Nuo DNR priklausomas baltymų kinazės katalizinis subvienetas (DNR-PKcs) skatina lėtinės inkstų ligos progresavimą pelių patinams

Inkstų pažeidimasinicijuoja epitelio dediferenciaciją ir miofibroblasto aktyvinimas perlėtinės inkstų ligos progresavimas. Čia mesfiir kad DNR-PKcs ekspresija yra reikšmingafismarkiai padidėjoabiejų lėtinių inkstų ligų inkstų audiniaipacientų ir pelių patinaisukeltas vienpusio šlapimtakio obstrukcijosirvienpusis išemijos-reperfuzijos pažeidimas. In vivo, DNR-PKcs išmušimas arba gydymas jo specifikacijomisfic inhibitorius NU7441 trukdolėtinės inkstų ligos vystymasispelių patinuose. In vitro DNR-PKcs defiišsaugo epitelio ląstelių fenotipą ir slopinafibroblastų aktyvacija, sukelta transformuojant augimo faktorių-beta 1. Be to, mūsų rezultatai rodo, kad TAF7, kaip galimas DNR-PKcs substratas, sustiprina mTORC1 aktyvaciją, padidindamas RAPTOR ekspresijos reguliavimą, o tai vėliau skatina medžiagų apykaitos perprogramavimą pažeistose epitelio ląstelėse ir mio.fibroblastai. Apskritai, DNR-PKcs gali būti slopinamas, kad būtų ištaisytas metabolinis perprogramavimas per TAF7 / mTORC1 signalizacijąlėtinė inkstų ligair yra galimas gydymo taikinyslėtinė inkstų liga. 

SPUSTELĖKITE ČIA, norėdami sužinoti daugiau apie augalinę CIRANČIO FORMĄ.LĖTINĖ INKSTŲ LIGA

Lėtinė inkstų liga(CKD) serga 10 % suaugusiųjų visame pasaulyje1. CKD kelia didžiulę naštą pasaulinei visuomenės sveikatai, nes yra didelė tikimybė, kad ji progresuosgalutinės stadijos inkstų liga(ESRD), kuriai reikalinga dializė arba inkstų transplantacija1,2. Inkstų intersticinė fibrozė yra viena iš pagrindinių patologinių CKD2–4 požymių. Daugelis patofiziologinių inkstų fibrozės požymių būdingi ir kitoms fibrozinėms ligoms, tokioms kaip kepenų cirozė ir kardiomiopatijos5. Nėra veiksmingų CKD gydymo būdų, todėl reikia skubiai geriau suprasti patologinius mechanizmus.pagrindinė ŠKL.

Pažeistuose inkstuose intersticinė fibrozė apima nenormalią profibrozinių faktorių, tokių kaip transformuojantis augimo faktorius-beta 1 (TGF- 1), epitelio diferenciacija ir miofibroblastų aktyvacija2, ekspresiją. Kaip pagrindinis intersticinės fibrozės tarpininkas, TGF- 1 ne tik aktyvina fibrotinių genų, įskaitant lygiųjų raumenų aktiną (-SMA), fibronektiną (FN) ir kolagenus, ekspresiją, bet ir skatina Warburgo efektą panašų metabolinį perprogramavimą inkstų ląstelės6,7. Pastaruoju metu atsirandantys įrodymai parodė ryšį tarp metabolinio disreguliacijos ir intersticinės fibrozės, atskleidžiant, kad inkstų ląstelėse (inkstų kanalėlių epitelio ląstelėse8, 9 ir miofibroblastuose10) metabolinis perprogramavimas vyksta inkstų pažeidimo metu ir prisideda prie CKD vystymosi. Metabolinis perprogramavimas inkstų ląstelėse sukelia drastišką riebalų rūgščių oksidacijos (FAO) sumažėjimą ir metabolinį poslinkį į glikolizę, prisidedant prie imuninių ląstelių infiltracijos ir intersticinės fibrozės7, 11, 12. Be to, klinikiniai duomenys atskleidė, kad LIL sergantiems pacientams metabolizmas ir uždegimo keliai yra nereguliuojami7. FAO atkūrimas arba glikolizės slopinimas genetiniais ar farmakologiniais metodais susilpnina fibrozę įvairiuose inkstų fibrozės modeliuose 11, 13–15.

Metabolinio perprogramavimo molekuliniuose mechanizmuose žinduolių taikinys rapamicinas (mTOR), kuris yra citoplazminė serino / treonino baltymų kinazė, moduliuoja ląstelių metabolizmą ir palaiko metabolinę homeostazę 16, 17. Du skirtingi funkciniai mTOR kompleksai buvo apibrėžti pagal jo surišančius baltymus. MTOR kompleksas 1 (mTORC1) sąveikauja su specifiniu reguliatoriumi RAP TOR ir yra jautrus rapamicinui18,19. mTOR kompleksą 2 (mTORC2) reguliuoja RICTOR20. Lėtinis mTORC1 aktyvinimas skatina medžiagų apykaitos perprogramavimą esant įvairioms patologinėms sąlygoms, įskaitant inkstų intersticinę fibrozę 9, 21–23, tačiau mechanizmai, reguliuojantys šį aktyvavimą, ypač esant intersticinei fibrozei, iš esmės nežinomi.

Nuo DNR priklausoma baltymų kinazė (DNR-PK), trimerinis kompleksas, sudarytas iš katalizinio subvieneto (DNR-PKcs) ir Ku70/80 heterodimero, aktyvuojamas DNR dvigrandėmis pertraukomis (DSB) 24, 25 arba ROS26. Gerai žinoma DNR-PK funkcija yra tarpininkavimas nehomologiniam galo sujungimui (NHEJ), kuris sujungia užprogramuotas DSB, sukurtas V (D) J rekombinacijos metu, ir vaidina pagrindinį vaidmenį limfocitų rekombinacijoje25. Dėl to DNR-PKcs mutacijos sustabdo T ir B limfocitų vystymąsi dėl V (D) J rekombinacijos trūkumo27, ​​28. Tačiau augimo sulėtėjimas ar didelis T ląstelių limfomos vystymosi dažnis nepasirodė DNR-PKcs išmuštoms pelėms28. Nors tai yra DNR DSB jutiklis, DNR-PKcs pasižymi kai kuriomis neįprastomis savybėmis, pavyzdžiui, kaupiasi ląstelėse iki lygio, gerokai viršijančio tą, kurio greičiausiai reikia NHEJ29. Be to, DNR-PKcs yra tiek branduolyje, tiek citoplazmoje30. Atsižvelgiant į jo neįprastas savybes, naujausi įrodymai rodo, kad DNR-PKcs turi papildomų funkcijų, išskyrus NHEJ31. Pavyzdžiui, DNR-PKcs tarpininkaujantis transkripcijos faktoriaus USF-1 fosforilinimas skatina insulino sukeltą riebalų rūgščių sintezę32, o DNR-PKcs skatina medžiagų apykaitos nuosmukį senėjimo metu33. Ne NHEJ DNR PKcs funkcijų, tokių kaip medžiagų apykaita ir senėjimas, tyrimai ką tik prasidėjo, ir daugelis klausimų liko neatsakyti31. Be to, buvo nustatyta, kad DNR-PK, kaip viena iš fosfoinozitido 3-kinazių (PI3K) susijusių kinazių, reguliuoja mTOR aktyvaciją34.

Šiame darbe mūsų rezultatai rodo, kad DNR-PKcs tarpininkauja aktyvinant RAPTOR / mTORC1 signalizaciją fosforilinant TATA dėžutę surišančio baltymo faktorių 7 (TAF7) sergant CKD. DNR-PKcs slopinimas koreguoja metabolinį perprogramavimą pažeistose epitelio ląstelėse ir miofibroblastuose sergant CKD. DNR-PKcs gali būti naujas galimas taikinys gydant CKD.

Rezultatai

DNR-PKcs yra padidėjęs LIL sergančių pacientų ir pelių, sergančių inkstų fibroze, inkstuose

DNR-PKcs aktyvumas buvo analizuojamas imunohistocheminiu būdu nudažant S2056 autofosforilinimą DNR-PKcs (p-DNR-PKcs) sveikuose ir CKD žmogaus inkstų audiniuose. Nefrektomijos mėginių nenavikinės dalys buvo naudojamos kaip „sveiki“ inkstų audiniai, kurie buvo paimti iš pacientų, sergančių inkstų ląstelių karcinoma. Rezultatai parodė, kad p-DNR-PKcs buvo beveik neaptinkamas šiuose normaliuose inkstų audiniuose, tačiau p-DNR-PKcs baltymų kiekis buvo žymiai padidėjęs CKD žmogaus inkstų audiniuose (1a pav.). Siekiant nustatyti DNR-PKcs aktyvumo ir inkstų fibrozės svarbą in vivo, fibronektino (FN), esminio geno, susijusio su inkstų fibroze, ekspresija buvo ištirta imunohistocheminiu dažymu, o taip pat buvo atliktas dažymas Sirius raudonu, siekiant išanalizuoti intersticinės fibrozės laipsnį. sergančių LIL (1a pav.). Mūsų rezultatai atskleidė teigiamą ryšį tarp p-DNR-PKcs baltymų kiekio ir intersticinės fibrozės laipsnio (P=0.005, 1b, c pav.). Be to, DNR-PKcs ekspresijos lygiai taip pat buvo analizuojami naudojant anksčiau paskelbtus žmogaus CKD mikrogardelių duomenų rinkinius (Nephroseq). Mes nustatėme, kad DNR-PKcs mRNR lygis reikšmingai padidėjo daugiau nei 1{20}}kartu 48 LIL sergančių pacientų inkstų biopsijos audiniuose, palyginti su kontroliniais pacientais (papildomas 1a pav.), o tai rodo reikšmingą teigiamą koreliaciją su LIL laipsniu. pacientų inkstų fibrozė (papildomas 1b pav.). Be to, imunofluorescencinio p-DNR-PKcs dažymo su Lotus tetragonolobus lektinu (LTL) (inkstų kanalėlių žymekliu) arba -SMA (miofibroblastų žymekliu) rezultatai parodė, kad DNR-PKcs buvo sureguliuotas tiek kanalėlių epitelio ląstelėse, tiek kanalėlių epitelio ląstelėse. LIL sergančių pacientų inkstų audinių miofibroblastai (1d, e pav.). Turimos internetinės inkstų vienos ląstelės RNR sekos duomenų bazės (http://humphreyslab.com/SingleCell/) analizė atskleidė, kad DNR-PKcs mRNR buvo plačiai ekspresuojama inkstų ląstelėse ir padidinta žmogaus diabeto inkstuose, palyginti su kontroliniais inkstais (papildomas pav. 1c).

Norėdami toliau nustatyti ryšį tarp DNR-PKcs aktyvumo ir inkstų fibrozės vystymosi, toliau ištyrėme DNR-PKcs ekspresiją ir aktyvumą dviejuose pelių inkstų fibrozės modeliuose, vienašalėje šlapimtakio obstrukcijoje (UUO) ir vienašalėje išemijos-reperfuzijoje (UIR). Imunohistocheminis p-DNR-PKcs dažymas parodė, kad p-DNR PKcs buvo žymiai sukeltas 3 dieną, palyginti su fiktyviomis kontrolėmis UUO modelyje, o p-DNR-PKcs baltymų kiekis dar labiau padidėjo, nes nuo 3 dienos išsivystė inkstų fibrozė. 14 (1f pav.). Western blot ir qRT-PGR rezultatai parodė, kad UUO pelių inkstų audiniuose bendras baltymų ir mRNR kiekis DNR-PKcs taip pat buvo žymiai padidintas, palyginti su netikra kontrole (1g pav. ir papildomas 1e pav.). Panašūs rezultatai buvo pastebėti UIR pelėms (1h pav. ir papildomas 1d, f pav.). Galimas ryšys tarp DNR-PKcs ir CKD paskatino mus toliau tirti DNR PKcs vaidmenį ir mechaninius padarinius sergant CKD.

DNR-PKcs sukeltas CKD progresavimas pelėms

Tada sukūrėme DNR-PKcs išmuštas peles, kuriose DNR-PKcs koduotas genas Prkdc buvo išmuštas naudojant CRISPR/cas9, kaip aprašyta metoduose (papildomas 2a pav.). DNR-PKcs heterozigotinės (+/-) ir homozigotinės (-/-) išmuštos ir laukinio tipo (WT) pelės buvo atskirtos pagal genotipą, kaip parodyta papildomame 2a pav. Prkdc mRNR (papildomas 2c pav.) ir DNR-PKcs baltymų lygiai (2e pav.) nebuvo aptikti DNR-PKcs-/- pelių inkstų audiniuose, o tai rodo sėkmingą DNR-PKcs išmušimą pelėms. Norint įvertinti DNR-PKcs išmušimo strategijos poveikį inkstų pažeidimui ir fibrozei, suaugusiems (6–8 savaičių amžiaus) DNR-PKcs-/- ir WT kontrolinių pelių patinams buvo atlikta UUO ir eutanazija atlikta praėjus 7 dienoms po operacijos. PAS dažymas atskleidė, kad UUO sukeltos kanalėlių atrofijos ir išsiplėtimo laipsnis žymiai pagerėjo DNR-PKcs-/- pelėms, palyginti su WT kontrolinėmis grupėmis (2a pav.). Inkstų fibrozė taip pat labai pagerėjo DNR-PKcs-/- pelėms, palyginti su WT pelėmis, kaip buvo pastebėta ir kiekybiškai įvertinta Massono dažymu (2b pav.). Intersticinio kolageno I nusėdimo ir -SMA imuninio ženklinimo vaizdai parodė, kad abu klasikiniai profibrotiniai žymenys buvo žymiai sumažėję DNR-PKcs-/- pelių UUO inkstuose, palyginti su WT kontrolėmis (2c, d pav.). Profibrotinių žymenų, įskaitant FN ir -SMA, baltymų lygis taip pat buvo žymiai sumažintas DNR-PKcs-/- pelių UUO inkstuose, analizuojamas Western blot metodu (2e pav.). QRT-PCR analizė parodė, kad pelių DNR-PKcs pašalinimas žymiai sumažino svarbiausių inkstų fibrozės genų, įskaitant Col1a1, Col3a1, Fn1 ir Acta2, ekspresijos lygį, kurie buvo labai sureguliuoti UUO inkstuose. Atsižvelgiant į sumažėjusią fibrozę, DNR PKcs išmušimas taip pat sumažino UUO sukelto inkstų pažeidimo žymeklio KIM{36}} mRNR lygį (papildomas 2c pav.). Be to, uždegimas yra pagrindinis inkstų fibrozės požymis ir vaidina svarbų vaidmenį inkstų fibrozės patogenezėje. Taigi, qRT-PGR analizavome su uždegimu susijusius žymenis, įskaitant citokinus Il1, Il6, Tnf ir Mcp1. UUO modelyje mes nustatėme, kad UUO sukeltų uždegiminių citokinų reguliavimas buvo žymiai sumažintas dėl DNR-PKcs išmušimo (papildomas 2c pav.). Kadangi tiek klinikiniai tyrimai, tiek gyvūnų modeliai rodo stiprų ryšį tarp makrofagų ir inkstų fibrozės masto, infiltruoti makrofagai UOinkstų audiniuose buvo įvertinti imunohistocheminiu būdu makrofagų žymeniui F4/80. Vaizdai atskleidė daug infiltruotų makrofagų užsikimšusiuose WT pelių inkstuose praėjus 7 dienoms po UUO, kurių DNR-PKcs išmušimas buvo žymiai sumažintas (2f pav.). Įdomu, DNR-PKcs

Norėdami toliau įvertinti inkstų kanalėlių DNR-PKcs poveikį inkstų fibrozei, mes sukonstravome proksimalinę inkstų kanalėlių epitelio ląstelę su specifiniu DNR-PKcs išmušimu in vivo, naudodami CRISPR / cas9 knockin peles (papildomas 2e, f pav.). Po trijų savaičių subkapsulinės adeno-associated viruso (AAV), turinčio DNR-PKcs vadovo RNR (gRNR), injekcijos, proksimalinėms inkstų kanalėlių ląstelėms būdingoms DNR-PKcs išmuštoms pelėms buvo atliktas UUO ir eutanazija buvo atlikta praėjus 7 dienoms po operacijos. Imunofluorescencinis DNR-PKcs dažymas parodė, kad DNR-PKcs nėra inkstų kanalėlių ląstelėse (2h pav.), tačiau ji vis tiek buvo ekspresuojama -SMA teigiamuose miofibroblastuose (papildomas 2g pav.) cas9 pelių, kurioms buvo suleista AAV-gRNR, palyginti su tie cas9 pelėms, kurioms buvo sušvirkštas AAV be gRNR DNR PKcs. Western blot analizė parodė, kad DNR PKcs ir profibrotinių žymenų, įskaitant FN ir -SMA, baltymų kiekis taip pat buvo reikšmingai sumažintas cas9 pelių, kurioms buvo sušvirkšta AAV-sgRNR, UUO inkstuose, lyginant su kontroline grupe (2g pav.). . Panašiai kaip UUO modelis, DNR-PKcs išmuštos pelės taip pat buvo apsaugotos nuo UIR sukeltos CKD (papildomas 2h-m pav.). Kartu šie rezultatai rodo, kad DNR-PKcs ištrynimas susilpnina CKD progresavimą pelėms.

Norint nustatyti, ar per didelė DNR-PKcs ekspresija inkstuose yra pakankama inkstų fibrozei sukelti, žmogaus DNR-PKcs ekspresijos plazmidės (Addgene: 83317) buvo tiekiamos į pelių inkstus per uodegos veną aukšto slėgio injekcijos metodu, kaip aprašyta keliuose ankstesniuose tyrimuose36. Praėjus trisdešimt šešioms valandoms po DNR-PKcs plazmidės injekcijos, pelėms 7 dienas buvo atlikta UUO operacija. Apskritai mūsų rezultatai rodo, kad žmogaus DNR-PKcs negimdinė ekspresija yra pakankama, kad paskatintų inkstų fibrozės progresavimą in vivo (papildomas 3 pav.).

DNR-PKcs aktyvumo slopinimas susilpnina CKD vystymąsi pelėms

Šie atradimai paskatino mus apsvarstyti galimybę, kad DNR PKcs inhibitoriai gali būti naudojami apsaugoti nuo inkstų fibrozės. Norėdami patikrinti mūsų hipotezę, suaugusios (6–8 savaičių) WT pelių patinai kasdien buvo gydomi labai specifiniu DNR-PKcs inhibitoriumi NU7441, pradedant 1 dieną po UUO operacijos. NU7441-gydytos ir kontrolinės pelės buvo numarintos praėjus 7 dienoms po UUO operacijos, o DNR-PKcs aktyvumas buvo ištirtas imunohistocheminiu dažymu, o rezultatai parodė, kad gydymas NU7441 ženkliai slopina DNR-PKcs aktyvaciją UUO inksto audiniuose. 3a pav.). UUO sukeltos kanalėlių atrofijos ir išsiplėtimo laipsnis labai pagerėjo po gydymo NU7441, palyginti su nešiklio kontrole, kaip rodo PAS dažymas (3b pav.). Histopatologinės Massono dažymo analizės atskleidė maždaug 50 % inkstų intersticinės fibrozės sumažėjimą NU7441- gydytų pelių užsikimšusiuose (UUO) inkstuose, palyginti su nešiklio kontroliniais UUO inkstais (3c pav.). Imunofluorescencinio dažymo vaizdai parodė, kad UUO sukeltas intersticinio kolageno I nusėdimas buvo žymiai sumažintas gydant NU7441 (3e pav.). Profibrotinių žymenų, įskaitant FN ir -SMA, baltymų kiekis, išanalizuotas Western blot metodu, taip pat buvo žymiai sumažintas NU7441- gydytų pelių UUO inkstuose, palyginti su nešiklio kontrolinėmis grupėmis (3f pav.). QRT-PGR analizė parodė, kad gydymas NU7441 žymiai sumažino svarbiausių inkstų fibrozės genų, įskaitant Col1a1, Col3a1, Fn1 ir Acta2, ekspresijos lygį UUO pelių inkstų audiniuose, palyginti su nešiklio kontrole (papildomas 4a pav.). Be to, makrofagų infiltracija UUO pelių inkstų audiniuose labai sumažėjo po gydymo NU7441, palyginti su nešiklio kontrole (3d pav.). NU7441 taip pat sumažino su uždegimu susijusių žymenų, įskaitant citokinus Il1 , Il6, Tnf ir Mcp1, ekspresijos lygius UUO pelių inkstų audiniuose, kaip analizuojama naudojant qRT-PGR (papildomas 4a pav.). Be to, DNR PKcs išmuštos pelės taip pat buvo gydomos NU7441, kad būtų ištirtas galimas NU7441 pašalinis taikinys. Mūsų rezultatai parodė, kad NU7441 neturėjo akivaizdaus antifibrozinio poveikio DNR-PKcs išmuštoms pelėms (3g pav., h), o tai rodo specifinį NU7441 poveikį DNR-PKcs šioje eksperimentinėje aplinkoje.

Apsauginis NU7441 poveikis nuo UUO sukelto inkstų pažeidimo ir inkstų fibrozės buvo išplėstas iki UIR sukeltos CKD. Kaip ir tikėtasi, gydymas NU7441 taip pat apsaugojo nuo UIR sukelto inkstų pažeidimo ir fibrozės, palyginti su nešiklio kontrole (papildomas 4b–h pav.). Kartu šie rezultatai rodo, kad DNR-PKcs aktyvumo slopinimas NU7441 susilpnina CKD progresavimą pelėms.

3 pav.|DNR-PKcs aktyvumo slopinimas susilpnina CKD vystymąsi UUO pelėse. a Imunohistocheminis p-DNR-PKcs dažymas pelių, gydomų NU7441 (40 mg/kg) arba nešikliu, paveiktu UUO (7 diena), inkstuose, skalės juostos: 20 μm. Juostos rodo kiekybinio įvertinimo rezultatus (vidurkis ± SD, n=6 kiekvienos grupės pelių). b PAS dažymas pelių, apdorotų NU7441 arba nešikliu, paveiktų UUO, inkstų dažymas, skalės juostos: 50 μm. Juostos rodo kiekybinio įvertinimo rezultatus (vidurkis ± SD, n=6 kiekvienos grupės pelių). c Pelių, apdorotų NU7441 arba nešikliu, paveiktų UUO, inkstų Massono dažymas, skalės juostos: 50 μm. Juostos rodo kiekybinio įvertinimo rezultatus (vidurkis ± SD, n=6 kiekvienos grupės pelių). d Imunohistocheminis F4/80 dažymas pelių, apdorotų NU7441 arba nešikliu, paveiktų UUO, inkstuose, skalės juostos: 20 μm. Juostos rodo kiekybinio įvertinimo rezultatus (vidurkis ± SD, n=6 kiekvienos grupės pelių). e Imunofluorescencinis COL1A1 dažymas pelių, apdorotų NU7441 arba nešikliu, paveiktų UUO, inkstuose, skalės juostos: 20 μm. Juostos rodo kiekybinio įvertinimo rezultatus (vidurkis ± SD, n=6 kiekvienos grupės pelių). f FN ir -SMA baltymų kiekis pelių, gydomų NU7441 arba nešikliu, paveiktų UUO, inkstuose. Juostos rodo kiekybinio įvertinimo rezultatus (vidurkis ± SD, n=6 kiekvienos grupės pelių). g FN ir -SMA baltymų kiekis DNR-PKcs-/- arba WT pelių, gydomų NU7441 arba nešikliu, paveiktų UUO, inkstuose. Juostos rodo kiekybinio įvertinimo rezultatus (vidurkis ± SD, n=6 kiekvienos grupės pelių). h DNR-PKcs-/- arba WT pelių, gydytų NU7441 arba nešikliu, paveiktų UUO, inkstų dažymas Sirius raudonu. Juostos rodo kiekybinio įvertinimo rezultatus (vidurkis ± SD, n=6 kiekvienos grupės pelių). Dviejų uodegų nesuporuotas t testas buvo naudojamas a, c, e p reikšmėms nustatyti. b, d, h p reikšmėms nustatyti buvo naudojamas vienpusis ANOVA, po kurio buvo atliktas Tukey daugkartinio palyginimo testas. Dviejų krypčių ANOVA ir Šídák daugkartinio palyginimo testas buvo naudojami f, g p reikšmėms nustatyti. Šaltiniai duomenys pateikiami kaip šaltinio duomenų failas.

DNR-PKcs slopinimas išsaugo kanalėlių epitelio ląstelių fenotipą ir reguliuoja intersticinį fibroblastų aktyvavimą in vitro

Epitelio pažeidimas ir miofibroblastų aktyvacija yra pagrindiniai CKD2 patogenezės įvykiai. Imuninis dažymas atskleidė, kad p-DNAPKcs buvo akivaizdžiai sukeltas TGF 1 stimuliacijos tiek HK-2 ląstelėse (4a pav.), tiek pirminėse kanalėlių epitelio ląstelėse (papildomas 5a pav.). Western blot rezultatai parodė, kad TGF 1 arba H2O2 apdorotose HK-2 ląstelėse DNR-PKcs fosforilinimo ir bendro baltymo lygis taip pat buvo žymiai padidintas (4i pav. ir papildomas 5b pav.). Be to, naudojant CRISPR-Cas9 buvo sukurtos DNR-PKcs išmuštos HK-2 ląstelės, o WT ir DNR-PKcs−/− pelės pirminės kanalėlių epitelio ląstelės buvo kultivuojamos. Sėkmingas DNR-PKcs išmuštų HK-2 ląstelių konstravimas buvo patvirtintas Western blot metodu (papildomas 5c pav.). Mūsų rezultatai parodė, kad DNR-PKcs išjungimas arba DNR-PKcs slopinimas NU7441 pagerino inkstų epitelio ląstelių dediferenciaciją, kaip rodo mažesnis FN ir Col1A1 gamybos lygis po TGF 1 poveikio DNR-PKcs išmušimo arba NU{27 }}apdorotos ląstelės (4b–d, k, l pav.). Tačiau KU80 išmušimas padidino TGF 1 sukeltą FN gamybą kanalėlių epitelio ląstelėse (4m pav.). Kaip ir UUO modelis, DNR-PKcs išjungimas nepasunkino DNR pertrūkių HK-2 ląstelėse, kurias sukelia H2O2 (papildomas 5d pav.). KU70/80 pirmiausia atpažįsta DNR nulaužtus galus DSB, tada įdarbina DNR-PKcs, kad susidarytų DNR-PK, kuris yra būtinas DSB taisymui per NHEJ37. Šie rezultatai rodo, kad DNR-PKcs sustiprino inkstų epitelio ląstelių profibrotinį poveikį CKD, nepriklausomai nuo jo DSB atkūrimo funkcijos.

Siekiant ištirti, ar DNR-PKcs yra susijęs su intersticinių fibroblastų aktyvavimu ir proliferacija, buvo auginami. Western blot rezultatai parodė, kad TGF 1 apdorotose NRK-49F ląstelėse DNR-PKcs fosforilinto ir bendrojo baltymo lygis taip pat buvo žymiai padidintas (4j pav.). Imuninis dažymas atskleidė, kad DNR-PKcs aktyvumas buvo ženkliai indukuotas gydant TGF 1 NRK-49F ląstelėse (4e pav.), tačiau jį labai slopino gydymas NU7441. NRK-49F ląstelių gydymas TGF 1 sukėlė fibroblastų aktyvaciją ir miofibroblastų diferenciaciją padidinus COL1, -SMA ir FN reguliavimą, o išankstinis apdorojimas NU7441 labai sumažino profibrotinį fenotipą (4f pav., g, n). Be to, gydymas NU7441 reikšmingai slopino TGF 1 sukeltą NRK-49F ląstelių proliferaciją, palyginti su nešiklio kontrole, kaip rodo EdU dažymas (4h pav.). Visi šie duomenys rodo, kad DNR-PKcs slopinimas išsaugo kanalėlių epitelio ląstelių fenotipą ir reguliuoja intersticinį fibroblastų aktyvavimą, kurį indukuoja TGF 1 in vitro .

Be to, mes taip pat ištyrėme TGF 1-sukeliamos DNR-PKcs ekspresijos mechanizmą. Pirma, mes nustatėme kelias galimas SMAD2 surišimo vietas DNR-PKcs promotoriaus srityje, atlikdami JASPAR transkripcijos faktoriaus surišimo profilių analizę 38. Antra, liuciferazės tyrimo rezultatai parodė, kad per didelė SMAD2 ekspresija padidino DNR-PKcs transkripcijos aktyvaciją (papildomas 5e pav.) . Be to, taip pat buvo analizuojamas DNR-PKcs poveikis SMAD signalizacijos aktyvavimui. Rezultatai parodė, kad DNR-PKcs išmušimas slopino SMAD2/SMAD3 aktyvavimą UUO pelės modelyje (papildomas 5f pav.). Šie rezultatai rodo, kad SMAD2/SMAD3 padidino DNR PKcs ekspresiją, o DNR-PKcs aktyvavo SMAD2/SMAD3 (papildomas 5g pav.), sudarydamas teigiamą kilpą.

„Wecistanche“ – didžiausio cistansų eksportuotojo Kinijoje – pagalbinė tarnyba:

El. paštas:wallence.suen@wecistanche.com

WhatsApp / Tel.:+86 15292862950

Įsigykite daugiau specifikacijų:

https://www.xjcistanche.com/cistanche-shop

SPAUSKITE ČIA, KAD GAUTI NATŪRALIŲ EKOLOGIŠKŲ CISTANČIŲ EKSTRAKTĄ, SU 25% ECHINAKOZIDU IR 9% AKTEOZIDU, SKIRTA INKSTS