Kaip Cistanche echinakozidas padidina androgenų kiekį per endotelio ląsteles?

Kontaktai: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 El. paštas:audrey.hu@wecistanche.com

Abstraktus.

Echinakozidas (ECH) yra natūralus junginys, turintis nuo endotelio priklausomą kraujagysles plečiantį poveikį. Azoto oksidas (NO) yra svarbus kraujagysles atpalaiduojantis agentas, išsiskiriantis iš endotelio ląstelių. Siekiant ištirti ECH sukeltos NO gamybos endotelio ląstelėse molekulinį mechanizmą, šiame tyrime buvo tiriamas androgenų receptorių (AR) ir fosfatidilinozitolio 3- kinazės (PI3K) / baltymų kinazės B (Akt) kelias. endotelio azoto oksido sintazės (eNOS) fosforilinimas žmogaus bambos venų endotelio ląstelėse (HUVEC). Naudojant fluorescencinį zondą DAF-FM, nustatyta, kad NO gamyba žymiai padidėjo, o eNOS buvo fosforilintas Ser1177, priklausomai nuo koncentracijos, naudojant 0.01-10 µM ECH apdorojimas HUVEC. Be to, NO gamyba ir ECH sukeltas eNOS fosforilinimas sumažėjo, kai buvo iš anksto apdorotas AR antagonistu nilutamidu arba kai buvo transfekuotas AR mažomis trukdančiomis RNR. Be to, ECH sukeltas Akt fosforilinimas Ser473 buvo panaikintas 5 µM wortmannin (PI3K inhibitoriumi). Šie duomenys parodė, kad ECH stimuliavo NO gamybą per nuo AR priklausomą eNOS aktyvavimą HUVEC ir kad PI3K / Akt kelias gali būti susijęs su ECH sukeltu eNOS fosforilinimu.

Cistanche deserticola turi daug efektų, spustelėkite čia, kad sužinotumėte daugiau

Įvadas

Cistanche Hoffman. Et Link yra daugiametis parazitinis augalas, priklausantis Orobanchaceae šeimos genčiai. HerbaCistanche, stiebasCistanche deserticolaYC MA irCistanche tubulosa(Šenkas). Cistanche yra tonizuojanti žolė, kuri buvo naudojama gydymuiinkstų nepakankamumas, impotencija, liguista leukorėja ir senatvinis vidurių užkietėjimas (1), kurį gali lemti į androgenus panašus arba lytinius hormonus reguliuojantis poveikis (2). Echinakozidas (ECH; C35H46O20; molekulinė masė 786,73; 1 pav.) yra vienas iš feniletanoidinių glikozidų (PhG), išskirtų iš Herba stiebų.Cistancheir pasižymi daugybe biologinių savybių, įskaitant antioksidacinį, senėjimą stabdantį, priešuždegiminį, hepatoprotekcinį ir neuroprotekcinį poveikį (3). Šiuolaikiniai farmakologiniai tyrimai parodė, kad įvairios Herba sudedamosios dalysCistanche, įskaitant ECH,akteozido, kankanozė, Lankos pusė F ircistanozidasF, pasižymi kraujagysles atpalaiduojančiu aktyvumu (4).

Endotelis yra svarbus kraujagyslių reguliatorius, o azoto oksidas (NO) yra svarbus atpalaiduojantis faktorius, kurį išskiriaendotelio ląstelės.Pasklidęs į lygiųjų raumenų ląsteles, NO aktyvuoja guanilato ciklazę, padidina ciklinio guanozino monofosfato (cGMP) kiekį, o tada aktyvuoja nuo cGMP priklausomas proteinkinazes (PKG), kad paskatintų lygiųjų raumenų atsipalaidavimą (5). Anksčiau buvo įrodyta, kad 350-400 µM ECH tiesiogiai veikia kraujagyslių lygiuosius raumenis ir slopina hipoksijos sukeltą proliferaciją žiurkių plaučių arterijų lygiųjų raumenų ląstelėse (6), o 30-300 µM ECH sukėlė ūmų kraujagyslių atsipalaidavimą endotelyje. nepažeistus žiedus, priklausomai nuo koncentracijos, ir sustiprintą cGMP gamybą aortos žiedų lygiuosiuose raumenyse, kuriuos sutraukia fenilefrinas (7). Atidarius NO-cGMP-PKG-BKCa kanalus lygiųjų raumenų ląstelėse, 100 arba 300 µM ECH slopino noradrenalino sukeltą susitraukimą žiurkių plaučių arterijose, ypač žieduose, kuriuose nėra endotelio (8).Endotelio ląstelėsyra pagrindiniai širdies ir kraujagyslių funkcijos reguliatoriai, ir kai kuriais atvejais buvo nustatyta, kad nuo endotelio priklausomas atsipalaidavimas atsirado dėl pernešamos medžiagos, tokios kaip NO, išsiskiriančios iš endotelio (9). Tačiau prieš srovę esantis ECH sukeltos NO gamybos kraujagyslėse molekulinis mechanizmasendotelio ląstelėsreikalauja tolesnio tyrimo. Kraujagyslių endotelyje NO susidarymą pirmiausia tarpininkauja endotelio NO sintazė (eNOS). Kelios grupės įrodė, kad fosfatidilinozitolio 3-kinazės (PI3K) kelias suaktyvina serino-treonino baltymo kinazę B (Akt), kuri sukelia tiesioginį eNOS fosforilinimą serine 1177 (Ser1177) (10). Androgenų receptorius (AR) yra branduolinių receptorių pošeimos s3 narys, kuris kanoniškai modifikuoja genų ekspresiją. AR lokalizacija ląstelės membranoje esančiose kaveolėse yra susijusi su negenominiu endotelio ląstelių funkcijos reguliavimu arba genų ekspresija, sukeldama c-Src/PI3K/Akt kaskadą, dėl kurios galiausiai atsiranda eNOS fosforilinimas ir NO gamyba (11). Žmogaus aortojeendotelio ląstelėsBuvo pranešta, kad testosteronas aktyvuoja PI3K/Akt signalizaciją ir greitai sukelia NO gamybą dėl tiesioginės AR ir PI3K p85 subvieneto sąveikos širdies ir kraujagyslių sistemoje (12). Buvo pranešta, kad ECH sustiprina su hormonų trūkumu susijusius simptomus ir daro į androgeną panašų poveikį dėl konkurencinio prisijungimo prie AR, o ne testosterono (2). Todėl šiame tyrime buvo iškelta hipotezė, kad PI3K / Akt kelias gali būti susijęs su NO gamyba per nuo AR priklausomą eNOS fosforilinimą, kurį sukelia ECH. Šio tyrimo tikslas buvo įvertinti šiuos ECH efektus: i) NO gamybos ir eNOS fosforilinimo indukciją; ii) AR dalyvavimas eNOS fosforilinime ir iii) PI3K/Akt kelio aktyvinimas žmogaus bambos venų endotelio ląstelėse (HUVEC), gerai žinomas eksperimentinis endotelio ląstelių funkcijų reguliavimo ir angiogenezės tyrimo modelis (13).

medžiagos ir metodai

Cheminės medžiagos ir reagentai. ECH (grynumas, 92,5 proc.) buvo gautas iš Nacionalinių vaistų standartų Nacionaliniame maisto ir vaistų kontrolės institute. Antikūnai prieš p-Akt (Ser473; kat. Nr. ab8805), Akt (kat. Nr. ab81283), p-eNOS (Ser1177; kat. Nr. ab184154) ir eNOS (kat. Nr. ab76198) buvo įsigyti iš Abcam . Nilutamido ir ICI 182780 inhibitoriai buvo gauti iš Sigma-Aldrich; Merck KGaA. L-NAME buvo įsigytas iš Adamas-Beta, Ltd., o wortmannin pirktas iš Pribolab.

Ląstelių kultūra ir gydymas vaistais.

HUVEC buvo gauti iš ScienCell Research Laboratories Inc. ir auginamiendotelio ląstelėterpė (ECM; ScienCell Research Laboratories) su 5 procentais (t/v) jaučio vaisiaus serumu (FBS; Gibco, Thermo Fisher Scientific, Inc.) ir 1 procento endotelio ląstelių augimo priedu (ECGS) 37 °C temperatūroje (5 procentai CO2 ir 95 procentų drėgmė) (14). Pasiekus santaką, ląstelės buvo virškinamos tripsinu ir padengtos ECM su 1 procentu FBS ir 1 procentu EKGS. Visiems eksperimentams HUVEC buvo padengti 1x104/ml koncentracija ir auginami iki susiliejimo. Prieš pradedant gydymą ECH ar kitais stimuliatoriais, ląstelės buvo inkubuojamos be fenolio raudonojo ECM be FBS ir EKG 6 valandas, kad būtų sustabdytas augimas. Atliekant slopinamuosius eksperimentus, HUVEC buvo iš anksto inkubuojami su įvairiais antagonistais arba inhibitoriais, įskaitant 10 µM nilutamido, 10 µM ICI 182780, 0,5 mM L-NAME arba 5 µM wortmannin, 30 min. su ECH arba be jo, 37˚C temperatūroje. Visose grupėse, įskaitant kontrolę, DMSO buvo naudojamas kaip tirpiklis vienodomis 0,001 proc.

Tarpląstelinės NO gamybos matavimas.

Santykiniai citozolinio NO koncentracijos pokyčiai HUVEC buvo stebimi naudojant fluorescencinį NO zondą DAF-FM (Cayman Chemical Company), kaip buvo pranešta anksčiau (12). Trumpai tariant, ląstelės buvo pakrautos 5 µM DAF-FM diacetatu 20 minučių 37 ° C temperatūroje į juodą mikrotitravimo plokštelę ir keletą kartų perplaunamos PBS (pH 7, 4). Fluorescencija buvo nustatyta atitinkamai 495 ir 515 nm sužadinimo ir emisijos bangos ilgiuose, naudojant fluorescencinį mikroplokštelių skaitytuvą (Biotek Synergy H4; BioTek Instruments, Inc.) ir kompaktinį apverstą mikroskopą (Nikon eclipse Ts2R; Nikon Corporation).

Western blot analizė.

Kaip buvo pranešta anksčiau (15), susilieję ląstelių sluoksniai du kartus buvo plaunami lediniu PBS ir lizuojami RIPA buferiu (P0013D; Beyotime Biotechnologijos institutas). Baltymų koncentracija supernatante buvo matuojama naudojant bicinchonino rūgšties tyrimo metodą (16). Vėliau vienoje juostoje buvo pakrauta 30 µg baltymų, atskirta naudojant 10 procentų poliakrilamido gelius ir perkelta ant polivinilideno difluorido membranų. Membranos buvo užblokuotos 5 procentų nugriebtu pienu 1 valandą 25 °C temperatūroje. Po inkubacijos su monokloniniais antikūnais prieš Akt (1:1, 000 praskiedimas), p-Akt (1:500 praskiedimas), eNOS (1:2, 000 praskiedimas) arba p-eNOS (1 :1,000 praskiedimas) 4 °C temperatūroje per naktį, membranos buvo plaunamos TBST (sudėtyje yra 0,1 proc. Tween-20) 4 kartus po ~15 min per plovimą 25 °C temperatūroje. Vėliau membranos buvo inkubuojamos su krienų peroksidaze konjuguotais antriniais antikūnais (1:5, 000 praskiedimas; anti-pelės antikūnas, kat. Nr. A0216, arba antikūnas prieš triušius, kat. Nr. A0208, Beyotime Institute biotechnologijos) 1 valandą 25 ˚C temperatūroje ir aptikta naudojant sustiprintą chemiliuminescencijos rinkinį (kat. Nr. 32209, Thermo Fisher Scientific, Inc.). Juostos intensyvumas buvo kiekybiškai įvertintas naudojant Image J gelio analizės programinę įrangą, 1.8 versiją.0_112 (Nacionaliniai sveikatos institutai).

Mažų trukdančių (si) RNR paruošimas ir transfekcija.

Ilgos dvigrandės RNR buvo susintetintos tikslinės AR ir estrogenų receptoriaus (ER) mRNR, kurių sekos parodytos I lentelėje. siRNR numušimo sąlygos apėmė HUVEC transfekavimą esant 70 procentų santakai, išlaikant neantimikrobines medžiagas. auginimo terpė 60 mm kolagenu padengtuose auginimo lėkšteliuose. 5 nM AR-siRNR arba 10 nM ER -siRNR transfekcija Lipofectamine 3000 reagentu (Invitrogen; Thermo Fisher Scientific, Inc.) buvo atlikta atskirai, pagal gamintojo protokolus. Transfekcijos efektyvumas buvo įvertintas atvirkštinės transkripcijos kiekybine PGR analize (RT-qPCR), kaip buvo pranešta anksčiau (17). Termociklo sąlygos buvo tokios: 10 min 95˚C temperatūroje; 40 ciklų 95 ˚C 5 sek. ir 60 ˚C 1 min. ir lydymosi kreivė 95 ˚C 15 sek., 60 ˚C 1 min. ir 95 ˚C 15 sek.; kiekvienam mėginiui buvo atlikti trys nepriklausomi biologiniai pakartojimai. Vėlesni eksperimentai buvo atlikti praėjus 48 valandoms po transfekcijos. Pradmenų poros buvo sukurtos naudojant Primer Premier v5.0 programinę įrangą (PREMIER Biosoft) su šiomis sekomis: AR pirmyn, 5'-GGTTACACCAAAGGGCTAGAA-3' ir atgal, 5'-GACTTGTAGAGAGACAGGGTAGA-3'; ER pirmyn, 5'-CCAGTACCAATGACAAGGGAAG-3' ir atgal, 5'-TCACAGGACCAGACTCCATAA-3"; ir GAPDH pirmyn, 5'-CAGGGCTGCTTTTAACTCTGGTAA-3' ir atgal, 5'-GGGTGGAATCATATTGGAACATGT-3

Statistinė analizė.

Visi duomenys pateikiami kaip vidurkis ± standartinis nuokrypis. Statistiniai grupių palyginimai buvo atlikti naudojant Kruskal-Wallis testą arba dvipusį ANOVA su Tukey post hoc testu daugkartiniam palyginimui. P<0.05 was="" considered="" to="" indicate="" a="" statistically="" significant="">

Rezultatai

ECH sukelia NO gamybą ir eNOS fosforilinimą.

Kaip parodyta 2A ir B pav., 1 µM ECH reikšmingai padidino tarpląstelinę NO gamybą HUVEC, palyginti su neigiamomis kontrolinėmis ląstelėmis, o stimuliuojantis ECH poveikis buvo susilpnintas iki kontrolinio lygio iš anksto apdorojus L-NAME. Norint gauti optimalią koncentraciją, eNOS fosforilinimas buvo išbandytas praėjus 60 min. po apdorojimo ECH, kai koncentracija buvo 0, 0.{11}}1, 0. 1, 1 ir 10 µM. Rezultatai atskleidė, kad ECH, kai koncentracija yra 0,01–10 µM, gali reikšmingai sukelti eNOS fosforilinimą Ser 1177, priklausomai nuo koncentracijos, o didžiausias eNOS fosforilinimas stebimas esant 10 µM ECH indukcijai (2C ir D pav.). Be to, eNOS fosforilinimas Ser1177 buvo ištirtas Western blot analize po 0, 5, 15, 30, 60 ir 120 minučių po inkubacijos su 1 µM ECH. Pastebėta, kad eNOS fosforilinimas buvo greitai suaktyvintas ECH 5 min., ir toliau didėjo iki 30 min. inkubacijos (2E ir F pav.). Vėliau, nepaisant gydymo ECH, santykinis eNOS fosforilinimo dydis išliko stabilus nuo 30 min. todėl ECH neturėjo įtakos bendrai eNOS ekspresijai (2C ir E pav.).

AR tarpininkauja ECH sukeltai NO gamybai ir eNOS fosforilinimui.

RT-qPCR tyrimas parodė, kad šiame tyrime AR-siRNR-1 ir ER-siRNR-2 trukdantis poveikis buvo sėkmingiausias slopinant AR ir ER raišką HUVEC (3 pav. ). Vėliau, siekiant įvertinti AR dalyvavimą ECH sukeltame eNOS aktyvavime ir NO gamyboje, buvo pritaikytas antagonistas AR slopinimo funkcijos analizei ir siRNR AR funkcijos praradimo analizei. Kaip parodyta 4A pav., 1 µM ECH žymiai padidino NO gamybą HUVEC (P<0.05). pretreatment="" with="" the="" ar="" antagonist="" nilutamide="" (10="" µm)="" abolished="" ech-induced="" no="" production,="" whereas="" ici182789="" (an="" er="" antagonist)="" did="" not="" exert="" the="" same="" effects.="" furthermore,="" the="" effects="" of="" sirna-mediated="" ar="" knockdown="" on="" no="" production="" were="" examined="" in="" cultured="" cells,="" indicating="" that="" no="" production="" was="" diminished="" by="" transfection="" with="" ar="" sirnas;="" however,="" it="" was="" not="" affected="" by="" er="" sirnas="" or="" control="" random="" sirnas="" (fig.="" 4b).="" representative="" western="" blots="" and="" semi-quantitative="" analysis="" (fig.="" 4c="" and="" d)="" revealed="" that="" the="" phosphorylation="" of="" enos="" induced="" by="" ech="" was="" inhibited="" by="" nilutamide="" and="" ici182789="" and="" that="" the="" inhibitory="" effect="" of="" nilutamide="" on="" ech-induced="" enos="" activation="" was="" significantly="" higher="" compared="" with="" that="" of="" ici182789,="" which="" indicated="" that="" inhibition="" of="" ar="" function="" had="" a="" greater="" impact="" than="" er="" on="" enos="" phosphorylation="" induced="" by="" ech.="" similarly,="" the="" phosphorylation="" of="" enos="" induced="" by="" ech="" was="" reduced="" significantly="" in="" cells="" transfected="" with="" ar-sirna="" and="" er-sirna="" compared="" with="" the="" control="" random="" sirna;="" the="" inhibitory="" effect="" of="" ar‑sirna="" on="" ech‑induced="" enos="" activation="" was="" significantly="" stronger="" compared="" with="" that="" of="" er-sirna="" (fig.="" 4e="" and="" f).="" therefore,="" the="" aforementioned="" results="" suggested="" that="" ech="" may="" cause="" ar-dependent="" activation="" of="" enos="" to="" induce="" no="" production="" in="">

ECH aktyvuoja PI3K/Akt kelią.

Šiame tyrime Akt fosforilinimas Ser473 buvo išbandytas praėjus 60 min. po ECH inkubacijos, kai koncentracija buvo 0, 0.01, 0.1 , 1 ir 10 µM. Rezultatai parodė, kad ECH (001-10 µM) gali reikšmingai sukelti Akt fosforilinimą. Santykiniai p-Akt ekspresijos lygiai pasiekė aukščiausią tašką esant 1 ir 10 µM ECH apdorojimo (5A ir B pav.). Be to, Akt fosforilinimas buvo ištirtas Western blot analize po 0, 5, 15, 30, 60 ir 120 minučių po 1 µM ECH pridėjimo prie HUVEC kultūrų. Kaip parodyta 5C ir D pav., ECH greitai padidino Akt fosforilinimą po 5 min. inkubacijos, o didžiausias p-Akt baltymų lygis buvo pastebėtas po 60 min. Priešingai, ECH neturėjo įtakos bendrai Akt išraiškai (5A ir C pav.). Be to, norint ištirti galimą PI3K kelio poveikį eNOS fosforilinimui, prieš naudojant ECH, HUVEC buvo iš anksto apdoroti PI3K inhibitoriumi wortmannin. Nustatyta, kad Wortmannin sumažina ECH sukeltą NO gamybą iki pradinio lygio (5E pav.). Panašus reiškinys buvo pastebėtas naudojant fluorescencinę mikroskopiją tiriant ECH sukeltą DAF-FM fluorescenciją (5F pav.). Be to, wortmannin gali turėti galimybę panaikinti greitą eNOS fosforilinimą HUVEC (5G ir H pav.). Pirmiau minėti rezultatai rodo, kad ECH gali suaktyvinti eNOS fosforilinimą ir NO gamybą per PI3K / Akt kelią.

Diskusija

ECH yra natūralus junginys, išskirtas iš HerbaCistanche, turintis įvairių farmakologinių savybių. Anksčiau buvo įrodyta, kad ECH darė nuo endotelio priklausomą kraujagyslių atsipalaidavimo poveikį, atidarydamas NO-cGMP-PKG-BKC kanalus kraujagyslių lygiųjų raumenų ląstelėse (7, 8). Dabartinės išvados rodo, kad ECH veikė nuo AR priklausomą eNOS aktyvavimą, kad sukeltų NO gamybą, dalyvaujant PI3K / Akt signalizacijos keliui kraujagyslėse.endotelio ląstelės.

Kaip vidinis kraujagyslės sienelės sluoksnis, endotelis gali greitai pajusti ir reaguoti į kraujo tėkmės pokyčius, o tai savo ruožtu perduoda signalą į apatines lygiųjų raumenų ląsteles, kad reguliuotų kraujagyslių tonusą (18). Buvo plačiai pranešta, kad yra daug endotelio kilmės kraujagysles plečiančių junginių, kurių prototipiškiausia medžiaga

yra NO, susidaro iš eNOS endotelio izoformos, dėl kurios vyksta fosforilinimas (19). Įprastomis sąlygomis eNOS lieka neaktyvus, kai yra prijungtas prie kaveolino, ir suaktyvinamas toliau sekančiais įvykiaisendotelio ląstelės: i) eNOS atsiskiria nuo caveolino-1 ir asocijuojasi su Ca2 plius /CaM; ii) šilumos šoko baltymas (HSP)90 skatina eNOS.

Be to, vis daugiau tyrimų parodė, kad AR yra išreikštasendotelio ląstelėskai kuriuose žmogaus audiniuose, o tai rodo galimą androgenų ir jų analogų, veikiančių per AR sukeltus procesus, vaidmenį moduliuojant žmogaus endotelio ląstelių homeostazę (21). Neklasikiniame PI3K/Akt kelyje AR gali suaktyvinti PI3K tiesiogiai sąveikaudamas su PI3K reguliavimo subvienetu p85 (22). Šis tyrimas parodė, kad AR antagonistas arba AR siRNR sumažino NO gamybą ir eNOS fosforilinimą, kurį sukėlė ECH HUVEC. Anksčiau buvo pranešta, kad estrogenai sukelia eNOS fosforilinimą ir stimuliuoja NO gamybą per klasikinį ER aktyvavimą endotelio ląstelėse (23), o ECH skyrimas žymiai padidina ER ekspresiją gimdoje (24). Tačiau šiame tyrime AR poveikis buvo ryškesnis, palyginti su ER, ECH sukeltai eNOS aktyvacijai ir NO gamybai. Be to, buvo pastebėta, kad ECH sukėlė ūmų NO gamybą per kelias minutes dėl AR sukelto eNOS aktyvavimo HUVEC, o tai atitinka negenominį atsako pobūdį endotelio ląstelėse. AR yra susijęs su pastolių baltymais, įskaitant HSP90, HSP70 ir kinazę Src, citoplazmoje, ir jis gali būti perneštas į membraną iš AR komplekso per 5 minutes po gydymo testosteronu (23). Remiantis „tikslinės žvejybos“ strategija, HSP90 buvo nustatytas kaip su PhGs susietas taikinys, o tai parodė, kad ECH gali palengvinti AR atsiskyrimą nuo pastolių baltymų (25). Kitas tyrimas parodė, kad pagumburyje ECH gali susijungti su AR kišene prie aminorūgščių Met-894 ir Val-713 ir slopinti citoplazminio AR transportavimą į branduolį (26). Tačiau reikia toliau tirti pagrindinį mechanizmą, per kurį ECH tarpininkauja citoplazminiam AR perkėlimui į membraną. Todėl reikia atlikti tolesnius tyrimus, siekiant išsiaiškinti mechanizmą, per kurį ECH pasiekia nuo AR priklausomą eNOS aktyvavimą ir kaip jis gali būti susijęs su prisijungimu prie HSP90 kraujagyslių endotelio ląstelėse.

PI3K/Akt kelias yra viena iš svarbiausių signalizacijos kaskadų, kurios aktyvavimą skatina gaminant fosfatidilinozitolį-3,4,5-trifosfatą, kuris suriša Ser/ N-galo pleckstrin homologijos domeną. Thr kinazės Akt. Tai palengvina Akt įtraukimą į plazmos membraną (27). PI3K / Akt kelias gali atlikti svarbų vaidmenį kontroliuojant nuo NO priklausomą atsipalaidavimą, kurį sukelia ECH. Šis tyrimas atskleidė, kad ECH sukelta NO gamyba žymiai sumažėjo, kai ląstelės buvo inkubuojamos su PI3K inhibitoriumi wortmannin. Ankstesnė ataskaita parodė, kad 15 mg/kg ECH suaktyvino PI3K/Akt signalizacijos kelią 5-fluorouracilo slopintose kaulų čiulpų ląstelėse (28). Šiame tyrime PI3K inhibitoriai žymiai sumažino ECH sukeltą eNOS fosforilinimą Ser1177. Be to, Akt aktyvumą daugiausia reguliavo prieš srovę esantys reguliavimo būdai, ypač nuo PI3K priklausomas fosforilinimas Ser473 (20). Šiame tyrime ECH sukėlė Akt fosforilinimą Ser473, priklausomai nuo dozės; panašiai, ankstesnis tyrimas parodė, kad 5, 10 arba 20 µM ECH, priklausomai nuo dozės, turėjo širdies apsauginį poveikį nuo anoksijos / reperfuzijos gydymo, galbūt padidindamas p-Akt ir SLC8A3 (29). Akt geno transkripcijos reguliavimas iš esmės nežinomas (30); todėl šiame tyrime daugiausia dėmesio buvo skiriama potranskripcijos ECH reguliavimo poveikiui Akt. Atsižvelgiant į pirmiau minėtas išvadas, buvo padaryta išvada, kad ECH taikymas HUVEC gali sukelti PI3K / Akt kelią, kuris fosforilina eNOS ir vėliau padidina NO gamybą.

Apibendrinant galima pasakyti, kad ECH yra natūralus produktas, daugiausia izoliuotas nuoHerba Cistanche. Galimas mechanizmas, kuriuo grindžiama ECH sukelta NO gamybaendotelio ląstelėsgali apimti šiuos dalykus (6 pav.): i) ECH veikia kaip funkcinis AR ligandas, kuris yra lokalizuotas ląstelės membranoje esančiose kaveolėse; ii) PI3K prisijungia prie hidrofobinio Akt domeno ties Ser473 ir palengvina Akt pritraukimą į ląstelės membraną; iii) PI3K/Akt kaskadų įdarbinimas sukelia nuo AR priklausomą eNOS fosforilinimą ir iv) NO susidarymą tarpininkauja eNOSendotelio ląstelės. Pastebėjimas, kad ECH sukelia NO gamybą per nuo AR priklausomą eNOS fosforilinimą, dalyvaujant PI3K / Akt keliui, gali padėti geriau suprasti ECH kraujagysles atpalaiduojantį poveikį. Be to, ECH, nukreiptas į endotelio išvestus NO kelius, gali būti dėl negenominio poveikio. Todėl šis tyrimas gali padėti išsiaiškinti mechanizmus, per kuriuos ECH daro savo farmakologinį poveikį širdies ir kraujagyslių ligų prevencijai.

Autorius:

LI GU, DANHONG LIAN, YIMEI ZHENG, WEI ZHOU, JINLEI GU ir XIN LIU

Valstybinės švietimo ministerijos Maisto ir sveikatos inžinerinių tyrimų centras, Gyvybės mokslų mokykla,

Sun Yat-sen universitetas, Guangdžou, Guangdong 510275, PR Kinija

Gauta 2019 m. gegužės 1 d.; Priimta 2019 m. gruodžio 10 d

Nuorodos

1. Kinijos farmakopėjos komisija:Cistanche Herba. In: Pharmacopoeia of the People's Republic of China 1. smakras. Med. Sci. Spauda, ​​Pekinas, 135 p., 2015 m.

2. Jiang Z, Wang J, Li X ir Zhang X:EchinakozidasirCistanche tubulosa(Schenk) R. wight pagerino bisfenolio A sukeltą sėklidžių ir spermos pažeidimą žiurkėms per lytinių liaukų ašies reguliuojamus steroidogeninius fermentus. J Ethnopharmacol 193: 321-328, 2016 m.

3. Liu J, Yang L, Dong Y, Zhang B ir Ma X:Echinakozidas, neįkainojamas natūralus produktas gydant neurologinius ir kitus sutrikimus. 23 molekulės: piiE1213, 2018 m.

4. Yoshikawa M, Matsuda H, Morikawa T, Xie H, Nakamura S ir Muraoka O: feniletanoidiniai aminoglikozidai ir acilinti oligocukrai, turintys kraujagysles atpalaiduojantį poveikįCistanche tubulosa. Bioorg Med chem 14: 7468-7475, 2006 m.

5. Arnold WP, ​​Mittal CK, Katsuki S ir Murad F: Azoto oksidas aktyvina guanilatciklazę ir padidina guanozino 3':5'-ciklinio monofosfato kiekį įvairiuose audinių preparatuose. Proc Natl Acad Sci USA 74: 3203-3207, 1977 m.

6. Gai XY, Tang F, Ma J, Zeng KW, Wang SL, Wang YP, Wren TN, Lu dX, Zhou Y ir Ge RL: antiproliferacinis poveikisechinakozidasžiurkių plaučių arterijų lygiųjų raumenų ląstelėse esant hipoksijai. J Pharmacol Sci 126: 155-163, 2014 m.

7. Jis WJ, Fang TH, Ma X, Zhang K, Ma ZZ ir Tu PF:Echinakozidassukelia nuo endotelio priklausomą atsipalaidavimą žiurkės aortos žieduose per NO-cGMP kelią. Planta Med 75: 1400-1404, 2009 m.

8. Gai XY, Wei YH, Zhang W, Wren TN, Wang YP, Li ZQ, Liu S, Ma L, Lu dX, Zhou Y ir Ge RL:Echinakozidassukelia žiurkių plaučių arterijų kraujagyslių atsipalaidavimą, atidarydamas NO-cGMP-PKG-BKca kanalus ir sumažindamas intracelulinį ca^{2 plius}lygius. Acta Pharmacol Sin 36: 587-596, 2015 m.

9. Maruhashi T, Kihara Y ir Higashi Y: nuo endotelio nepriklausomos vazodilatacijos įvertinimas: nuo metodikos iki klinikinių perspektyvų. J Hipertenzija 36: 1460-1467, 2018 m.

10. Ahmad KA, Ze H, Chen J, Khan FU, Chen X, Xu J ir ding Q: Apsauginis naujų sintetinių elementų darinio poveikis žmogaus bambos venaiendotelio ląstelėsnuo oksidacinio streso sukeltos žalos: antioksidacijos ir PI3k / Akt / eNOS / NO signalizacijos takų dalyvavimas. Biomed Pharmacother 106: 1734-1741, 2018 m.

11. Yu J, Akishita M, Eto M, Koizumi H, Hashimoto R, Ogawa S, Tanaka K, Ouchi Y ir Okabe T: Src kinazės sukeltas androgenų receptorių priklausomas negenominis signalizacijos kaskados aktyvavimas, vedantis į endotelio azoto oksido sintazę . Biochem Bioph Res Commun 424: 538-543, 2012 m.

12. Yu J, Akishita M, Eto M, Ogawa S, Son B, Kato S, Ouchi Y ir Okabe T: nuo androgenų receptorių priklausomas endotelio azoto oksido sintazės aktyvavimas kraujagyslėseendotelio ląstelės: fosfatidilinozitolio 3-kinazės/Akt kelio vaidmuo. Endokrinologija 151: 1822-1828, 2010 m.

13. Pittarella P, Squarzanti dF, Molinari c, Invernizzi M, Uberti F ir Reno F: nuo NO priklausomas proliferacija ir migracija, kurią sukelia vitaminas d HUVEc. J Steroid Biochem 149: 35-42, 2015 m.

14. He Y, Luan Z, Fu X ir Xu X: per didelė atsijungiančio baltymo 2 ekspresija slopina didelės gliukozės sukeltą žmogaus bambos venos apoptozęendotelio ląstelės. Int J Mol Med 37: 631-638, 2016 m.

15. Xiao-Hong d, Chang-Qin X, Jian-Hua H, Wen-Jiang Z ir Bing S: Icariin atitolina homocisteino sukeltąendotelio ląstelėsenėjimas, apimantis PI3K / AKT-eNOS signalizacijos kelio aktyvavimą. Pharm Biol 51: 433-440, 2013 m.

16. Smith PK, Krohn RI, Hermanson GT, Mallia AK, Gartner FH, Provenzano Md, Fujimoto EK, Goeke NM, Olson BJ ir Klenk dc: Baltymų matavimas naudojant bicinchonino rūgštį. Anal Biochem 150: 76-85, 1985.

17. Gu L, Zhong X, Lian d, Zheng Y, Wang H ir Liu X: Triterpenoidų biosintezė ir transkripcijos atsakas, kurį sukelia azoto oksidas panardinamoje fermentacijoje Ganoderma lucidum.Process Biochem 60: 19-26, 2017 m.

18. Ellingsworth dc, Sandow SL, Shukla N, Liu Y, Jeremy JY ir Gutterman dd: Endotelio sukelta hiperpoliarizacija ir vainikinių kraujagyslių išsiplėtimas: įvairūs ir integruoti epoksieikozatrieno rūgščių, vandenilio peroksido ir tarpų jungčių vaidmenys. Mikrocirkuliacija 23: 15-32, 2016 m.

19. Freed JK ir Gutterman dd: bendravimas yra svarbiausias: tarpląstelinio signalizacijos mechanizmai kraujagyslių išsiplėtimui. J Cardiovasc Pharm 69: 264-272, 2017 m.

20. Quillon A, Iš B ir diskusijų R: Endotelio mikroaplinkos jutimas, sukeliantis azoto oksido sukeltą vazodilataciją: nervinių ir biomechaninių signalų apžvalga. Azoto oksidas 45: 20-26, 2015 m.

21. Torres-Estay V, Carreno V, Francisco IF, Sotomayor P, Godoy AS ir Smith GJ: androgenų receptoriai žmogaus organizmeendotelio ląstelės. J Endocrinol 224: 131-137, 2015 m.

22. Deng Q, Zhang Z, Wu Y, Yu WY, Zhang J, Jiang ZM, Zhang Y, Liang H ir Gui YT: Negenominį androgenų poveikį lemia greitas fosforilinimas ir androgenų receptorių prekybos reguliavimas. Cell Physiol Biochem 43: 223-236, 2017 m.

23. de Oliveira TS, de Oliveira LM, de Oliveira LP, costa RMd, Tostes Rc, Georg Rc, costa EA, Lobato NS, Filgueira FP ir Ghedini Pc: estrogenų receptorių tarpininkaujamo PI3K/Akt kelio aktyvinimas. sukeltas cGMP signalizacijos kraujagyslių aktyvavimas. Vascul Pharmacol 110: 42-48, 2018 m.

24. Li F, Yang X, Yang Y, Guo c, Zhang c, Yang Z ir Li P: antiosteoporozinis aktyvumasechinakozidasžiurkėms, kurių kiaušialąstės pašalintos. Fitomedicina 20: 549-557, 2013 m.

25. Zeng KW, Liao LX, Wan YJ, Jiang Y ir Tu PF: feniletanoidinių glikozidų farmakologinių tikslų nustatymas ir veiksmingumo analizėCistanchesHerba, pagrįsta „tikslinės žvejybos“ strategija. smakras Tradit Vaistažolių preparatai 49: 173-178, 2018 m.

26. Jiang Z, Zhou B, Li X, Kirby GM ir Zhang X:Echinakozidaspadidina spermatozoidų kiekį žiurkėms, nukreipdamas į pagumburio androgenų receptorius. Sci Rep 8: 3839-3850, 2018 m.

27. coffer PJ, Jin J ir Woodgett JR: baltymų kinazė B (c-Akt): daugiafunkcinis fosfatidilinozitolio 3-kinazės aktyvinimo tarpininkas. Biochem J 335, 1-13, 1998.

28. Wang S, Zheng G, Tian S, Zhang Y, Shen L, Pak Y, Shen Y ir Qian J:Echinakozidaspagerina 5-FU sukeltos mielosupresijos pelių hemopoetinę funkciją. Life Sci 123: 86-92, 2015 m.

29. Chen M, Wang X, Hu B, Zhou J, Wang X, Wei W ir Zhou H: apsauginis poveikisEchinakozidasnuo anoksijos / reperfuzijos pažeidimo H9c2 ląstelėse per padidintą p-AKT ir SLc8A3 reguliavimą. Biomed Pharmacother 104: 52-59, 2018 m.

30. Abeyrathna P ir Su Y: Akt svarbus vaidmuo širdies ir kraujagyslių funkcijoms. Vascul Pharmacol 74: 38-48, 2015 m.