdinio kalcifikacijos mechanizmus ir ligos atsiradimą žmogaus organizme.

Rezultatai

Mes ištyrėme inkstų audinius, chirurginiu būdu pašalintus iš pacientų, sergančių galutinės stadijos lėtine inkstų liga (n=2) arba inkstų vėžiu (n=18; žr. 1 lentelę; inkstų vėžio mėginiams daugiausia dėmesio skyrėme ne -vėžinė audinio dalis). Kaip sveiki kontroliniai asmenys, tyrėme inkstų biopsijas, gautas iš pacientų, patyrusių traumą arba hematomą, bet anksčiau neturėjo nenormalios inkstų funkcijos (n=2; 1 lentelė).

Sveikų asmenų inkstų audiniai parodė normalius histologinius požymius, o po von Kossa dažymo negimdinio kalcifikacijos nepastebėta (1A, B pav.). Kita vertus, inkstų audiniai, gauti iš sergančių asmenų ir nudažyti hematoksilinu ir eozinu (H&E), parodė audinių pažeidimą (2A–C pav., pažymėti rodyklėmis), o 80 procentų tirtų sergančių audinių buvo mineralizuotų nuosėdų, kaip parodyta. von Kossa dažymu (1C–T pav., 2E, F pav., kalcifikacija matoma kaip juoda medžiaga, pažymėta juodomis rodyklėmis; taip pat žr. 1 lentelę). Sukalkėjusios nuosėdos buvo pastebėtos žievėje ir smegenyse, įskaitant tarpląstelinę erdvę, supančią distalinius vingiuotus kanalėlius, proksimalinius vingiuotus kanalėlius, Henlės surinkimo kanalus ir kilpas, taip pat ląstelių citoplazmą, brėžiančią kanalėlius ir latakus (1C–T pav. ir Fig. 2E, F). Inksto korpuse kalcifikacijos nenustatyta (2D pav.).

Norėdami ištirti mineralinių nuosėdų pobūdį, paruošėme ypač plonas inkstų dalis, kad būtų galima stebėti transmisijos elektronų mikroskopu (TEM). Mėginiuose, kuriuose yra mikroskopinių mineralų sankaupų, mineralų dalelių arba granulių buvo aptikta inkstų epitelio ląstelių citoplazmoje, tarpląstelinėje matricoje po bazine membrana ir proksimalinių bei distalinių vingiuotų kanalėlių spindyje (3A pav., B, dalelės yra padidintos). plokštėse A1–A4 ir B1–B4). Mineraliniai NP taip pat buvo pastebėti ląstelėse, išklojusiose Henlės kilpas ir surinkimo kanalus (3C pav., D, padidintos plokštėse C1, C2 ir D1). Kai kurios dalelės buvo aptiktos tarpląstelinėse pūslelėse inkstų ląstelėse (3A pav., A1 ir A2 plokštės). Čia naudojamas elektroninės mikroskopijos metodas taip pat leido mums vizualizuoti mineralinių dalelių vidų; kai kuriose dalelėse buvo tankūs elektronų žiedai, besikeičiantys šviesiais, elektronų šviesumo sluoksniais (3A pav., plokštės A3 ir A4, 3C pav., skydelis C1). Keletas kraujagyslių, tokių kaip vasa recta rents (tiesios inksto arterijos), mus supa daugybė mineralinių NP (3D pav., D1 skydelis). Taigi mineraliniai NP buvo rasti įvairiose visų žmogaus inkstų audinių vietose, turinčiose negimdinio kalcifikacijos požymių, o tirtuose sveikuose kontroliniuose mėginiuose dalelių nerasta.

Atrodo, kad inkstų audiniuose randamos mineralinės dalelės yra labai panašios į mineralinius organinius NP, aprašytus spontaniškai kūno skysčiuose mūsų ankstesniuose tyrimuose 15, 17 (ir kuriuos mes pavadinome bionais 24). Norėdami patikrinti šią galimybę, mes paruošėme mineralinius organinius NP (arba bionus), naudodami nusodinimo metodą, kaip aprašyta anksčiau . Šis metodas susideda iš nusodinančių jonų, tokių kaip kalcis ir fosfatas, pridėjimo į ląstelių auginimo terpę (Dulbecco modifikuotą Erelio terpė arba DMEM), kurioje yra kūno skysčio, pavyzdžiui, žmogaus serumas (HS), po to inkubavimas ląstelių kultūros sąlygomis (žr. Tokiu būdu pagamintos dalelės (HS-NPS) buvo sferinės arba elipsoidinės ir turėjo lygų arba kristalinį mineralinį paviršių (4A–E pav.), panašius į anksčiau aprašytas daleles kūno skysčiuose22, 23, taip pat esant žmogaus ascitui12 ir kalcifikuotos arterijos13. Mineralinės dalelės pagal bendrą morfologiją, daugiasluoksnę struktūrą ir paviršiaus charakteristikas buvo labai panašios į mineralines NP arba granules, pastebėtas inkstų audiniuose (4F – J pav.). Iš HS gautų dalelių ir inkstų granulių dydis taip pat buvo panašus – jų skersmuo svyravo nuo 50 iki 1500 nm (4A–E, F–J pav.). Kaip minėta aukščiau, kai kurios inkstų granulės buvo apsuptos lipidinės membranos, galbūt vaizduojančios tarpląstelines krovinines pūsleles arba tarpląstelines membranines pūsleles (4H, I pav., membranos pažymėtos rodyklėmis); tokių membraninių struktūrų nebuvo HS-NP mėginiuose, paruoštuose in vitro (4A-E pav.). Šie stebėjimai rodo, kad inkstų granulės yra panašios į mineralinius organinius NP, surinktus serume.

Naudodami pasirinktos srities elektronų difrakcijos analizę, pastebėjome, kad in vitro paruoštų HS-NP mineralinė fazė susideda iš polikristalinės nanomedžiagos (4E pav., įdėta; atkreipkite dėmesį į silpnus koncentrinius žiedus). Panašūs rezultatai gauti dėl inkstų granulių (4J pav., įdėklas) ir dėl kaulų bei negimdinių kalcifikacijų, kaip aprašyta ankstesniuose tyrimuose33,35.

Mes ištyrėme HS-NP ir inkstų granulių cheminę sudėtį naudodami energiją dispersinę rentgeno spektroskopiją (EDX). HS-NP parodė pagrindines anglies (C), kalcio (Ca), deguonies (O) ir fosforo (P) smailes (4K pav.), atitinkančias kalcio fosfato mineralo buvimą. Žema silicio (Si) smailė taip pat buvo pastebėta HS-NP (4K pav.), galbūt tai yra nedidelė dalelių sudedamoji dalis. Inkstų granulės taip pat parodė anglies, kalcio, deguonies ir fosforo smailes, o tai rodo kalcio fosfato mineralą, kartu su papildomomis silicio ir geležies (Fe) smailėmis (4L pav.). Urano smailės (U) buvo priskirtos uranilo acetatui, naudotam kaip kontrastinis reagentas ruošiant mėginį (urano buvimas kai kuriuose mineralinių dalelių, pavyzdžiui, inkstų granulių, mėginiuose ir jo nebuvimas kontroliniame audinyje 4M pav. gali būti siejamas su dideliu urano afinitetas fosfatui, kaip buvo pranešta anksčiau35). Inksto audinio, supančio daleles, kontroliniai EDX spektrai parodė anglies ir deguonies smailes (4M pav.), o tai rodo, kad kalcio ir fosforo daugiausia buvo rasta mineralinėse dalelėse.

HS-NP ir inkstų granulių kalcio: fosforo (Ca:P) santykis svyravo nuo 0,65 iki 1,18. Šie santykiai skiriasi nuo teorinės vertės 1, 67, nustatytos stechiometriniam hidroksiapatitui, tačiau vis dar patenka į anksčiau nustatytą kalcio fosfato ir apatito kristalų diapazoną, pastebėtą esant įvairiems kristalizacijos laipsniams15. Kartu šie radiniai patvirtina, kad inkstų granulės susideda iš kalcio fosfato NP.

Nustatyta, kad įvairūs baltymai sistemiškai slopina negimdinį kalcifikaciją organizme36,37. Be to, manoma, kad sintetinių NP paviršiuje randama baltymo korona lemia dalelių biologinį pasiskirstymą ir poveikį ląstelėms in vivo 38, 39. Kita vertus, žmogaus inkstų audiniuose randamų mineralinių organinių NP baltymų sudėtis lieka nevisiškai suprantama. Anksčiau mes nustatėme, kad albuminas, fetuinas-A ir apolipoproteinas-A1 (apo-A1) yra pagrindiniai baltymai, kurie sąveikauja su mineraliniais organiniais NP, susidariusiais kūno skysčiuose 17, 20. Čia mes panaudojome imunoaukso ženklinimą, kad ištirtume šių baltymų buvimą ir ultrastruktūrinę vietą inkstų granulėse.

Norėdami ištirti serumo baltymų buvimą HS-NP ir inkstų granulėse, naudojome polikloninius antikūnus prieš žmogaus serumo albuminą (HSA), žmogaus serumo fetuiną-A (HSF), žmogaus apo-1A ir visą HS. Polikloninių antikūnų (pagamintų, kaip aprašyta anksčiau25) specifiškumas buvo patikrintas naudojant Western blot metodą (5 pav.). Kiekvienas iš polikloninių antikūnų teigiamai reagavo su in vitro paruoštais HS-NP, taip pat su mineralinėmis granulėmis, randamomis žmogaus inkstų audiniuose (6A, B pav., A1–A3 ir B1–B3 plokštės; juodi taškai). Antikūnai daugiausia reagavo su elektronų tankiais sluoksniais arba tamsiąja HS-NP ir inkstų granulių šerdimi (6A, B pav.), o tai rodo, kad šiose tamsiose srityse gali būti didesnis baltymų kiekis, palyginti su elektronų šviesumo sritimis. Neigiama kontrolė, atlikta be pirminio antikūno, nesukėlė jokios reakcijos (6A, B pav., A4 ir B4 skydeliai, kontrolė). Padarėme išvadą, kad inkstų granulės yra mineralinės-organinės NP, panašios į HS-NP, remiantis ne tik jų morfologija ir mineraline sudėtimi, bet ir jų prisijungimu prie pagrindinių kalcifikacijos inhibitorių, esančių serume.

Imunofluorescencinė mikroskopija buvo naudojama siekiant patvirtinti mineralinių granulių, turinčių HSA ir HSF, buvimą sergančiuose žmogaus inkstuose. Naudojant šią techniką, žmogaus inkstų audiniai parodė

teigiamas dviejų baltymų dažymas įvairiose srityse, įskaitant inkstų kanalėlius supančią intersticiją, taip pat kanalėlius apibrėžiančių ląstelių citoplazmą (7A pav., A1 ir A2 plokštės). Šiose srityse taip pat buvo pastebėti baltymų agregatai, kuriuose yra ir albumino, ir fetuino-A, nors ir mažesniais kiekiais, palyginti su atskirų baltymų dažymu (7A pav. ir A3 skydelis, sujungtas geltonos spalvos dažymas). Pažymėtina, kad pastebėjome, kad imunofluorescencijos būdu aptiktas baltymų dažymas glaudžiai sutapo su negimdinio kalcifikacijos modeliu, pastebėtu naudojant von Kossa dažymą (7A, B pav., kalcifikacija matoma kaip juoda medžiaga, pažymėta rodyklėmis B). Šie rezultatai papildomai patvirtina mineralinių organinių dalelių buvimą tiriamuose žmogaus inkstų audiniuose.

Diskusija

Nors mūsų supratimas apie sintetinių NP ir žmogaus ląstelių sąveiką buvo pasiekta pažangos, mes žinome daug mažiau apie mineralinių organinių NP, kurios spontaniškai susidaro kūno skysčiuose, poveikį. Mūsų ankstesni tyrimai parodė, kad šios dalelės susidaro biologiniuose skysčiuose, kai kalcio ir fosfato koncentracija viršija prisotinimą15,16. Taip pat pastebėjome, kad šias daleles internalizuoja imuninės ląstelės, tačiau tik didelės dalelės sukelia priešuždegimines imunines reakcijas23. Tačiau šių dalelių pasiskirstymas žmogaus audiniuose ir ar jos atlieka fiziologinį ar patologinį vaidmenį organizme iki šiol nebuvo ištirtas.

Šiame tyrime pirmą kartą aptikome mineralinių organinių NP pacientų, sergančių galutinės stadijos inkstų liga arba inkstų vėžiu, inkstuose. Aptiktuose mineraliniuose organiniuose NP yra prastai kristalizuoto kalcio fosfato, panašaus į kaulų mineralą, taip pat albumino, fetuino-A ir apo-A1, kurie veikia kaip sisteminiai kalcifikacijos inhibitoriai kūno skysčiuose. Mūsų rezultatai atitinka ankstesnes ataskaitas, kuriose aprašytas mineralinių baltymų kompleksų buvimas kraujagyslių audiniuose ir kūno skysčiuose 12, 13, 34, 40. Kadangi dalelės, kurias stebėjome, buvo aptiktos vietose, kuriose nėra mikroskopinių kalcifikacijų, mūsų stebėjimai rodo, kad dalelės gali būti negimdinio kalcifikacijos pirmtakai žmogaus audiniuose. Atsižvelgiant į galimybę, kad mineraliniai organiniai NP gali palaipsniui didėti ir, esant palankioms sąlygoms, kaip aprašyta mūsų ankstesniuose tyrimuose15, 18, gali virsti dalelėmis į plėvelę, čia pateikti stebėjimai rodo, kad mineraliniai pirmtakai gali sukelti didesnių mineralų nuosėdos in vivo, pvz., Randall plokštelė ir inkstų akmenys.

Mūsų pastebėjimai, kad mineraliniai negimdiniai kalcifikacijos ir mineraliniai organiniai NP randami įvairiose anatominėse inkstų struktūrose, atitinka ankstesnius šio organo negimdinio kalcifikacijos duomenis41. Evan ir kt. pastebėjimai parodė, kad inkstų akmenligė sergančių pacientų inkstų mineralizacija gali prasidėti ir atsirasti daugiausia Henle kilpų intersticiniame audinyje40,42. Šie autoriai pastebėjo, kad šioje srityje susidarančios mineralinės nuosėdos gali išsikišti iš bazinės urotelio pusės ir sukelti inkstų akmenų susidarymą. Mūsų stebėjimai rodo, kad, be Henlės kilpų, kitose inkstų srityse gali būti mineralinių NP, kurios ilgainiui gali išsivystyti ir sudaryti dideles mineralų nuosėdas žmogaus inkstuose. Taip pat tiriame galimybę, kad kraujotakoje susidarantys mineraliniai NP gali persikelti į inkstų audinius ir sukelti negimdinį kalcifikaciją bei akmenų susidarymą inkstuose.

Keletas šiame tyrime aptiktų inkstų granulių yra tarpląstelinėse arba tarpląstelinėse pūslelėse (4H pav., I), kurios yra panašios į matricines pūsleles, kurios, kaip parodyta, sukelia kalcifikaciją kauluose ir dantyse7,8. Neseniai pastebėjome, kad iš žmogaus ir gyvūnų serumo išskirtos pūslelės in vitro sukelia mineralinių NP ir mikroskopinių nuosėdų susidarymą . Schlieper ir kt.34 taip pat pastebėjo, kad arterijose esančios mineralinės dalelės yra susijusios su membranų struktūromis, ir pasiūlė, kad matricos pūslelės arba apoptoziniai kūnai gali būti mineralinių dalelių branduoliai šiuose audiniuose. Panašiai Khan ir kt. pranešė, kad kalcio fosfato nuosėdos, randamos žmonių, sergančių idiopatiniais inkstų akmenimis, inkstuose yra susijusios su kolageno skaidulomis ir matricos pūslelėmis9. Šie rezultatai rodo, kad inkstų audiniuose aptikti mineraliniai organiniai NP gali susidaryti per mechanizmą, apimantį membranines pūsleles, o tai yra analogiška situacijai, kuri matoma aterosklerozinėse arterijose 7, 8. Kita vertus, neseniai atliktas tyrimas parodė, kad negimdinis kalcifikacija, nustatyta moterų krūties arterijose, nebuvo susijusi su osteogeniniais ar apoptoziniais ląstelių žymenimis43, o tai rodo, kad kalcifikacijos mechanizmas gali būti specifinis dalyvaujančiam organui ar biologiniam kontekstui. Be to, mineraliniai organiniai NP, tokie kaip aprašyti čia, žmogaus inkstų audiniai taip pat gali susidaryti dėl to, kad nepavyksta išlaikyti fiziologinės jonų (pvz., kalcio ir fosfato) ir kalcifikacijos inhibitorių (pvz., albumino, fetuino A ir apo) koncentracijos. -A1) žmogaus kūno skysčiuose.

Mūsų rezultatai rodo, kad mineralų-organinių NP elektronų tankiame sluoksnyje ir šerdyje gali būti didesnis baltymų ir organinių molekulių lygis, palyginti su dalelių elektronų šviesumo sritimis (6A pav., B). Atrodo, kad šie elektronų tankūs sluoksniai yra mineralizuoti, kaip matyti iš šios medžiagos kristalinės prigimties pagal TEM (žr. 4A-J pav.). Kiti autoriai, įskaitant Ryall41 ir Evan et al.44, pasiūlė, kad elektronų šviesumo sluoksnis gali atstovauti mineralams, o elektronų tankūs sluoksniai – organines molekules. Šiuos aiškinimus bent iš dalies gali lemti mėginių apdorojimas ir tyrimas kiekviename tyrime, taip pat naudojamų pradinių audinių pobūdis.

Mineralinės organinės dalelės gali ne tik prisidėti prie negimdinio kalcifikacijos, bet ir sukelti inkstų audinių uždegimą. Neseniai parodėme, kad nors mineraliniai organiniai NP nesugeba paskatinti žmogaus makrofagų priešuždegiminio interleukino -1 sekrecijos, didesni nei 1 μm mineraliniai agregatai gali tai padaryti23. Įrodyta, kad interleukino -1 išsiskyrimas, reaguojant į kristalines medžiagas, priklauso nuo tarpląstelinių molekulinių kompleksų, vadinamų uždegimo 45–47, aktyvavimo. Be to, mineralinių dalelių buvo aptikta inkstuose, kuriuose yra navikų, o ryšys tarp vėžio ir uždegimo dabar yra gerai žinomas48. Dar reikia ištirti galimybę, kad agreguotos mineralinės dalelės gali suaktyvinti uždegimą ir prisidėti prie uždegimo ir vėžio išsivystymo inkstuose ar kituose audiniuose.

Be negimdinio kalcifikacijos, čia aprašytos mineralinės granulės gali dalyvauti ir kituose ligos procesuose. Pavyzdžiui, anksčiau siūlėme, kad mineraliniai NP gali prisijungti prie įvairių kūno skysčių baltymų ir išeikvoti šias organines molekules iš kūno skysčių 20, 26. Kita vertus, žmogaus organizmas gali užkirsti kelią mineralinių NP susidarymui ir kaupimuisi normaliomis aplinkybėmis, pasikliaudamas kalcifikacijos inhibitoriais ir retikuloendoteline sistema (ty makrofagais). Taigi mineraliniai NP gali kauptis tik tada, kai sutrikdoma sisteminė ar vietinė kalcio homeostazė ir kai žmogaus organizme sugenda apsauginiai mechanizmai.

Siūlome, kad čia sukurtas nanomedžiagų metodas galėtų būti naudojamas mineralinių organinių NP susidarymui gyvūnų ir žmonių audiniuose tirti. Pavyzdžiui, antikūnai, sukurti prieš kalcifikacijos inhibitorius baltymus, tokius kaip albuminas, fetuinas-A ir apo-A1, gali būti naudojami kartu su mineralų analize, siekiant nustatyti ir apibūdinti mineralinių organinių NP susidarymą gyvūnų modelių audiniuose. Rezultatai, gauti naudojant šį metodą, gali būti taikomi atliekant klinikinius žmogaus kūno skysčių matavimus, siekiant nustatyti biologinius parametrus, atspindinčius mineralinių dalelių susidarymo ir negimdinio kalcifikacijos būklę organizme. Tikimės, kad šios žinios gali padėti sukurti naujas gydymo strategijas, skirtas užkirsti kelią ir gydyti žmonių ligas ir sąlygas, susijusias su negimdiniu kalcifikavimu.

Metodai

Inkstų audiniai.Žmogaus audinių naudojimas ir eksperimentai, atlikti šiame tyrime, buvo patvirtinti Chang Gung memorialinės ligoninės Institucinės peržiūros tarybos; metodai ir eksperimentai buvo atlikti pagal patvirtintas gaires. Iš pacientų buvo gautas raštiškas informuotas sutikimas. Kontroliniai sveiki inkstų audiniai buvo gauti iš traumų ir hematoma sergančių pacientų, kuriems nebuvo inkstų ligos anamnezėje, biopsijos (n=2); inkstų audiniai taip pat buvo gauti iš pacientų, sergančių inkstų vėžiu (n=20) ir iš pacientų, sergančių galutinės stadijos inkstų liga (n=2), kurių inkstai buvo pašalinti arba paimti biopsija per transplantacijos operaciją (1 lentelė). Inkstų vėžio audiniams šiame tyrime buvo išpjaustyta ir ištirta ne vėžinė audinio dalis.

Histologinė analizė.Inkstų audiniai buvo sumontuoti ant parafino blokų. Blokai buvo padalinti į dalis, o audinių griežinėliai kaitinami ant kaitvietės 70 laipsnių temperatūroje 30 minučių, kad pašalintų parafiną. Sekcijos buvo panardintos į šviežią ksileno tirpalą tris kartus 15 minučių, kad būtų visiškai pašalintas likęs parafinas. Sekcijos buvo rehidratuojamos 95 procentų, 80 procentų ir 70 procentų etanoliu kiekvieną kartą 5 minutes. Rehidratuoti mėginiai buvo plaunami dvigubai distiliuotu vandeniu (ddH2O) 5 minutes. Ląstelių branduoliai buvo nudažyti hematoksilinu 8 minutes. Dažai buvo pašalinti iš mėginių šiltu vandeniu 10 min. Inkstų mėginiai buvo nuplauti ddH2O ir 10 kartų panardinti į 95 procentų etanolį. Etanoliu apdoroti mėginiai 1 minutę buvo prieš dažomi eozinu Y. Mėginiai buvo dehidratuoti 95 procentų ir 100 procentų etanoliu kiekvieną kartą 10 minučių, po to 10 minučių dehidratuoti ksilene. Galutiniai dehidratuoti inkstų mėginiai buvo sumontuoti ant stiklinių stiklelių su 50 procentų glicerolio ir stebimi šviesos mikroskopu su skaitmenine kamera.

Deparafinuoti ir rehidratuoti mėginiai buvo paruošti taip, kaip aprašyta H&E dažymui. Rehidratuotos sekcijos buvo nudažytos sidabro nitratu (5 procentai), po to 20 minučių veikiamos UV šviesoje. Tirpalas buvo plaunamas ddH2O 15 min. Pjūviai buvo dažomi natrio tiosulfatu (5 procentai) 5 minutes, po to 15 minučių plaunami ddH2O. Pjūviai buvo nudažyti branduoliniu greitu raudonu (Sigma-Aldrich, St. Louis, MI) 5 min. Dažyti mėginiai buvo dehidratuoti iš eilės 95 procentų ir 100 procentų etanoliu po 10 minučių, prieš dehidratuojant ksilene 10 minučių. Inkstų mėginiai buvo sumontuoti ant stiklinių stiklelių ir ištirti, kaip aprašyta aukščiau.

Elektroninė mikroskopija ir EDX analizė.Inkstų mėginiai buvo supjaustyti į mažus gabalėlius, mažesnius nei 1 mm storio, naudojant LGPS skrodimo mikroskopą (Olympus, Tokijas, Japonija). Audiniai buvo fiksuoti 2,5 procento glutaraldehido ir 1 procento paraformaldehido 0,1 M kakodilato buferyje 4 laipsnių temperatūroje per naktį. Fiksuoti mėginiai tris kartus plaunami 0,1 M kakodilato buferiu 8 procentų sacharozės tirpale (pH 7,2) ant ledo 10 min. Išplauti audiniai 2 valandas ant ledo buvo inkubuojami fosfatiniame buferiniame fiziologiniame tirpale (PBS; 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4), kuriame yra 1 procentas osmio tetroksido ir 1,5 procento kalio ferocianido. Audiniai tris kartus plaunami ddH2O ant ledo 10 min. Išplauti audiniai buvo nudažyti ant ledo 1 procento uranilo acetatu ddH2O 1 valandą, prieš tai tris kartus plaunant ddH2O ant ledo. Inkstų audiniai buvo dehidratuoti 30, 50, 70, 80 ir 90 procentų etanolio kiekvieną kartą 10 minučių, išskyrus atvejus, kai etanolis pasiekė 70 procentų, tokiu atveju mėginiai buvo laikomi 4 laipsnių temperatūroje per naktį. Audiniai buvo nudažyti 1 procento fosfotungsto rūgštimi 95 procentų etanolyje 15 minučių, prieš dehidrataciją 95 procentų etanoliu 5 minutes. Mėginiai buvo panardinami į propileno oksidą 40, 57, 67 ir 100 procentų etanolyje 10 minučių kiekvieną kartą, po to dar kartą panardinami į 100 procentų propileno oksidą 5 minutes. Inkstų audiniai buvo infiltruojami 50, 70 ir 100 procentų Eponate 812 (Ted Pella, Redding, CA) kiekvieną kartą 1 valandą. Eponate 812-įterptieji inkstų mėginiai buvo paruošti du kartus inkubuojant 100 procentų eponate. Įterpti mėginiai buvo inkubuojami į orkaitę 60 laipsnių temperatūroje per naktį, kad būtų galima polimerizuotis.

Išplautos HS-NP granulės, gautos kaip aukščiau, buvo fiksuotos glutaraldehidu (2,5 proc.) ir paraformaldehidu (1 proc.) ddH2O 4 valandas 4 laipsnių temperatūroje. Fiksuotos granulės buvo plaunamos ddH2O tris kartus po 10 min. Granulės buvo dehidratuojamos nuosekliai inkubuojant 30, 50, 70, 80, 90, 95 ir 100 procentų etanolyje, kiekvieną kartą po 10 minučių, išskyrus atvejus, kai etanolis pasiekė 70 procentų, o granulės buvo laikomos 4 laipsnių temperatūroje per naktį. Kiti etanolio tirpalai buvo kontaktuojami su granulėmis tik 10 minučių. Dehidratuotos granulės buvo infiltruotos LR balta įterpimo terpe (Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA), naudojant skirtingus etanolio ir LR terpės santykius (3: 1, 1: 1 ir 1: 3) 30 minučių. Prieš polimerizaciją per naktį granulės buvo infiltruotos šviežia LR terpe (100 proc.). Granulės, infiltruotos su LR terpe, buvo inkubuojamos 60 laipsnių orkaitėje 2 dienas, kad būtų galima polimerizuotis. Inkstų ir HS-NP blokai buvo suskirstyti, kad būtų pagaminti 70–100 nm storio griežinėliai, naudojant Reichert Ultracut S mikrotomą (Leica, Wetzlar, Vokietija). Prieš vizualizuojant JEM 1230 perdavimo elektronų mikroskopu (JEOL, Tokijas, Japonija), veikiančiu 100 kV, audinių sekcijos buvo nudažytos 4 procentų uranilo acetatu. Elektronų difrakcijos modeliai buvo gauti naudojant tą pačią sistemą. Nikelio tinkleliai buvo naudojami kaip atrama.

EDX analizei plonos inkstų audinių dalys buvo nudažytos uranilo acetatu ir plaunamos ddH2O, kaip aprašyta aukščiau, po to džiovinamos elektroninėje eksikatoriaus spintelėje. Mėginiai buvo stebimi naudojant didelės skiriamosios gebos JEM 2100 perdavimo elektronų mikroskopą (JEOL), veikiantį 120 kV įtampa. EDX spektrai buvo gauti trimis egzemplioriais naudojant INCA Energy EDS sistemą (Oxford Instruments, Abingdon, JK). Plonos HS-NP dalys buvo stebimos be dažymo.

Mineralinių organinių NP paruošimas.Visi pradiniai tirpalai buvo sureguliuoti iki pH 7,4 ir prieš naudojimą sterilizuojami filtruojant per 0,2 μm membranas. HS buvo gautas iš sveikų savanorių, naudojant įprastą venos punkcijos metodą. Žmogaus biologinių skysčių naudojimą šiame tyrime patvirtino Linko Chang Gung memorialinės ligoninės institucinė peržiūros taryba ir buvo gautas raštiškas savanorių sutikimas. HS-NP buvo paruošti pridedant po 3 mM CaCl2 ir Na2HPO4 į DMEM (Gibco, Carlsbad, CA), turintį 10 procentų HS, po to vieną savaitę inkubuojant ląstelių kultūros sąlygomis (37 laipsniai, 5 procentai CO2, drėgnas oras). Dalelės buvo susmulkintos centrifuguojant 16, 000 × g 15 minučių 4 laipsnių kampu ir du kartus plaunamos HEPES buferiu (20 mM HEPES, 1 mM CaCl2, 2 mM Na2HPO4, 150 mM NaCl), naudojant tą pačią centrifugavimo procedūrą.

SDS-PAGE ir Western blotting.SDS-PAGE ir Western blot analizė buvo atlikta iš esmės kaip ir anksčiau15. Trumpai tariant, 0.2 ug (5A, D pav.) arba 1,2 ug (5B, C pav.) HS baltymų, 47 ug (5A, B, D pav.) arba 590 ug HS-NP baltymų (5C pav.), 0,1 ug HSA (5A–D pav.) ir 0,6 ug (5A, C, D pav.) arba {{23} },15 g HSF (5B pav.) buvo ištirpinta 5x „pakrovimo buferyje“ (0,313 M Tris-HCl pH 6,8, 10 proc. SDS, 0,05 proc. bromfenolio mėlynojo, 50 proc. glicerolio, 12,5 proc. merkaptoetanolis) iki galutinės koncentracijos 1 ×, prieš kaitinant 95 laipsnių temperatūroje 5 minutes ir atskyrimą denatūravimo ir redukavimo sąlygomis 10 procentų SDS-PAGE, naudojant mini gelio sistemą (Hoefer, Holliston, MA). NP kontrolė (naudojama 5A–D pav. 1 juostoje) susideda iš mineralinių NP, paruoštų pridedant po 3 mM CaCl2 ir Na2HPO4 į DMEM (galutinis tūris 1 ml), po to inkubacija vieną dieną ląstelių kultūros sąlygomis; dalelės buvo susmulkintos centrifuguojant 16, 000 × g 15 minučių, du kartus plaunamos HEPES buferiu ir resuspenduojamos 50 ul HEPES buferio. 20 ul resuspenduotų dalelių alikvotinė dalis buvo apdorota SDS-PAGE, kaip nurodyta aukščiau. PVDF membranos buvo užblokuotos 1 valandai 5 procentų (m/v) nuriebalintame piene kambario temperatūroje. Pirminiai antikūnai, sukurti namuose, kaip aprašyta anksčiau25, buvo naudojami praskiedus santykiu 1:1, 000 (-apo-A1 ir -HS-NP), 1:3, 000 (-HSF) , arba 1:6, 000 ( -HSA). Ožkos anti-triušio krienų peroksidaze konjuguotas antrinis antikūnas buvo naudojamas pagal gamintojo pateiktas instrukcijas (Millipore, Billerica, MA). Dėmės buvo atskleistos naudojant sustiprintą chemiliuminescenciją (Amersham Biosciences, Amersham, JK) ir autoradiografines plėveles.

Imuninio aukso ženklinimas.Mėginiai buvo paruošti TEM stebėjimui. HS-NP blokai buvo suskirstyti į mažesnius nei 70 nm storio griežinėlius. Mėginių sekcijos ant grotelių buvo užblokuotos 1 procento žuvų želatina (Sigma) 0,1 M HEPES buferyje (pH 8,0) 25 min. Tinkleliai buvo inkubuojami su šiais pirminiais antikūnais: -HSA, 1:30; -HSF, 1:50; -apo-A1, 1:30; -HS-NP, 1:60. Neigiama kontrolė neturėjo pirminio antikūno (1 procentas žuvies želatinos HEPES buferyje). Inkubuotos sekcijos buvo plaunamos HEPES buferiu 15 minučių. Išskalautos sekcijos buvo užblokuotos 1 procento žuvų želatina HEPES buferyje 20 minučių. Mėginiai buvo apdoroti antriniu 5-nm-aukso konjuguotu ožkos anti-triušio IgG 1 valandą. Mėginiai buvo plaunami HEPES buferiu 10 minučių, prieš tai 10 minučių ddH2O. TEM stebėjimai buvo atlikti, kaip nurodyta aukščiau.

Fluorescencinė mikroskopija.Histologiniai inkstų audinio stikleliai, paruošti kaip aukščiau, kambario temperatūroje 1 valandą buvo užblokuoti 1 procento galvijų serumo albuminu. Skaidrės buvo inkubuojamos su pirminiais polikloniniais antikūnais, praskiedus 1:4, 000. Po plovimo, mėginiai buvo inkubuojami su antriniais antikūnais ožkos anti-triušis-FITC (492/520 nm) ir ožkos anti-triušis-TRITC (550/570 nm) (Jackson Immuno Research, West Grove, PA) 1:100 1 val. Kompleksai buvo plaunami PBST 15 min. Fluorescencinė 4′,6-diamidino-2-fenilindolio (DAPI) dėmė buvo naudojama 10 ug/ml 15 min. DAPI dažyti mėginiai buvo dehidratuoti 95 ir 100 procentų etanoliu 10 minučių, po to dar 10 minučių dehidratuoti ksilene. Dehidratuoti inkstų mėginiai buvo pritvirtinti naudojant Vectashield fluorescencinę H-1000 tvirtinimo terpę (Vector Laboratories, Burlingame, CA) ir buvo stebimi konfokaliniu mikroskopu (LSM510 Meta; Zeiss, Oberkochen, Vokietija), turinčiu Spot Flex kamerą.

Cistanche tubulosa apsaugo nuo inkstų ligos, spustelėkite čia, kad gautumėte mėginį

Nuorodos

1. Giachelli, CM Negimdinis kalcifikavimas: rimtų faktų apie minkštųjų audinių mineralizaciją rinkimas. Am J Pathol 154, 671-675 (1999).

2. Abedin, M., Tintut, Y. & Demer, LL Kraujagyslių kalcifikacija: mechanizmai ir klinikinės pasekmės. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 24, 1161–1170 (2004).

3. Alexopoulos, N. & Raggi, P. Kalcifikacija sergant ateroskleroze. Nat Rev Cardiol 6, 681–688 (2009).

4. Allison, MA, Criqui, MH & Wright, CM Sisteminės kalcifikuotos aterosklerozės modeliai ir rizikos veiksniai. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 24, 331–336 (2004).

5. Ketteler, M. ir kt. Kalcio reguliuojančių baltymų trūkumai dializuojamiems pacientams: nauja širdies ir kraujagyslių kalcifikacijos koncepcija uremijoje. Kidney Int Suppl 84, S84–87 (2003).

6. Kapustin, A. & Shanahan, CM Nukreipimas į kraujagyslių kalcifikaciją: kieto tikslo minkštinimas. Curr Opin Pharmacol 9, 84–89 (2009).

7. Kapustin, AN & Shanahan, CM Kalcio reguliavimas kraujagyslių lygiųjų raumenų ląstelių kilmės matricos pūslelių. Trends Cardiovasc Med 22, 133–137 (2012).

8. Doherty, TM ir kt. Kalcifikacija sergant ateroskleroze: kaulų biologija ir lėtinis uždegimas arterijų kryžkelėje. Proc Natl Acad Sci USA 100, 11201-11206 (2003).

9. Khan, SR, Rodriguez, DE, Gower, LB & Monga, M. Randall plokštelių susiejimas su kolageno skaidulomis ir membraninėmis pūslelėmis. J Urol 187, 1094–1100 (2012).

10. Price, PA, Nguyen, TM & Williamson, MK Biocheminis serumo fetuino ir mineralų komplekso apibūdinimas. J Biol Chem 278, 22153-22160 (2003).

11. Price, PA, Williamson, MK, Nguyen, TM & Than, TN Fetuino ir mineralų komplekso koncentracija serume koreliuoja su žiurkės arterijų kalcifikacija. J Biol Chem 279, 1594-1600 (2004).

12. Heiss, A. ir kt. Hierarchinis fetuino A ir rūgščių serumo baltymų vaidmuo formuojant ir stabilizuojant kalcio fosfato daleles. J Biol Chem 283, 14815-14825 (2008).

13. Bertazzo, S. ir kt. Nanoanalitinė elektronų mikroskopija atskleidžia esmines žmogaus širdies ir kraujagyslių audinių kalcifikacijos įžvalgas. Nat Mater 12, 576–583 (2013).

14. Martel, J. & Young, JD Teigiama, kad nanobakterijos žmogaus kraujyje yra kalcio karbonato nanodalelės. Proc Natl Acad Sci USA 105, 5549–5554 (2008).

15. Young, JD ir kt. Tariamos nanobakterijos yra normalios kalcio homeostazės fiziologinės liekanos ir kultūros šalutiniai produktai. Plos One 4, e4417 (2009).

16. Young, JD ir kt. Kalcio ir apatito granulių apibūdinimas serume kaip pleomorfiniai mineralo-baltymų kompleksai ir kaip spėjamų nanobakterijų pirmtakai. Plos One 4, e5421 (2009).

17. Wu, CY, Martel, J., Young, D. & Young, JD. Fetuino-A/albumino mineralų kompleksai, panašūs į kalcio granules serume ir spėjamas nanobakterijas: dvigubo slopinimo-sėjimo koncepcijos demonstravimas. Plos One 4, e8058 (2009).

18. Young, JD ir Martel, J. Nanobakterijų atsiradimas ir kritimas. Sci Am 302, 52–59 (2010).

19. Martel, J., Wu, CY & Young, JD Kritinis gama apšvitinto serumo, naudojamo kaip tiekėjas kultūroje, įvertinimas ir numanomų nanobakterijų bei kalcifikuojančių nanodalelių demonstravimas. Plos One 5, e10343 (2010).

20. Martel, J. ir kt. Išsami mineralinių nanodalelių, gautų iš žmogaus kūno skysčių ir analizuotų skysčių chromatografijos-tandemo masės spektrometrija, proteominė analizė. Anal Biochem. 418, 111–125 (2011).