Diferencinė žmogaus treg ir efektorinių T ląstelių kontrolė auglio imunitete naudojant Fc sukurtą anti-CTLA{1}} antikūną

Anti-CTLA-4 mAb yra veiksmingas stiprinant žmonių imunitetą nuo naviko. CTLA-4 ekspresuoja įprastos T ląstelės po aktyvacijos ir natūraliai atsirandančios FOXP3 ir CD4 bei Treg ląstelės, todėl kyla klausimas, kaip anti-CTLA-4 mAb gali skirtingai kontroliuoti šias funkciškai priešingas T ląstelių populiacijas. naviko imunitetas. Čia parodome, kad FOXP3 stipriai slopinančių efektorinių Treg ląstelių buvo daug melanomos audiniuose, išreiškiančių CTLA-4 daugiau nei į naviką infiltruojančios CD8 plius T ląstelės. In vitro sveikų asmenų ar melanoma sergančių pacientų periferinio kraujo mononuklearinių ląstelių stimuliavimas naviko antigenu, Fc regione modifikuotas anti-CTLA-4 mAb, pasižymintis dideliu nuo antikūnų priklausomu ląstelių sukeltu citotoksiškumu (ADCC) ir ląstelių fagocitoze (ADCP). ) aktyvumas selektyviai sumažino CTLA-4 plius FOXP3 plius Treg ląsteles ir dėl to išplėtė naviko antigenui specifines CD8 plius T ląsteles.

Svarbu tai, kad išsiplėtimas įvyko tik tada, kai antigeno stimuliacija buvo atidėta kelioms dienoms nuo gydymo antikūnais iki atsarginių CTLA-4 plius aktyvuoto efektoriaus CD8 ir T ląstelių nuo mAb sukelto žudymo. Panašiai pelėms, turinčioms naviką, gydymas dideliu ADCC/ADCP anti-CTLA-4 mAb su atidėta naviko antigeno vakcina žymiai pailgino jų išgyvenimą ir žymiai padidino citokinų gamybą naviką infiltruojančiose CD8 plius T ląstelėse, o gydymas antikūnais. kartu su vakcinacija nepadarė. Anti-CTLA4 mAb, modifikuotas taip, kad pasižymėtų mažesniu Fc surišimo aktyvumu arba jo visai nerodytų, tokio nuo laiko priklausomo in vitro ir in vivo imuniteto stiprinimo nepavyko. Taigi, didelis ADCC anti-CTLA-4 mAb gali selektyviai išeikvoti efektorines Treg ląsteles ir sukelti naviko imunitetą, priklausomai nuo CTLA-4, išreiškiančio efektorinių CD8 ir T ląstelių būseną. Šie atradimai yra svarbūs kuriant vėžio imunoterapiją su mAb, nukreiptais į molekules, kurias paprastai ekspresuoja FOXP3 plius Treg ląstelės ir į naviką reaguojančios efektorinės T ląstelės.

Reguliuojančios T ląstelės|CTLA-4|FOXP3|vėžio imunoterapija|nuo antikūnų priklausomas ląstelių sukeltas citotoksiškumas.

Natūraliai atsirandančios CD25 plius CD4 ir Treg ląstelės, ekspresuojančios transkripcijos faktorių FOXP3, atlieka nepakeičiamą vaidmenį palaikant imunologinę savitoleranciją ir homeostazę (1). Tačiau jie taip pat trukdo veiksmingam imuniniam atsakui prieš naviko ląsteles, atsirandančias iš savęs, kaip rodo išvados, kad pelių navikus galima išnaikinti tiesiog išeikvojus Treg ląsteles (2–5).

Žmonėms yra daug įrodymų, kad Treg ląstelės įsiskverbia į įvairius naviko audinius (6–8), ir reikšminga koreliacija tarp Treg infiltracijos ir prastos įvairių vėžio rūšių prognozės (9). Todėl Treg ląstelių kontrolė naviko audiniuose greičiausiai bus vienas perspektyvus būdas sukelti veiksmingą naviko imunitetą vėžiu sergantiems pacientams.

Dėl priešnavikinių tyrimų mes nustatėme, kad Cistanche deserticola turi akivaizdų priešnavikinį poveikį žiurkių tyrimuose. 3 Cistanche deserticola esantys polisacharidiniai komponentai gali sustiprinti organizmo imuninę funkciją, skatinti baltųjų kraujo kūnelių aktyvavimą, pagerinti organizmo imuninę būklę ir taip pat gali tiesiogiai veikti naviko ląsteles. Slopinti naviko ląstelių dauginimąsi, metastazę ir invaziją. Taip pat slopina angiogenezę. Naviko augimui ir metastazėms reikia palaikyti naujų kraujagyslių augimą, o Cistanche esantys polisacharidai gali slopinti angiogenezę ir taip sumažinti naviko augimą ir metastazes.

Spustelėkite čia norėdami nusipirkti cistanche

Žmogaus FOXP{0}}išreiškiančios CD4 ir T ląstelės yra nevienalytės, įskaitant Treg ląsteles ir neslopinančias įprastas T ląsteles. Jie gali būti suskirstyti į tris subpopuliacijas pagal skirtingus FOXP3 ir CD45RA ekspresijos lygius (10) (1A pav.): (i) CD45RA ir FOXP3lo negyvos / ramybės būsenos Treg ląstelės [frakcija (Fr). I];(ii) CD45RA− FOXP3hi efektorinės Treg (Treg) ląstelės (Fr. II), kurios yra galutinai diferencijuotos ir labai slopina; ir (iii) CD45RA−FOXP3lo ne Treg ląstelės (Fr. III), kurios neturi slopinamojo aktyvumo ir gali išskirti priešuždegiminius citokinus. Atlikus antigeninę stimuliaciją, kun. Aš naivios Trego ląstelės diferencijuojasi į Fr. II Treg ląstelės, kurios stipriai ekspresuoja CTLA-4 (10).

1 pav. FOXP3hi Treg ląstelių pirmenybinė CTLA-4 ekspresija melanomos audinyje. (A ir B) reprezentatyvūs CD4 ir T ląstelių dažymo grafikai (A) ir kiekvienos frakcijos (B) dažniai. Sveikų donorų PBMC (HD, n=5) ir melanoma sergančių pacientų PBMC ir TIL (atitinkamai n=11 ir 14) buvo tiesiogiai nudažyti dėl CD4, CD45RA ir FOXP3. (C ir D) reprezentatyvūs CD8 ir T ląstelių CCR7 ir CD45RA ekspresijos sklypai (C) ir kiekvieno CD8 ir T ląstelių pogrupio santrauka (D). (E) CTLA-4 – išreiškiančios klasterius (punktyrinė linija) melanoma sergančių pacientų PBMC ir TIL, atlikus CyTOF analizę. Rodomi CD4 plius ir CD8 plius T ląstelių viSNE diagramos su nurodytų žymenų ekspresijos lygių šilumos žemėlapiais (n=2). (F) HD PBMC tik paviršius arba paviršiaus ir tarpląstelinis CTLA-4 dažymas. (G) Paviršiaus CTLA-4 išraiškos pagal kiekvieną ląstelių frakciją iš melanoma sergančių pacientų TIL ir PBMC. Reiškia ± SEM. *P Mažiau arba lygu {{20}}.05, **P Mažiau arba lygu 0.01, ***P Mažiau arba lygu 0,001 ir ****P Mažiau arba lygu 0,0001 pagal vienpusę ANOVA su post hoc Tukey HSD testu.

Nors dauguma celių kun. III yra ne Treg ląstelės ir nesiskiria į Fr. II eTreg ląstelės, cirkuliuojantis T folikulų reguliavimo ląstelių pogrupis, kuris yra CXCR5 ir CD45RA−, yra įtrauktas į Fr. III (11), rodantis Fr nevienalytiškumą. III populiacija. Priešingai, kai kraujyje yra šios trys FOXP3 plius populiacijos, daugumoje navikų vyrauja Treg ląstelių infiltracija, kurios, atrodo, slopina veiksmingą priešnavikinį imuninį atsaką vėžiu sergantiems pacientams (12). Šie atradimai rodo, kad Treg ląstelių išeikvojimas ir (arba) sumažėjimas navikuose ir regioniniuose limfmazgiuose yra labai svarbus norint sukelti ir sustiprinti priešnavikinį imuninį atsaką, kaip neseniai buvo parodyta kai kurie monokloniniai antikūnai (mAb), specifiniai Treg ląstelių specifinėms molekulėms (13).

CTLA-4 ekspresuoja įprastos T ląstelės po aktyvavimo ir FOXP3 plius CD25 plius CD4 ir Treg ląstelės iš esmės. Jis atlieka pagrindinį vaidmenį Treg sukeltame slopinime, bent jau iš dalies, kontroliuojant CD80/CD 86 ekspresiją antigeną pateikiančiomis ląstelėmis (APC) (14–16). Anti-žmogaus CTLA-4 mAb, kuris yra kliniškai veiksmingas gydant melanomą (17, 18), iš pradžių buvo manoma, kad blokuoja CTLA-4-medijuojamą neigiamą signalą į aktyvuotas efektorines T ląsteles, palaikydamas jų aktyvuotą būseną atakuoja naviko ląsteles. Tačiau naujausi ikiklinikiniai tyrimai parodė, kad anti-CTLA-4 mAb gali išeikvoti FOXP3 ir Treg ląsteles, ypač naviko audiniuose, ir taip sustiprinti naviko imunitetą (19–21). Tačiau žmonėms ginčytina, ar CTLA-4 mAb turi įtakos Treg ląstelių arba efektorinių T ląstelių, arba abiejų, skaičiui ar funkcijai, stiprindamas priešnavikinį imuninį atsaką klinikiniame kontekste.

Šiame tyrime in vivo ir in vitro tyrėme žmonėms ir pelėms Fc sukurtų anti-CTLA-4 mAb poveikį FOXP3 plius Treg ląstelėms ir savaiminio / naviko antigenui specifinėms CD8 plius T ląstelėms. Mes parodome, kad ląsteles ardantis anti-CTLA-4 mAb, turintis didelį nuo antikūnų priklausomą ląstelių sukeltą citotoksiškumą (ADCC), gali sukelti priešnavikinį imuninį atsaką, priklausomai nuo CTLA-4 ekspresijos lygio ir kinetikos. dvi populiacijos. Rezultatai gali būti išplėsti iki ląsteles ardančių mAb, nukreiptų į kitas ląstelių paviršiaus molekules, kurias tiek Treg, tiek efektorinės T (Teff) ląstelės paprastai išreiškia skirtingais lygiais ir skirtinga kinetika.

Reikšmė

Anti-CTLA-4 mAb gali padidinti naviko imunitetą, nepaisant CTLA-4 ekspresijos, funkciškai priešindamas T ląstelių populiacijas: aktyvuotas efektorines T (Teff) ląsteles ir FOXP3 plius CD4 ir Treg ląsteles. Čia parodome, kad anti-CTLA-4 mAb, sukurtas taip, kad būtų citotoksiškai išeikvotas Treg ląstelės, veiksmingai in vitro žmonėms ir in vivo pelėms. Jis išplėtė antigenui specifines CD8 ir Teff ląsteles, kai naviko antigeno stimuliavimas buvo atidėtas kelioms dienoms, kad apsaugotų jas nuo mAb nužudymo. Anti-CTLA-4 mAb, modifikuotas taip, kad parodytų mažesnį ląsteles ardantį aktyvumą arba jo visai nereikėtų, tokio poveikio neparodė. Ši strategija, skirta skirtingai kontroliuoti Treg ir Teff ląsteles citotoksiniais anti-CTLA{9}} mAb, siekiant sukelti veiksmingą naviko imunitetą, padės sukurti vėžio imunoterapiją, nukreiptą į kitas molekules, paprastai ekspresuojamas Treg ir Teff ląstelių.

Autoriaus indėlis: DH, A. Tanaka, HN ir SS suprojektuoti tyrimai; DH, A. Tanaka, TK, A. Tanemura, DS, JBW, ELL, KWWT, DA ir IK atliko tyrimus; A. Tanemura prisidėjo prie naujų reagentų/analitinių priemonių; DH, A. Tanaka, TK, DS, DA, EWN, IK, HN ir SS analizuoti duomenys; ir DH, A. Tanaka ir SS parašė darbą.

Recenzentai: MA, Tokijo medicinos ir odontologijos universitetas; ir SAQ, Londono universiteto koledžas.

Interesų konflikto pareiškimas: HN gavo mokslinių tyrimų stipendiją iš Bristol Myers Squibb. SS gavo mokslinių tyrimų stipendiją iš Chugai Pharmaceutical Co., Ltd. TK dirba Chugai Pharmaceutical Co., Ltd., kuri pateikė kai kuriuos šiame tyrime naudotus antikūnus.

Paskelbta pagal PNAS licenciją.

1 Dabartinis adresas: Nagojos universiteto Medicinos mokyklos Imunologijos katedra, 466-8550 Nagoja, Japonija.

2 Dabartinis adresas: Imunologijos skyrius, Moffitt Cancer Center, Tampa, FL 33612.

3 Dabartinis adresas: Vėžio imunologijos skyrius, žvalgomųjų onkologijos tyrimų ir klinikinių tyrimų centras, Nacionalinis vėžio centras, 277-8577 Kašiva, Japonija.

4 Kam turėtų būti adresuojama korespondencija. El. paštas: shimon@ifrec.osaka-u.ac.jp.

Paskelbta internete 2018 m. gruodžio 26 d.

Rezultatai

CTLA{0}} – ekspresuojančios, galutinai diferencijuotos FOXP3hi Treg ląstelės kaupimasis melanomos audiniuose.

Pirmiausia įvertinome įvairių T ląstelių subpopuliacijų dažnį tarp naviko infiltruojančių limfocitų (TIL) pacientams, sergantiems melanoma. CD45RA−FOXP3hi eTreg ląstelės (Fr. II) daugiausia (~{3}} kartų) padidėjo tarp CD4 ir TIL, palyginti su sveikų donorų ar melanoma sergančių pacientų periferinio kraujo CD4 ir T ląstelėmis (1 A ir B pav. ). CD45RA− FOXP3lo Fr dažnis. III ne Treg ląstelės taip pat šiek tiek padidėjo (∼ du kartus) tarp CD4 ir TIL. Priešingai, CD45RA ir FOXP3lo negydytų Treg ląstelių (Fr. I) reikšmingai sumažėjo TIL iki vidutiniškai ketvirtadalio atitinkamos frakcijos periferinio kraujo mononuklearinėse ląstelėse (PBMC).

Tarp FOXP3− įprastų CD4 plius T ląstelių TIL, CD45RA− FOXP3− efektoriaus/atminties CD4 plius T ląstelės, kurios galėtų būti toliau išskaidomos į CD25 plius (Fr. IV) ir CD25− (Fr. V) populiacijas (10). , šiek tiek (∼1.{9}}karto) padidėjo, o CD45RA plius FOXP3− naivus CD4 plius T ląstelės (Fr. VI) žymiai sumažėjo iki dešimtosios PBMC. TIL CD8 ir T-ląstelių frakcijoje, palyginti su pacientų ar sveikų donorų PBMC, reikšmingai (~1{17}}kartu) padidėjo CD45RA−CCR7− efektorinės atminties T (TEM) ląstelių. reikšmingai sumažėjo CD45RA ir CCR7 plius naivios ir CD45RA plius CCR7− galutinai diferencijuotos efektorinės atminties (TEMRA) ląstelės atitinkamai iki pusės ir penktadalio PBMC ląstelių, o CD45RA− CCR7 ir centrinės atminties T reikšmingų pokyčių nėra. (TCM) ląstelės (1 pav. C ir D). Taip pat pastebėta, kad pacientams, sergantiems melanoma, negydytų CD8 ir T ląstelių skaičius PBMC žymiai sumažėjo (∼{29}} kartus), palyginti su sveikais donorais.

Tada įvertinome, kuri T-ląstelių populiacija išreiškė CTLA-4 melanoma sergančių pacientų TIL arba PBMC, taikant citometriją skrydžio laiko (CyTOF) masės spektrometrijos citometru (1E pav. ir SI priedas, S1A pav.). CD4 plius CD45RA− Foxp3hi ląstelių klasteris, atstovaujantis Fr. II eTreg ląstelės, daugiausia išreiškiančios CTLA4 PBMC ir TIL, o CD8 plius T ląstelės mažai ekspresavo CTLA-4 nei PBMC, nei TIL. Pelėms vyraujanti FOXP3 ir Treg ląstelių CTLA4 ekspresija buvo panašiai pastebėta blužnyje ir CMS5a naviko audinyje (SI priedas, S1B pav.). CTLA4, išreikštas žmogaus Fr. II Treg ląstelių daugiausia buvo tarpląsteliniame skyriuje, o ląstelės paviršiaus CTLA-4 buvo ribotas (1F pav.). Nepaisant to, TIL, Treg ląstelėse ir mažesniu mastu Fr. Nustatyta, kad III ne Treg ląstelės išreiškia paviršiaus CTLA-4 labai dideliu lygiu (1G pav. ir SI priedas, S2 pav.). TIL CD8 plius TCM ir TEM ląstelės taip pat išreiškė didesnį paviršiaus CTLA-4 lygį, palyginti su bet kuria cirkuliuojančia T ląstelių frakcija, nors Treg ląstelės pasižymėjo daug didesne ekspresija melanoma sergantiems pacientams (1G pav. ir SI priedas, Fig. S2).

Apibendrinant, pagrindiniai žmogaus melanomos audinių ypatumai yra atitinkamai reikšmingas Treg ląstelių ir naivių Treg ląstelių padidėjimas ir sumažėjimas bei žymus efektoriaus / atminties CD8 plius T ląstelių padidėjimas su naivų CD8 ir T ląstelių sumažėjimu. Šios Treg ląstelės ir CD8 plius T ląstelės, esančios TIL, ekspresuoja CTLA-4 ląstelės paviršiuje, o pirmosios ekspresija yra didesnė nei antroji. Priešingai nei TIL eTreg ląstelės, melanoma sergančių pacientų cirkuliuojančios eTreg ląstelės yra žymiai mažesnės paviršiaus CTLA4 ekspresijos lygiu, o tai rodo, kad gydymas anti-CTLA-4 mAb gali būti mažiau paveiktas.

Treg ląstelių ir antigenui specifinių CD8 plius T ląstelių kiekio mažinimas in vitro gydant ląsteles ardančiomis anti-CTLA-4 mAb ir tuo pat metu vykstančiu antigeno stimuliavimu.

Siekdami išsiaiškinti, ar antinavikinis anti-CTLA-4 mAb poveikis priklausys nuo jo gebėjimo sunaikinti Treg ląsteles ADCC, modifikavome anti-CTLA-4 IgG1 mAb Fc dalį (klonas MDX{{3). }}, ipilimumabas), kuris pasižymėjo vidutiniu ADCC aktyvumu, kad pakeistų savo afinitetą Fc RIIIa (CD16a), aktyvinamojo Fc R, kurį išreiškia NK ląstelės, monocitai/makrofagai ir kitos ląstelės (22) (2A pav.). Tokiu būdu sukurtas anti-CTLA-4 mAb, pasižymintis dideliu ADCC aktyvumu, kurį pavadinome asimetrine reinžinerijos technologija-Fc domenu (ART-Fc), turėjo skirtingą aminorūgščių pakaitalą kiekvienoje sunkiojoje grandinėje (23); tai yra, L234Y/L235Q/G236W/S239M/H268D/D270E/S298A pakaitalai į vieną sunkiosios grandinės Fc sritį ir D270E/K326D/A330M/K334E pakaitalai į kitą. Rekonstruoto mAb jungimosi afinitetas žmogaus Fc RIIIa buvo 1,{24}}kartas didesnis nei nemodifikuoto mAb, nepadidinant afiniteto slopinančiam Fc RIIb. Taip pat sukūrėme anti-CTLA-4 mAb, beveik nesijungiantį su Fc Rs, kurį pavadinome tyliuoju Fc anti-CTLA-4, pakeisdami aminorūgštis; ty L235R, G236R ir S239K į abiejų sunkiųjų grandinių Fc sritį. Palyginti su nemodifikuotu arba tyliuoju Fc anti-CTLA-4 mAb, ART-Fc in vitro parodė daug didesnį citotoksiškumą CTLA-4 – ekspresuojančioms kininio žiurkėnų kiaušidžių (CHO) ląstelėms, kai buvo sveikų donorų PBMC. , su padidėjusiu citotoksiškumu ilgiau inkubuojant (2B pav.). Panašiai ART-Fc anti-CTLA-4 mAb veiksmingai sunaikino ką tik paruoštą Fr. II Trego ląstelės ir, kiek mažesniu mastu, kun. III ne Tregas arba kun. I naivus Treg ląsteles, o IgG1 (ipilimumabas) arba silent-Fc mAb beveik nepasižymėjo žudymu (2C pav.).

Tada įvertinome šių Fc sukurtų mAb poveikį specifiniam CD8 plius T ląstelių išsiplėtimui in vitro, stimuliuojant PBMC iš HLA-A*0201 – išreiškiančių sveikus donorus arba melanomos pacientus 9 dienas įvairiais peptidais, pavyzdžiui: gautas iš Melan-A/MART-1, savaiminio / naviko antigeno, kurį išreiškia normalūs melanocitai ir kai kurios melanomos ląstelės (24); ir NY-ESO-1, vėžio / sėklidžių antigenas, ekspresuojamas įvairių tipų vėžio ląstelių ir žmogaus lytinių ląstelių ląstelių (25), citomegaloviruso (CMV) arba gripo (gripo) viruso. Ši in vitro peptidų stimuliacija, pavyzdžiui, Melan-A peptidu, išlaikė aukštą CTLA4 ekspresiją Treg ląstelėse (2D pav. ir SI priedas, S3 pav.). Vien tik peptidų stimuliacija taip pat padidino peptidui specifinį tetramerą (Tet) ir CD8 plius T ląsteles, kurios išreiškė didesnį CTLA-4 kiekį, ypač ląstelės paviršiuje, palyginti su Tet- ląstelėmis (2 pav. E, F, ir aš). Kai ART-Fc anti-CTLA-4 mAb buvo nuo sveikų donorų ar melanoma sergančių pacientų PBMC stimuliacijos peptidais, CTLA-4 ekspresuojančių Treg ląstelių santykis tarp CD4 ir T ląstelių buvo žymiai sumažėjo priklausomai nuo dozės, o tylusis Fc mAb šio poveikio neparodė (2 pav. D ir G ir SI priedas, S4 ir S5 pav.).

Tačiau Treg ląstelių sumažėjimas nebuvo susijęs su antigenui specifinių CD8 plius T ląstelių išsiplėtimu; veikiau, gydymas smarkiai sumažino Tet ir CD8 plius T ląstelių santykį tarp CD8 ir T ląstelių (2H pav.). Šių in vitro stimuliacijų metu nemodifikuotas IgG1 arba tylusis Fc anti-CTLA-4 mAb neparodė reikšmingo eTreg ardančio aktyvumo (2I pav.). Šių mAb eTreg ląstelių mažinimo laipsnis iš tikrųjų buvo koreliuojamas su antigenui specifinių CD8 plius T ląstelių sumažėjimu, nepaisant stimuliuojančio antigeno, pavyzdžiui, Melan-A arba CMV peptido (2I pav.).

Taigi, nors Treg ląstelės iš esmės ekspresuoja CTLA-4, ypač tarpląstelinį CTLA-4, antigeno stimuliacija išplečia CD8 ir T ląsteles, kurios išreiškia didelį CTLA-4 kiekį, ypač ląstelės paviršiuje. Todėl ART-Fc anti-CTLA-4 mAb, pasižymintis dideliu ADCC aktyvumu, gali išeikvoti ne tik CTLA-4 plius Treg ląsteles, bet ir antigenu aktyvuotas CTLA-4 plius CD8 plius T ląsteles. . Šis efektoriaus CD8 ir T-ląstelių išeikvojimas gali kompensuoti imunitetą stiprinantį eTreg ląstelių išeikvojimo poveikį imuniniam atsakui in vitro.

2 pav. Vienu metu in vitro stimuliavimas peptidais su ART-Fc anti-CTLA-4 mAb riboja antigenui specifinį CD8 ir T ląstelių atsaką. (A) aminorūgščių pakeitimų, atliktų anti-žmogaus CTLA-4 IgG1 mAb (klonas MDX-010, ipilimumabas), Fc dalyje, kad būtų sukurti ART-Fc arba tylūs Fc mAb, santrauka ir jų giminingumas. į slopinamąjį Fc RIIb arba aktyvuojantį Fc RIIIa. Silent-Fc mAb afinitetas buvo mažesnis už BIACORE tyrimo aptikimo ribą. (B) Įvairių anti-CTLA4 mAb ADCC aktyvumas prieš žmogaus CTLA{13}} ekspresuojančias CHO ląsteles. Anti-CTLA-4 mAb (ART, ADCC sustiprintas anti-CTLA-4 ART-Fc; IgG1, įprastas nemodifikuotas anti-CTLA-4 IgG1; tylus, Fc regiono inaktyvuotas anti- CTLA-4 silent-Fc) buvo inkubuojami su CHO ląstelėmis ir HD PBMC (n=3), kai E/T santykis yra 50:1. Reiškia ± SEM. Žvaigždutės rodo reikšmingus skirtumus tarp kiekvieno antikūno ir tylaus Fc, esant atitinkamoms koncentracijoms {{30}}h (juoda) arba 24-h (raudona) kultūroms. (C) ADCC aktyvumas kiekvienai CD4 plius ir CD8 plius T ląstelių frakcijai iš PBMC naudojant ART-Fc, IgG1 arba tyliojo Fc anti-CTLA-4 mAb (n=4 arba 5). Nurodytas negyvų ląstelių dažnis tarp CTV iš anksto pažymėtų ląstelių po {{40}} val. kultūros. (D) CTLA-4 išraiška kun. II Treg ląstelės po 9 d. stimuliacijos Melan-A peptidu ir 1 ug/mL ART-Fc, silent-Fc arba IgG1 anti-CTLA-4 mAb viso PBMC (n {{50 }}). (E ir F) Paviršiaus CTLA{51}} išraiškos Tet plus ir Tet− CD8 plus T ląstelėse po nurodytų peptidų stimuliacijų. Reprezentacinės histogramos (E) ir vidutinio fluorescencijos intensyvumo (MFI) suvestinė (F) (Melan-A, n=9; CMV, n=9; Gripas, n=3; ESO{{ 57}}, n=4). (G ir H) Reprezentatyvūs kun. siužetai ir dažniai. II eTreg ląstelės (G) ir antigenui specifinės CD8 plius T ląstelės (H) iš HD (n=6) arba melanoma sergančių pacientų (n=5) po kultivavimo su nurodytu peptidu ir 1 ug/mL ART -Fc anti-CTLA-4 mAb kaip D. (I) Treg ląstelių (viršutinė) ir Tet plius CD8 plius T ląstelių (apatinė) dažnio kiekybinis įvertinimas po 9 d. Melan-A arba CMV antigeno stimuliacijos HD PBMC su nurodytomis anti-CTLA-4 mAb G ir H. Vidurkis ± SEM. Pavaizduotas reikšmingumas tarp dviejų grupių buvo apskaičiuotas naudojant suporuotą t testą, vienpusį ANOVA arba dvipusį ANOVA su post hoc Tukey HSD testu. *P mažesnis arba lygus 0,05, **P mažesnis arba lygus 0,01, ***P mažesnis arba lygus 0,001 ir ****P mažesnis arba lygus 0,0001.

Tvirtas antigenui specifinių CD8 ir T ląstelių išplėtimas dėl eTreg ląstelių išeikvojimo prieš antigeno stimuliavimą.

. Toliau bandėme išeikvoti CTLA{0}} plius Treg ląsteles prieš stimuliuodami antigenu, kad apsaugotume antigenu aktyvuotas CTLA-4 – ekspresuojančias CD8 ir T ląsteles nuo žudymo anti-CTLA-4 mAb. Mes auginome sveikų donorų ar melanoma sergančių pacientų ištisus PBMC su ART-Fc anti-CTLA-4 mAb 5 dienas be antigeno stimuliacijos, pašalinome mAb, tada 8 dienas stimuliavome ląsteles įvairiais peptidais ir analizavome, ar nėra Treg ląstelių ir Tet plius CD8 plius T ląstelių santykis tarp CD4 plius T ląstelių arba CD8 plius T ląstelių, atitinkamai (3A pav.). FOXP3hi Treg ląstelių santykis buvo žymiai sumažintas per 5 dienas po išankstinio apdorojimo ART-Fc (3A pav. ir SI priedas, S6 pav.) ir išliko žemas per vėlesnę stimuliaciją peptidais (3B pav.), o tai rodo, kad Treg ląstelės nebuvo visiškai atsigavusios per antigeno stimuliavimo laikotarpį. Šis išankstinis apdorojimas ART-Fc kartu su antigeno stimuliacija sukėlė tvirtą Melan-A specifinių CD8 plius T ląstelių iš sveikų donorų PBMC ir NY-ESO-1 specifinių CD8 plius T ląstelių iš PBMC išplitimą pacientams, kurių melanomos audiniai buvo išreikšti. NY-ESO-1 (3C pav.). ART-Fc sukeltas Treg išeikvojimas neturėjo didelės įtakos CMV specifinėms CD8 plius T ląstelėms. Priešingai nei ART-Fc, tylusis Fc anti-CTLA-4 mAb nepakeitė Treg ląstelių dažnio ir nesugebėjo išplėsti Tet ir CD8 plius T ląstelių, nepaisant antigeno rūšies (3D pav.).

Vienas iš įvairių Treg ląstelių naudojamų slopinimo mechanizmų yra nuo CTLA{0}} priklausomas CD80 ir CD86 ekspresijos reguliavimas dendritinėmis ląstelėmis (DC) (14, 15). Norėdami ištirti galimą šio mechanizmo indėlį į savaiminio / naviko antigenui specifinių CD8 plius T ląstelių išplitimą po gydymo ART-Fc anti-CTLA-4 mAb in vitro, įvertinome CD80 ir CD86 ekspresiją. DC, kurie fenotipiškai buvo apibrėžti kaip Lin-1- CD11c plius HLA-DR plus, sveikų donorų PBMC. Tiek CD80, tiek CD86 ekspresija parodė skirtingą reguliavimą iš anksto apdorotoje ART-Fc grupėje, priešingai nei nepakitusi CD80/CD86 ekspresija nemodifikuotame IgG1- iš anksto apdorotame tyliajame Fc. – iš anksto apdorota arba neapdorota grupė (3E pav.). Be to, mAb Fc R surišimo afinitetas turėjo gerą koreliaciją su jų Treg išeikvojimu, taip pat su Tet plius CD8 plius T ląsteles indukuojančiu aktyvumu (3F pav.). Kadangi vien silent-Fc blokada CTLA-4 nesureguliavo CD80/86, rezultatai parodė, kad Treg išeikvojimas ART-Fc suaktyvino DC, nors yra galimybė, kad pats ART-Fc gali papildomai prisideda prie DC aktyvavimo per didelį afinitetą prisijungiant prie jų aktyvuojančių Fc receptorių.

Apibendrinant, šie rezultatai rodo, kad ART-Fc anti-CTLA-4 mAb Treg išeikvojimas likus kelioms dienoms iki antigeno poveikio gali apsaugoti nuo antikūno CTLA-4 ir antigenu aktyvuotų CD8 plius T ląstelių nužudymo. išplečiant juos, bent iš dalies, pagerinant CD80/CD86 išraišką APC.

3 pav. Išankstinis Treg ląstelių išeikvojimas naudojant ART-Fc anti-CTLA-4 mAb sustiprina savaiminio / naviko antigenui specifinį CD8 ir T ląstelių atsaką. (A–D) Antigenui specifinės CD8 plius T ląstelės buvo sukeltos iš visų HD (n=7) arba pacientų (n=5) ​​PBMC po 5 d. išankstinio apdorojimo ART-Fc anti-CTLA{ {11}} mAb. (A) Eksperimento schema ir reprezentatyvus FOXP3 ir CD45RA dažymas CD4 plius T ląstelėse –5 dieną ir 0 eksperimento dieną. Santrauka kun. II eTreg dažniai dieną 0 (apačioje). (B ir C) Reprezentatyvus FOXP3 dažymas CD4 plius T ląstelėse (B) ir antigenui specifinės CD8 plius T ląstelės (C) su arba be išankstinio apdorojimo ART-Fc kiekvienam peptidui po kultūros. Treg ir antigenui specifinių CD8 plius T ląstelių dažnių santrauka po kultūros (apačioje). (D) Santrauka kun. II eTreg ir Tet plus CD8 plius T ląstelių dažniai su tyliuoju Fc anti-CTLA-4 mAb išankstiniu apdorojimu vietoj ART-Fc, kaip A–C. (E) CD80 ir CD86 ekspresijos lygiai naudojant Lin-1-CD11c plius HLA-DR ir DC po 5 d. stimuliacijos Melan-A, prieš tai apdorojant nurodytu anti-CTLA. -4 mAb (n=6). Skaičiai histogramose rodo PFI. (F) Treg ir Tet plius CD8 ir T ląstelių dažnių santrauka po išankstinio apdorojimo nurodytais anti-CTLA-4 mAb, po kurio buvo atlikta Melan-A26-35 stimuliacija, kaip nurodyta A-C. Reiškia ± SEM. Pavaizduotas reikšmingumas tarp dviejų grupių buvo apskaičiuotas naudojant suporuotą t testą. *P Mažesnis arba lygus 0,05.

CTLA-4 – tarpininkaujantis trego išeikvojimas prieš skiepijant naviko antigenu padidina pelių priešnavikinį atsaką.

Norėdami patvirtinti pelių rezultatus, gautus naudojant žmogaus PBMC ir anti-žmogaus CTLA{1}} mAb, sukūrėme mAb su dideliu arba mažu ADCC ir nuo antikūnų priklausomos ląstelinės fagocitozės (ADCP) aktyvumu iš antipelės CTLA{{4 }} IgG2a izotipo (toliau vadinamas mIgG2a) mAb (klonas UC10), pakeitus aminorūgštimis Fc domene (4A pav.). Abiejų sunkiųjų grandinių mutacija S239D padidino afinitetą pelės Fc RIV ~septyneriopai (mFa55 mIgG2a variantas), tuo tarpu L235R, G236R ir S239K mutacijos abiejose sunkiosiose grandinėse padarė jas neprisirišusias prie pelės Fc Rs (mFa3a1 mIgG); pirmoji buvo vadinama pelės ADCC/ADCP-enhanced-Fc (patobulinta), antroji pelės tylioji-Fc (mSilent) mAb. Norėdami palyginti šių Fc modifikuotų anti-pelės-CTLA-4 mAb priešnavikinį aktyvumą kartu su vakcinacija naviko antigenu, poodiniu būdu inokuliavome BALB/c pelių CMS5a fibrosarkomos ląsteles, ekspresuojančias žmogaus NY-ESO-1 antigeną, ir 9 dieną, kai auglys susiformavo, paskyrė peles po 100 ug kiekvieno mAb ir tą pačią dieną paskiepijo NY-ESO-1 peptidu (9 diena; toliau protokolą vadiname „gydymu kartu“). arba po 3 d. (12 diena; toliau „Ab pirminis gydymas“) (4B pav.). Išankstinis gydymas mEnhanced mAb sulėtino naviko augimą buvo veiksmingesnis nei gydymas kartu arba pirminis gydymas mIgG2a arba mSilent mAb; pastarųjų dviejų mAb poveikis naviko augimui buvo mažas ir reikšmingai nesiskyrė tarp pirminio gydymo ir gydymo kartu (4C pav.). Išgyvenamumas buvo žymiai geresnis pelių, kurios buvo iš anksto apdorotos mEnhanced mAb, taip pat pelių, kurioms kartu buvo skirtas gydymas arba išankstinis gydymas mIgG2a, nors nė vienas mIgG2a gydymo būdas nesukėlė daugumos pelių naviko regresijos (4 C ir D pav.).

4 pav. Išankstinis gydymas ADCC/ADCP sustiprintu anti-CTLA-4 mAb sukelia stiprų priešnavikinį poveikį pelėms. (A) aminorūgščių pakeitimų, atliktų anti-pelės CTLA-4 IgG2a mAb (klonas UC10; mIgG2a), Fc dalyje, kad būtų sukurta ADCC/ADCP patobulinta anti-pelės – CTLA{{, suvestinė. Parodytas 10}} (patobulintas) arba tylusis Fc anti-pelės–CTLA-4 (mSilent) mAb ir jų giminingumas su pelės Fc RIV. mAb afinitetas buvo mažesnis už BIACORE tyrimo aptikimo ribą. (B–D) Eksperimento schema (B). Pelės buvo užkrėstos 2 × 106 CMS5a fibrosarkoma, išreiškiančia žmogaus NY-ESO-1 {{40}} dieną ir negydomos arba gydomos mEnhanced, mIgG2a arba silent. anti-pelės – CTLA-4 mAb 9 dieną. Vakcinacija nuo NY-ESO-181-88 peptidų, sumaišytų su CFA, buvo atlikta tą pačią dieną (9 diena, gydymas kartu) arba 3 d vėliau (dieną). 12, Ab išankstinis apdorojimas). Kiekvienos pelės naviko augimas su paryškinta linija, nurodantis kiekvienos gydymo grupės vidurkį (C) (n=8–13 grupėje). Vidutinio naviko augimo kiekvienoje gydymo grupėje suvestinė (D, kairėje). Žvaigždutės žymi P reikšmes tarp mEnhanced mAb išankstinio apdorojimo grupės dvipusio ANOVA su Tukey daugkartinio palyginimo testu. Kiekvienos gydymo grupės išgyvenamumo rodiklio (D, dešinėje) suvestinė. P reikšmės tarp kiekvienos grupės išgyvenamumo ir kontrolinės vakcinos išgyvenimo buvo apskaičiuotos log-rank testu. Mirties įvykis atitinka auglio ilgį, didesnį nei 200 mm arba lygų, arba pelės mirtį. *P mažesnis arba lygus 0,05, **P mažesnis arba lygus 0,01, ***P mažesnis arba lygus 0,001 ir ****P mažesnis arba lygus 0,0001.

Patobulintas išankstinis mAb apdorojimas taip pat žymiai padidino naviką infiltruojančių CD8 plius T ląstelių skaičių ir CD8/Treg santykį TIL, nors FOXP3 plius ląstelių procentas tarp CD4 ir T ląstelių šiek tiek padidėjo (5 A pav. C). Be to, nors NY-ESO-1 peptidui specifinio CD8 ir TIL dažnis statistiškai nesiskyrė pelėms, kurios buvo gydomos kiekvienu mAb, arba tarp išankstinio gydymo ir gydymo kartu, antigenui specifiniai CD8 ir TIL iš sustiprinto mAb buvo iš anksto apdoroti. pelėms, lyginant su kitomis grupėmis, buvo žymiai aktyvesnė IL-2 ir IFN gamyba po in vitro pakartotinio stimuliavimo NY-ESO-1 peptidu (5 D ir E pav.). Be to, efektorinės atminties CD8 plius T ląstelės, apibrėžtos kaip CD44highCD62Llow populiacija, reikšmingai padidėjo tarp NY-ESO-1 specifinių CD8 ir TIL su sustiprintu mAb iš anksto apdorotų pelių (5 F ir G pav.).

Apibendrinant, pirminis gydymas mEnhanced mAb buvo veiksmingiausias sukeliant naviko imunitetą, po to sekė išankstinis gydymas mIgG2a, kuris turėjo tam tikrą ADCC aktyvumą, o mSilent mAb buvo daug mažiau veiksmingas. Rezultatai rodo, kad auglių turinčių pelių išankstinis gydymas ADCC/ADCP sustiprintu anti-CTLA-4 mAb ir po to vakcinacija naviko antigenu gali veiksmingai sukelti priešnavikinį imuninį atsaką in vivo.

Diskusija

Pagrindinės išvados šioje ataskaitoje yra šios: (i) galutinai diferencijuotų, labai slopinančių eTreg ląstelių gausu naviko audiniuose ir jos išreiškia paviršiaus CTLA-4 daugiau nei į naviką infiltruojančios CD8 plius T ląstelės; (ii) anti-CTLA-4 mAb, turintis didelį ADCC aktyvumą, gali išeikvoti/sumažinti CTLA-4didelio eTreg ląstelių ir CTLA-4 plius efektoriaus CD8 plius T ląsteles; ir (iii) ląsteles ardantis anti-CTLA-4 mAb gali sukelti ir sustiprinti veiksmingą naviko imunitetą, kai gydymo antikūnais režimas yra sukurtas taip, kad nepaveiktų CTLA-4 plius efektoriaus CD8 ir T ląstelių, pavyzdžiui, Treg ląstelių išeikvojimo ir vakcinacijos nuo vėžio antigeno laiko keitimas.

Anti-CTLA-4 mAb ADCC aktyvumas yra pagrindinis veiksnys, lemiantis eTreg mažinimo veiksmingumą ir dėl to į naviką reaguojančių CD8 plius T ląstelių išplitimą. Pagrįsdami mintį, parodėme, kad anti-CTLA-4 mAb (ART-Fc), pasižymintis padidintu ADCC aktyvumu (ir (arba) ADCP aktyvumu pelėms), gali padidinti priešnavikinį imuninį atsaką žmonėms in vitro ir in vivo peles, išeikvodamos CTLA{5}}-išreiškiančias Treg ląsteles. Anti-CTLA4 mAb (tylusis-Fc), modifikuoti taip, kad pasižymėtų daug mažesniu ADCC aktyvumu arba jo visai nebuvo, tokio priešnavikinio aktyvumo nepasižymėjo, net jei jie turėjo tą patį specifiškumą CTLA-4 molekulės epitopui. Žmonėms lieka neaišku, ar ipilimumabo su IgG1 Fc dalimi priešnavikinis poveikis yra susijęs su CTLA4 molekulės blokavimu ar CTLA{11}} ekspresuojančių ląstelių išeikvojimu ADCC. Su pelėmis buvo įrodyta, kad norint sustiprinti priešnavikinį imunitetą anti-CTLA-4 mAb, reikia išeikvoti naviką infiltruojančias Treg ląsteles dėl Fc R tarpininkaujamo ADCC (19–21, 26, 27). Panašiai buvo įrodyta, kad antikūnai prieš GITR, OX40 ir CD25 molekules, kuriose į naviką infiltruojančios Treg ląstelės išreiškia didžiausią kiekį, priklauso nuo ADCC sukelto Treg ląstelių išeikvojimo naviko atmetimo atveju (19, 26, 28). Taip pat buvo pranešta, kad melanoma sergančių pacientų gydymas ipilimumabu žymiai sumažino FOXP3 ir Treg ląstelių skaičių naviko audiniuose, ypač tiems, kuriems buvo klinikinis atsakas (29).

Be to, neseniai paskelbta ataskaita parodė, kad tarp melanoma sergančių pacientų, turinčių didelę naviko mutacijų naštą, tie, kurie genetiškai turi didelio afiniteto Fc RIIIa variantą su sustiprintu ADCC (V158 variantas, priešingai nei F158 mažo afiniteto variantas), pasižymėjo žymiai geriau. klinikinis atsakas į gydymą ipilimumabu ir geresnis bendras išgyvenamumas (27). Ši išvada patvirtina mintį, kad anti-CTLA-4 mAb, pasižymintis geresniu Treg išeikvojimu, gali būti veiksmingesnis už ipilimumabą vėžio imunoterapijoje. Taigi tikėtina, kad ART-Fc anti-CTLA4 mAb, turintis didelį afinitetą V158 variantui (KD=3,7 × 10–10 M, palyginti su 3,1 × 10–6 M ipilimumabui arba IgG1) , gali turėti geresnį klinikinį vėžio imunoterapijos veiksmingumą mažinant Treg ląsteles. Apibendrinant, šie atradimai žmonėms ir pelėms rodo, kad didelio ADCC/ADCP anti-CTLA-4 mAb gali būti veiksmingi skatinant ir stiprinant naviko imunitetą, nes išeikvoja Treg ląsteles.

5 pav. Ag specifinis CD8 ir T ląstelių atsakas, sukeltas pelėms, turinčioms auglių, iš anksto apdorojant ADCC/ADCP sustiprintu anti-CTLA-4 mAb. (A–G) 4 pav. TIL buvo analizuojami praėjus 19 dienų po naviko implantacijos (n=4–6 grupėje). Infiltruotų T ląstelių skaičius grame naviko (A). CD8/Treg ląstelių santykis (B). Foxp3 ir Treg ląstelių dažnis tarp CD4 ir T ląstelių (C). Reprezentatyvūs IL-2 plius IFN ir CD8 plius T ląstelių diagramos (D). Citokinų gamyba buvo matuojama iš naujo stimuliuojant TIL su ESO-181-88 peptidais in vitro 5 valandas. Tet ir CD8 plius T ląstelių auglyje ir IL{{20}} plius IFN ir CD8 plius T ląstelių D santrauka po restimuliacijos (E). Reprezentatyvūs CD44 ir CD62L ekspresijų grafikai (F) ir santrauka (G) pagal NY-ESO-1-Tet plius CD8 ir T ląstelės kiekvienos gydymo grupės navikuose. Duomenys buvo gauti iš trijų nepriklausomų eksperimentų. P reikšmės tarp naivių arba EM CD8 ir kiekvienos būklės T ląstelių pogrupių. Reiškia ± SEM. *P Mažiau arba lygu 0.05, † P Mažesnis arba lygus 0.05, **P Mažesnis arba lygus 0,01, ††P Mažiau arba lygus 0,01 ir ***P Mažiau arba lygus 0,001 pagal dvipusę ANOVA su Tukey daugkartinio palyginimo testu.

Medžiagos ir metodai

Donorų mėginiai.

Periferinio kraujo mėginiai buvo paimti iš sveikų asmenų arba pacientų, sergančių III–IV stadijos melanoma. PBMC buvo išskirti tankio gradientu naudojant Ficoll-Paque (GE Healthcare). TIL buvo gauti iš pašalintų melanomos audinių. Auglys buvo sumaltas, o vienos ląstelės suspensijos, gautos po švelnaus MACS disociacijos (Miltenyi), buvo paruoštos filtruojant per 40- μm ląstelių sietelį. Visi donorai prieš imant mėginius pagal Helsinkio deklaraciją pateikė raštišką informuotą sutikimą. Šį tyrimą patvirtino Osakos universiteto Institucinė peržiūros taryba.

CyTOF analizė.

TIL ir splenocitai iš pelių, turinčių auglį, buvo praturtinti CD3 plius ląstelėmis ir nudažyti 198-cisplatina, kad būtų galima atskirti negyvas ląsteles, ir antikūnų grupe, įskaitant šiuos metalu konjuguotus antikūnus: 172Yb-CD4 (RM4-5). ), 168Er-CD8 (53-6.7), 164Dy-CTLA-4 (UC-10), 158GdFOXP3 (FJK-16s). Žmogaus PBMC ir TIL ląstelių suspensijos buvo užkoduotos anti-CD45 antikūnais su įvairiais metalo konjugatais, kaip aprašyta anksčiau (35), prieš dažant 198- cisplatina, kad būtų galima atskirti negyvas ląsteles, o tada dažant antikūnus, naudojant kitą skydelį. Metalu konjuguoti antikūnai buvo gauti iš Fluidigm arba Maxpar Antibody Labeling rinkinys (Fluidigm) buvo naudojamas pagal gamintojo instrukcijas išgrynintiems antikūnams konjuguoti: 89Y-CD45 (klonas: HI30; Fluidigm), 115In-CD45 (HI30; Biolegend),- Skirtingiems mėginiams koduoti buvo naudojami CD45 (HI30; Biolegend) antikūnai; CLA-FITC (HECA-452; BD), CCR8-PE (L263G8; Biolegend), CXCR5-Biotinas (RF8B2; BD), eVolve 605 (114 Cd)-CD8a (RPA) -T8; eBioscience), 139La-CD123 (6H6; Biolegend), 141Pr-CCR6 (11A9; Fluidigm), 142Nd-CD14 (M5E2; Biolegend), 144Nd-FITC (CLA) (FIT22; CD14RPAN-T), 414RPN-4 ; Fluidigm), 148Sm-CD20 (2H7; Biolegend), 149Sm-CCR4 (205410; Fluidigm), 150Nd-SAV (CXCR5) (1D4-C5; Fluidigm), 151Eu-ICOS (C3) Fluidigm4 (C3); , 152Sm-CD69 (FN50; Biolegend), 153Eu-CD45RA (HI100; Fluidigm), 154Sm-CD3 (UCHT1; Fluidigm), 155Gd-CD197 (CCR7) (150503; R&D (R&D) sistemos,-1-56 ()-8 PE001; Fluidigm), 158Gd-CD27 (L128; Fluidigm), 159TbCD19 (HIB19; Biolegend), 160Gd-CD39 (A1; Fluidigm), 163Dy-CXCR3 (G025H7; Fluidigm (G025H7; Fluidigm (G025H7); Fluidigm (G025H7; Fluidigm) (-25) CD45RO (UCHL1; Fluidigm), 166Er-CD279 (PD-1) (EH12.2H7; Biolegend), 167Er-PDL1 (29E.2A3; Biolegend), 169Tm-CD25 (IL-2R) ( 2A3; Fluidigm), 171Yb-CD11c (3.9; Biolegend), 172YbCD38 (HIT2; Fluidigm), 173Yb-TIGIT (MBSA43; eBioscience), 174Yb-HLA-DR (L243; Fluidigm), 176Yb-CD127 (IL-7R) (A019D5; Fluidigm), 209Bi-CD11b (ICRF44; Fluidigm), 146Nd-Helios (22F6; Biolegend), 161Dy–CTLA} ({143}) Fluidigm), 162Dy-FOXP3 (236A/E7; eBioscience) ir 168Er-Ki-67 (Ki-67; Fluidigm).

Žmogaus ir pelės ląstelės prieš tarpląstelinį dažymą buvo fiksuotos naudojant eBioscience Foxp3 / transkripcijos faktoriaus dažymo buferius (ThermoFisher). Tada nudažytos ląstelės buvo resuspenduojamos 2 procentų PFA su 191/193-iridžio DNR interkalatoriumi (Fluidigm) per naktį, tada plaunamos ir resuspenduojamos Maxpar vandenyje (Fluidigm) ir EQ keturių elementų granulėse (Fluidigm) prieš pat analizę su Helios CyTOF. sistema (Fluidigm). Normalizuoti duomenys buvo analizuojami naudojant Cytobank Premium.

Antigenui specifinių CD8 ir T ląstelių stimuliavimas.

Ištisi sveikų asmenų ir melanoma sergančių pacientų PBMC buvo stimuliuojami 10 μM trumpų peptidų, būdingų HLA-A*0201 (Operon Biotechnology) 8–9 dienas: Melan-A26–35 (EAAGIGILTV), CMV495–503 (NLVPMVATV), Flu58. –66 (GILGFVFTL) arba NY-ESO1157–165 (SLLMWITQC) (12, 22). Norint nustatyti anti-CTLA-4 mAb su įvairiais ADCC poveikį, tą pačią dieną arba likus 5 dienoms iki antigeno stimuliacijos į kultūrą buvo pridėtas vienas iš šių mAb 1 ug/ml (jei nenurodyta kitaip): ADCC - sustiprintas anti-žmogaus–CTLA-4 IgG1 (MDX-010-ART-Fc), įprastas nemodifikuotas anti-CTLA-4 IgG1 (MDX-010-IgG1) arba tylusis Fc anti-CTLA-4 IgG1 antikūnai (MDX-010-silent-Fc): visus mAb maloniai pateikė Chugai Pharmaceutical. Pusė terpės buvo pakeista šviežia terpe, kurioje yra 10 V/mL IL-2 ir 40 ng/mL IL-7 kas 3 d.

Laktato dehidrogenazės išsiskyrimo tyrimas su žmogaus CTLA-4 – ekspresuojančiomis CHO ląstelėmis.

Buvo atliktas laktato dehidrogenazės (LDH) atpalaidavimo tyrimas, siekiant nustatyti ADCC aktyvumą PBMC. CHO DG44-hCTLA4 ląstelės (iš Chugai Pharmaceutical) buvo pasėtos į 96-šulinėlių apvaliadugnes plokšteles (1 × 104 ląstelės šulinėlyje) ir 15 minučių inkubuojamos su įvairių koncentracijų mAb. Po to į kultūrą buvo dedami iš sveikų donorų gauti PBMC, kurių efektoriaus ir tikslinio (E∕T) santykis buvo 50:1. Ląstelės buvo inkubuojamos 37 laipsnių temperatūroje, 5 procentų CO2 6 arba 24 valandas, iš kiekvieno šulinio buvo surinkta 100 μl supernatanto ir 492 nm bei 630 nm absorbcija buvo išmatuota naudojant Cytation 5 Cell Imaging Multi-Mode Reader (BioTek Instruments). LDH išsiskyrimas buvo didžiausias po ląstelių inkubacijos 1 procento Nonidet P-40 tirpale. Citotoksiškumas (procentais) buvo nustatytas pagal formulę; (AC)∕(BC) × 100, kur A, B ir C atitinkamai reiškia kiekvieno eksperimento LDH išsiskyrimą, didžiausią LDH išsiskyrimą ir foninį LDH išsiskyrimą. Visi eksperimentai buvo atlikti dviem egzemplioriais.

ADCC tyrimas su šviežiai izoliuotu žmogaus PBMC.

Sveikų donorų PBMC buvo surūšiuoti pagal FACS kiekvienai T frakcijai, o Treg ląstelės buvo iš anksto pažymėtos CellTrace Violet (CTV; ThermoFisher) ir kultivuojamos su ne T ląstelėmis, kaip efektorinėmis ląstelėmis, 1:50 tikslinio ir efektoriaus santykiu. Tada į 10 procentų žmogaus AB serumo, kuriame yra RPMI1640 terpės su 5 TV/mL IL{10}}, buvo pridėta 1 ug/mL nurodyto anti-CTLA-4 mAb. Po 24-h kultivavimo 37 laipsnių temperatūroje negyvų ląstelių dažnis, nurodytas LIVE/DEAD fiksuojamu dažymu (ThermoFisher), tarp CTV plius ląstelių buvo įvertintas FACS.

Pelių navikų eksperimentai.

Šešių–{1}}sav. BALB/c pelės buvo įsigytos iš CLEA Japan ir laikomos konkrečiomis sąlygomis, kuriose nėra patogenų. Pelės buvo po oda užkrėstos 2 × 106 CMS5a-NY-ESO-1. Praėjus devynioms dienoms po naviko implantacijos, pelėms į veną buvo įšvirkšta 100 ug anti-pelės-CTLA4 mAb (UC-10 klonas; mIgG2a, mEnhanced arba mSilent, iš Chugai Pharmaceutical). Sustiprintas variantas (mFa55 mIgG2a variantas) buvo sukurtas naudojant S239D mutaciją CH2 domene ir parodė pagerėjusį jungimosi afinitetą su pelės Fc RIV maždaug septynis kartus, palyginti su laukinio tipo mIgG2a. Pelės buvo vakcinuotos 100 µg ESO-181–88 peptidų (Operon Biotechnology), sumaišyto su 200 µl CFA/PBS (santykiu 1:1), arba tą pačią dieną (9 diena, gydymas kartu) arba 3 d vėliau (12 diena, pirminis gydymas Ab) po oda. Naviko dydis buvo matuojamas kas 3–4 dienas. Eksperimentus patvirtino Institucinė peržiūros taryba ir jie buvo atlikti laikantis Osakos universiteto taisyklių.

Srauto citometrija.

Kaip aprašyta anksčiau (12, 23), in vitro sukurtos antigenui specifinės CD8 plius T ląstelės buvo nudažytos PE pažymėtu Melan-A, CMV arba Flu tetrameru (TC Matrix) arba PE pažymėtu NY-ESO-1 tetrameras (MBL) 10 minučių 37 laipsnių temperatūroje, o po to nudažytas įvairiais paviršiaus mAb. Šiame tyrime paviršiaus CTLA-4 dažymui buvo naudojamas biotinilintas anti-žmogaus CD152 antikūnas (klonas BNI3; BD Biosciences) 4 laipsnių temperatūroje 15 min. kartu su kitais antikūnais prieš paviršiaus molekules. Po plovimo taip pat 15 min. pridėjome APC-streptavidino (Biolegend) 4 laipsnių temperatūroje, kad išvengtume CTLA-4 molekulių, kurios išorėtos į paviršių po ilgesnio dažymo 37 laipsnių temperatūroje, dažymosi. Šios dažymo procedūros buvo atliktos prieš fiksavimą ir pralaidumą, kaip aprašyta ankstesniame tyrime (24).

Intracelulinis FOXP3 dažymas buvo atliktas naudojant FOXP3 transkripcijos faktoriaus dažymo buferio rinkinį (eBioscience). Žmogaus ląstelėms dažyti buvo naudojami šie antikūnai su nurodytomis fluorescencinėmis žymėmis: PerCP/Cy5.5-CCR7 (150503; BD Biosciences), FITC-CD45RA (HI100; BD Biosciences), biotinas – CTLA-4 (BNI3). ; BD Biosciences), APC-Streptavidin (BioLegend), V500-CD8 (RPA-T8; BD Biosciences), BrilliantViolet711-CD3 (OKT3; Biolegned), AlexaFluor700-CD4 (RPA) -T4; eBioscience), FITC-Lineage mišinys (BD Biosciences), PerCP/Cy5.{25}}CD11c (3.9; BioLegend), APC-HLA-DR (LN3; eBioscience), PE-CD86 (IT2.2; eBioscience), AlexaFluor700-CD80 (L307.4; BD Biosciences), PE-FOXP3 (236A/E7; eBioscience) ir fiksuojamų gyvybingumo dažų eFluor780 (eBioscience). Pelės ląstelėms dažyti buvo naudojami šie antikūnai: V500-CD8 (53-6.7; BD Biosciences), PE-Cy7-CD3e (145-2C11; eBioscience), eFluor 450-CD4 (RM4-5; eBioscience), APC-CD25 (PC61.5; eBioscience), PE-FOXP3 (FJK-16s; eBioscience), FITC–IFN- (XMG1. 2; BD Biosciences), AlexaFluor647-IL-2 (JES6-5H4; eBiosciences) ir fiksuojamų gyvybingumo dažų eFluor780 (eBioscience). Antigenui specifinės pelių TIL CD8 plius T ląstelės buvo nudažytos PE pažymėtais H-2Dd-ribotais ESO-181-88 tetramerais (TC Matrix), kaip aprašyta aukščiau. Norint išmatuoti citokinų gamybą iš CD8 plius T ląstelių, pelių TIL buvo pakartotinai stimuliuojami 5 valandas 37 laipsnių temperatūroje, esant 10 μM tų pačių ESO-181-88 peptidų, kurie buvo naudojami vakcinacijai naudojant GolgiPlug (BD Bioscience). Fiksavimas ir pralaidumas buvo atlikti naudojant Cytofix / Cytoperm buferių rinkinį (BD Bioscience). Ląstelės buvo paimtos naudojant LSR Fortessa (BD Bioscience) ir analizuojamos naudojant FlowJo v9.9.5 programinę įrangą.

Statistinė analizė

Dviejų grupių reikšmingumui įvertinti buvo naudojamas dvipusis suporuotas t testas. Kelių grupių palyginimui buvo naudojamas vienpusis arba dvipusis ANOVA su post hoc Tukey sąžiningo reikšmingo skirtumo (HSD) testu. Visos statistinės analizės buvo atliktos naudojant Prism v6 programinę įrangą (GraphPad). P reikšmės < 0,05 buvo laikomos reikšmingomis.

PADĖKA.

Dėkojame Osakos universiteto Medicinos mokyklos Dermatologijos skyriaus nariams už pacientų mėginių rinkimą; ir K. Teshima, T. Shimizu ir N. Mizoguchi už techninę pagalbą. Sukurtus antikūnus prieš žmones ir pelę CTLA-4 sukūrė ir pateikė Chugai Pharmaceutical Co., Ltd. Šį tyrimą palaikė Grant-in-Aid for Specially Promoted Research 16H06295 (SS), Grants-in-Aid Moksliniams tyrimams (A) 26253030 (SS) ir (B) 26290054 (HN), Grantin-Aid už iššūkius žvalgomiesiems tyrimams 26670581 (HN) ir Grant-inAid jauniesiems mokslininkams (B) 26860331 ir 717 (to). A. Tanaka) iš Japonijos švietimo, kultūros, sporto, mokslo ir technologijų ministerijos; ir Japonijos mokslo ir technologijų agentūros (SS) pagrindiniai evoliucinio mokslo ir technologijų tyrimai. Šis tyrimas iš dalies buvo atliktas kaip Japonijos Inovatyvių vėžio terapijos tyrimų plėtros (P-DIRECT) ir praktinių naujoviškų vėžio kontrolės tyrimų bei Vėžio tyrimų ir terapinės evoliucijos projekto (P-CREATE) mokslinių tyrimų programa. Medicinos tyrimų ir plėtros agentūra.

1. Sakaguchi S (2004) Natūraliai atsirandančios CD4 plius reguliavimo T ląstelės imunologiniam savęs tolerancijai ir neigiamai imuninių atsakų kontrolei. Annu Rev Immunol 22:531–562.

2. Zou W (2006) Reguliuojančios T ląstelės, naviko imunitetas ir imunoterapija. Nat Rev Immunol 6:295–307.

3. Tanaka A, Sakaguchi S (2017) Reguliuojančios T ląstelės vėžio imunoterapijoje. Cell Res 27: 109-118.

4. Quezada SA, Peggs KS, Curran MA, Allison JP (2006) CTLA4 blokada ir GM-CSF kombinuota imunoterapija pakeičia efektorinių ir reguliuojančių T ląstelių auglio pusiausvyrą. J Clin Invest 116:1935–1945.

5. Shimizu J, Yamazaki S, Sakaguchi S (1999) Naviko imuniteto sukėlimas pašalinant CD25 plius CD4 plius T ląsteles: bendras naviko imuniteto ir autoimuniteto pagrindas. J Immunol 163:5211-5218.

6. Wolf AM ir kt. (2003) reguliuojančių T ląstelių padidėjimas vėžiu sergančių pacientų periferiniame kraujyje. Clin Cancer Res 9:606–612.

7. Curiel TJ ir kt. (2004) Specifinis reguliuojančių T ląstelių įdarbinimas sergant kiaušidžių karcinoma skatina imuninę privilegiją ir prognozuoja sumažėjusį išgyvenamumą. Nat Med 10:942–949.

8. Petersen RP ir kt. (2006) Į naviką infiltruojančios Foxp3 ir reguliuojančios T-ląstelės yra susijusios su pasikartojimu I stadijos NSCLC pacientams. Vėžys 107:2866–2872.

9. Shang B, Liu Y, Jiang SJ, Liu Y (2015) Prognostinė naviką infiltruojančių FoxP3 ir reguliuojamųjų T ląstelių reikšmė vėžiui: sisteminė apžvalga ir metaanalizės. Sci Rep 5:15179.

10. Miyara M ir kt. (2009) Žmogaus CD4 ir T ląstelių, išreiškiančių FoxP3 transkripcijos faktorių, funkcinis atskyrimas ir diferenciacijos dinamika. Imunitetas 30:899–911.

11. Sparnas JB ir kt. (2017) Atskira CD25-T folikulų reguliavimo ląstelių pogrupis lokalizuojasi gemalo centruose. Proc Natl Acad Sci USA 114:E6400–E6409.

12. Saito T ir kt. (2016) Dvi FOXP3 (plus) CD4 (plius) T ląstelių subpopuliacijos aiškiai kontroliuoja gaubtinės ir tiesiosios žarnos vėžio prognozę. Nat Med 22:679–684.

13. Sugiyama D ir kt. (2013) Anti-CCR4 mAb selektyviai išeikvoja efektoriaus tipo FoxP3 ir CD4 bei reguliuojančias T ląsteles, sukeldamas priešnavikinį imuninį atsaką žmonėms. Proc Natl Acad Sci USA 110:17945–17950.

14. Shevach EM (2009) Foxp3 plius T reguliavimo ląstelių slopinimo mechanizmai. Imunitetas 30:636–645.

15. Wing K ir kt. (2008) CTLA-4 kontroliuoja Foxp3 ir reguliuojančių T ląstelių funkciją. Mokslas 322:271–275.

16. Qureshi OS ir kt. (2011) CD80 ir CD transendocitozė86: CTLA-4 išorinės ląstelės funkcijos molekulinis pagrindas. Mokslas 332: 600–603.

17. Hodi FS ir kt. (2010) Geresnis išgyvenamumas vartojant ipilimumabą pacientams, sergantiems metastazavusia melanoma. N Engl J Med 363:711–723.

18. Robert C ir kt. (2011) Ipilimumabas ir dakarbazinas anksčiau negydytai metastazavusiai melanomai. N Engl J Med 364:2517–2526.

19. Bulliard Y ir kt. (2013) Aktyvuojantys Fc receptoriai prisideda prie imunoreguliacinių receptorių antikūnų priešnavikinės veiklos. J Exp Med 210:1685–1693.

20. Simpson TR ir kt. (2013). J Exp Med 210:1695–1710.

21. Selby MJ ir kt. (2013) IgG2a izotipo anti-CTLA-4 antikūnai sustiprina priešnavikinį aktyvumą sumažindami intratumorinių reguliuojančių T ląstelių skaičių. Cancer Immunol Res 1: 32–42.

22. Nimmerjahn F, Ravetch JV (2008) Fcgamma receptoriai kaip imuninio atsako reguliatoriai. Nat Rev Immunol 8:34–47.

23. Mimoto F ir kt. (2013) Naujas asimetriškai sukurtas antikūno Fc variantas, pasižymintis geresniu Fc R surišimo afinitetu ir specifiškumu, palyginti su fukozilintu Fc variantu. MAbs 5:229-236.

24. Maeda Y ir kt. (2014) Savaime reaguojančių CD8 ir T ląstelių, turinčių anerginį fenotipą, aptikimas sveikiems asmenims. Mokslas 346:1536–1540.

25. Gnjatic S ir kt. (2006) NY-ESO-1: Imunogeninio naviko antigeno apžvalga. Adv Cancer Res 95:1–30.

26. Arce Vargas F ir kt.; Melanomos TRACERx konsorciumas; Inkstų TRACERx konsorciumas; Plaučių TRACERx konsorciumas (2017) Fc optimizuotas anti-CD25 išeikvoja naviką infiltruojančias reguliuojančias T ląsteles ir sinergizuoja su PD-1 blokada, kad išnaikintų susidariusius navikus. Imunitetas 46:577–586.

27. Arce Vargas F ir kt.; TRACERx melanoma; TRACERx Renal; TRACERx Lung consortia (2018) Fc efektoriaus funkcija prisideda prie žmogaus anti-CTLA-4 antikūnų aktyvumo. Vėžio ląstelė 33:649–663.e4.

28. Bulliard Y ir kt. (2014 m.) OX40 įsitraukimas išeikvoja intratumorinius tregus aktyvindamas Fc Rs, o tai lemia priešnavikinį veiksmingumą. Immunol Cell Biol. 92:475-480.

29. Romano E ir kt. (2015) Nuo ipilimumabo priklausomas ląstelių sukeltas reguliuojančių T ląstelių citotoksiškumas ex vivo neklasikiniais monocitais melanoma sergantiems pacientams. Proc Natl Acad Sci USA 112:6140–6145.

30. Walker LSK, Sansom DM (2011) Kylantis CTLA4, kaip išorinio T ląstelių atsako reguliatoriaus, vaidmuo. Nat Rev Immunol 11:852–863.

31. Linsley PS ir kt. (1996) CTLA-4 prekyba ląstelėje ir židinio lokalizavimas TCR įtraukimo vietose. Imunitetas 4:535–543.

32. Egen JG, Allison JP (2002) Citotoksinio T limfocitų antigeno-4 kaupimasis imunologinėje sinapsėje yra reguliuojamas TCR signalo stiprumo. Imunitetas 16:23–35.

33. Ko K ir kt. (2005) Pažengusių navikų gydymas agonistiniu anti-GITR mAb ir jo poveikis naviką infiltruojančioms Foxp3 plius CD25 ir CD4 bei reguliuojančioms T ląstelėms. J Exp Med 202: 885–891.

34. Prieto PA ir kt. (2012) CTLA-4 blokada naudojant ipilimumabą: ilgalaikis 177 pacientų, sergančių metastazavusia melanoma, stebėjimas. Clin Cancer Res 18:2039–2047.

35. Mei HE, Leipold MD, Schulz AR, Chester C, Maecker HT (2015) Gyvų žmogaus periferinio kraujo mononuklearinių ląstelių brūkšninis kodavimas multipleksinei masės citometrijai. J Immunol 194:2022–2031.

Danbee Haa,b, Atsushi Tanakaa, Tatsuya Kibayashia,c, Atsushi Tanemurad, Daisuke Sugiyamaa,1, James Badger Winga, Ee Lyn Lima, Karen Wei Weng Tenge, Dennis Adeegbea, 2, Evan W. Newelle, Ichiro Hirawa Katayaos,hi 1,3 ir Shimon Sakaguchia, b,4.

Experimental Imunology, Imunology Frontier Research Center, Osaka University, 565-0871 Osaka, Japonija; b Eksperimentinės imunologijos laboratorija, Regeneracijos mokslo ir inžinerijos katedra, Pasienio gyvybės ir medicinos mokslų institutas, Kioto universitetas, 606-8507 Kiotas, Japonija; c Tyrimų skyrius, Chugai Pharmaceutical Co., Ltd., 247-8530 Kanagawa, Japonija; d Osakos universiteto medicinos mokyklos Dermatologijos skyrius, 565-0871 Osaka, Japonija; ir e. Mokslo, technologijų ir tyrimų agentūra, Singapūro imunologijos tinklas, 138632 Singapūras.

Prisidėjo Shimon Sakaguchi, 2018 m. lapkričio 23 d. (išsiųsta peržiūrėti 2018 m. liepos 19 d.; peržiūrėjo Miyuki Azuma ir Sergio A. Quezada).

For more information:1950477648nn@gmail.com