Kontralateralinės nefrektomijos laiko ir išeminių būklių poveikis inkstų fibrozei po vienašalės inkstų išemijos ir reperfuzijos pažeidimo
Oct 27, 2023
Įvadas
Sergamumasūminis inkstų pažeidimas(AKI) pastaraisiais metais visame pasaulyje smarkiai išaugo [1]. Klinikinėje praktikoje AKI gali sukelti organų transplantacija, pooperacinė perfuzija, kraujavimas, dehidratacija, šokas ir sepsis [2]. Naujausi epidemiologiniai ir eksperimentiniai tyrimai parodė, kad AKI sunkumas, dažnis ir trukmė yra glaudžiai susiję su vėlesniulėtinė inkstų liga(CKD). Inkstų fibrozė po AKI gali sukelti CKD ar netgalutinės stadijos inkstų liga(ESKD) [3–5], o tai reiškia, kad AKI ir CKD yra susiję sindromai [6]. Tačiau, nepaisant daugybės eksperimentinių ir klinikinių tyrimų, mechanizmai, kuriais grindžiamas perėjimas nuo AKI prie CKD, lieka nežinomi. Gyvūnų modeliai yra svarbios priemonės tiriant mechanizmus, kuriais AKI sukelia CKD. Inkstų išemijos-reperfuzijos pažeidimas (IRI) yra viena iš pagrindinių AKI priežasčių, todėl buvo sukurti keli IRI sukeltos AKI su gyvūnais modeliai [7], įskaitant dvišalį IRI (bIRI) modelį, vienpusį IRI modelį su nepažeistu kontralateraliniu inkstu. , uIRI modelis su tuo pačiu metu atlikta kontralateraline nefrektomija ir uIRI modelis su uždelsta priešinga nefrektomija.
BIRI modelis yra mažiau nuoseklus, nes kai abiejų inkstų išeminis pažeidimas yra per lengvas, ilgalaikėje perspektyvoje nėra reikšmingų fibrozinių pokyčių. Kai AKI yra per sunkus, pelės gali mirti ūminio sužalojimo fazėje. Be to, nedideli abiejų inkstų pažeidimų skirtumai po kelių savaičių gali lemti reikšmingus jų lėtinės inkstų patologijos skirtumus [8, 9]. uIRI modelis su tuo pačiu metu atliekama kontralateraline nefrotomija yra panašus į bIRI modelį, nes dėl kitos pusės nefrektomijos lieka tik pažeistas inkstas [10]. IRI modelyje su nepažeistu kontralateraliniu inkstu išeminio inksto fibrozė yra sunki [11,12]. Šis modelis yra labai nuoseklus ir patikimas ilgalaikiam tyrėjų stebėjimui. Tačiau dėl to, kad yra nepažeistas priešingos pusės inkstas, jis negali būti naudojamas įvertinti glomerulų filtracijos greitį (eGFR), kreatinino kiekį serume (SCr) ir kraujo šlapalo azotą (BUN) [11–14]. Palyginti su dviem aukščiau minėtais uIRI modeliais, uIRI modelis su atidėta kontralateraline nefrektomija išsprendžia šias problemas ir gali būti naudojamas tiek ilgalaikiams stebėjimams po AKI, tiek inkstų funkcijos stebėjimui. Todėl šis modelis yra tinkamas AKI-CKD perėjimui tirti [15].
SPAUSKITE ČIA, KAD GAUTI CISTANCHE EKSTRAKTĄŪMUS INKSTU SUŽAIDIMAS
Nepaisant to, skirtingos išeminės būklės ir intervalas tarp kontralateralinės nefrektomijos ir uIRI gali turėti reikšmingos įtakos CKD progresavimui ir sunkumui po AKI. Ankstesni tyrimai buvo skirti išeminės trukmės poveikiui inkstų fibrozei po AKI ir nebuvo daug dėmesio skiriama pagrindinei kūno temperatūrai išemijos metu. Pavyzdžiui, Skrypnyk ir kt. [12] kontroliavo išeminę temperatūrą esant 38 C vandens vonios sistema, kurios išeminė trukmė buvo 30 min., o priešingas nepažeistas inkstas buvo pašalintas praėjus 8 dienoms po uIRI. Rezultatas parodė, kad išeminis inkstas turėjo reikšmingų fibrozinių pokyčių praėjus 28 dienoms po uIRI. Esant tokiai pat išeminei trukmei, Xiao ir kt. [8] parodė, kad reikšmingi fibroziniai pokyčiai įvyko praėjus 11 dienų po uIRI, kai išeminė temperatūra buvo kontroliuojama 37 C 38 C, o laiko intervalas tarp uIRI ir priešingos nefrektomijos buvo 10 dienų. Kai kurie tyrinėtojai, tokie kaip Colombaro ir kt. [14] ir Li ir kt. [16] savo tyrimuose neminėjo išeminės temperatūros.
Tuo tarpu nedaugelis žmonių ištyrė laiko intervalo tarp kontralateralinės nefrektomijos ir uIRI poveikį šiame modelyje, todėl įvairiose laboratorijose buvo gauti labai skirtingi rezultatai, o tai taip pat smarkiai paveikė vėlesnius eksperimentus. Šiame tyrime ištyrėme pagrindinių veiksnių, turinčių įtakos inkstų fibrozei po AKI, poveikį, įskaitant laiko intervalą tarp kontralateralinės nefrektomijos ir uIRI, pagrindinę kūno temperatūrą išemijos metu ir išemijos trukmę. Siekėme pateikti nuorodą, kaip sukurti tinkamą gyvūnų modelį AKI CKD perėjimui tirti
Medžiagos ir metodai Gyvūnų modeliai
C57BL / 6J pelių patinams (8–10 savaičių amžiaus, maždaug 22 g svorio; GemPharmatech Co., Ltd., Nankinas, Kinija) buvo suteikta nemokama prieiga prie maisto ir vandens Šansi medicinos universiteto gyvūnų eksperimentų centre. Veisimosi sąlygos buvo tokios: drėgmė 40–70%, temperatūra 23 C, oro švarumo klasė 7, kontroliuojamas 12-h šviesos/tamsos ciklas be patogenų, pašarų švitinimas Co60 ir išgrynintas vanduo. Visas šio tyrimo procedūras patvirtino Šansi medicinos universiteto antrosios ligoninės gyvūnų etikos komitetas (etikos numeris: DW2022028).
Protokolai
Atsižvelgiant į tai, kad išemijos trukmė, pagrindinė kūno temperatūra išemijos metu ir priešingos pusės nepažeisto inksto rezekcijos laikas gali turėti įtakos AKI ir vėlesnės inkstų fibrozės sunkumui, mes ištyrėme aukščiau minėtų trijų veiksnių poveikį atskirai, o kiti du buvo fiksuoti. Trys eksperimentai buvo atlikti taip.
1 protokolas: norint stebėti intervalo tarp kontralateralinės nefrektomijos ir uIRI poveikį inkstų funkcijai ir po AKI fibrozei, kairiojo inksto išeminis laikas buvo fiksuotas 24 min., o pagrindinė kūno temperatūra inksto metu buvo nustatyta 37 C. tuo tarpu išemija. Dešiniojo inksto rezekcija buvo atlikta atitinkamai 7, 10 ir 14 dieną (n ¼ 8 grupėje) po kairiojo inksto IRI. Išemijos ir inkstų rezekcijos trukmę nustatėme remdamiesi ankstesnių tyrimų rezultatais [8, 10, 12, 15] ir mūsų priešeksperimentiniais rezultatais. Tyrimo protokolą žr. 1 paveiksle (A–C).
2 protokolas: norint stebėti pagrindinės kūno temperatūros poveikį išemijos metu AKI-CKD perėjimui, kairiojo inksto išeminis laikas buvo fiksuotas 24 min., o dešinysis inkstas buvo pašalintas praėjus 14 dienų po kairiojo inksto IRI. Pagrindinė kūno temperatūra buvo kontroliuojama atitinkamai 36 C, 36,5 C, 37 C, 37,5 C ir 38 C (n ¼ 8 grupėje). Tyrimo protokolą žr. 1 paveiksle (D).
3 protokolas: norint stebėti inkstų išemijos trukmės poveikį perėjimui nuo AKI prie CKD, išemijos metu pagrindinė kūno temperatūra buvo fiksuota 37 C, o dešinysis inkstas buvo pašalintas praėjus 14 dienų po kairiojo inksto IRI. Šį laiko momentą pasirinkome todėl, kad pagal ataskaitas [8, 10, 12, 15] ir mūsų priešeksperimentinius rezultatus inkstų fibrozė, kuri buvo tipiškas pokytis po AKI į CKD, buvo labai akivaizdus. Kairiojo inksto išeminis laikas buvo kontroliuojamas atitinkamai 21 min., 24 min., 27 min. ir 30 min. (n ¼ 8 grupėje). Tyrimo protokolą žr. 1 paveiksle (E).
Visos pelės buvo eutanazuotos praėjus 8 savaitėms po kairiojo inksto IRI. Dalis kairiojo inksto audinio buvo laikoma 70 C temperatūroje, kad būtų galima atlikti tolesnę RT-PGR ir Western blot analizę, o kita dalis buvo fiksuota neutraliame formalinu histopatologinei analizei. Kraujo mėginiai buvo paimti per retroorbitinį sinusą biocheminiam tyrimui.
1 pav. Vienašalio išemijos-reperfuzijos pažeidimo (uIRI) protokolai su uždelsta kontralateraline nefrektomija. (A–C): kairiajam inkstui buvo atlikta IRI 0 dieną, o dešiniojo inksto rezekcija buvo atlikta skirtingais laiko momentais (7 dieną, 1 dieną 0 ir 14 dieną), kai išeminė trukmė truko. fiksuota 24 min., o pagrindinė kūno temperatūra fiksuota 37 C inkstų išemijos metu. (D): 0 dieną kairiajam inkstui buvo atlikta IRI, o dešiniojo inksto rezekcija buvo atlikta esant skirtingoms pagrindinėms kūno temperatūroms (36 C, 36,5 C, 37 C, 37,5 C ir 38 C) esant išemijai. kairiojo inksto laikas fiksuotas 24 min., o dešinysis inkstas buvo pašalintas praėjus 14 dienų po kairiojo inksto IRI. (E): kairiajam inkstui buvo atlikta IRI 0 dieną, o dešiniojo inksto rezekcija buvo atlikta skirtingomis išeminėmis trukmėmis (21 min., 24 min., 27 min. ir 30 min.), kai inksto metu pagrindinė kūno temperatūra buvo fiksuota 37 C. išemija, o dešinysis inkstas buvo pašalintas praėjus 14 dienų po kairiojo inksto IRI. Inkstų svoris, inkstų funkcija, inkstų histologinis pažeidimas ir inkstų fibrozė buvo vertinami iki 56 dienos.
Chirurginė procedūra
Prieš operaciją visos pelės nevalgė 12 valandų su laisva prieiga prie vandens ir buvo švirkščiamos į pilvaplėvės ertmę 3% pentobarbitalio natrio druskos 50 mg/kg. Anestezijos metu skirtingose eksperimentinėse grupėse rektalinė temperatūra buvo palaikoma atitinkamai 36 C, 36,5 C, 37 C, 37,5 C arba 38 C. Kad tai būtų pasiekta, pelė buvo uždėta nugara ant kaitinimo pagalvėlės (CW{{10}}, BARBAROUS GROWTH, Džedziangas, Kinija) ir ištiesta galva ir kaklas, kad būtų užtikrintas kvėpavimo takas. be kliūčių, o akys buvo padengtos šilta druskos marle, kad procedūros metu neišsausėtų. Po anestezijos plaukų kirpimo mašinėle buvo nuskusti plaukai kairėje pelės nugaroje. Oda chirurginėje srityje buvo nuvalyta 75% alkoholio tamponu. Paprastai po plaukų skutimo pelės kūno temperatūra nukrenta. Chirurginė procedūra buvo atlikta, kai pasidarė pastovi kūno temperatūra, kuri galėjo trukti apie 15 min. Kairįjį inkstą buvo galima pamatyti nupjovus kairiąją nugaros odą 0,5 cm šalia vidurinės linijos ir 0,5 cm apatiniame pelės šonkaulių narvelio krašte. Tada viena ranka suspaudėme kairįjį pilvą, kad kairysis inkstas išeitų iš kūno ertmės, pakėlėme inkstą bukomis lenktomis žnyplėmis (žiūrėdami, kad nepažeistumėte inksto), atjungėme inksto kotelį ir greitai jį suspaudėme, o užveržtą uždėjome. inkstų po oda, kad ji būtų šilta ir sudrėkinta. Sėkmingai išemijai buvo būdingas laipsniškas inkstų spalvos pasikeitimas iš raudonos į tamsiai violetinę, kuris truko atitinkamai 21 min., 24 min., 27 min. ir 30 min. skirtingose eksperimentinėse grupėse. Inkstų spalva vėl pasikeitė į raudoną per 2–5 minutes po spaustuko atleidimo. Tada pilvo ertmę uždarome sluoksniuotomis siūlėmis. Dešinė nugaros oda ir raumuo buvo įpjauti atitinkamai 7, 10 ir 14 dieną po uIRI skirtingose eksperimentinėse grupėse, o dešinysis inkstas buvo rezekuotas. Tada uždarykite žaizdą standartinėmis siūlėmis. Po kiekvienos operacijos į pilvaplėvės ertmę buvo įšvirkščiama 500 l fiziologinio tirpalo, siekiant kompensuoti skysčių praradimą operacijos metu. Tuo pačiu metu pelė buvo laikoma ant šildymo kilimėlio maždaug 2–3 valandas, kol ji įgijo visišką sąmonę, prieš perkeldama į laikymo narvą. Apsimetinė grupė neužspaudė inksto pedikulo, o likusios chirurginės operacijos buvo tokios pačios kaip ir uIRI grupėje. Visas chirurgines operacijas atliko tas pats asmuo, turintis daugiau nei 2 metų šio modelio eksploatavimo patirtį.
Inkstų funkcijos tyrimas
SCr lygis buvo matuojamas kreatinino rinkiniu (Jaffe Method, 100020170, Biosino Biotechnology and Science). BUN lygiai buvo matuojami naudojant karbamido rinkinį (Ureazės-glutamato dehidrogenazės metodas, Biosino Biotechnology and Science).
Inkstų svorio tyrimas
Po šlapinimosi pelių kūno svoris buvo matuojamas tiksliomis elektroninėmis svarstyklėmis. Švieži inkstai buvo tris kartus skalauti iš anksto atšaldytu fiziologiniu tirpalu, tada vandens perteklius ant inkstų buvo nuvalytas filtravimo popieriumi. Inkstų kapsulės buvo nulupamos ant ledo ir iš karto pasverti inkstai. Inksto svorio ir kūno svorio santykis buvo apskaičiuotas siekiant įvertinti pakoreguotą inkstų svorį mg/g.
Hematoksilino-eozino (HE) dažymas ir inkstų pažeidimo balas
Neutralūs formalinu fiksuoti inkstų audiniai buvo reguliariai dehidratuoti, įterpti į parafiną, supjaustyti (3 lm) ir nudažyti HE, kad būtų galima stebėti inkstų audinių pažeidimus. Dešimt atsitiktinai parinktų kiekvienos sekcijos inkstų žievės laukų buvo užfiksuota šviesos mikroskopu, padidinus 400. Du patologai glomerulų ir inkstų kanalėlių sužalojimą įvertino atskirai. Vamzdelio pažeidimas buvo įvertintas skalėje {{20}}–4, taikant šiuos kriterijus [17]: 0, sužalojimo nėra; 1, paveikianti 1–25% inkstų ploto; 2, paveikianti 26–50 % inkstų srities; 3, paveikianti 51–75% inkstų ploto; ir 4, paveikiantys 75–100 % inkstų ploto. Kanalėlių pažeidimo laipsnis buvo įvertintas pusiau kiekybiškai, apskaičiuojant inkstų kanalėlių pažeidimo plotą. Glomerulų pažeidimas buvo įvertintas ir įvertintas skalėje nuo 0 iki 4 pagal mezangialo išsiplėtimo arba sklerozės plotą procentais, taikant šiuos kriterijus [17]: 0, normalūs glomerulai; 1, 1–25% ploto sužalotas; 2, 26–50% ploto sužeista; 3, 51–75% ploto sužeista; ir 4, sužeista 76–100 proc. Galutinis glomerulų pažeidimo balas ¼ 0 (% 0 laipsnio glomerulų) þ 1 (% 1 laipsnio glomerulų) þ 2 (% 2 laipsnio glomerulų) þ 3 (% 3 laipsnio glomerulų) þ 4 (% 4 laipsnio glomerulų). Vienai pelei buvo įvertinta daugiau nei 50 glomerulų.
Massono dažymas trichromu
Neutralūs formalinu fiksuoti inkstų audiniai buvo reguliariai dehidratuoti, įterpti į parafiną, suskirstyti į dalis (3 lm) ir nudažyti Massono trichromu, kad būtų galima stebėti inkstų fibrozę. Massono trichromu nudažytuose pjūviuose buvo užfiksuota dvidešimt nesutampančių inkstų žievės laukų, padidinant 200 kartų. „Image-Pro Plus“ vaizdo analizės programinė įranga buvo naudojama automatiniam matavimui ir analizei. Inkstų intersticinės fibrozės lygiui nustatyti buvo naudojamas fibrozinio ploto procentas [8].
RT-PGR
Bendra mRNR buvo išskirta iš kiekvienos grupės inkstų audinio Trizol ir išmatuota jo koncentracija, tada ji buvo konvertuota į cDNR (Taka Reverse Transcription Kit). Fibronektino (FN) ir kolageno I (COL-I) RNR ekspresijai inkstų audiniuose nustatyti buvo naudojamas Taqman fluorescencinis metodas (TB Green Premix Ex Taq II Real-time RT-PCR). Konkretūs pradmenys buvo naudojami FN (pirmyn: 50 -GGAGTGGCACTGTCAACCTC-30 ir atvirkštinė: 50 -ACTGGATGGGGTGGGAAT-30) ir COL-I (pirmyn: 50 -ACATGTTCAGCTTTGTGGACC{ {9}} ir atvirkščiai: 50 -TAGGCCATTGTGTATGCAGC-30 ) [18] (pateikia Sangon Biotech Co., Ltd., Šanchajus, Kinija). Amplifikacijos sąlygos yra tokios: 95 C – 30 s, 95 C – 5 s, 60 C – 30 s, 40 ciklų; 95 C 10 s, 65 C 5 s ir 95 C/5 C. Išanalizavus produktų amplifikacijos kreives ir tirpumo kreives, santykiniai mRNR lygiai buvo nustatyti lyginamuoju KT metodu (2-DDCt) su 18SrRNR (pirmyn: 50 - CGGACACGGACAG GATTGACAG-30 ir atgal: 50 -AATCGCTCCACCAACT AAGAACGG-30 ) kaip vidinė nuoroda.
Western blot
Inkstų audiniams lizuoti buvo naudojamas radio-imuno-precitation-assay (RIPA) lizės buferis, o baltymų koncentracija buvo nustatyta BCA metodu. Gradientinė gelio elektroforezė buvo naudojama baltymams atskirti nuo 50 lg mėginių. Tada baltymai buvo perkelti į nitroceliuliozės membraną. Po 2 valandų blokavimo 5% neriebiu pienu, membranos per naktį 4 °C temperatūroje buvo mirkomos triušio anti-pelės monokloniniu antikūnu prieš lygiųjų raumenų aktiną (a-SMA) (1:1000, Nr.19245, Cell Signaling Technology). ), FN (1:1000, Nr.ab2413, ABCam) arba COL-I (1:1000, Nr.72026, ląstelių signalizacijos technologija). Kitą dieną membranos buvo pašildytos kambario temperatūroje 0, 5 valandos. Po plovimo TBST membranos buvo inkubuojamos su HRP konjuguotu AffiniPure Goat Anti-rabbit IgG (H þ L) (1:1000, Nr.BA1054, BOSTER Biological Technology) 2 valandas. Po to, kai jie buvo dar kartą nuplauti TBST, jie buvo nudažyti ypač didelio jautrumo ECL chemiliuminescenciniu reagentu, kad būtų galima vizualizuoti imunoblotus. b-aktinas buvo matuojamas toje pačioje membranoje kaip ir vidinė atskaita. Baltymų ekspresija buvo nustatyta kiekybiškai įvertinus santykinę tikslinių baltymų ekspresiją, palyginti su b-aktinu.
Duomenų ir statistinė analizė
Visi ištirti duomenys išreiškiami kaip vidurkis ± standartinis nuokrypis. Dviejų grupių palyginimai buvo atlikti naudojant nepriklausomą t testą. Kelių grupių palyginimai buvo gauti naudojant vienpusį ANOVA, kai duomenų pasiskirstymas yra normalus, o dispersija yra vienalytė, Welch ANOVA buvo naudojama statistiniam reikšmingumui įvertinti, kai dispersija buvo nevienalytė, o po to buvo atliktas Tukey post hoc testas daugkartiniams palyginimams. Visos statistinės analizės buvo atliktos programine įranga GraphPad Prism 8.{3}}. p < 0,05 buvo laikomas statistiškai reikšmingu.
„Wecistanche“ – didžiausio cistansų eksportuotojo Kinijoje – pagalbinė tarnyba:
El. paštas:wallence.suen@wecistanche.com
WhatsApp / Tel.:+86 15292862950
Įsigykite daugiau specifikacijų:
https://www.xjcistanche.com/cistanche-shop
