Cistanche Tubulosa ekstraktų poveikis streptozotocino ir nikotinamido sukeltų diabetinių žiurkių patinų reprodukcinei funkcijai-Ⅰ

1. Įvadas

Cukrinis diabetas (DM) yra būklė, kai padidėjagliukozės kiekiskraujyje dėl to, kad kasa neefektyviai gamina pakankamai insulino arba organizmas nesugeba jo efektyviai panaudoti. PSO duomenimis, sergančiųjų cukriniu diabetu skaičius išaugo nuo 108 milijonų 1980 metais iki 422 milijonų 2014 metais [1]. Yra keturios pagrindinės kategorijos: diabetas prieš diabetą (stadija prieš diabetą), 1 tipas (kai kasa negamina insulino), 2 tipas (organizmas nenaudoja insulino) ir gestacinis diabetas (pasireiškia nėštumo metu). Oksidacinis stresas atsiranda dėl disbalanso tarp reaktyviųjų deguonies rūšių (ROS) ir antioksidantų gamybos [2], galiausiai sukeliančio diabetinę būklę. Diabeto komplikacijos yra inkstų nepakankamumas, nervų pažeidimas, aklumas, insultas, širdies priepuolis, vaisiaus mirtis ir nevaisingumas. [1]. Tyrimai rodo, kad diabetu sergančių vyrų spermos branduoliai, dezoksiribonukleino rūgštis (DNR) ir mitochondrijos buvo labai pažeistos [3]. Oksidacinis stresas spermatozoidų transportavimo metu pakeis vyrų reprodukcinės sistemos procesą [4,5].

NATŪRALUS CISTANCHE TUBULOSA LYTINEI FUNKCIJAI GERINTI PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Spermatogenezės procesą kontroliuoja pagumburio – hipofizės – lytinių liaukų (HPG) ašis. Pagumburio gaminamas gonadotropiną atpalaiduojantis hormonas (GnRH) skatina liuteinizuojančio hormono (LH) ir folikulus stimuliuojančio hormono (FSH) gamybą. Leydig ląstelės randamos greta sėklinių kanalėlių irgaminti testosteronąkontroliuojamas LH. FSH skatina antigeną surišančio baltymo (ABP), kuris padeda perduoti vyrišką hormoną, gamybą. Taigi nevaisingumas ir kitos problemos daugiausia kyla dėl HPG ašies sutrikimų. Streptozotocino ir nikotinamido derinio vartojimas sukelia diabetą eksperimentinėms žiurkėms. Streptozotocinas yra cheminis junginys, toksiškas insuliną gaminančioms kasos ląstelėms, o nikotinamidas yra vandenyje tirpus vitaminas, apsaugantis ląsteles nuo visiško pažeidimo [6].

Cistanche tubulosa yra dykumos augalų rūšis, dar žinoma kaip "Rou Cong-Rong" [7]. Tai nechlorofilinis parazitinis augalas, augantis daugiausia ant Calotropis procera medžio šaknų ir plačiai paplitęs sausose Gansu, Činghajaus, Sindziango, Mongolijos, Irano ir Indijos žemėse. Bendras Cistanche tubulosa pavadinimas yra „Dykumos hiacintas“. Jis plačiai pripažįstamas tradicinėje kinų medicinoje ir buvo pavadintas „Dykumos ženšenis“. Jis plačiai naudojamas medicinos srityje, gydant liguistą leukorėją, gausią metroragiją, lėtines inkstų ligas, vidurių užkietėjimą, impotenciją ir nevaisingumą. Cheminės sudedamosios dalysCistanche tubulosa susideda iš nelakių feniletanoidinių glikozidų(PHG), iridoidai, lignanai, lakieji aliejai, alditoliai, oligosacharidai ir polisacharidai [8]. Tyrimai rodo, kadechinakozidasnuo šios žolės apsaugo pažeistą fibroblastą reguliuodamas ROS lygį [9]. Šis junginys sukelia antioksidacinį, kraujagysles atpalaiduojantį ir priešuždegiminį poveikį kartu su neuroprotekcija ir osteoporozės prevencija [10,11].

Šiuo tyrimu buvo siekiama ištirti poveikįCistanche tubulosa ekstraktaskurių sudėtyje yra ECH dėl streptozotocino ir nikotinamido sukeltos diabetinės žiurkės reprodukcinės funkcijos sutrikimo.

2. Medžiagos ir metodai

2.1. Medžiagos

ECH ir CTE buvo įsigyti iš Sinphar Pharmaceutical Co., Ltd (Yilan, Taivanas). Pažangūs glikacijos galutiniai produktai (AGE) buvo įsigyti iš Biovision (San Franciskas, CA, JAV). LC-540 ir TM3 ląstelių linijos buvo įsigytos iš Maisto pramonės tyrimų ir plėtros instituto (Hsinchu, Taivanas). Penkių savaičių Sprague-Dawley (SD) žiurkių patinai buvo įsigyti iš Nacionalinio laboratorinių gyvūnų centro (Taipėjus, Taivanas). Feed Lab Diet® buvo nupirkta iš PMI Nutrition International, Inc. (Taipėjus, Taivanas). 2,2-difenil-1-pikrilhidrazilas (DPPH) buvo gautas iš Sigma (St. Louis, MO, JAV). Metanolis ir 4-(2-hidroksietil)-1-piperazinetansulfonrūgštis (HEPES) taip pat buvo įsigyti iš „Sigma“. Dulbecco modifikuota Eagle terpė/F12 ir tripsinas-EDTA buvo gauti iš GIBCO (Niujorkas, NY, JAV). 3-(4, 5-dimetiltiazol-2-il)-2, 5-difeniltetrazolio bromidas (MTT), dichlordihidrofluoresceino diacetatas (DCFH-DA), dimetilsulfoksidas (DMSO) ir nitromėlynasis tetrazolis (NBT) buvo įsigyti iš Sigma. Gliukozės fermentiniai rinkiniai buvo gauti iš Kyokutoseiyaku, Tokijas, Japonija. Insulino ELISA rinkiniai buvo įsigyti iš Mercodia AB Inc., Sylveniusgatan 8A (Upsala, Švedija). T-PER audinių baltymų ekstrahavimo reagentas buvo įsigytas iš Thermo Scientific (Čikaga, IL, JAV). Anti-žmogaus / pelės / žiurkės branduolinis faktorius-kappa B NF-κB polikloniniai antikūnai buvo įsigyti iš Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, JAV. Anti-Pelės/Žiurkės receptorius pažangių glikacijos galutinių produktų (RAGE) polikloniniams antikūnams, anti-žmogaus/pelės/žiurkės StAR polikloniniams antikūnams ir anti-žmogaus/pelės/žiurkės citochromo P450 17A1 monokloniniams antikūnams buvo įsigyti iš Gene. Teksas (Irvine, CA, JAV). Anti-žmogaus / pelės / žiurkės CYP11A1 polikloniniai antikūnai buvo gauti iš Cell Signaling Technology (Beverly, PA, JAV). Easy-Blue reagentas buvo įsigytas iš Invitrogen, Thermo Fisher Scientific (Carlsbad, CA, JAV). Agarozė ir 100 bp DNR žymuo buvo gauti iš Promega, Corporation (Madison, WI, JAV). RNeasy Lipid Tissue Mini rinkinys buvo įsigytas iš QIAGEN, Hilden, Vokietija.

NATŪRALUS CISTANCHE TUBULOSA LYTINEI FUNKCIJAI GERINTI PHGS75% ECH 30% ACT 12%

2.2. Metodai

2.2.1. In vitro analizė

LC{{0}} ir TM3 ląstelių kultūra: LC-540 ląstelių linijos buvo kultivuojamos 37 ◦C temperatūroje Earle's Balanced Salt Solution (EBSS) terpėje, papildytoje natrio bikarbonatu (1,5 g/l), L-glutamino (2 mM), neesminių aminorūgščių (0,1 mM), natrio piruvato (1,{21}} mM) ir galvijų vaisiaus serumo (FBS) (10 %) 5% CO2 inkubatorius (CO2 inkubatorius, Napco 5410, Taivanas). TM3 ląstelių linija buvo kultivuojama Dulbecco modifikuotoje Eagle terpėje (DMEM), papildytoje gliukoze (4,5 g/l), natrio piruvatu (0,5 mM), L-glutaminu (2,5 mM), natrio bikarbonatu (1,2 g/l), {{ 28}}(2-hidroksietilas)-1-piperazinetansulfonrūgštis (HEPES, 15 mM) ir veršelio vaisiaus serumas (FCS, 10 %) arba arklio serumas (5 %) 37 ◦C temperatūroje 5 proc. CO2 inkubatorius.

Ląstelių gyvybingumo nustatymasEchinakozidas (ECH): 3-(4, 5-dimetiltiazol-2-il)-2,5- difeniltetrazolio bromido (MTT) reagentas buvo naudojamas ląstelių gyvybingumo tyrimui. Ląstelių koncentracija buvo sureguliuota iki 2 × 105 ląstelių / ml 96-šulinėlių plokštelėje. Tada buvo pridėta 20 µL ECH (atskiesto 2% terpės) ir inkubuojama 24 valandas 37 °C temperatūroje 5% CO2 inkubatoriuje. Vėliau buvo pridėta 100 µL MTT reagento ir inkubuojama 4 valandas 37 ◦C temperatūroje tamsiomis sąlygomis. Absorbcija buvo išmatuota ties 570 nm (ELISA skaitytuvas, Dynatech MR5000, Kloten, Šveicarija).

Santykinis ląstelių gyvybingumas (%)=[(Mėginys esant 570 nm – Tuščiasis esant 570 nm)]/[(Akontrolė prie 570 – Tuščioji esant 570)] × 100.

Nitromėlynojo tetrazolio (NBT) redukcijos tyrimas ir 2,2-difenil-1-pikrilhidrazilo (DPPH) tyrimas: ląstelių skaičius buvo pakoreguotas iki 1 × 1{{10}}6 ląstelių/ ml. Tada buvo pridėta 50 mg/mL ECH, resveratrolio (RES) ir pažangių glikacijos galutinių produktų (AGE) (kontrolė) ir kartu kultivuojama 18 valandų 37 ◦C temperatūroje. Tada buvo pridėta 0,3 ml NBT tirpalo (0,1 mg/ml NBT, 5% FBS ir 3% dimetilsulfoksido (DMSO), ištirpinto 10 ml DMEM) ir inkubuojama 37 °C temperatūroje 5% CO2 1 valandą. Po centrifugavimo (800 × g 3 min.) supernatantas buvo pašalintas, pridėta 200 µL DMSO ir 5 minutes purtoma ultragarso generatoriuje (Delta Ultrasonic Cleaner D 200, Keelung, Taivanas). Absorbcija buvo matuojama esant 630 nm. Atliekant DPPH radikalų tyrimą, kaip standartas buvo Trolox (95 % alkoholio). Tada 75 µL 0,5 mM DPPH tirpalo buvo sumaišyta su 25 µL mėginių ir leista reaguoti kambario temperatūroje tamsioje vietoje 30 min. Mišinys buvo sukratytas ir išmatuota absorbcija esant 517 nm.

Reaktyviųjų deguonies rūšių (ROS) kiekio analizė: ląstelių skaičius buvo nustatytas iki 2 × 105 ląstelių/ml 12-šulinėlių plokštelėje, kurioje yra 2 % FBS. Tada į plokštelę buvo pridėta 50 µL/mL ECH, RES ir AGE ir inkubuojama 37 °C temperatūroje 24 valandas. Po 24 valandų buvo pridėta 20,70 -dichlorfluoresceino diacetato (DCFH-DA) ir inkubuojama 37 ◦C temperatūroje 30 min. Po centrifugavimo (400 x g, 5 min.), supernatantas buvo pašalintas ir ląstelės du kartus plaunamos fosfatiniu buferiniu tirpalu (PBS). Po to ląstelės buvo suspenduotos 1 ml PBS ir ROS lygiai buvo nustatyti naudojant srauto citometrą (Flow Cytometer, Becton Dickinson, CA, JAV).

Baltymų identifikavimas ir kiekybinė analizė: Baltymai buvo ekstrahuoti naudojant baltymų ekstrahavimo reagentą (T-PER). Ląstelių tankis buvo sureguliuotas iki 2 × 105 ląstelių/ml 12-šulinėlių plokštelėje ir 50 µL/mL ECH, RES ir pažengusio glikacijos galutinio produkto (RAGE) antagonisto receptorių, pridėta AGE ir inkubuota. 37 ◦C temperatūroje 5% CO2 inkubatoriuje 24 val. Po to buvo pridėta 400 µL T-PER, nugramdomos ląstelės ir centrifuguojama 125,000 × g 20 min. (4 ◦C). Supernatantas buvo surinktas ir laikomas –80 ◦ C temperatūroje (–80 ◦ C šaldiklis, Nuaire, Plymouth, MN, JAV), kad būtų galima atlikti tolesnę analizę. Baltymų kiekybiniam įvertinimui buvo naudojamas bicinchonino rūgšties (BCA) rinkinys. Tada į 8-šulinėlių plokšteles buvo įpilta 10 µL standartinio ląstelių tirpalo ir 200 µL BCA reagento ir inkubuojama 37 ◦ C temperatūroje 5 % CO2 inkubatoriuje 30 min. Sugertis buvo išmatuota ties 562 nm. Baltymų identifikavimo analizė atlikta natrio dodecilsulfato (SDS)-poliakrilamido gelio (SDS-PAGE) elektroforeze. Mėginiai buvo paruošti pridedant baltymų lizato į baltymų pakrovimo buferį, o specifiniams baltymams nustatyti buvo atlikta Western blot analizė.

2.2.2. In vivo analizė

Gyvūnų modelio dizainas: šešiasdešimt {{0}}savaičių Sprague-Dawley (SD) žiurkių patinų buvo nupirkti iš Nacionalinio laboratorinių gyvūnų centro (Taipėjus, Taivanas). Kiekviena žiurkė buvo laikoma atskirai dezinfekuojamuose nerūdijančio plieno narveliuose kontroliuojamoje temperatūroje (23 ± 1 ◦C) ir drėgmei (40–60 %), naudojant 12 valandų šviesos / 12 valandų tamsos ciklą. Maistas ir vanduo buvo tiekiami ad libitum. Kiekviena žiurkė buvo prijaukinta pirmąją savaitę ir jai buvo skirta laboratorinė graužikų dieta 5001. Visos procedūros atitiko Taivano nacionalinio Taivano vandenyno universiteto Institucinio gyvūnų priežiūros ir naudojimo komiteto (IACUC patvirtinimo Nr. 101026) standartus. Po prijaukinimo žiurkės buvo suskirstytos į dvi grupes: kontrolinę grupę (Con), kuriai buvo šeriama laboratorine dieta 5001, ir diabeto grupę, kuri viso eksperimento metu buvo šeriama riebia dieta (HFD, 40%). Po to, kai 4 savaites buvo šeriamos HFD, diabeto grupės žiurkėms buvo sušvirkštas streptozotocinas (65 mg / kg) (STZ), kad sukeltų diabetą (DM). Per 15 minučių po STZ injekcijos buvo sušvirkštas nikotinamidas (230 mg/kg kūno svorio). Praėjus savaitei po injekcijos, buvo atliktas geriamojo gliukozės tolerancijos testas (OGTT), siekiant nustatyti sėkmingą cukrinio diabeto (DM) indukciją. Po to gyvūnai buvo suskirstyti į šešias grupes: kontrolinė (šeriama laboratorine dieta 5001); DM grupė (DM + 45 % HFD); DMR grupė (DM + roziglitazonas: 0,571 mg/kg KM) + 45% HFD; DME1 grupė (DM + CTE: 80 mg/kg KM) + 45% HFD; DME2 grupė (DM + CTE: 160 mg/kg KM) + 45% HFD; ir DME4 grupė (DM + CTE: 320 mg/kg KM) + 45% HFD. Rosiglitazonas (RSG) buvo priimtas kaip teigiama kontrolė. Pagal Taivano maisto ir vaistų administracijos (TFDA) sveiko maisto funkcinio vertinimo gaires buvo naudojamos trys CTE dozės (80, 160 ir 320 mg/kg). Gydymas buvo atliktas iki eksperimento pabaigos. Visos eksperimentinės žiurkės buvo numarintos po 6 savaičių. Iš žiurkių paimtas kraujas buvo centrifuguojamas 3000 aps./min. greičiu 15 min 4 °C temperatūroje. Supernatantas buvo ištirtas tokiai analizei:

Bendro gliukozės, trigliceridų ir cholesterolio nustatymas: Gliukozės nustatymas buvo atliktas naudojant fermentinius gliukozės rinkinius. Tada į reagentus buvo pridėta 20 µl kraujo plazmos mėginių ir 5 minutes palaikyta 37 ◦C temperatūroje. Bendras trigliceridų kiekis ir bendrojo cholesterolio koncentracija buvo nustatyti naudojant trigliceridų ir cholesterolio fermentinius rinkinius. Tada į reagentus buvo pridėta 10 µl kraujo plazmos ir eksperimentas buvo atliktas pagal gamintojo instrukcijas. Absorbcija buvo matuojama esant 510 nm.

Plazmos bendroji gliukozės/trigliceridų/cholesterolio koncentracija (mg/dL)=(Pavyzdys – ABtuščioji)/(Astandartas – ABtuščioji) × 200.

Mėginys: kraujo mėginių sugertis, AB tuščioji: rinkinių be mėginio sugerties vertė, Astandard: standartinio reagento absorbcijos vertė, 200: standartiniai reagentai, kurių koncentracija 200 mg/dL.

Insulino, leptino ir homeostatinio modelio įvertinimas – atsparumo insulinui (HOMA-IR) nustatymas:Insulino lygis buvo nustatytas insulino ELISA rinkiniais. Čia, 25µĮpilta L kraujo plazmosreagentai, o absorbcija buvo matuojama esant 450 nm. Bendras leptino kiekis buvo nustatytas naudojant aleptino fermento imunometrinio tyrimo rinkinys.Tada 100µIštirta L plazmos ir absorbcijabuvo matuojamas esant 450 nm, naudojant ELISA skaitytuvą. Visas eksperimentas buvo atliktas pagalgamintojo instrukcijas. HOMA-IR vertė buvo nustatyta pagal homeostazės modelįįvertinimo lygtis=Insulino koncentracija plazmoje nevalgius (mg/mL)× gliukozės kiekis plazmoje nevalgiuskoncentracijos (mmol/L)/22,5.

Plazmos lipidų peroksidacija: čia {{0}},5 ml kraujo plazmos buvo sumaišyta su 1 ml reagento (15%, m/v trichloracto rūgštis 0,25 N druskos rūgštyje (HCl) ) ir 0,375%, w/v tiobarbitūro rūgštis 0,25 N HCl) ir 15 min įdedama į vandens vonią (Water Bath, BUCHI 461, Ciurichas, Šveicarija) esant 100 ◦C. Po aušinimo buvo pridėta 1 ml n-butanolio, stipriai suplakama ir centrifuguojama 1500 x g 10 min. Supernatantas buvo surinktas ir išmatuota absorbcija esant 532 nm [12].

Malondialdehido (MDA) koncentracija (nM/mL)=[(Mėginys prie 532 nm – Tuščiasis mėginys esant 532 nm)/ (Standartinis 532 nm – Tuščiasis esant 532 nm)] × 5.

standartinis, esant 532 nm – tuščiasis, esant 532 nm)] × 5. Testosterono ir liuteinizuojančio hormono (LH) lygių plazmoje nustatymas: Testosterono ELISA rinkinys buvo naudojamas testosterono kiekiui kraujo plazmoje matuoti. LH koncentracijai nustatyti buvo naudojamas RIA rinkinys. Tada buvo pridėta 50 µL plazmos ir skaičiavimai buvo pagrįsti hormono LH-RP-3 (standartinis) koncentracija. Tolesni veiksmai buvo atlikti pagal gamintojo instrukcijas.

Auglio nekrozės faktoriaus (TNF) ir interleukino-6 (IL-6) koncentracijos nustatymas: užfiksuotas antikūnas buvo praskiedžiamas 250 kartus dengimo buferiu, pridėtas prie 96- šulinėlių plokštelę (100 µl/šulinėliu) ir per naktį palaikoma 4 ◦C temperatūroje. Supernatantas buvo išsiurbtas ir penkis kartus plaunamas plovimo buferiu (1 kartą PBS, 0,05% Tween 20). Po inkubacijos (1 val.) su 200 µg tyrimo skiediklio, ląstelės buvo plaunamos 5 kartus plovimo buferiu ir į kiekvieną šulinėlį įpilama 100 µL standartinio TNF tirpalo arba tiriamųjų mėginių ir inkubuojamos 2 valandas. Po plovimo buvo pridėta 100 µl IL-6- aptiktų antikūnų ir inkubuojama 1 valandą kambario temperatūroje. Supernatantas išsiurbtas ir išplautas 5 kartus. Tada buvo pridėta 480 µl fermento avidino-krienų peroksidazės (HRP) ir inkubuojama 30 minučių kambario temperatūroje. Supernatantas buvo išsiurbtas ir penkis kartus plaunamas plovimo buferiu. Tada buvo pridėta 100 µL substrato tirpalo ir inkubuojama 15 minučių kambario temperatūroje. Vėliau į kiekvieną šulinėlį buvo įpilta 50 µl stabdymo tirpalo (1 M fosforo rūgšties) ir išmatuota absorbcija esant 450 nm.

NATŪRALUS CISTANCHE TUBULOSA, SKIRTA LYTINĖS FUNKCIJOS ATSTATYMAS PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Spermos ir sėklidžių parametrų analizė

Spermos mėginių paėmimas: Spermos mėginių paėmimas buvo atliktas pagal anksčiau aprašytą metodą [13]. Spermatozoidai buvo paimti iš supernatanto ir panaudoti tolesnei analizei.

Spermos kiekis, spermatozoidų judrumas ir nenormalus spermatozoidų skaičius: spermatozoidų skaičius buvo apskaičiuotas naudojant hemocitometrą ir tripano mėlynojo tirpalą. Tada 100 µL spermatozoidų skysčio buvo sumaišyta su tripano mėlynojo tirpalu ir naudojant hemocitometrą ir mikroskopą buvo apskaičiuotas spermatozoidų skaičius, judrumas ir nenormalių spermatozoidų skaičius [14].

Nitro mėlynojo tetrazolio NBT redukcija ir spermos ir sėklidžių lipidų peroksidacija: Lipidų peroksidacija ir NBT redukcija buvo analizuojami pagal tą pačią plazmos analizės procedūrą.

Superoksido dismutazės (SOD) ir katalazės aktyvumo nustatymas: Superoksido dismutazės (SOD) aktyvumas buvo analizuojamas naudojant RANSEL rinkinį. Čia {{0}}.05 ml sėklidžių homogenatų buvo įpilta į 1,7 ml reakcijos tirpalo (0,05 mM ksantino, 0,025 mM 2-({ {9}}jodofenilas)- 3-(4-nitrofenolis)-5-feniltetrazolio chloridas (INT)). Sumaišius, buvo pridėta 0,25 ml ksantino oksidazės (80 U/L) ir 30 s reagavo kambario temperatūroje. Absorbcija buvo matuojama esant 505 nm. Sėklidžių homogenato baltymų koncentracija buvo nustatyta Bio-Rad DC baltymų tyrimo rinkiniu ir apskaičiuotas jo specifinis aktyvumas (U/mg baltymo). Katalazės (CAT) aktyvumas buvo nustatytas pagal anksčiau aprašytą metodą [15].

H&E (hematoksilino ir eozino) dažymas

Sėklidė buvo mirkoma 10% formalino 24 valandas ir laikoma 4 ◦C temperatūroje. Audiniai buvo mikro dydžio ir pritvirtinti prie stiklelio. Po fiksacijos (95% metanolio + 5% acto rūgšties) stikleliai buvo panardinami į hematoksiliną 3 min., plaunami tekančiu vandeniu 5 min., o po to mirkomi 50%, 70% ir 90% alkoholio. vieną minutę. Po to stikleliai buvo nudažyti eozinu 10 s ir mirkomi 100% alkoholyje vieną minutę, kol išbluko. Galiausiai stiklelis vieną minutę buvo mirkomas ksilene. Vėliau stiklelis buvo išdžiovintas ore ir užsandarintas. Nudažytas mėgintuvėlis buvo patalpintas į apverstos fazės kontrasto mikroskopą (Inverted Phase Difference Microscope, Olympus CK-2, Tokijas, Japonija), kad būtų galima stebėti morfologiją.

Pagumburio analizė

Pelės KISS1, G-baltymų prijungtas receptorius (GPR) 54, citokinų signalizacijos slopintuvas 3 (SOCS-3) ir sirtuino 1 (SIRT1) genų sekos buvo identifikuotos iš NCBI (Nacionalinio biotechnologijos informacijos centro) genų duomenų bazės. ir konkretus gruntas buvo sukurtas naudojant Primer 5.{8}} PREMIER Biosoft, Palo Alto, CA, JAV.). Eksperimente naudojami pradmenys pateikti 1 lentelėje.

Ribonukleino rūgšties (RNR) ekstrahavimas iš hipotalamo. RNR ekstrahavimas iš smegenų pagumburio buvo atliktas naudojant RNeasy Lipid Tissue Mini rinkinį. Gautos mRNR buvo kiekybiškai išmatuotos atvirkštinės transkripcijos (RT) ir polimerazės grandininės reakcijos (PGR) būdu. Komplimentinė DNR, gauta atlikus RT analizę, buvo laikoma –20 ◦C temperatūroje, kad būtų galima naudoti vėliau. Išskirtai DNR buvo atlikta polimerazės grandininės reakcijos (PGR) analizė naudojant Taq polimerazę. Tada buvo paimta 5–10 µl PGR produkto ir analizuojama elektroforezės būdu ant 1,5 % agaro koloido. Vaizdas darytas UVP BioDoc-It vaizdo gavimo sistema. Buvo paimta atvirkštinė transkribuota komplementari dezoksiribonukleino rūgštis (cDNR) ir atlikta PGR naudojant IQ SYBR Green Supermix rinkinį. Vėliau ji buvo analizuojama naudojant iQTM 5 Optical System Software. Baltymai buvo ekstrahuoti naudojant baltymų ekstrahavimo reagentą (T-PER). Tada į 400 µl T-PER buvo pridėta 20 mg sėklidžių homogenato ir centrifuguojama (didelio greičio centrifuga, Hettich CR-12, Tuttlingen, Vokietija) 4 ◦C (125, 000 × g) temperatūroje. ) 20 min. Šis metodas buvo panašus į "baltymų identifikavimą ir kiekybinę analizę" in vitro analizėje.

2.3. Statistinė analizė

Eksperimento rezultatai buvo išreikšti kaip vidurkis ± standartinis nuokrypis (vidurkis ± SD), o duomenys analizuoti naudojant Statistical Product & Service Solutions (SPSS) 11.{1}} programinę įrangą, IBM, Armonk, Niujorkas, NY, JAV. Skirtumai tarp grupių buvo analizuojami taikant vienpusę dispersinę analizę (ANOVA). Daugkartiniai skirtingų grupių palyginimai buvo išanalizuoti Dunkano testu, kai p < 0.05 reikšmingas lygis.

3. Rezultatai

3.1. In vitro analizė

3.1.1. ECH, CTE ir RES antioksidacinės veiklos palyginimas

Ilgalaikis hdidelis oksidacinis stresas ir lėtinis uždegimas yra pagrindinės diabeto priežastyskomplikacijos [16]. CTE yra įvairiųfeniletanoidiniai glikozidai, tokie kaip echinakozidas(ECH) ir akteozido, galintis turėti antioksidacinį aktyvumą [17]. DPPH radikalų šalinimasECH antioksidaciniam aktyvumui įvertinti buvo atliktas tyrimas. Troloksas ir resveratrolis(3,5,4'-trihidroksistilbenas, RES) buvo atitinkamai paimti kaip standartinė ir teigiama kontrolė. Kaip parodytapaveiksle1, ECH parodė geresnį radikalų šalinimo aktyvumą ir aktyvumas buvo žymiai didesnisnei teigiamos kontrolės (RES).

3.1.2. ECH ląstelių gyvybingumas LC-540 ir TM3 Leydig ląstelėse

MTT tyrimas buvo atliktas siekiant įvertinti skirtingų ECH koncentracijų ląstelių gyvybingumą. LC-540 Leydig ląstelių ir TM3 Leydig ląstelių gyvybingumas buvo daugiau nei 80 % po gydymo ECH (2 pav.). Palyginti su kitomis koncentracijomis, 100-µM koncentracija (100 µM skiedimai 2 % FBS) parodė geresnį ląstelių gyvybingumą TM3 Leydig ląstelėse. Rezultatas parodė, kad padidėjusi ECH koncentracija nesukelia reikšmingo toksiškumo ląstelėms.

3.1.3. ECH poveikis AGE sukeltai superoksido gamybai NBT tyrimu LC-540 ir TM3 Leydig ląstelėse

AGE sukelia oksidacinę žalą organizme dėl gliukozės oksidacijos ir laisvųjų radikalų, tokių kaip O2-, hidroksilo radikalų ir karbonilo grupių, susidarymo [18]. Po to, kai jos buvo stimuliuojamos 50 ug/mL AGE, LC-540 (3a pav.) ir TM3 (3b pav.) ląstelės buvo apdorotos ECH ir RES (kiekviena po 5 μM ir 10 μM). Rezultatai parodė, kad superoksido anijonų gamyba padidėjo kontrolinėje grupėje (stimuliuojami AGE), tačiau superoksido anijonų gamyba sumažėjo po kontrolinės grupės (stimuliuotų AGE), tačiau superoksido anijonų gamyba sumažėjo po superoksido gamybos ir apsaugota. ląstelės nuo oksidacinės pažaidos. LC-540 ląstelių atveju 10 µM ECH parodė beveik panašų aktyvumą su normalia grupe. Superoksido gamyba abiejose ląstelėse sumažėjo padidėjus ECH ir RES koncentracijai.

NATŪRALUS CISTANCHE TUBULOSA LYTINEI FUNKCIJAI GERINTI PHGS75% ECH 30% ACT 12%

3.1.4. ECH poveikis H2O2 gamybai AGE stimuliuojamose LC-540 Leydig ląstelėse

DCFH-DA tyrimas buvo atliktas siekiant nustatyti oksidacinių rūšių buvimą. Fluorescencinis dažiklis DCFH-DA, patekęs į ląsteles, oksiduojamas ląstelėje H2O2 ir sudaro dichlorfluoresceiną (DCF). Kaip parodyta 4 paveiksle, AGE stimuliuojamoje grupėje (kontrolinėje) žymiai padidėjo tarpląstelinė H2O2 gamyba, o pridėjus 10 µM ECH ir RES, H2O2 gamyba ląstelėse žymiai sumažėjo. Paskyrus 10 µM ECH, susidaro tik apie 47,1 % H2O2, o tai yra žymiai mažesnė nei kontrolinėje grupėje.

3.1.5. ECH poveikis RAGE ir NF-κB baltymų ekspresijos lygiams AGE stimuliuojamose LC{5}} Leydig ląstelėse

Siekiant patvirtinti RAGE buvimą LC-540 Leydig ląstelėse, atlikta Western blot analizė. ECH poveikis RAGE (5a pav.) ir NF-κB (5b pav.) baltymų ekspresijos lygiams AGE stimuliuojamose Leydig ląstelėse parodytas 5 paveiksle. Rezultatai parodė, kad 50 µg/mL AGE koncentracija sukėlė didesnį RAGE ir NF- κB ekspresija LC-540 Leydig ląstelėse ir 10 µM ECH ir RES koncentracija žymiai sumažino RAGE ir NF-κB ekspresiją. NF-κB ekspresija buvo žymiai mažesnė RES ir ECH nei RAGE antagonistų. Taigi, rezultatai patvirtino, kad ECH sumažino uždegimo lygį sumažindamas RAGE ir NF-κB lygį.

3.1.6. ECH poveikis testosterono sintezės keliui AGE stimuliuojamose LC-540 Leydig ląstelėse.

Spermatogenezės ir vyrų nevaisingumo procesas priklauso nuo testosterono buvimo. Kaip parodyta 6 paveiksle, StAR (6a pav.), CYP11A1 (6b pav.), CYP17A1 (6c pav.) ir HSD17 3 (6d pav.) baltymų ekspresija buvo žymiai sumažinta AGE stimuliuojamame LC{{11 }} Leydig ląstelės (kontrolinė grupė). StAR, CYP11A1, CYP17A1 ir HSD17 3 baltymų ekspresija žymiai padidėjo, kai buvo pridėtas RAGE antagonistas, RES ir ECH. Padidėjusi StAR ir CYP11A1 baltymų ekspresija buvo pastebėta tiek ECH, tiek RES gydytose grupėse. CYP17A1 ekspresijos lygis buvo beveik panašus RES ir ECH grupėse. HSD17 3 baltymo ekspresija ECH apdorotose Leydig ląstelėse buvo daug didesnė nei RES ir RAGE antagonistais apdorotose ląstelėse. Padidėjusi StAR, CYP11A1, CYP17A1 ir HSD{30}} baltymų ekspresija rodo normalią testosterono gamybą.