Echinakozidas atšaukia miokardo remodeliavimą ir pagerina širdies veiklą

Kontaktas:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Yajuan Ni1|Jie Deng1|Xin Liu1|Qing Li1|Juanli Zhang1|Hongyuan Bai1|Jingwen Zhang2

Abstraktus

Miokardo remodeliacija yra svarbus patologinis ŠN pagrindas, mitochondrijų oksidacinis stresas yra miokardo hipertrofijos, fibrozės ir apoptozės skatintojas. ECH yra pagrindinis aktyvus tradicinės kinų medicinos Cistanches Herba komponentas, daugybė tyrimų rodo, kad jis pasižymi stipriu antioksidaciniu gebėjimu nervų ląstelėse ir navikuose, slopina mitochondrijų oksidacinį stresą, apsaugo mitochondrijų funkciją, tačiau specifinis mechanizmas neaiškus. SIRT1 / FOXO3a / MnSOD yra svarbi antioksidantų ašis, tyrime nustatyta, kad ECH kovalentiškai jungiasi prie SIRT1 kaip ligando ir padidina SIRT1 ekspresijos reguliavimą smegenų ląstelėse. Manome, kad ECH gali pakeisti miokardo remodeliavimą ir pagerinti HF širdies funkciją, reguliuodamas SIRT1 / FOXO3a / MnSOD signalizacijos ašį ir slopindamas mitochondrijų oksidacinį stresą kardiomiocituose. Čia pirmiausia ISO su AC-16 ląstelėmis sukeliame oksidacinio streso ląstelių modelį ir iš anksto apdorojame ECH, nustatome mitochondrijų ROS, mtDNR oksidacinio pažeidimo, MMP, karbonilinto baltymo, lipidų peroksidacijos, tarpląstelinio ROS ir aptikta apoptozė, patvirtina ECH poveikį mitochondrijų oksidaciniam stresui ir funkcijai in vitro. Tada sukuriame HF žiurkės modelį, sukeltą ISO, ir iš anksto apdorojame ECH. Matuojami širdies funkcijos, miokardo remodeliacijos, mitochondrijų oksidacinio streso ir funkcijos indeksai, SIRT1/FOXO3a/MnSOD signalizacijos ašies raiška, duomenys rodo, kad ECH gerina širdies veiklą, slopina miokardo hipertrofiją, fibrozę ir apoptozę didina SIRT1/FOXO3a/ raišką. MnSOD signalizacijos ašis sumažina mitochondrijų oksidacinius pažeidimus, apsaugo mitochondrijų funkciją. Darome išvadą, kad ECH pakeičia miokardo remodeliavimą ir pagerina širdies funkciją, reguliuodamas SIRT1 / FOXO3a / MnSOD ašį ir slopindamas mitochondrijų oksidacinį stresą HF žiurkėms.

KEYWORDSechinakozidas, širdies nepakankamumas, mitochondrijų oksidacinis stresas, miokardo remodeliavimas

šviežių žolelių cistancheįmitochondrijų oksidacinis stresas

1|ĮVADAS

Širdies nepakankamumas (ŠN) yra galutinis daugelio širdies ir kraujagyslių ligų, kurių paplitimas yra labai paplitęs ir kurios yra prastos prognozės, pasekmė, o dėl vis sunkėjančios visuomenės senėjimo tendencijos, hospitalizavimas ir mirtingumas dėl lėtinio širdies nepakankamumo (ŠN) smarkiai išaugo visame pasaulyje.1 Per pastaruosius 20 metų ŠN gydymas vaistais padarė didelę pažangą, tačiau poveikis yra labai ribotas, todėl skubiai reikia naujų vaistų. Miokardo remodeliavimasis yra svarbus patologinis ŠN pagrindas, kuriam būdinga miokardo hipertrofija, apoptozė, intersticinė fibrozė, miokardo ląstelės yra neorganizuotos, todėl sumažėja išstūmimo frakcija (KSIF), padidėja kairiojo skilvelio diastoliniai ir sistoliniai matmenys. (LVIDd ir LVID) ir kairiojo skilvelio frakcijinio sutrumpėjimo (LVFS) sumažėjimas.2 Tačiau pagrindiniai mechanizmai vis dar nebuvo iki galo suprasti. Pastaraisiais metais daugybė tyrimų patvirtino, kad oksidacinis stresas yra svarbus miokardo remodeliavimosi veiksnys.3-7

Oksidacinis stresas yra būklė, kai susidaro per daug reaktyviųjų deguonies rūšių (ROS) arba laisvųjų radikalų, kurie sukelia oksidacinį ląstelių komponentų pažeidimą, o tai savo ruožtu sukelia ląstelių disfunkciją.8 Mitochondrijos yra pagrindinis tarpląstelinės ROS šaltinis. nutekėjimas iš kvėpavimo elektronų transportavimo grandinės, o mitochondrijos yra jautriausia vieta ROS poveikiui.9 HF tyrimais nustatyta, kad iš kvėpavimo grandinės I komplekso padidėja ROS susidarymas.8 Padidėjusi ROS gamyba pirmiausia pažeidžia mitochondrijų komponentus ir sukelia perteklinį oksidacinį stresą. , pasireiškia kaip baltymų karbonilinimas, lipidų peroksidacija ir DNR pažeidimai10 bei mitochondrijų disfunkcija, dėl kurios susidaro per didelis ROS8 susidarymas, sudaro užburtą ratą. Įrodyta, kad ilgalaikis oksidacinis stresas gali sukelti miokardo hipertrofiją ir miokardo fibrozę, 11-13 ir sukelti miokardo ląstelių apoptozę, suaktyvindamas nuo mitochondrijų priklausomą apoptozę dėl mitochondrijų membranos baltymų karbonilinimo ir mitochondrijų membranos potencialo praradimo. Manoma, kad mitochondrijų oksidacinio streso slopinimas gali būti nauja strategija siekiant užkirsti kelią miokardo remodeliacijai ir net ŠN.15-17

Echinakozidas (ECH), natūralus feniletanoido glikozidas, yra pagrindinis aktyvus Cistanches Herba, kuris yra tradicinė kinų medicina, komponentas. Pastaraisiais metais ECH buvo plačiai ištirtas nervų sistemoje ir navikuose, ir buvo pranešta, kad jis turi įvairių farmakologinių poveikių, tokių kaip antioksidacinės, priešuždegiminės, antiapoptozės ir priešnavikinės savybės.18,19In nervų ląstelės, ECH žymiai padidina antioksidacinį pajėgumą, sumažina ROS gamybą, pagerina mitochondrijų membranų potencialą (MMP) ir padidina ląstelių gyvybingumą, 20 turi apsauginį poveikį mitochondrijų funkcijai ir slopina mitochondrijų oksidacinį stresą, apsaugo nuo oksidacinio pažeidimo ir gerina atmintį, galiausiai užkerta kelią neurodegeneracija.21,22 ECH taip pat padidina SOD aktyvumą ir atlieka apsauginį vaidmenį smegenų ir tinklainės audiniuose,19,23 tačiau specifinis antioksidacinio poveikio mechanizmas neaiškus.

SIRT1 yra glaudžiai susijęs su oksidaciniu stresu, o SIRT1 / FOXO3a / MnSOD signalizacijos ašis yra svarbiausia antioksidantų ašis ir yra atsakinga už mitochondrijų oksidacinio streso slopinimą, MnSOD plačiai pasiskirsto mitochondrijose ir pirmiausia yra atsakingas už mitochondrijų ROS išvalymą, taigi. slopindami oksidacinį stresą, junginiai, aktyvinantys šią antioksidacinę ašį, gali slopinti oksidacinį stresą.24,25 Naujausi tyrimai parodė, kad ECH farmakologinį poveikį daro reguliuodamas kelis signalizacijos kelius, tokius kaip p-AKT, mTOR/STAT3, TGF-beta 1/Smads. ir SIRT1 signalizacijos kelią.{10}} naujame tyrime nustatyta, kad ECH kovalentiškai jungiasi prie SIRT1 kaip ligando ir padidina SIRT1 ekspresiją smegenų ląstelėse.26 Tai rodo, kad ECH gali slopinti mitochondrijų oksidacinį stresą kardiomiocituose ir atvirkštinį miokardo veikimą. pertvarkymas. Tačiau ECH poveikio tyrimai buvo sutelkti į nervų sistemą arba naviką, o ECH poveikis ir mechanizmai mitochondrijų oksidaciniam stresui kardiomiocituose ir miokardo remodeliavimui lieka nežinomi. Čia pirmiausia sukelsime oksidacinio streso ląstelių modelį ISO ir patvirtiname ECH poveikį mitochondrijų oksidaciniam stresui ir funkcijai in vitro . Tada sukuriame ISO sukeltą HF žiurkės modelį ir parodome, kad ECH pakeičia miokardo remodeliavimą ir pagerina širdies funkciją, reguliuodamas SIRT1 / FOXO3a / MnSOD signalizacijos ašį ir slopindamas mitochondrijų oksidacinį stresą HF žiurkėms. Rezultatai yra skirti pateikti eksperimentinius įrodymus naujų vaistų, skirtų širdies nepakankamumui išvengti, kūrimui.

2|MEDŽIAGOS IR METODAI

2.1|Ląstelių kultūra ir gydymas

AC16 ląstelės perkamos iš Bena Culture Collection. Ląstelės laikomos didelės gliukozės kiekio Dulbecco modifikuotoje Eagle terpėje (DMEM; Hyclone, GE Healthcare, JAV) priede su 10 procentų galvijų vaisiaus serumo (10 procentų FBS; Gibco) T-75 kolbose (Corning Glassworks, Corning, NY, JAV). Sąlygos palaikomos 37 laipsnių drėgnoje atmosferoje, kurioje yra 5 procentai CO2. Kai ląstelės pasiekia 70 procentų -80 procentų susiliejimo, ISO (Sigma, JAV) grupės ląstelės 24 valandas inkubuojamos terpėje, kurioje yra 10 uM ISO (Sigma, JAV), ECH grupės ląstelės iš anksto apdorojamos 50 uM ECH (MCE). , JAV) 30 minučių prieš ISO ekspoziciją. Valdymo langeliai (Ctrl) nėra apdorojami.

Parduodu cistankąekstraktas

2.2|Mitochondrijų ROS lygio nustatymas naudojant luminolio chemiliuminescenciją

Mitochondrijos išskiriamos ir išvalomos iš AC-16 ląstelių naudojant Mitochondria Isolation Kit (Sigma, JAV) pagal gamintojo instrukcijas. Baltymų koncentracijos nustatomos naudojant BCA baltymų tyrimo rinkinį (Biotech). Mitochondrijų ROS lygis aptinkamas luminaliniu būdu (3-aminoftalio hidrazidas 5-amino-2, 3-dihidro-1, 4-ftalazinedionas), naudojant Elisa rinkinį (GERMED SCIENTIFIC INC, JAV), jis reaguoja su ROS ir sukelia fotonų emisiją, kuri yra juostos spektras, kurio smailė yra maždaug 460 nm, o santykinis šviesos vienetas (RLU) aptinkamas chemiliuminescencijos matavimo prietaisu ir paverčiamas RLU/ug. mitochondrijų baltymas.

2.3|8-OHdG naudojamas mitochondrijų DNR oksidaciniam pažeidimui įvertinti

Mitochondrijų DNR oksidacinis pažeidimas įvertinamas nustatant 8-hidroksi-2-deoksiguanozino (8-OHG) kiekį. Išgrynintos mitochondrijos ląstelėse išskiriamos naudojant mitochondrijų izoliavimo rinkinį, kaip nurodyta aukščiau (Sigma). Baltymų koncentracijos nustatomos naudojant BCA baltymų tyrimo rinkinį (Biotech). Tada jie atskiriami, kad būtų nustatytas 8-OHdG lygis naudojant Elisa rinkinį (GERMED SCIENTIFIC INC, JAV) pagal gamintojo instrukcijas. Spalvos pasikeitimo absorbcija matuojama spektrofotometru, kai bangos ilgis yra 450 nm. Tada 8-OHdG koncentracija mėginiuose nustatoma lyginant mėginių OD su standartine kreive ir paverčiama ng/ml.

2.4|JC išmatavo MMP-1

Mitochondrijos išskiriamos ir išvalomos nuo AC-16, o baltymų koncentracija nustatoma, kaip minėta aukščiau. Tada mitochondrijos resuspenduojamos esant 1 mg/ml koncentracijai, MMP matuojamas naudojant JC-1 tyrimo rinkinį pagal gamintojo instrukcijas. Fluorescencijos intensyvumas matuojamas, kai sužadinimo bangos ilgis: 490 nm, plyšys 5 nm, emisijos bangos ilgis: 590 nm, plyšys 5 nm su spektrofotometro prietaisu30, rezultatai pateikiami kaip FLU/ugP.

2,5|Apoptozinių ląstelių aptikimas srauto citometrija AC-16 ląstelėse

Srauto citometrija naudojama ląstelių apoptozei įvertinti. Apoptozinėms ir nekrozinėms ląstelėms aptikti pagal tiekėjo instrukcijas naudojamas Annexin V-FITC/PI apoptozės aptikimo rinkinys (CWBIO, Kinija). Ankstyvosios stadijos apoptozė, vėlyvosios stadijos apoptozė arba nekrozė, ląstelių liekanos ir gyvybingos ląstelės identifikuojamos kaip aneksinas V (pliusas)/PI (-), aneksinas V (pliusas)/PI (pliusas), aneksinas V (-)/PI. ( plius ) ir aneksinas V (−)/PI (−). Fluorescencijos intensyvumas analizuojamas naudojant srauto citometrą (BD FACSVerse™ Flow Cytometer, BD Biosciences, San Chosė, CA, JAV). Kiekvienas eksperimentas kartojamas 3 kartus.

2.6|Įvertintas tarpląstelinis ROS srauto citometru

Po apdorojimo ląstelės tripsinizuojamos, du kartus plaunamos PBS. Tada ląstelės resuspenduojamos PBS, nudažomos DCFH-DA (Beyotime, Kinija) iki galutinės 1 μM koncentracijos ir inkubuojamos 1 valandą 37 laipsnių temperatūroje inkubatoriuje su CO2, o po to tiriamos srauto citometru esant 488 nm sužadinimui. . Fluorescencijos intensyvumas parodo tarpląstelinės ROS lygį.

2.7|Patikrinkite karbonilo baltymų kiekį AC-16 ląstelių mitochondrijose

Po apdorojimo išvalytos mitochondrijos išskiriamos ir ultragarsu apdorojamos ant ledo ir apdorojamos 1 procento streptomicino sulfatu, kad nusodintų mitochondrijų nukleorūgštis, nustatoma baltymų koncentracija. Karbonilo baltymų kiekis tikrinamas naudojant Elisa rinkinį (GERMED SCIENTIFIC INC, JAV), pagrįstą karbonilo grupės dariniu dinitrofenilhidrazinu (DNPH), pagal rinkinio instrukcijas OD matuojamas mikroplokštelių skaitytuvu ir paverčiamas nmol/ mg baltymų, lyginant su standartine kreive.

2,8|Lipidų peroksidacijos lygio nustatymas AC-16 ląstelių mitochondrijose

Po apdorojimo ląstelės surenkamos ir lizuojamos, mitochondrijos išskiriamos ir išgryninamos bei suskaidomos ultragarsu, baltymų koncentracija nustatoma BCA baltymų tyrimo rinkiniu (Biotech), lipidų peroksidacija nustatoma pagal malondialdehido (MDA) lygį per TBARS tyrimą. , naudojant rinkinį (Nan jing Jian cheng, Kinija), o MDA lygis matuojamas pagal gamintojo protokolą. OD aptinkamas esant 586 nm mikroplokštelių skaitytuvu ir paverčiamas μmol/g baltymu, lyginant su standartine kreive.

2,9|Gyvūnai ir gydymas

Jauni Sprague-Dawley žiurkių patinai, sveriantys 120-140 g, yra įsigyti iš Xi'an Jiao tong universiteto laboratorinių gyvūnų centro (Šansi, Kinija). Tyrimas atitinka JAV nacionalinių sveikatos institutų paskelbtą laboratorinių gyvūnų priežiūros ir naudojimo vadovą (NIH leidinio Nr. 85-23, peržiūrėtas 1996 m.), o eksperimentinius protokolus patvirtino vietos valdžios institucijos ( Xi 'a Jiao Tong universiteto Medicinos departamento Biomedicininės etikos komitetas). ŠN modelis žiurkėms nustatytas taip, kaip aprašyta anksčiau.31 Trumpai tariant, izoproterenolis (10 mg/kg) skiriamas vieną kartą per dieną intraperitonine injekcija 2 savaites (apibrėžiama kaip ŠN grupė), ECH skiriama su 20 ug/g vieną kartą per parą švirkščiant į pilvaplėvės ertmę likus 30 min. iki ISO gydymo (apibrėžiama kaip ECH grupė), o vartojimas trunka 2 savaites. Kontroliniams gyvūnams skiriama 0,9 % NaCl (apibrėžiama kaip Ctrl grupė). Širdies funkcijai įvertinti atliekami echokardiografiniai matavimai.

2.10|Echokardiografiniai matavimai

Gyvūnai anestezuojami intraperitonine injekcija 300 mg/kg chloralio hidrato. Ultragarso sistema SONOS-2500 su 7,5 MHz ultragarso keitikliu (HP, JAV) naudojama echokardiografiniams tyrimams atlikti. Kairiojo skilvelio išstūmimo frakcija (KSEF), kairiojo skilvelio frakcijinis sutrumpėjimas (LVFS), kairiojo skilvelio galutiniai diastoliniai matmenys (LVIDd), kairiojo skilvelio galutiniai sistoliniai matmenys (LVID), širdies susitraukimų dažnis (HR), tarpskilvelinės pertvaros storis diastolėje (IVSTd). ), kairiojo skilvelio užpakalinės sienelės storis diastolėje (LVPWTd) matuojamas taip, kaip aprašyta anksčiau.32

PAVEIKSLAS 1 50μmol ECH veiksmingai slopina AC-16 ląstelių mitochondrijų oksidacinį stresą, kurį sukelia 10 μmol/L ISO, ir apsaugo mitochondrijų funkciją bei mažina apoptozę.

2.11|Matuojamas širdies svorio ir kūno svorio santykis (HW/BW).

Žiurkė pasveriama prieš anesteziją, išskiriama šviežia širdis ir išplaunamas kraujas su 0,1 mol/L PBS, išpjaunamos kraujagyslės ir kiti pertekliniai audiniai, o širdis pasveriama, tada nustatoma HW/BW(mg/100g). apskaičiuotas.

2.12|Histologinis dažymas

Žiurkių širdys išpjaustomos ir fiksuojamos 4 procentų paraformaldehidu, įterpiamos į parafiną ir supjaustomos į 5 μm storio griežinėlius. Patologiniams pokyčiams stebėti naudojamas dažymas hematoksilinu-eozinu (HE), o žiurkių miokardo audinio kolageno skaiduloms įvertinti naudojamas Massono trichromas. Širdies kolageno tūrio frakcija (CVF) ir kardiomiocitų skerspjūvio plotas matuojamas naudojant Image-Pro Plus 6.0 (Media Cybernetics, Bethesda, MD, JAV).

2.13|TUNEL dažymas

Surenkamas miokardo audinys iš kairiojo skilvelio ir TUNEL tyrimas atliekamas taip, kaip aprašyta anksčiau32

2.14|Perdavimo elektronų mikroskopas

Šviežias širdies audinys fiksuojamas 2,5 procento glutaraldehidu 4 laipsnių temperatūroje, tada audinys supjaustomas 1 mm3 tūrio ir vėl fiksuojamas 2,5 procento glutaraldehidu 4 laipsnių temperatūroje 2 valandas, tada plaunamas 0,1 mol/L PBS, fiksuojamas 1 procento osminėje rūgštyje, dehidratuotoje acetonu, įterptoje epoksidine derva, padaromos itin plonos, apie 800 nm plonos griežinėliai, nudažomos uranilo acetatu ir švino citratu, po to stebimos transmisijos elektronų mikroskopu (H{ {13}}, „Hitachi Limited“, Japonija). Norint kiekybiškai įvertinti apsauginį ECH poveikį mitochondrijų morfologijai, vidutinis mitochondrijų apskritimas, vidutinis mitochondrijų skerspjūvio plotas, degeneracijos procentas ir vakuolizacijos procentas mitochondrijose statistiškai analizuojami naudojant Image-Pro Plus 6.0 (Media Cybernetics, JAV).

2,15|Kiekybinė PGR

Bendra RNR gaunama iš kairiojo skilvelio audinio naudojant Trizol reagentą (Invitrogen, Carlsbad, JAV). cDNR sintetinama naudojant TUREscript 1st Strand cDNA Synthesis Kit (Takara, Japonija). Konkrečios kolageno pradmenų sekos, kurias naudoju realaus laiko PGR, yra tokios: pirmyn: 5′-GTCGTATCCAGTGCGTGTC-3′, atvirkštinė: 5′-GTGGAGTCGGCAATTGCA-3′. GAPDH pirmyn 5'-GGC AAG GTC ATC CCA GAG CT-3', atvirkštinė 5'-CGC CTG CTT CAC CAC CTT CT-3'. Realaus laiko kiekybinė PGR (qPCR) atliekama naudojant SYBRPremix Ex Taq (tobulas realiu laiku) (Takara, Japonija). Santykinis mRNR lygis apskaičiuojamas normalizuojant pagal GAPDH pagal 2-ΔΔCT metodą.

2,16|SIRT1, FOXO3a, MnSOD baltymų ekspresijos Western blot analizė

Visas kairiojo skilvelio audinio baltymas ekstrahuojamas ant ledo naudojant šaltą RIPA buferį (BioRad, JAV) su proteazės inhibitorių kokteiliu (Sigma-Aldrich). Koncentracija nustatoma BCA metodu. Western blot procedūros aprašytos anksčiau.33 Trumpai tariant, baltymų mėginys frakcionuojamas ant 15 procentų natrio dodecilsulfato-poliakrilamido gelių, perkeliamas į PVDF membranas (BioRad, JAV), blokuojamas 5 procentais nugriebto pieno ir inkubuojamas su MYH antikūnu iš pelės. (atskiestas santykiu 1:200, Santa Kruzas, JAV). Tada inkubuojamas su krienų peroksidaze konjuguotu ožkų pelių antikūnu (atskiestas santykiu 1:2, 000, Santa Kruzas, JAV). Santykinis baltymų lygis apskaičiuojamas normalizuojant vidutinę spindulių vertę iki -aktino. Baltymų juostos aptinkamos chemiliuminescencine sistema (ChemiDoc XRS, BioRad).

2,17|Mitochondrijų oksidacinio streso matavimas žiurkės miokarde

Išgrynintos žiurkės miokardo mitochondrijos išskiriamos naudojant Mitochondria Isolation Kit (Sigma, JAV) pagal gamintojo instrukcijas, mitochondrijų ROS, MMP, oksidacinis mtDNR pažeidimas, karbonilinto baltymo kiekis ir lipidų peroksidacijos lygis mitochondrijose aptinkami tais pačiais metodais kaip ir pirmiau aprašyti ląstelių eksperimentai. Pažymėtina, kad ROS miokardo audinyje aptinkamas naudojant DCFH-DA fluorescencinius zondus, fluorescencijos intensyvumas nustatomas naudojant fermentų žymėjimo matavimo prietaisą, rezultatai pateikiami kaip RLU/ug mitochondrijų baltymo.

2,18|Statistinė analizė

Visi duomenys pateikiami kaip vidurkiai ± SEM. Vienpusė ANOVA naudojama kelių grupių skirtumams palyginti, po to atliekamas Tukey post hoc reikšmingumo testas. Visa statistika nustatoma naudojant SPSS15.{2}} programinę įrangą (SPSS Inc, IL, JAV). Tikimybės reikšmė P < 0,05="" laikoma="">

3|REZULTATAI

3.1|50 μM ECH veiksmingai slopina mitochondrijų oksidacinį pažeidimą ir apoptozę AC-16 ląstelėse

Neapdorotos ląstelės nustatomos kaip Ctrl grupė. Pirma, kaip parodyta 1A paveiksle, ECH slopina mitochondrijų ROS, kurią sukelia ISO. ISO apdorotos ląstelės rodo reikšmingą mitochondrijų ROS padidėjimą, palyginti su Ctrl, ir šį padidėjimą žymiai sumažina išankstinis apdorojimas 50 μM ECH. Antra, ECH gali slopinti ISO sukeltą oksidacinį mtDNR pažeidimą. Manoma, kad 8-OHdG yra vienas iš labiausiai paplitusių DNR pažeidimų, atsirandančių dėl oksidacinio streso, ir yra oksidacinio DNR pažeidimo ir atstatymo biologinis žymeklis. Kaip parodyta 1B paveiksle, aptiktas 8-OHdG kiekis išgrynintose mitochondrijose iš AC-16 ląstelių, rezultatai rodo, kad 8-OHdG lygis mitochondrijose iš ISO apdorotų ląstelių labai padidėjo, bet pokytis buvo pakeistas 50 μM ECH. Trečia, ECH veiksmingai apsaugo MMP, kurį pažeidžia ISO. Ląstelėse, apdorotose ISO, fluorescencijos intensyvumas žymiai sumažėja, palyginti su Ctrl ląstelėmis, o išankstinis apdorojimas 50 μM ECH žymiai sumažina MMP sumažėjimą, kaip parodyta 1C paveiksle. Ketvirta, ECH apsaugo nuo oksidacinio mitochondrijų baltymo pažeidimo AC-16 ląstelėse. Kaip parodyta 1D paveiksle, karbonilo baltymų kiekis ISO apdorojimo ląstelių mitochondrijose žymiai padidėja, o ECH susilpnina poveikį. Penkta, ECH taip pat slopina mitochondrijų lipidų peroksidaciją AC-16 ląstelėse, kurią sukelia ISO. Kaip parodyta 1E paveiksle, lipidų peroksidų lygis ISO ląstelių mitochondrijose yra akivaizdžiai didesnis nei Ctrl ląstelėse, o šį padidėjimą žymiai sumažina išankstinis 50 μM ECH apdorojimas. Galiausiai ECH slopina tarpląstelinio ROS kaupimąsi. Kaip parodyta 1F paveiksle, tarpląstelinio ROS lygis ISO ląstelėse yra žymiai padidėjęs ir pastebimai sumažėja ECH iš anksto apdorotose ląstelėse. 1G paveiksle parodyta, kad AC-16 ląstelių apoptozės greitis žymiai padidėja po 24 valandų inkubacijos su 10 μM ISO, palyginti su Ctrl ląstelėmis, o prieš tai apdorotos ląstelės su 50 μM ECH žymiai sumažina ISO sukeltą apoptozę.

2 PAVEIKSLAS Gydymas ECH sumažina HF žiurkių širdies hipertrofiją, kurią sukėlė ISO, ir žymiai pagerina širdies funkciją.

3.2|ECH pakeičia miokardo remodeliavimąsi ir pagerina ISO sukeltų HF žiurkių širdies funkciją

Kaip parodyta 2A paveiksle, HF žiurkių širdys yra akivaizdžios hipertrofijos ir yra pakeistos gydant ECH. Kaip parodyta 2B-D ir L paveiksluose, ECH sumažina HW/BW. Echokardiografijos rezultatai rodo, kad ŠN grupėje KSIF ir KSFS žymiai sumažėja, ŠN grupėje – LVIDd, LVID ir IVSTd. Tačiau ECH žymiai sumažina LVIDd, LVID, IVSTd ir pagerina LVEF ir LVFS, nėra reikšmingo ŠSD skirtumo tarp trijų grupių, LVPWTd padidėja esant HF, bet nėra skirtumo tarp ECH ir Ctrl arba tarp ECH ir HF. 2E-K paveiksle parodyta. HE dažymo rezultatai rodo, kad ŠN žiurkėms atsiranda miokardo hipertrofija, išsidėsčiusi sutrikimo ar degeneracijos nekrozė, uždegiminių ląstelių infiltracija ir intersticinė hiperemija bei edema, o ECH žymiai palengvina šiuos pažeidimus, palengvėja miokardo hipertrofija ir sutvarkytas sutrikimas. degeneracinė nekrozė ir uždegiminis infiltratas sumažėja, kaip parodyta 3A paveiksle. Išmatuotas kardiomiocitų skerspjūvio plotas, jis žymiai padidėja po ISO ir sumažėja ECH gydytoje grupėje, kaip parodyta 3E paveiksle. Kolageno nusėdimo vertinimas naudojant Massono dažymą rodo, kad kairiojo skilvelio kolageno kiekis ŠN žiurkėms akivaizdžiai padidėja ir akivaizdžiai sumažėjo po gydymo ECH, o tai akivaizdžiai sumažina CVF. Realaus laiko PGR analizė atskleidžia, kad Ⅰ tipo prokolageno transkriptai yra reguliuojami ISO žiurkėms ir sumažinami ECH žiurkėms. Šie rezultatai atitinka vienas kitą, kaip rodo 3B ir FG paveikslai, duomenys rodo, kad ECH veiksmingai sumažina kolageno nusėdimą. . TUNEL teigiamų ląstelių skaičius kardiomiocituose žymiai padidėja HF žiurkėms, palyginti su Ctrl, ECH žymiai sumažina miokardo ląstelių apoptozę, o 3C-D paveiksle parodytas reprezentatyvus TUNEL teigiamų ląstelių vaizdas atitinkamai mažos ir didelės galios laukuose. 3H rodo miokardo ląstelių apoptozės greitį. Šie rezultatai rodo, kad ECH veiksmingai panaikina miokardo hipertrofiją, miokardo intersticinę fibrozę ir apoptozę bei pagerina širdies funkciją HF žiurkėms, kurias sukelia ISO.

3 PAVEIKSLAS Histologinio dažymo rezultatai rodo, kad ECH pakeičia kairiojo skilvelio remodeliavimąsi HF žiurkėms, sukeltą ISO.

3.3|ECH apsaugo HF žiurkių miokardo ultrastruktūrą

Perdavimo elektronų mikrografijos rezultatai rodo, kad ECH gali susilpninti miokardo ultrastruktūros pažeidimą, kaip parodyta 4A-B paveiksluose. Miofibrilės yra vertikaliai išsidėsčiusios, sarkomerų struktūra akivaizdi, miofilamentai išsidėstę tvarkingai, Z linija aiški. Mitochondrijos yra tvarkingai išdėstytos, o struktūra aiški Ctrl žiurkėse. Tačiau miofibrilės yra neorganizuotos, plyšusios ir ištirpusios, sarkomero struktūra neryški, Z linijos nebuvimas, matoma miokardo susitraukimo zona, padidėjęs mitochondrijų skaičius ir tūris, mitochondrijos yra įvairių formų ir dydžių, išsidėsčiusios netvarkingai, HF žiurkėms struktūra yra neaiški, patinimas ir kristų suskaidymas, kolapsas arba sulipimas ir ištirpsta į vakuolę. ECH akivaizdžiai susilpnina šiuos pokyčius, didžioji dalis širdies raumens skaidulų yra tvarkingai išsidėsčiusios, o miokardo gijos yra aiškios, Z linija yra, nors ir matomas tam tikras siūlų ištirpimas, sarkomero struktūra aiški, mitochondrijų tankis sumažėjęs, formos. ECH, palyginti su HF, akivaizdžiai sumažina mitochondrijų patinimą ir kristų suskaidymą, kolapsą ar sulipimą ir vakuolizaciją. Mitochondrijų patinimas ir kristų suskaidymas, kolapsas ar sulipimas ir dalinė vakuolizacija yra laikomi mitochondrijų degeneracija. Rezultatai rodo, kad ECH veiksmingai apsaugo miokardo ultrastruktūrą ir ypač apsaugo HF žiurkių mitochondrijų morfologiją, kaip parodyta 4C-F paveiksle.

4 PAVEIKSLAS ECH apsaugo HF žiurkių kardiomiocitų ultrastruktūrą ir mitochondrijų morfologiją, kurią sukelia ISO.

3.4|ECH reguliuoja SIRT1, FOXO3a ir MnSOD baltymų ekspresiją

Western Blot analizė rodo, kad SIRT1, FOXO3a ir MnSOD baltymų ekspresijos lygis HF žiurkėms yra žymiai sumažintas, tačiau ECH akivaizdžiai padidina sumažėjusią baltymų ekspresiją. Imunoblotavimo ir statistinės analizės rezultatų reprezentatyvios baltymų juostos parodytos 5 paveiksle. Duomenų dalis rodo, kad ECH padidina SIRT1, FOXO3a ir MnSOD baltymų ekspresiją.

3,5|ECH slopina mitochondrijų oksidacinį stresą kairiojo skilvelio miokardo audinyje

Šioje dalyje matuojamas mitochondrijų ROS, MMP, mitochondrijų DNR oksidacinis pažeidimas, karbonilo baltymų kiekis ir lipidų peroksidacijos lygis mitochondrijose kairiojo skilvelio miokardo audinyje žiurkėms, o rezultatai atitinka ląstelių eksperimentus, ty. ECH sumažina mitochondrijų ROS, apsaugo MMP, sumažina mtDNR pažeidimo laipsnį, sumažina karbonilo baltymų kiekį ir lipidų peroksidaciją mitochondrijose, kaip parodyta 6 paveiksle.

5 pav. ECH padidina SIRT1, FOXO3a ir MnSOD baltymų ekspresijos lygį, kuris yra sumažintas HF žiurkėms.

4|DISKUSIJA

Šis tyrimas rodo, kad ECH atlieka veiksmingą vaidmenį užkertant kelią miokardo remodeliavimui ir gerinant širdies funkciją, reguliuodamas SIRT1 / FOXO3a / MnSOD signalizacijos ašį ir slopindamas mitochondrijų oksidacinį stresą.

Mitochondrijos yra pagrindinė ROS, kaip oksidacinio fosforilinimo šalutinio produkto, susidarymo vieta, nes yra arti ROS, manoma, kad mitochondrijų baltymai, lipidai ir mtDNR yra pagrindiniai oksidacinio pažeidimo taikiniai po pernelyg didelio mitochondrijų ROS išmetimo, 34, 35. ši žala skatina tolesnę ROS gamybą, užburtas ratas tęsiasi, ROS ir oksidacinis stresas gali sukelti miokardo hipertrofiją, apoptozę, intersticinę fibrozę ir ŠN, aktyvindami kelis signalizacijos kelius.35 Taigi, atrodo, kad vaistai, skirti slopinti mitochondrijų oksidacinį poveikį. stresas yra veiksmingi miokardo remodeliacijos prevencijai. ECH yra natūralus feniletanoido glikozidas, tradicinės kinų žolės Cistanche tubulosa komponentas. jis yra plačiai ištirtas ir pastaraisiais metais buvo įrodyta, kad jis turi tam tikros rūšies farmakologinės veiklos, pavyzdžiui, priešnavikinį, anti-apoptozę, senėjimą stabdantį, neuroprotekcinį poveikį ir pan. Tyrimai įrodė, kad ECH farmakologinis poveikis daugiausia priklauso nuo jo antioksidacinio ir priešuždegiminio aktyvumo, 18, 21 o ECH sumažina mitochondrijų ROS ir apsaugo mitochondrijų funkciją nuo oksidacinio pažeidimo nervinėse ląstelėse.20, 22 Čia pirmiausia įrodėme, kad ECH sumažina kardiomiocitų mitochondrijų ROS, todėl pagerina MMP, mažina mtDNR, baltymų ir lipidų oksidacinį pažeidimą, veiksmingai slopina mitochondrijų oksidacinį pažeidimą ir mažina apoptozę in vitro ir in vivo, taigi, jis atšaukia miokardo remodeliavimąsi ir pagerina širdies veiklą. Tai reiškia, kad ECH yra potencialus naujas vaistas, skirtas miokardo remodeliacijos ir ŠN profilaktikai.

Normaliomis sąlygomis mitochondrijų ROS daugiausia išvalo MnSOD, kuris pasiskirsto mitochondrijose ir apsaugo nuo mitochondrijų oksidacinio pažeidimo. Ang II reikšmingai sumažina kardiomiocitų MnSOD ekspresiją ir sukelia miokardo hipertrofiją, tačiau resveratrolis gali padidinti MnSOD raišką ir slopinti Ang II sukeltą miokardo hipertrofiją.36 Sergant ŠN MnSOD aktyvumas žymiai sumažėja, o mitochondrijų ROS generacija padidėja. .37,38 Iš širdžiai specifinių MnSOD genų išmuštų pelių mitochondrijų ROS nepavyko išvalyti, o ROS padidėja kardiomiocituose, todėl atsirado mitochondrijų disfunkcija ir progresuojantis širdies padidėjimas, galiausiai sukeldamas širdies nepakankamumą.39 Šiame tyrime patvirtiname, kad kad MnSOD ekspresija žymiai sumažėja, o tai susilpnėja gydant ECH, todėl sumažėja mitochondrijų ROS ir slopinamas mitochondrijų oksidacinis stresas. Tai reiškia, kad ECH apsaugo kardiomiocitus nuo oksidacinės pažaidos, padidindamas MnSOD ekspresijos reguliavimą, toliau tyrinėjame molekulinius mechanizmus, kuriais grindžiamas šis poveikis.

MnSOD ekspresiją reguliuoja FOXO3a, kuris yra transkripcijos faktorius ir jungiasi prie MnSOD geno promotoriaus regiono ir skatina genų transkripciją.40 SIRT1 yra FOXO3a molekulė prieš srovę ir gali suaktyvinti FOXO3a deacetilinant. SIRT1/FOXO3a/MnSOD signalizacijos ašis vaidina pagrindinį vaidmenį apsaugant nuo oksidacinio streso įvairių tipų ląstelėse, signalizacijos ašies aktyvinimas estradioliu slopina oksidacinį stresą ir apsaugo širdį24; Signalizacijos ašies aktyvinimas resveratroliu slopina oksidacinio streso sukeltą ląstelių mirtį40; Priešingu atveju angiotenzinas II slopina SIRT1/FoxO3a/MnSOD kelią ir sukelia mitochondrijų oksidacinį stresą, mtDNR pažeidimą osteoblastuose,415 tipo adenililciklazė padidina oksidacinį stresą slopindama MnSOD ekspresiją per Sirt1/FoxO3a kelią. SIRT1, FoxO3a ir MnSOD ekspresija yra žymiai sumažinta HF žiurkėms, padidėja mitochondrijų ROS ir padidėja oksidacinis stresas, tačiau pokyčius keičia ECH. Nauji tyrimai rodo, kad ECH tiesiogiai suriša SIRT1 kaip ligandą ir sudaro kompleksą su 9 kovalentiniais ryšiais ir padidina SIRT1 ekspresijos reguliavimą nervinėse ląstelėse.26 Remiantis šiuo tyrimu, šis tyrimas rodo, kad ECH taip pat reguliuoja SIRT1 ekspresiją. SIRT1 kardiomiocituose, tada padidina MnSOD genų ekspresiją per FoxO3a ir slopina mitochondrijų ROS bei oksidacinį stresą.

Ilgalaikė lėtinė išemija gali sukelti miokardo žiemojimą, šiose žiemojančiose miokardo ląstelėse paprastai netenkama susitraukiančių siūlų, citozolyje yra perteklinis glikogeno granulių, sarkoplazminis tinklas, prarandami skersiniai kanalėliai43, taip pat yra mitochondrijų dydžio ir formos anomalijų. , reaktyvioji miokardo hipertrofija ir intersticinė fibrozė, kuri yra antrinė dėl miocitų praradimo.44 Savo tyrime taip pat stebėjome pirmiau minėtus pokyčius ŠN žiurkėms, tuo tarpu ECH žymiai sumažina šiuos pokyčius, nes naujausias tyrimas pranešė apie širdies funkcijos atsigavimą po išeminio streso. Miokardo užmigdymo ypatybė45, taip pat matuojamas miokardo glikogeno lygis, rezultatai rodo, kad tarp trijų grupių nėra reikšmingo skirtumo, kaip parodyta 7J paveiksle.

Ankstesniame tyrime taip pat buvo nustatytas miokardo užmigdymas ne išeminio širdies nepakankamumo kiaulių modelyje, aukštu dažniu stimuliuojant KS laisvąją sienelę46, nes mikrovaskulinė obstrukcija vaidina svarbų vaidmenį miokardo užmigdymo miegu ir dėl to atsirandančiame susitraukimų sutrikime, o tai žymiai pagerėja, kai mikrovaskulinė obstrukcija panaikinama vartojant vaistą.47 Šiuo metu kai kuriuose tyrimuose daroma išvada, kad revaskuliarizacijos terapija yra veiksminga užmigdant miokardą,43 naudojant HE ir Masson dažymą, pastebime, kad žiurkėms, sergančioms ŠN, miokardo kapiliarų ir arteriolių tankis akivaizdžiai sumažėja ir žymiai palengvėja. ECH, kaip parodyta 7A-H pav. Ankstesni tyrimai parodė, kad kiti natūralūs junginiai, tokie kaip miežių beta-gliukanas, padidina MnSOD ekspresiją, 48, 49, o MnSOD padidėjimas yra susijęs su padidėjusiu miokardo kapiliarų tankiu ir VEGF ekspresija. Mes atlikome RT-PCR, kad nustatytų VEGF ekspresiją, duomenys atitinka histologinio dažymo radinį, o tai reiškia, kad ECH gali skatinti angiogenezę ir padidinti miokardo kapiliarų tankį reguliuodamas VEGF ekspresiją, kaip parodyta 7I paveiksle. Šiame tyrime nustatyta, kad ECH gali apsaugoti ir padidinti miokardo kapiliarus ir arteriolius, reguliuodamas SIRTI / FOXO3a / MnSOD kelią ir VEGF ekspresiją, taip slopindamas žiemojantį miokardą ir prisidedant prie širdies funkcijos gerinimo.

Cistanche prisidedaįgerinant širdies veiklą.

Norėdami gauti daugiau informacijos, spustelėkite čia.

Pažymėtina, kad kardiomiocitų apoptozė yra gerai žinomas kaip svarbus patologinis širdies nepakankamumo pokytis, o šis tyrimas iš tikrųjų patvirtina, kad didelis kiekis apoptozinių ląstelių HF žiurkėse ir ECH žymiai sumažina apoptozę reguliuodamas SIRTI / FOXO3a / MnSOD kelią ir slopindamas. mitochondrijų oksidacinis stresas, kaip minėta aukščiau.

Visų pirma, ECH atšaukia miokardo remodeliavimą ir pagerina širdies veiklą, reguliuodamas SIRT1 / FoxO3a / MnSOD signalizacijos ašį, taip slopindamas mitochondrijų oksidacinį stresą ir sumažindamas užmigdantį miokardą. Taigi siūloma, kad ECH yra galimas vaistas miokardo remodeliacijos ir ŠN profilaktikai arba gydymui.