Cistanche Tubulosa ekstraktų poveikis streptozotocino ir nikotinamido sukeltų diabetinių žiurkių patinų reprodukcinei funkcijai – Ⅱ

3.2. In vivo analizė

3.2.1. CTE poveikis kūno svoriui ir suvartojamų kalorijų kiekiui

Po 6 savaičių eksperimento diabeto grupė (HFD-DM) parodė didesnį kūno svorį nei kontrolinė grupė. HFD-DME4 grupė parodė mažesnį kūno svorį nei HFD-DM ir HFD-DMER grupės (7a pav.). Kontrolinės grupės kalorijų suvartojimas buvo žymiai mažesnis nei kitų grupių. Tarp kitų penkių grupių suvartojamų kalorijų reikšmingo skirtumo nebuvo (7b pav.).

3.2.2. Geriamojo gliukozės tolerancijos testas (OGTT) siekiant nustatyti sėkmingą diabeto sukėlimą

Geriamasis gliukozės tolerancijos testas (OGTT) naudojamas kaip perspektyvi diabeto nustatymo priemonė. Padidėjęs gliukozės kiekis kraujyje rodo diabeto būklę. Kaip parodyta 8a paveiksle, gliukozės kiekis plazmoje buvo mažesnis CTE grupėse nei DM grupėje 0, 30, 90 ir 120 min. Be to, gliukozės koncentracijos plazmoje plotas po kreive (AUC) parodė, kad CTE ir RSG grupėse padidėjo gliukozės įsisavinimo greitis kraujyje (8b pav.).

3.2.3. Bendras gliukozės, cholesterolio ir trigliceridų kiekis plazmoje

Gliukozės kiekis plazmoje nevalgius buvo didesnis DM grupėje ir mažesnis DME2 grupėje (išskyrus kontrolę) nei kitose. Nebuvo reikšmingo bendro cholesterolio skirtumo tarp grupių, išskyrus DME4 grupę. DME4 grupėje cholesterolio lygis buvo mažesnis nei kitų. Trigliceridų kiekis buvo didesnis DM grupėje ir mažesnis DME4 grupėje, o trigliceridų kiekis sumažėjo padidėjus CTE koncentracijai (2 lentelė). Rezultatai rodo, kad gliukozės, cholesterolio ir trigliceridų kiekis plazmoje buvo didesnis DM grupėje, o lygis buvo žymiai sumažintas gydant CTE.

3.2.4. Insulino lygis plazmoje, plazmos leptino lygis ir homeostazės modelio įvertinimas – atsparumo insulinui (HOMA-IR) vertės

Insulino, leptino ir HOMA-IR reikšmės plazmoje pateiktos 3 lentelėje. DM grupėje buvo didesnis insulino ir leptino kiekis plazmoje nei kontrolinės grupės. HOMA-IR indeksas taip pat buvo žymiai didesnis DM grupėje. Insulino, leptino ir HOMA-IR vertės plazmoje sumažėjo padidėjus CTE koncentracijai. Plazmos leptinas buvo žymiai sumažintas CTE grupėse, tačiau RSG vaistų grupė (DMR) neparodė jokio reikšmingo skirtumo nuo DM grupės.

3.2.5. CTE poveikis LH ir testosterono kiekiui diabetu sergančių žiurkių plazmoje

Kaip parodyta 4 lentelėje, testosterono koncentracija žiurkėse, sergančiose cukriniu diabetu, buvo žymiai sumažinta.testosterono koncentracija žymiai padidėjovartojant įvairias CTE dozes. Be to, rezultatai parodė nedidelį LH lygio sumažėjimą DM grupėje, palyginti su DMR, DME1, DME2 ir DME4. LH gamyba buvo didesnė DME4 grupėje.

3.2.6. CTE poveikis diabetinių žiurkių spermos parametrams

Eksperimentiniai rezultatai parodė, kad DM grupėje reikšmingai sumažėjo spermatozoidų skaičius ir judrumas nei kontrolinėje grupėje, o spermatozoidų anomalijų dažnis DM grupėje žymiai padidėjo. Įdomu tai, kad DMR grupės spermatozoidų skaičius, judrumas ir spermatozoidų anomalijų dažnis pagerėjo, tačiau spermatozoidų judrumas nepasiekia reikšmingo lygio, palyginti su DME4. DME2 spermatozoidų skaičius buvo geresnis nei visų jų, o judrumas žymiai padidėjo DME4 grupėje. Nebuvo reikšmingo skirtumo tarp nenormalių spermatozoidų skaičiaus tarp RSG ir CTE gydytų grupių (5 lentelė).

3.2.7. CTE poveikis diabetinių žiurkių sėklinių kanalėlių morfologijai

9 paveiksle parodytas sėklidžių skyriaus H&E dažymas. Juoda rodyklė žymi Leydig ląstelę, o balta rodyklė žymi Sertoli ląstelę. Tiek Leydig ląstelė, tiek Sertoli ląstelė DM grupėje parodė reikšmingą atrofiją, o spindyje buvo matoma ertmė. CTE ir RSG gydytose grupėse buvo atkurta Leydig ląstelių ir Sertoli struktūra. Sėklinių kanalėlių storis buvo didesnis CTE ir RSG grupėse nei DM grupėje.

3.2.8. CTE poveikis KiSS1, GPR54, SOCS-3 ir SIRT1 MRNR diabetu sergančių žiurkių pagumburyje

KiSS1 (10a pav.), GPR54 (10b pav.), SOCS-3 (10d pav.) ir SIRT1 (10c pav.) ekspresija parodyta 10 paveiksle. žymiai mažesnis nei kontrolinėje grupėje. KiSS1 ir GPR 54 mRNR ekspresijos lygiai DMR, DME1, DME2 ir DME4 buvo žymiai padidėję. Visų pirma, GPR54 mRNR ekspresija žymiai padidėjo DME4 ir buvo beveik panaši į kontrolinę grupę.

NATŪRALŪS CISTANCHE TUBULOSA, SAUGOTI NUO TESTOSTERONO GAMYBOS PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Šis eksperimentas toliau tyrė SOCS-3 ir SIRT1 mRNR kiekį žiurkių pagumburyje. Diabetu sergančių žiurkių SOCS-3 mRNR ekspresija buvo žymiai padidėjusi, o tai rodo, kad leptino varža buvo rimtesnė. DMR, DME1, DME2 ir DME4 grupėse buvo pastebėtas reikšmingas pagerėjimas, palyginti su diabetu sergančių pacientų grupe. SIRT1 mRNR ekspresija DM grupėje žymiai sumažėjo ir žymiai padidėjo DME1 ir DME4 grupėse.

3.2.9. CTE poveikis antioksidaciniams fermentams diabetinių žiurkių plazmoje ir sėklidėse

6 lentelėje parodyta, kad diabetu sergančių žiurkių plazmos SOD aktyvumas, GPx aktyvumas ir katalazės aktyvumas labai sumažėjo, o aktyvumas padidėjo CTE ir RSG gydytose grupėse. Be to, DME4 žymiai pagerino GPx veiklą nei kiti. Rezultatai parodė, kad diabetu sergančių žiurkių SOD ir katalazės aktyvumas po šešių savaičių žymiai sumažėjo. DMR grupės SOD ir katalazės aktyvumas nepasiekia reikšmingo lygio. CTE gydytų grupių SOD ir katalazės aktyvumas žymiai pagerėjo. Padidėjęs katalazės ir SOD aktyvumas CTE grupėse taip pat buvo pastebėtas sėklidėse (7 lentelė). Didžiausias SOD ir katalazės aktyvumas buvo pastebėtas atitinkamai DME1 ir DME2 grupėse.

3.2.10. CTE poveikis oksidaciniam stresui ir diabetinių žiurkių plazmos ir sėklidžių uždegimui

Azoto oksido (NO) gamyba plazmoje (11a pav.) ir sėklidėse (11b pav.) parodyta 11 paveiksle. NO gamyba DM grupėje reikšmingai padidėjo tiek sėklidėse, tiek plazmoje, palyginti su kontroline grupe. Pastebėtas laipsniškas NO gamybos sumažėjimas DME1, DME2 ir DME4 grupėse (plazmoje). DMR grupė taip pat parodė reikšmingą NO gamybos sumažėjimą. Sėklidžių atveju CTE grupėse buvo pastebėtas nedidelis NO gamybos sumažėjimas, o DMR grupė reikšmingai nesumažino NO gamybos.

Kaip parodyta 12 ir 13 paveiksluose, diabetu sergančių žiurkių TNF ir IL -6 kiekis buvo žymiai padidėjęs (tiek plazmoje, tiek sėklidėse), o tai rodo, kad uždegimas yra rimtesnis. Plazmoje TNF lygis yra panašus CTE ir RSG gydomose grupėse (12a pav.). CTE grupės reikšmingai (ypač DME2) sumažino TNF- kiekį sėklidėse (12b pav.). IL-6 lygis buvo žymiai sumažintas CTE ir RSG grupių plazmoje (13a pav.). Sėklidėje buvo IL{13}} lygio sumažėjimo tendencija, tačiau tai nepasiekė reikšmingo lygio (13b pav.).

3.2.1.1. CTE poveikis oksidaciniam stresui ir diabetinių žiurkių spermatozoidų uždegimams, kuriuos sukelia riebi dieta

14 paveiksle parodytas superoksido anijonų kiekis žiurkės spermoje. Rezultatai parodė, kad superoksido anijonų gamyba cukriniu diabetu sergančių žiurkių spermoje žymiai padidėjo, o DMR grupėje reikšmingo pagerėjimo nepastebėta. DME1 ir DME4 grupės parodė žymiai sumažintą superoksido anijono gamybą.

3.2.12. CTE poveikis lipidų peroksidacijai diabetinių žiurkių spermatozoiduose, kuriuos sukėlė riebi dieta

Tyrimai parodė, kad lipidų peroksidacija padidėjo tiek 1, tiek 2 tipo cukriniu diabetu sergantiems pacientams [19]. Malondialdehido (MDA) kiekis plazmoje, spermoje ir sėklidėse parodytas 8 lentelėje. MDA lygis DM grupės plazmoje, sėklidėse ir spermoje buvo žymiai didesnis, o gydymas CTE ir RSG sumažino MDA gamybą. Buvo pastebėtas reikšmingas DME4 ir DMEI grupių plazmos sumažėjimas. Šis tyrimas parodė, kad cukriniu diabetu sergančios žiurkės ne tik padidino lipidų peroksidacijos laipsnį plazmoje, bet ir padidino sėklidėse bei spermoje. Buvo pastebėtas reikšmingas pagerėjimas vartojant įvairias CTE dozes.

4. Diskusija

Cukrinis diabetas yra lėtinė liga, susijusi su dideliu cukraus kiekiu kraujyje. Antioksidantų ir ROS lygio disbalansas sukels būklę, vadinamą oksidaciniu stresu. Superoksidas, hidroksilo radikalas, vandenilio peroksidas, azoto oksidas ir vienkartinis deguonis yra keletas ROS pavyzdžių, kurie dėl oksidacinio streso prisidės prie diabeto sąlygų [20].Cistanche tubulosayra dykumos augalas, kuriame yra aktyvių komponentų, tokių kaippolisacharidai, oligosacharidai, feniletanoidiniai glikozidai (echinakozidas, verbaskozidas), palmitino rūgštis, linolo rūgštis, iridoidai, alditoliai ir lignanai. Šis augalas gali sukelti priešuždegiminį, neuroprotekcinį, antibakterinį, antivirusinį, antioksidacinį, priešnavikinį ir imunomoduliacinį poveikį [21]. Literatūros tyrimai rodo, kad feniletanoidiniai glikozidai iš Cistanche tubulosa yra pagrindinė antioksidacinio aktyvumo priežastis [22]. Resveratrolis (RES) ir roziglitazonas (RSG) buvo laikomi teigiama kontrole in vitro ir in vivo tyrimams. RSG yra galingas insulino sensibilizatorius ir turi afinitetą peroksisomų proliferatoriaus aktyvuoto receptoriaus (PPARc) izoformai. Jis kontroliuoja diabetu sergančių pacientų hiperglikemiją [23]. RES turi natūralų antioksidacinį aktyvumą ir veikia kaip kraujagysles plečianti priemonė, reguliuojanti lipoproteinų apykaitą, slopinanti trombocitų agregaciją ir užkertanti kelią vėžiui [24,25]. Mūsų tyrimas parodė, kad ECH rodo geresnį radikalų šalinimo aktyvumą nei CTE ir RES (1 pav.). Taip pat suprantama, kad ECH nesukelia jokio reikšmingo toksiškumo LC-540 ir TM3 Leydig ląstelėms (2 pav.).

NATŪRALUS CISTANCHE TUBULOSA VYRŲ LYTINIAI FUNKCIJAI PHGS75% ECH 30% ACT 12%

AGE buvo naudojami streso sąlygoms sukelti Leydig ląstelėse. AGE gamyba, uždegimas, oksidacinis stresas ir diabetas yra tarpusavyje susiję. Hiperglikeminė cukrinio diabeto būklė skatina ląstelių sužalojimą gaminant AGE ir oksidacinį stresą. AGE sukelia toksiškumą ląstelėms, o tai dar labiau skatina imuninių ląstelių įdarbinimą ir ląstelių mirtį. Padidėjęs AGE lygis skatina dviejų tipų receptorių, vadinamų RAGE ir AGER1, ekspresiją [26]. Lašantis ir vėlesnis elektrono perkėlimas iš mitochondrijų kvėpavimo grandinės į molekulinį deguonį oksidacinio streso metu sukelia superoksido anijono susidarymą. Mūsų rezultatai rodo, kad AGE sukelta superoksido anijonų gamyba padidėjo kontrolinėje grupėje ir buvo pastebėtas tolesnis pagerėjimas tiek naudojant ECH, tiek RES. Remiantis mūsų tyrimu, buvo suprasta, kad esant ECH ir RES, AGE sukelta superoksido (3 pav.) ir H2O2 (4 pav.) gamyba sumažėjo.

NF-κB yra žinomas kaip svarbus su diabetu susijusio uždegimo tarpininkas [27]. NF-κB ekspresija sukelia ląstelių disfunkciją ir ląstelių mirtį. NF-κB aktyvinimas oksidaciniu stresu skatina priešuždegiminį atsaką, endotelino reguliavimą ir apoptozę [28]. RAGE ir NF-κB ekspresija padidėjo AGE stimuliuojamose grupėse, o vėlesnis sumažėjimas buvo pastebėtas ECH ir RES apdorotose ląstelėse (5 pav.).

Testosteronasyra anabolinis steroidas ir pagrindinisvyriškas lytinis hormonassintetinamas iš cholesterolio. Procesas prasideda nuo cholesterolio šoninės grandinės oksidacinio skilimo naudojant cholesterolio šoninės grandinės skilimo geną (CYP11A). Šis genas yra lokalizuotas mitochondrijų membranoje ir paverčia cholesterolį pregnenolonu. Tada CYP17A1 genas iš endoplazminio tinklo pašalina du papildomus anglies atomus ir gamina daug C19 steroidų. Be to, hidroksisteroidų dehidrogenazės (3- -HSD) būdu pregnenolonas oksiduojamas, kad susidarytų androstenedionas / progesteronas. Galiausiai, testosteronas gaminamas redukuojant keto grupę 17-oje androstendiono anglies padėtyje, veikiant 17-beta-hidroksisteroidų dehidrogenazei (17- -HSD). Leydig ląstelės dalyvauja pagrindinėje testosterono gamyboje. Cholesterolio perkėlimui į vidinę mitochondrijų membraną reikalingas steroidogeninio ūmaus reguliavimo baltymo (StAR) veikimas. Dabartiniai tyrimai rodo, kad StAR, CYP11A1, CYP17A1 ir HSD17 3 ekspresija sumažėjo AGE apdorotose ląstelėse (kontrolė), o ECH ir RES apdorotose ląstelėse buvo pastebėtas didžiulis padidėjimas (6 pav.). . Taigi rezultatai rodo, kad gaminantECH ir RES gydytų grupių testosterono kiekis padidėjo. 

NATŪRALUS CISTANCHE TUBULOSA LYTINEI GALIAI GERINTI PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Sergant cukriniu diabetu, gliukozės transportavimas į organus yra ribotas ir dėl to padidėja gliukozės kiekis [29]. Taigi hiperglikeminė būklė yra vienas iš svarbiausių diabeto nustatymo žymenų. Mūsų tyrimai rodo, kad gliukozės kiekis plazmoje buvo padidėjęs diabeto grupėse, o DM grupės AUC buvo žymiai didesnis nei kitų grupių (8 pav.). Kartu su gliukoze plazmoje DM grupėje žymiai padidėjo bendro cholesterolio ir trigliceridų kiekis (2 lentelė). Aterosklerozę skatina padidėjęs cholesterolio ir trigliceridų kiekis [30]. Tačiau CTE ir RSG gydytose grupėse cholesterolio ir trigliceridų kiekis sumažėjo. DME4 grupės trigliceridų kiekis pasiekė beveik panašias reikšmes kaip kontrolinėje grupėje.

Insulinas yra kasos ląstelių gaminamas hormonas, skirtas kontroliuoti cukraus kiekį kraujyje organizme, o leptinas yra hormonas, kurį gamina adipocitai, galintys reguliuoti maisto suvartojimą ir energijos panaudojimą. Tyrimai parodė, kad leptinas yra susijęs su nutukimo patofiziologija ir yra teigiama sąveika tarp leptino ir insulino [31]. Mūsų tyrimai rodo, kad inulino ir leptino kiekis plazmoje buvo didesnis DM grupėje, o insulino lygis sumažėjo padidėjus CTE koncentracijai. RSG grupė nerodo jokio reikšmingo skirtumo nuo DM grupės. Atsparumas insulinui ir ląstelių funkcija buvo įvertinti HOMA-IR metodu. HOMA-IR reikšmė padidėjo DM grupėje ir reikšmingai skyrėsi nuo kitų grupių (3 lentelė).

DM veikia reprodukcinę funkciją per hormonų kaitą HPG ašyje, o tyrimai atskleidė, kad insulino ekspresijai sėklidėse įtakos turi ir diabetas. Jai būdinga Sertoli ląstelių vakuolizacija, padidėjusi DNR fragmentacija, sutrikusi spermatogenezė ir padidėjęs lytinių ląstelių išeikvojimas. Oksidacinis stresas taip pat prisideda prie reprodukcinės funkcijos sutrikimų [32]. Spermos susidarymo procesas vyrų reprodukciniame organe (sėklidėse) vadinamas spermatogeneze. Sėklidė sudaryta iš sandariai susisukusių kanalėlių, vadinamų sėkliniais kanalėliais. Sertoli ląstelės matomos sėklinių kanalėlių sienelėse ir maitina nesubrendusius spermatozoidus. Spermos parametrų tyrimas parodė, kad DM grupėje sumažėjo spermatozoidų skaičius ir judrumas, padidėjo anomalijos (5 lentelė). Priešingas poveikis buvo pastebėtas CTE ir RSG gydytose grupėse. Tiek Leydig ląstelė, tiek Sertoli ląstelės DM grupėje parodė reikšmingą atrofiją, o ertmė buvo matoma spindyje. DM grupėje taip pat sumažėjo sėklinių kanalėlių storis. CTE ir RSG gydytų grupių rezultatai buvo geresni (9 pav.). Be to, LH ir testosterono lygis sumažėjo DM grupėje, o lygis padidėjo CTE gydytose grupėse (4 lentelė). Vyrams mažas testosterono kiekis serume ir mažesnis LH pulso dažnis dažnai buvo susiję su nutukimu ir 2 tipo cukriniu diabetu [33].

Kisspeptinai, užkoduoti KiSS1 geno, yra žinomi kaip stiprus HPG ašies stimuliatorius, o bet kokia kisspeptino geno mutacija sukels žemą lytinių steroidų ir gonadotropino kiekį. Tyrimai rodo, kad STZ sukeltų cukriniu diabetu sergančių žiurkių Kiss1 mRNR lygis sumažėjo [33]. Žinduolių nevaisingumo pradžia ir palaikymas yra susijęs su G-baltymu susietu receptoriumi 54 (GPR54). GPR 54 mutacijai būdingas lytinio brendimo nebuvimas ir žemas gonadotropinių hormonų (LH ir FSH) kiekis. Priešuždegiminiai citokinai, tokie kaip IL-6 ir TNF, padidina citokinų signalizacijos 3 (SOCS3) slopintuvo ekspresiją, susijusią su uždegimu sukeltu atsparumu insulinui kepenyse ir adipocituose [34]. SIRT 1 yra genas, susijęs su kelių senėjimo ligų reguliavimu. Šis genas yra aiškiai išreikštas kasos ląstelėse ir reguliuoja insulino sekreciją bei apsaugo nuo apoptozės. Dabartiniai tyrimai parodė, kad KiSS1, GPR54 ir SIRT1 ekspresija sumažėjo DM grupėje, tačiau ekspresija padidėjo CTE gydytose grupėse (10 pav.). SOCS-3 išraiškų padidėjimas DM grupėje rodo uždegiminę būklę. Pirmasis molekulinis ryšys tarp nutukimo ir uždegimo buvo TNF-. Taigi padidėjęs TNF kiekis yra uždegimo rodiklis. Sumažėjęs priešuždegiminių citokinų, tokių kaip TNF- ir IL-6, kiekis buvo pastebėtas CTE gydytose grupėse (12 ir 13 pav.).

Disbalansas tarp ROS ir antioksidantų sukelia diabetinę būklę. Superoksido dismutazė (SOD), katalazė (CAT) ir glutationo peroksidazė (GPX) yra žinomi kaip pagrindiniai antioksidantai, atsakingi už optimalaus ROS lygio palaikymą [35]. Iš gautų rezultatų buvo nustatyta, kad DM grupėje antioksidantų aktyvumas buvo žymiai mažesnis. KT gydytų grupių antioksidantų gamyba pagerėjo. RSG gydytos grupės antioksidacinis aktyvumas reikšmingai nepagerėjo (6 ir 7 lentelės).

Azoto oksidas (NO) yra žinomas kaip svarbus ROS, kuris prisideda prie uždegimo. Mūsų tyrimai rodo, kad NO lygis sumažėjo CTE gydytose grupėse (11 pav.). Rezultatai parodė, kad superoksido anijonų kiekis cukriniu diabetu sergančių žiurkių spermoje žymiai padidėjo ir po RSG skyrimo reikšmingo pagerėjimo nepastebėta. CTE grupėse superoksido gamyba sumažėjo.

MDA nustatymas yra labai naudingas vertinant lipidų peroksidaciją. Lipidų peroksidacija yra lipidų oksidacijos procesas, dėl kurio galiausiai pažeidžiamos ląstelės. MDA susidaro dėl polinesočiųjų riebalų rūgščių lipidų peroksidacijos. Tyrimai rodo, kad MDA lygis koreliuoja su amžiumi ir gliukozės kiekiu kraujyje nevalgius [36]. Dabartinis tyrimas parodė, kad CTE pagerina lipidų peroksidaciją plazmoje, sėklidėse ir spermoje (8 lentelė).

NATŪRALUS CISTANCHE TUBULOSA LYTINEI FUNKCIJAI GERINTI PHGS75% ECH 30% ACT 12%

5. Išvados

Oksidacinis stresas diabeto sąlygomis sutrikdo vyrų reprodukcinę sistemą dėl spermos pažeidimo ir lytinių liaukų disfunkcijos. Cistanche tubulosa yra dykumos augalas, plačiai pripažintas kinų medicinoje dėl savo farmakologinio poveikio.Echinakozidas (ECH)yra pagrindinė CTE sudedamoji dalis, atsakinga už savo antioksidacinę ir priešuždegiminę veiklą. Mūsų in vitro rezultatai parodė, kad ECH atkūrė testosterono sintezės kelią ir sumažino NF-κB ir RAGE baltymų ekspresijos lygį. ECH veiksmingai slopino superoksido anijono ir H2O2 gamybą Leydig ląstelėse. In vivo tyrimai atskleidė, kad ECH sumažino cholesterolio, trigliceridų, TNF- ir IL-6 kiekį. Be to, žiurkių, sergančių cukriniu diabetu, pagumburio mRNR ekspresija žymiai pagerėjo. Taip pat pažymėtina, kad ECH sumažino lipidų peroksidaciją ir pagerino atsparumą insulinui diabetu sergančių žiurkių patinams. Antioksidacinis aktyvumas padidėjo tiek plazmoje, tiek sėklidėse. Todėl mūsų tyrimai parodė, kad ECH suteikė veiksmingą apsaugą nuo STZ sukeltų diabetinių žiurkių patinų reprodukcinės disfunkcijos.