Cistanche Tubulosa ekstraktų poveikis streptozotocino ir nikotinamido sukeltų diabetinių žiurkių patinų reprodukcinei funkcijai

Raktiniai žodžiai:diabetas; nevaisingumas;Cistanche tubulosaekstraktas(CTE);echinakozidas(ECH);priešuždegiminisveikla;antioksidantasveikla;steroidogenezėefektai

Norėdami gauti daugiau informacijos apie cistanche ekstrakto miltelių naudą

1. Įvadas

Cukrinis diabetas (DM) yra būklė, kai dėl padidėjusio gliukozės kiekio kraujyjedėl kasos neveiksmingumo gaminant pakankamai insulino arba organizmo nesugebėjimą jo panaudotiefektyviai. PSO duomenimis, 1980 metais diabetu sergančių žmonių skaičius išaugo nuo 108 mlniki 422 mln., 2014 m.1]. Yra keturios pagrindinės kategorijos: priešdiabetas (stadija prieš diabetą), 1 tipas(kai kasa negamina insulino), 2 tipo (organizmas nenaudoja insulino) ir gestacinis.diabetas (pasireiškia nėštumo metu). Oksidacinis stresas atsiranda dėl disbalanso tarpreaktyviųjų deguonies rūšių (ROS) ir antioksidantų gamyba [2] galiausiai sukelia diabetinę būklę.Cukrinio diabeto komplikacijos yra inkstų nepakankamumas, nervų pažeidimas, aklumas, insultas, širdispriepuolis, vaisiaus mirtis ir nevaisingumas. [1]. Tyrimai rodo, kad spermatozoidų branduoliai, dezoksiribonukleino rūgštis (DNR),diabetu sergančių vyrų mitochondrijos buvo labai pažeistos [3]. Oksidacinis stresas jo metuspermos transportavimas pakeis vyrų reprodukcinės sistemos procesą [4,5]. 

Spermatogenezės procesą kontroliuoja pagumburio-hipofizės-lytinės liaukos (HPG)ašį. Gonadotropiną atpalaiduojantis hormonas (GnRH), kurį gamina pagumburis, stimuliuojaliuteinizuojančio hormono (LH) ir folikulus stimuliuojančio hormono (FSH) gamyba. Rasta Leydig ląsteliųgreta sėklinių kanalėlių ir gamina testosteroną kontroliuojant LH. FSH trigeriaiantigeną surišančio baltymo (AKP), kuris padeda perduoti vyrišką hormoną, gamyba. Taigi, nevaisingumasir kitos problemos daugiausia kyla dėl HPG ašies sutrikimų. Administravimasstreptozotocino ir nikotinamido derinys eksperimentinėms žiurkėms sukelia diabetą. Streptozotocinasyra cheminis junginys, toksiškas insulino gamybai kasos ląstelės ir nikotinamidas yra avandenyje tirpus vitaminas, kuris apsaugo ląstelės nuo visiško pažeidimo [6]. Cistanche tubulosayra dykumos augalų rūšis, dar žinoma kaip „Rou Cong-Rong“ [7]. Tai yranechlorofilinis parazitinis augalas, augantis daugiausia ant šakniesCalotropis proceramedis ir yraplačiai paplitęs sausringoje Gansu, Činghajaus, Sindziango, Mongolijos, Irano ir Indijos žemėje. BendrasisvardasCistanche tubulosayra „Dykumos hiacintas“. Tai plačiai pripažįstama tradicinėje kinų medicinojeir jam suteiktas „Dykumos ženšenio“ pavadinimas. Jis plačiai naudojamas medicinos srityjegydyti liguistą leukorėją, gausią metroragiją, lėtines inkstų ligas, vidurių užkietėjimą, impotenciją irnevaisingumas. Cheminės sudedamosios dalysCistanche tubulosasusideda iš nelakių feniletanoidinių glikozidų(PHG), iridoidai, lignanai, lakieji aliejai, alditoliai, oligosacharidai ir polisacharidai [8]. Studijosrodo, kad šios žolės echinakozidas apsaugo pažeistus fibroblastus, reguliuodamas ROS lygį [9]. Šis junginys sukelia antioksidacinį, kraujagysles atpalaiduojantį ir priešuždegiminį poveikįneuroprotekcija ir osteoporozės prevencija [10,11]. Šiuo tyrimu buvo siekiama ištirti poveikįCistanche tubulosaekstraktaskurių sudėtyje yra ECHstreptozotocino ir nikotinamido sukeltos diabetinės žiurkės reprodukcinė disfunkcija.

2. Medžiagos ir metodai

2.1. Medžiagos

ECH ir CTE buvo įsigyti iš Sinphar Pharmaceutical Co., Ltd (Yilan, Taivanas). Išplėstinėglikacijos galutiniai produktai (AGE) buvo įsigyti iš Biovision (San Franciskas, CA, JAV). LC-540ir TM3 ląstelių linijos buvo nupirktos iš Maisto pramonės tyrimų ir plėtros instituto(Hsinchu, Taivanas). Penkių savaičių Sprague-Dawley (SD) žiurkių patinai buvo įsigyti išNacionalinis laboratorinių gyvūnų centras (Taipėjus, Taivanas). Pašarų laboratorijos dieta® buvo pirktas iš PMINutrition International, Inc. (Taipėjus, Taivanas). 2,2-difenil-1-pikrilhidrazilas (DPPH) buvo gautasiš Sigma (St. Louis, MO, JAV). Metanolis ir 4-(2-hidroksietil)-1-piperazinetansulfonasrūgšties (HEPES) taip pat buvo nupirkta iš Sigma. Dulbecco modifikuotas Eagle medium/F12 irtripsinas-EDTA buvo gautas iš GIBCO (Niujorkas, NY, JAV). 3-(4, 5-dimetiltiazol-2-ilas)-2,5-difeniltetrazolio bromidas (MTT), dichlordihidroflfluoresceino diacetatas (DCFH-DA), dimetilassulfoksidas (DMSO) ir nitromėlynasis tetrazolis (NBT) buvo įsigyti iš Sigma. Gliukozė fermentinėrinkiniai buvo gauti iš Kyokutoseiyaku, Tokijas, Japonija. Buvo nupirkti insulino ELISA rinkiniaiiš Mercodia AB Inc., Sylveniusgatan 8A (Upsala, Švedija). T-PER audinių baltymų ekstrahavimasReagentas buvo įsigytas iš Thermo Scientifific (Čikaga, IL, JAV). Anti-žmogaus/pelės/žiurkės branduolinisfaktorius-kappa B NF-κB polikloniniai antikūnai buvo įsigyti iš Santa Cruz Biotechnology, SantaCruz, CA, JAV. Anti-Mouse / Rat receptorius pažangiems glikacijos galutiniams produktams (RAGE) polikloniniamsantikūnai, anti-žmogaus/pelės/žiurkės StAR polikloniniai antikūnai ir anti-žmogaus/pelės/žiurkės antikūnaiCitochromo P450 17A1 monokloniniai antikūnai buvo įsigyti iš Gene Tex (Irvine, CA, JAV).Anti-žmogaus/pelės/žiurkės CYP11A1 polikloniniai antikūnai buvo gauti iš Cell SignalingTechnologijos (Beverly, PA, JAV). Easy-Blue reagentas buvo įsigytas iš Invitrogen, Thermo FisherMokslinis (Karlsbadas, Kalifornija, JAV). Agarozė ir 100 bp DNR žymuo buvo gauti iš Promega,korporacija (Madisonas, WI, JAV). RNeasy Lipid Tissue Mini rinkinys buvo įsigytas iš QIAGEN,Hildenas, Vokietija.

5 procentai CO2 inkubatorius (CO2 inkubatorius, Napco 5410, Taivanas). TM3 ląstelių linija buvo auginama Dulbeccomodifikuota Eagle terpė (DMEM), papildyta gliukoze (4,5 g/l), natrio piruvatu (0,5 mM),L-glutaminas (2,5 mM), natrio bikarbonatas (1,2 g/l), 4-(2-hidroksietil)-1-piperazinetansulfonasrūgštis (HEPES, 15 mM) ir vaisiaus veršelio serumas (FCS, 10 proc.) arba arklio serumas (5 proc.) esant 37◦C 5 procCO2 inkubatorius.

Echinakozido (ECH) ląstelių gyvybingumo nustatymas: 3-(4, 5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-Ląstelių gyvybingumo tyrimui buvo naudojamas difeniltetrazolio bromido (MTT) reagentas. Ląstelių koncentracijabuvo pakoreguotas į 2× 105ląstelių / ml 96-šulinėlių plokštelėje. Tada, 20µL ECH (atskiestas 2 procentais terpės)buvo pridėta ir inkubuojama 24 valandas 37 °C temperatūroje◦C 5 procentų CO2 inkubatorius. Vėliau 100µL MTT reagento buvopridedama ir inkubuojama 4 valandas 37 temperatūroje◦C tamsiomis sąlygomis. Absorbcija buvo matuojama esant 570 nm(ELISA skaitytuvas, Dynatech MR5000, Kloten, Šveicarija).Santykinis ląstelių gyvybingumas (procentais)=[(Amėginys esant 570 nm− Atuščias esant 570 nm)]/[(AKontrolė 570− Atuščia 570)] × 100.

Reaktyviųjų deguonies rūšių (ROS) turinio analizė:

Ląstelės numeris buvo pakoreguotas2 × 105ląstelių/ml12-šulinėlių plokštelėje, kurioje yra 2 procentai FBS. Tada, 50µL/mL ECH, RES ir AGEbuvo dedama į plokštelę ir inkubuojama 37 °C temperatūroje◦C 24 val. Po 24 val., 20 ,70 -dichlorfluoresceino-diacetatas(DCFH-DA) buvo pridėta ir inkubuojama 37 °C temperatūroje◦C 30 min. Po centrifugavimo (400× g, 5 min.),

ir AGE buvo pridėta ir inkubuojama 37 °C temperatūroje◦C 5 procentų CO2 inkubatorius 24 val. Po 400µL iš T-PERbuvo pridėtos, nubrauktos ląstelės ir centrifuguotos esant 125,000× g 20 minučių (4◦C). Supernatantasbuvo surinktas ir saugomas adresu−80 ◦C (−80 ◦C šaldiklis, Nuaire, Plymouth, MN, JAV) tolesnei analizei.

Baltymų kiekybiniam įvertinimui buvo naudojamas bicinchonino rūgšties (BCA) rinkinys. Tada, 10µL standartinio ląstelių tirpaloir 200µL BCA reagento buvo pridėta į 8-šulinėlių plokšteles ir inkubuojama 37 °C temperatūroje◦C 5 procentų CO2 inkubatorius30 min. Sugertis buvo išmatuota ties 562 nm. Buvo atlikta baltymų identifikavimo analizėnatrio dodecilsulfato (SDS)-poliakrilamido gelio (SDS-PAGE) elektroforezės būdu. Mėginiai buvoparuoštas pridedant baltymų lizatą į baltymų pakrovimo buferį ir atlikta Western blot analizėaptikti specifinius baltymus.

2.2.2. In vivo analizė

Gyvūnų modelio dizainas: išNacionalinis laboratorinių gyvūnų centras (Taipėjus, Taivanas). Kiekviena žiurkė buvo laikoma atskirai dezinfekavimo priemonėjenerūdijančio plieno narveliai kontroliuojamoje temperatūroje (23± 1 ◦C) ir drėgmę (40–60 proc.) su 12 valšviesos/12 h tamsos ciklas. Maistas ir vanduo buvo tiekiami ad libitum. Kiekviena žiurkė buvo prijaukinta pirmuojusavaitę, o pagrindinė dieta buvo skirta laboratorinei graužikų dietai 5001. Visos procedūros atitiko standartąInstitucinio gyvūnų priežiūros ir naudojimo komiteto (IACUC patvirtinimo Nr. 101026) NacionalinėsTaivano vandenyno universitetas, Taivanas. Po prijaukinimo žiurkės buvo suskirstytos į dvi grupes: kontrolinesgrupė (Con), kuri buvo šeriama laboratorine dieta 5001, ir diabetinė grupė, kuri buvo šeriama daug riebalų turinčia dieta.(HFD, 40 proc.) visam eksperimentui. 4 savaites maitinus HFD, diabetikų grupėžiurkėms buvo suleista streptozotocino (65 mg/kg) (STZ), siekiant sukelti diabetą (DM). Viduje15 min. sušvirkštus STZ, buvo suleistas nikotinamidas (230 mg/kg kūno svorio). Praėjus savaitei po injekcijos,buvo atliktas geriamojo gliukozės tolerancijos testas (OGTT), siekiant nustatyti sėkmingą diabeto indukciją.Mellitus (DM). Po to gyvūnai buvo suskirstyti į šešias grupes: kontrolinius (šeriami laboratorine dieta5001); DM grupė (DM plius 45 procentai HFD); DMR grupė (DM ir roziglitazonas: 0,571 mg/kg KM) plius 45 procentai HFD;DME1 grupė (DM plius CTE: 80 mg/kg KM) plius 45 procentai HFD; DME2 grupė (DM plius CTE: 160 mg/kg KM)plius 45 procentai HFD; ir DME4 grupė (DM plius CTE: 320 mg/kg KM) plius 45 procentai HFD. Rosiglitazonas (RSG) buvolaikoma teigiama kontrole. Buvo panaudotos trys CTE dozės (80, 160 ir 320 mg/kg).Taivano maisto ir vaistų administracijos (TFDA) rekomendacija sveiko maisto funkcinisvertinimo gaires. Gydymas buvo atliktas iki eksperimento pabaigos. Visos eksperimentinės žiurkėsbuvo paaukoti po 6 savaičių. Iš žiurkių paimtas kraujas centrifuguojamas 3000 aps./min15 min 4 val◦C. Supernatantas buvo ištirtas tokiai analizei atlikti:Bendras gliukozės, trigliceridų ir cholesterolio kiekis

Nustatymas:

Gliukozės nustatymas buvoatliekama naudojant gliukozės fermentų rinkinius. Tada, 20µL kraujo plazmos mėginiai buvo pridėti priereagentai ir laikomi 37 temperatūroje◦C 5 min. Bendras trigliceridų ir bendro cholesterolio kiekis buvonustatoma naudojant trigliceridų ir cholesterolio fermentų rinkinius. Tada, 10µL kraujo plazmos buvobuvo pridėta prie reagentų ir eksperimentas buvo atliktas pagal gamintojo instrukcijas.Absorbcija buvo matuojama esant 510 nm.Bendra gliukozės / trigliceridų / cholesterolio koncentracija plazmoje (mg/dL)=(Amėginys− ATuščias)/(Astandartinis− ATuščias) × 200. Pavyzdys: kraujo mėginių absorbcija, ATuščias: rinkinių be mėginio sugerties vertė, standartinė: standartinio reagento sugerties vertė, 200: standartiniai reagentai, kurių koncentracija yra200 mg/dl.Insulino, leptino ir homeostatinio modelio įvertinimas – atsparumo insulinui (HOMA-IR) nustatymas:Insulino lygis buvo nustatytas insulino ELISA rinkiniais. Čia, 25µĮpilta L kraujo plazmosreagentai, o absorbcija buvo išmatuota esant 450 nm. Bendras leptino kiekis buvo nustatytas naudojantleptino fermento imunometrinio tyrimo rinkinys. Tada 100µBuvo ištirta L plazmos ir absorbcijabuvo matuojamas esant 450 nm, naudojant ELISA skaitytuvą. Visas eksperimentas buvo atliktas pagalgamintojo instrukcijas. HOMA-IR vertė buvo nustatyta pagal homeostazės modelįįvertinimo lygtis=Insulino koncentracija plazmoje nevalgius (mU/mL)× gliukozės kiekis plazmoje nevalgiuskoncentracijos (mmol/L)/22,5.Plazmos lipidų peroksidacija: čia 0,5 ml kraujo plazmos buvo sumaišyta su 1 ml reagento (15 proc.m/v trichloracto rūgštis {{0}},25 N druskos rūgštyje (HCl) ir 0,375 proc.w/v tiobarbitūro rūgštis0.25 N HCl) ir dedamas į vandens vonią (Water Bath, BUCHI 461, Ciurichas, Šveicarija) 100◦C už15 min. Po aušinimo įpilama 1 ml n-butanolio, stipriai suplakama ir centrifuguojama esant 1500× g 10 min. Supernatantas buvo surinktas ir išmatuota absorbcija esant 532 nm [12]. Malondialdehido (MDA) koncentracija (nM/mL)=[(Mėginysties 532 nm− Atuščias esant 532 nm)/ (Standartinisties 532 nm− Atuščias esant 532 nm)] × 5. Testosterono ir liuteinizuojančio hormono (LH) lygio nustatymas plazmoje: testosteronasTestosterono kiekiui kraujo plazmoje matuoti buvo naudojamas ELISA rinkinys. RIA rinkinys buvo naudojamasnustatyti LH koncentraciją. Tada, 50µBuvo pridėta L plazmos ir buvo atlikti skaičiavimaidėl hormono LH-RP-3 koncentracijos (standartinis). Tolesni veiksmai buvo atlikti pagalpagal gamintojo instrukcijas.Naviko nekrozės faktoriaus (TNF) nustatymas – ir interleukino-6 (IL-6) koncentracija:Pagautas antikūnas buvo atskiestas 250 kartų dengimo buferiu ir įdėtas į 96-šulinėlių plokštelę (100µL / šulinys),ir laikė 4 val◦C per naktį. Supernatantas buvo išsiurbtas ir penkiolika kartų nuplaunamasbuferis (1 kartas PBS, 0.05 proc. Tween 20). Po inkubacijos (1 val.) su 200µg tyrimo skiediklio, ląstelės buvoišplauti 5 kartus plovimo buferiu ir 100µL TNF- buvo standartinis tirpalas arba tiriamieji mėginiaiįpilama į kiekvieną duobutę ir inkubuojama 2 val. Po plovimo 100µBuvo pridėta L IL-6 aptiktų antikūnųir inkubuojamas 1 val. kambario temperatūroje. Supernatantas išsiurbtas ir išplautas 5 kartus. Tada480 µPridėta L fermento avidino-krienų peroksidazės (HRP) ir inkubuojama 30 min.temperatūros. Supernatantas buvo išsiurbtas ir penkis kartus plaunamas plovimo buferiu. Tada 100µL buvo pridėta substrato tirpalo ir inkubuojama 15 minučių kambario temperatūroje. Vėliau, 50µL stotelėĮ kiekvieną šulinėlį įpilama 1 M fosforo rūgšties tirpalo ir išmatuota absorbcija esant 450 nm.Spermos ir sėklidžių parametrų analizėSpermos mėginių paėmimas: Spermos mėginių paėmimas buvo atliktas pagalmetodas, anksčiau aprašytas [13]. Spermatozoidai buvo paimti iš supernatanto ir panaudotitolesnė analizė.Spermatozoidų skaičius, spermatozoidų judrumas ir nenormalus spermatozoidų skaičius: spermatozoidų skaičius buvoapskaičiuojamas naudojant hemocitometrą ir tripano mėlynojo tirpalą. Tada 100µL spermos skysčio buvosumaišytas su tripano mėlynojo tirpalu ir buvo nustatytas spermatozoidų skaičius, judrumas ir nenormalus spermatozoidų skaičiusapskaičiuojamas naudojant hemocitometrą ir mikroskopą [14]. Nitro mėlynasis tetrazolis NBT spermos ir sėklidžių redukcija ir lipidų peroksidacija: lipidaiperoksidacija ir NBT redukcija buvo analizuojami pagal tą pačią plazmos analizės procedūrą.

Superoksido dismutazės (SOD) ir katalazės aktyvumo nustatymas: Superoksido dismutazė(SOD) aktyvumas buvo analizuojamas naudojant RANSEL rinkinį. Čia 0.05 mL sėklidžių homogenatųbuvo įpilta į 1,7 ml reakcijos tirpalo (0.05 mM ksantino, 0,025 mM 2-(4-jodofenilo)-{{0}}(4-nitrofenolis)-5-feniltetrazolio chloridas (INT)). Sumaišius, 0,25 ml ksantino oksidazės (80 U/L)buvo pridėta ir reaguojama kambario temperatūroje 30 s kambario temperatūroje. Absorbcija buvomatuojamas ties 505 nm. Sėklidžių homogenato baltymų koncentracija buvo nustatyta pagalApskaičiuotas Bio-Rad DC baltymų tyrimo rinkinys ir jo specifinis aktyvumas (U/mg baltymo). Katalazė(CAT) aktyvumas buvo nustatytas pagal anksčiau aprašytą metodą [15]. H&E (hematoksilino ir eozino) dažymasSėklidė buvo mirkoma 10 procentų formalino 24 valandas ir laikoma 4 temperatūroje◦C. Supjaustė audinius įmikro dydžio ir pritvirtintas prie skaidrės. Po fiksavimo (95 procentai metanolio ir 5 procentų acto rūgšties) stikleliai buvopanardinti į hematoksiliną 3 min., plauti tekančiu vandeniu 5 min., o po to mirkyti50 procentų, 70 procentų ir 90 procentų alkoholio vieną minutę. Po to stikleliai buvo nudažyti eozinu 10 s irmirkoma 100 procentų spirite vieną minutę, kol išbluko. Galiausiai stiklelį vienam pamirkome ksileneminutė. Vėliau stiklelis buvo išdžiovintas ore ir užsandarintas. Dažytas vamzdelis buvo dedamas į apverstą fazės kontrastąmikroskopu (Inverted Phase Difference Microscope, Olympus CK-2, Tokijas, Japonija) stebėtimorfologija.Pagumburio analizėPelės KISS1, su G baltymu susietas receptorius (GPR) 54, citokinų signalizacijos 3 slopintuvas (SOCS-3)ir sirtuinas 1 (SIRT1)genų sekos buvo nustatytos iš NCBI (Nacionalinio biotechnologijų centroInformacija) genų duomenų bazė ir konkretus pradmuo buvo sukurtas naudojant Primer 5.0 PREMIER Biosoft,Palo Altas, Kalifornija, JAV). Eksperimente naudojami pradmenys pateikti lentelėje1.

Ribonukleino rūgšties (RNR) ekstrahavimas iš hipotalamo. RNR išskyrimas išsmegenų pagumburio tyrimas buvo atliktas naudojant RNeasy Lipid Tissue Mini rinkinį. GautasmRNR buvo kiekybiškai išmatuotos atvirkštinės transkripcijos (RT) ir polimerazės grandininės reakcijos būdu(PGR). Komplimentinė DNR, gauta iš RT analizės, buvo saugoma−20 ◦C vėlesniam naudojimui.Išskirtai DNR buvo atlikta polimerazės grandininės reakcijos (PGR) analizė naudojant Taq polimerazę.Tada 5-10µBuvo paimtas L PGR produkto ir analizuojamas elektroforezės būdu ant 1,5 proc. agarokoloidinis. Vaizdas darytas UVP BioDoc-It vaizdo gavimo sistema. Atvirkščiai transkribuotas komplementarasbuvo paimta dezoksiribonukleino rūgštis (cDNR) ir atlikta PGR naudojant IQ SYBR Green Supermix.rinkinys. Vėliau ji buvo analizuojama naudojant iQTM 5 Optical System Software. Baltymai buvo išgauti naudojant abaltymų ekstrahavimo reagentas (T-PER). Tada į 400 buvo pridėta 20 mg sėklidžių homogenatoµL T-PER ir centrifuguojama (didelio greičio centrifuga, Hettich CR-12, Tuttlingen, Vokietija) 4◦C (125,000× g) 20 min. Šis metodas buvo panašus į "identifikavimą ir kiekybinį nustatymą".baltymų analizė“ in vitro analizėje.2.3. Statistinė analizėEksperimento rezultatai buvo išreikšti kaip vidurkis± standartinis nuokrypis (vid± SD) irduomenys buvo analizuoti naudojant Statistical Product & Service Solutions (SPSS) 11.0 programinę įrangą, IBM, Armonk,Niujorkas, NY, JAV. Skirtumai tarp grupių buvo analizuojami atliekant vienpusę analizędispersija (ANOVA). Keli skirtingų grupių palyginimai buvo išanalizuoti Dunkano testuvertėp < 0.05="" as="" the="" signifificant="">

3. Rezultatai

3.1. In vitro analizė

3.1.1. ECH, CTE ir RES antioksidacinės veiklos palyginimas

Ilgalaikis didelis oksidacinis stresas ir lėtinis uždegimas yra pagrindinės diabeto priežastyskomplikacijos [16]. CTE yra įvairių feniletanoidinių glikozidų, tokių kaip echinakozidas(ECH) ir akteozidas, galintis turėti antioksidacinį poveikį [17]. DPPH radikalų šalinimasECH antioksidaciniam aktyvumui įvertinti buvo atliktas tyrimas. Troloksas ir resveratrolis(3,5,4'-trihidroksistilbenas, RES) buvo atitinkamai paimti kaip standartinė ir teigiama kontrolė. Taip, kaip parodytapaveiksle1, ECH parodė geresnį radikalų šalinimo aktyvumą ir aktyvumas buvo žymiai didesnisnei teigiamos kontrolės (RES).

3.1.2. ECH ląstelių gyvybingumas LC-540 ir TM3 Leydig ląstelėseMTT tyrimas buvo atliktas siekiant įvertinti skirtingų ECH koncentracijų ląstelių gyvybingumą.LC-540 Leydig ląstelių ir TM3 Leydig ląstelių gyvybingumas buvo daugiau nei 80 procentų po gydymoECH (pav2). Palyginti su kitomis koncentracijomis, 100-µM koncentracija (atskiedimai 100µM 2 proc. FBS) ECH parodė geresnį ląstelių gyvybingumą TM3 Leydig ląstelėse. Rezultatas parodė, kadpadidėjusi ECH koncentracija nesukelia jokio reikšmingo toksiškumo ląstelėms.

3.1.3. ECH poveikis AGE sukeltai superoksido gamybai naudojant NBT tyrimą LC-540 ir TM3Leidigo ląstelė

AGE sukelia oksidacinę žalą organizme dėl gliukozės oksidacijos ir susidarymolaisvųjų radikalų, tokių kaip O2-, hidroksilo radikalai ir karbonilo grupės [18]. Po to, kai buvo stimuliuojamas su50 µg/mL AGE, LC-540 (pav3a) ir TM3 (pav3b) ląstelės buvo apdorotos ECH ir RES(5 µM ir 10µM kiekvienas). Rezultatai parodė, kad padidėjo superoksido anijonų gamybakontrolinėje grupėje (stimuliuojami AGE), tačiau po to superoksido anijonų gamyba sumažėjogydymas ECH ir RES. Iš paveikslo3, buvo suprasta, kad ECH ir RES sumažina lygįskatina superoksido gamybą ir apsaugo ląsteles nuo oksidacinės pažaidos. LC-540 langelių atveju10 µM ECH parodė beveik panašų aktyvumą su normalia grupe. Superoksido gamyba abiejuoseląstelių sumažėjo, padidėjus ECH ir RES koncentracijai.3.1.4. ECH poveikis H2O2 Gamyba AGE stimuliuojamose LC-540 Leydig ląstelėseOksidacinių rūšių buvimui nustatyti buvo atliktas DCFH-DA tyrimas. Įstojus įląstelės, FL fluorescencinis dažiklis DCFH-DA yra oksiduojamas tarpląstelinio H2O2 ir sudaro dichlorfluoresceiną(DCF). Kaip parodyta paveiksle4, žymiai padidėjo tarpląstelinis H2O2 gamybaAGE stimuliuojama grupė (kontrolė), o pridėjus 10µM ECH ir RES žymiai sumažėjoH2O2 gamyba ląstelėse. 10 administracijaµM ECH sukėlė tik apie 47,1 proc2O2 produkcijos, žymiai mažesnė nei kontrolinėje grupėje.

3.1.5. ECH poveikis RAGE ir NF-κB baltymų ekspresijos lygiai AGE stimuliuojamame LC-540Leydigo ląstelės

Siekiant patvirtinti RAGE buvimą LC-540 Leydig, buvo atlikta Western blot analizėląstelės. ECH poveikis RAGE (Pav5a) ir NF-κB (pav5b) baltymų ekspresijos lygiaiAGE stimuliuojamose Leydig ląstelėse parodytos paveikslėlyje5. Rezultatai parodė, kad 50µg/mLAGE koncentracija sukėlė didesnį RAGE ir NF-κB išraiška LC-540 Leydig ląstelėse ir10 µECH ir RES M koncentracija žymiai sumažino RAGE ir NF-raišką.κB. NF išraiškaκB buvo žymiai mažesnis RES ir ECH nei RAGE antagonistai. Taigi, rezultataipatvirtino, kad ECH sumažino uždegimo lygį sumažindamas RAGE ir NF- lygįκB.

.1.6. ECH poveikis testosterono sintezės keliui AGE stimuliuojamose LC-540 Leydig ląstelėse.

Spermatogenezės ir vyrų nevaisingumo procesas priklauso nuo testosterono buvimo.Kaip parodyta paveiksle6, „StAR“ išraiškos (pav6a), CYP11A1 (pav6b), CYP17A1 (pav6c), ir HSD17 3 (pav6d) AGE stimuliuojamame Leydig LC-540 LC{1}} reikšmingai sumažėjo baltymų.ląstelės (kontrolinė grupė). StAR, CYP11A1, CYP17A1 ir HSD17 išraiškos Buvo 3 baltymaižymiai padidėjo, kai buvo pridėtas RAGE antagonistas, RES ir ECH. PadidėjęsStAR ir CYP11A1 baltymų ekspresija buvo pastebėta tiek ECH, tiek RES gydytose grupėse.CYP17A1 ekspresijos lygis buvo beveik panašus RES ir ECH grupėse. IšraiškosHSD17 3 baltymai ECH apdorotose Leydig ląstelėse buvo daug didesni nei RES ir RAGEantagonistais apdorotos ląstelės. Padidėjusi StAR, CYP11A1, CYP17A1 ir HSD17 ekspresija 3 baltymairodo normalią testosterono gamybą.

5ląstelių/mL ir gydymas RES bei ECH(10µM) buvo skiriamas 24 valandas. - Aktinas buvo naudojamas kaip vidinė kontrolė. Įprasta grupė (Nor)buvo apdorota terpe, o kontrolinė grupė (Con) buvo gydoma AGE (50µg/mL).

Rezultataibuvo parodyti kaip niekšiški±SD (n = 3). Reikšmingi skirtumai (p < 0.05)="" were="" represented="" by="" letters="">analizuojama Duncano kelių diapazonų testu.