Flavonoidų poveikis odai pagal jų struktūrines charakteristikas: apžvalga

Prašau susisiektioscar.xiao@wecistanche.comDaugiau informacijos

Santrauka:Pagrindiniai faktai: Miokardo infarkto (MI) metu prarandama milijardai kardiomiocitų. Optimali terapija turėtų veiksmingai pakeisti pažeistus kardiomiocitus, galbūt kamieninėmis ląstelėmis, galinčiomis įsitvirtinti ir diferencijuotis į suaugusiųjų funkcinius kardiomiocitus. Taigi širdies prieširdžių priedų kamieninės ląstelės (CASC) yra tinkamos kandidatės. Tačiau padidėjęs pažangių glikacijos galutinių produktų (AGE) kiekis širdies regionuose, kur persodinami CASC, gali turėti įtakos jų regeneraciniam potencialui. Šiame tyrime nagrinėjame, ar ir kaip AGE keičia CASC savybes in vitro. Metodai ir rezultatai: CASC kultūroje buvo veikiamos įvairios AGE koncentracijos (nuo 50 ug/mL iki 400 ug/mL). CASC išgyvenamumas, proliferacija ir migracijos pajėgumai žymiai sumažėjo po 72 valandų AGE ekspozicijos. Apoptozė žymiai padidėjo didėjant AGE koncentracijai. Žalingas šių AGE poveikis buvo iš dalies sumažintas iš anksto inkubavus su AGE receptoriumi (RAGE) inhibitoriumi (25 μM FPS-ZM1), o tai rodo, kad pastebėtas neigiamas poveikis yra susijęs su RAGE. Išvada: AGE turi nuo laiko ir koncentracijos priklausomą neigiamą poveikį CASC išgyvenimui, proliferacijai, migracijai ir apoptozei in vitro, iš dalies tarpininkaujant RAGE aktyvacijai. Ar anti-AGE terapija yra veiksmingas gydymas kamieninių ląstelių terapijoje po MI, reikia toliau tirti.

Raktiniai žodžiai:kamieninės ląstelės; aldehido dehidrogenazė; CASC; glikuoti baltymai; pažangūs glikacijos galutiniai produktai; platinimas; apoptozė; migracija; RAGE slopinimas

1. Įvadas

Koronarinė širdies liga (ISL) išlieka pagrindine mirtingumo ir sergamumo priežastimi visame pasaulyje, o miokardo infarktas (MI) yra dažniausia ŠKL forma [1]. MI atsiranda dėl visiško ar dalinio vainikinės arterijos užsikimšimo. Išeminėje srityje deguonis ir maistinės medžiagos yra apribotos, todėl miokardo ląstelės miršta. Infarkto dydis priklauso nuo daugelio veiksnių, tokių kaip išeminės rizikos zonos dydis, vainikinių arterijų okliuzijos vieta ir trukmė bei liekamasis kolateralinės kraujotakos kiekis [1,2]. Kadangi suaugę kardiomiocitai turi minimalias regeneracines savybes, vidinis pažeisto audinio atstatymas lieka sunkiai įmanomas. Vienintelė galimybė atkurti prarastą širdies audinį yra rasti terapinį metodą, kuris veiksmingai pakeičia miokardo randą funkciniu susitraukiančiu audiniu.kiek cistanche paimtiBuvo įdėta daug mokslinių tyrimų, siekiant atskleisti terapinį ląstelių terapijos potencialą ir mechanizmus su kaulų čiulpų ląstelėmis (BMC). Kaulų čiulpuose yra hematopoetinių kamieninių ląstelių (HSC), endotelio progenitorinių ląstelių (EPC) ir mezenchiminių kamieninių ląstelių (MSC) [3]. Klinikiniai tyrimai su mononukleariniais BMC ir MSC nepadėjo reikšmingai pagerinti širdies funkcijos po MI. Kadangi mononukleariniai BMC ir MSC nesiskiria į kardiomiocitus, pastebėtas ribotas pagerėjimas greičiausiai yra susijęs su parakrininiais mechanizmais [4, 5]. Siekiant žymiai pagerinti širdies funkciją po MI, tyrimų dėmesys buvo nukreiptas į rezidentines širdies kamienines ląsteles (CSC), pvz., c-kit plus, Sca-1 plus, Isl-1 plus -ląsteles ir kardiosferas, kurie greičiausiai bus iš anksto užprogramuoti tapti kardiomiocitais. Tačiau jų sėkmė širdies regeneracijoje yra menka [6].

spustelėkite čia norėdami sužinoti daugiau

Pastaraisiais metais mūsų tyrimų grupė atrado naujo tipo širdies kamienines ląsteles, pavadintas „širdies prieširdžių kamieninėmis ląstelėmis“ (CASC). Priešingai nei kitos kamieninės ląstelės, CASC pasižymi nepaprastomis kardiomiogeninėmis diferenciacijos savybėmis, todėl jos yra perspektyvus kandidatas širdies regeneracijai [4]. Šios kamieninių ląstelių populiacijos išskyrimas iš prieširdžių priedų pagrįstas dideliu aldehiddehidrogenazės (ALDH) aktyvumu. Didelis ALDH aktyvumas taip pat buvo pranešta apie kitų tipų kamienines ląsteles, pvz., MSC, HSC ir nervų bei vėžio kamienines ląsteles, be kita ko [7-9]. Kadangi įrodyta, kad ALDH apsaugo širdį ir skatina ląstelių išgyvenimą streso sąlygomis, ALDH ir kamieninių ląstelių populiacijos naudojimas išeminėmis sąlygomis gali būti naudingas [4, 10]. CASC galima išplėsti iki kliniškai reikšmingo skaičiaus, neprarandant pagrindinių savybių, tokių kaip ALDH aktyvumas, paviršiaus antigeno profilis ir kardiomiogeninės diferenciacijos gebėjimas [11]. Tai labai svarbu norint pritaikyti šį gydymo metodą klinikai. Be to, mes parodėme, kad dėl autologinių CASC transplantacijų pagerėja kairiojo skilvelio funkcija, atsirandanti dėl tinkamo kamieninių ląstelių įsisavinimo ir tolesnės CASC diferenciacijos [4,12].

Sergant MI, pažengusių glikacijos galutinių produktų (AGE) lygis yra padidėjęs [13]AGE yra baltymai ir (arba) lipidai, kuriuos negrįžtamai pažeidžia glikacija – procesas, kurio metu redukuojantis cukrus nefermentiškai reaguoja su amino grupėmis lipiduose arba baltymuose. . Be glikacijos, oksidacinis stresas taip pat sukelia AGE susidarymą oksiduojant baltymus ir (arba) lipidus [14]. AGE susidaro endogeniškai ir natūraliai kaupiasi organizme senstant arba esant patologinėms situacijoms, tokioms kaip MI, kai padidėja oksidacinio streso lygis [15-17].kas yra cistancheBe to, ankstesni tyrimai parodė, kad AGE veikia įvairių tipų kamienines ląsteles in vitro [18-20]. AGE sumažina kamieninių ląstelių gebėjimą daugintis, o pritaikius AGE padidėja apoptozės greitis. Šie efektai gali būti vykdomi naudojant kelis mechanizmus, įskaitant apoptozinio kelio aktyvavimą, RAGE arba pernelyg didelį ROS susidarymą [20]. Ar AGE taip pat turi įtakos CASC savybėms, lieka nežinoma. Šios išvados kelia klausimą, ar AGE gali neigiamai paveikti CASC, kurie naudojami kaip MI gydymas, terapinį veiksmingumą. Todėl šio tyrimo tikslas yra ištirti AGE poveikį in vitro ir galimą jo receptorių RAGE aktyvavimą CASCS proliferacijai, išgyvenimui ir migracijai.

2.Medžiagos ir metodai

2.1. Eksperimentai su gyvūnais

Tyrimai su gyvūnais buvo atlikti pagal ES direktyvą 2010/63/ES dėl eksperimentų su gyvūnais ir patvirtinti Vietinio eksperimentų su gyvūnais komiteto (UHasselt, Belgija, Diepenbeek; ID 201919K). Visi gyvūnai buvo laikomi kontroliuojamoje temperatūroje (21 laipsnis, 60 proc. drėgmė) su 12 h -12 h šviesos ir tamsos ciklu. Jie buvo šeriami standartine granulių dieta su vandeniu, kurį galima gauti ad libitum. Iš viso buvo naudojamos 62 Sprague-Dawley žiurkių patelės (Janvier Labs, Le Genest-Saint-Isle, Prancūzija).

2.2. Žiurkių CASC išskyrimas ir išplėtimas

CASC buvo paimti iš dešiniojo prieširdžio priedų, kaip aprašyta anksčiau [4]Trumpai tariant, žiurkėms buvo suleista heparino (1000 vienetų/kg, į pilvaplėvės ertmę (ip) ir eutanazija perdozavus natrio pentobarbitalis (Dolethal, Vetochinol, Aartselar Belgium, 200 mg/kg, ip). Širdelės buvo nuskintos, perfuzuotos įprastu Tyrode tirpalu (137mMNaCl,5.4mMKCl,0.5mMMgClz,1mMCaClz,11.8mM,Nase,2mgluu ,pH7,4), ir buvo surinkti dešiniojo prieširdžio priedai. Išskirtas dešiniojo prieširdžio priedo audinys susmulkintas ~1 mm³ gabaliukais, plaunamas fosfatiniu buferiniu fiziologiniu tirpalu (PBS) ir 30 minučių fermentiškai disocijuotas Hanko subalansuotame druskos tirpale. kuriame yra 0,6 WU/mL kolagenazės NB 4 (Serva, Heidelbergas, Vokietija) ir 20 mM Carly.bioflavonoidaiALDHt ląstelės buvo nudažytos pagal Aldefluor rinkinį (STEMCELL Technologies, Evergem, Belgija). ALDHt ląstelės buvo apibrėžtos kaip CASC ir buvo rūšiuojamos srautu (BD FACS Aria) X-VIVO 15 terpėje (Lonza, Bazelis, Šveicarija), papildytos 20 procentų veršelio vaisiaus serumo (FCS) ir 2 procentų penicilino / streptomicino (P/S). . Izoliuoti CASC buvo sėjami į 6-šulinėlių plokšteles, kurių tankis buvo 60,000 ląstelių vienoje duobutėje ir inkubuojami 37 laipsnių temperatūroje drėgname inkubatoriuje su 5 procentų CO2 atmosfera. Terpė buvo keičiama kas 2–3 dienas. Kai CASC pasiekė 80 procentų santaką, jie buvo nuimami naudojant tripsiną. Visiems eksperimentams buvo naudojami 1 ištraukos CASC.

Cistanche gali kovoti su senėjimu

2.3. AGEs pasirengimas

AGE buvo paruošti, kaip aprašyta anksčiau [21]. Trumpai tariant, galvijų serumo albuminas (BSA; 7 mg/ml) buvo inkubuojamas su glikolaldehido dimerais (90 mM; Sigma-Aldrich, Diegem, Belgija) steriliame PBS (pH 7,4) 5 dienas 37 laipsnių temperatūroje. Šis tirpalas buvo dializuojamas prieš PBS, du kartus 2 valandas ir per naktį 4 laipsnių temperatūroje, kad būtų pašalintas nesureagavęs glikolaldehidas (3,4 kDa riba. AGE buvo filtruojami (0,2 um filtras, Sarstedt, Antverpenas, Belgija). BSA inkubuojamas PBS (7 mg/mL). ) buvo naudojamas kaip kontrolinis tirpalas.

2.4.Išplitimo ir išgyvenimo tyrimas

Buvo atlikti proliferacijos ir išgyvenimo tyrimai, naudojant propidžio jodido (PI) tyrimą, kaip anksčiau aprašyta Gervois ir kt. ir Lo Monaco et al.[22,23]. Trumpai tariant, CASC buvo pasėtos į 96-šulinėlių plokštelę X-VIVO terpėje su 10 procentų FCS ir 2 procentais P/S. Proliferacijos tyrimams į vieną duobutę buvo pasėta 5000 ląstelių. Išgyvenamumo tyrimams į vieną duobutę buvo pasėta 100 ląstelių. Po 24 valandų į terpę buvo pridėtos penkios skirtingos sąlygos: 400 ug/mL BSA, 50 ug/mL, 100 ug/mL, 200 ug/mL ir 400 ug/mL AGE. Norint išmatuoti proliferaciją, į X-VIVO terpę su 2 procentais FCS ir 2 procentais P/S buvo pridėta BSA arba AGE.nusipirk cistancheIšgyvenamumui išmatuoti BSA arba AGE buvo pridėta prie X-VIVO terpės su 0 procentais FCS ir 2 procentais P/S. Praėjus trims skirtingiems laiko momentams (24, 48 ir 72 val.), terpė buvo pakeista lizės buferiu A100 (ChemoMetec, Kaiserslautern, Vokietija), po to tokiu pat kiekiu stabilizavimo buferio B (ChemoMetec), papildyto PI (10 ug/). ml, Sigma). Po 15 minučių inkubacijos tamsoje fluorescencija buvo matuojama naudojant Fluostar Optima plokštelių skaitytuvą (BMG Labtech, Ortenberg, Vokietija), esant 540 nm sužadinimui, 612 nm spinduliuotės bangos ilgiui ir 2000 padidėjimui. Buvo atlikti eksperimentai. trimis egzemplioriais. Duomenys buvo normalizuoti pagal duomenis, gautus naudojant 400 ug/ml BSA.

2.5. Migracijos tyrimas

CASC buvo sėjami į {{0}}šulinėlių plokštelę 5000 ląstelių tankiu X-VIVO terpėje su 10 procentais FCS ir 2 procentais P/S. Į terpę buvo pridėtos penkios sąlygos: 400 ug/mL BSA, 50 ug/ml, 100 ug/mL, 200 ug/ml ir 400 ug/mL AGE. Po 72 valandų inkubacijos laikotarpio kondicionuoti CASC buvo surinkti naudojant tripsiną ir naudojami transwell migracijos tyrimui. ThinCerts (Greiner Bio-One, Vilvoorde, Belgija) su 8 um porų dydžio akyta membrana, 100 000 ląstelių kiekvienai sąlygai buvo pasėta į X-VIVO terpę su 0 procentų FCS ir 2 procentais P/S. ThinCerts buvo dedamos į 24-šulinėlių plokšteles, kuriose buvo X-VIVO terpė su 2 procentais FCS ir 2 procentais P/S. Po 24 valandų migracijos ThinCerts buvo fiksuojamos 4 procentų paraformaldehidu (PFA) 15 minučių ir inkubuojamos su 0,1 procentų krištolinio violetinio 30 min. Ląstelės, kurios nemigravo, buvo pašalintos viršutinėje ThinCerts pusėje, o po to transmigruotų CASC kiekis buvo kiekybiškai įvertintas naudojant AxioVision 4.6 programinę įrangą (Carl Zeiss, Zaventem, Belgija). Duomenys buvo normalizuoti pagal duomenis, gautus naudojant 400 ug/ml BSA.

2.6.Apoptozės tyrimas

CASC buvo pasėtos į 96-šulinėlių plokštelę 10,00 ląstelių tankiu X-VIVO terpėje su 2 procentais FCS ir 2 procentais P/S. Apoptozei tirti buvo atliktas kaspazės tyrimas naudojant IncuCyte8 Caspase{7}}/7 Green Apoptosis Assay Reagent (praskiestas 1/100, Sartorius, Schaarbeek, Belgija). Į terpę buvo pridėtos penkios sąlygos: 400 ug/mL BSA, 50 ug/mL, 100 ug/mL, 200 ug/mL ir 400 ug/mL AGEs. CASC, kultivuoti X-VIVO terpėje be FCS ir 2 procentų P/ S buvo naudojami kaip teigiama kontrolė. Eksperimentai buvo atlikti trimis egzemplioriais. Vaizdai buvo paimti po 24, 48 ir 72 valandų inkubacijos naudojant IncuCyte@S3Live-Cell Analysis System (Sartorius, Schaarbeek, Belgija). Apoptotinių ląstelių užimamo ploto analizė buvo atlikta naudojant IncuCyte* SX1 Live-Cell Analysis System (Sartorius, Schaarbeek, Belgija). Duomenys buvo normalizuoti iki teigiamos kontrolės (plius , X-VIVO terpė be FCS).

2.7. In vitro RAGE slopinimas

RAGE buvo slopinamas, siekiant įvertinti RAGE aktyvacijos indėlį į CASC proliferaciją, išgyvenimą ir migraciją. Trumpai tariant, CASC buvo iš anksto inkubuojami 37 laipsnių temperatūroje 5 procentų CO2 inkubatoriuje su RAGE antagonistu FPS-ZM1 (10 ir 25 uM, Calbiochem / Merck, Overijse, Belgija). Po 2 valandų išankstinio inkubavimo buvo pridėta 400 ug/ml AGE.cistanche AustralijaPo 24 48 ir 72 valandų proliferacija ir išgyvenamumas buvo įvertinti, kaip aprašyta aukščiau. Po 72 valandų inkubacijos iš anksto kondicionuoti CASC buvo surinkti ir naudojami transwell migracijos tyrimui, kaip aprašyta aukščiau.

2.8.Statistika

Statistinė analizė buvo atlikta naudojant GraphPad Prism 9.0.0 programinę įrangą.cistanchasNormalus duomenų pasiskirstymas buvo įvertintas Shapiro-Wilk testu. Paprastai paskirstytiems duomenims buvo atliktas vienpusis ANOVA testas su pakartotiniais matavimais, po to Holm-Sidak kelių palyginimo testas. Kai duomenys nebuvo įprastai paskirstyti, buvo naudojamas neparametrinis Friedmano testas, po kurio buvo atliktas Dunn's Multiple Comparison testas. Visi duomenys išreiškiami kaip vidurkis ± standartinė vidurkio paklaida (SEM). P reikšmė<0.05 was="" considered="" statistically="">

3. Rezultatai

3.1. AGE ekspozicija neigiamai veikia CASC plitimą ir išlikimą

Kaip parodyta 1 paveiksle, AGE laikui bėgant žymiai ir palaipsniui sumažino CASC proliferaciją. Neigiamas AGE poveikis CASC proliferacijai taip pat priklausė nuo koncentracijos. Po 72 valandų 100 ug/mL, 200 ug/mL ir 400 ug/mL AGEs sig reikšmingai sumažino CASC proliferaciją, palyginti su BSA (1C pav.; 80 proc. ±7n100ug/ml, 74 proc. ±3in 200 ug/mL). ir 65 procentai ±4 400 ug/mL AGE). Vien tik BSA taikymas neturėjo įtakos CASC proliferaciniam pajėgumui (pav. Sl papildomose medžiagose). Kaip parodyta 2 paveiksle, didėjančios AGE koncentracijos neigiamai paveikė CASC išgyvenimą laiku. Reikšmingas AGE poveikis buvo pastebėtas po 48 (2B pav.) ir 72 valandų (2C pav.; 85 procentai ± 3 100 ug/ml, 73 procentai ± 3 200 ug/mL ir 64 procentai ± 4 po 400 ug/mL AGE) Vien BSA taikymas neturėjo įtakos CASC išgyvenamumui (S1 pav.).

3.2. Padidėjusi AGE koncentracija Padidėja CASC apoptozė

Siekiant išsiaiškinti skirtingų AGE koncentracijų (50, 100, 20 ir 400 ug/mL) poveikį CASC apoptozei, buvo atliktas kaspazės tyrimas. Ląstelių, ekspresuojančių 3/7 kaspazę, procentas buvo matuojamas skirtingais laiko momentais: 24 (3A pav.), 48 (3B pav.) ir 72 (3C pav.) Val. Apoptozės greitis laikui bėgant palaipsniui didėjo didėjant AGE koncentracijai (3C pav., 72 val.; 77 proc. ±17 400 ug/mL AGE, palyginti su 18 proc. ±3 BSA).

3.3. AGE ekspozicija sumažina CASC perkėlimo pajėgumus

CASC migracijos pajėgumas buvo įvertintas naudojant transwell migracijos tyrimą po 72 valandų inkubacijos su skirtingomis AGE koncentracijomis. 4-E paveiksle pateikti tipiški CASC migracijos pavyzdžiai po inkubacijos su BSA ir skirtingomis AGE koncentracijomis (50 100, 200 ir 400 ug/mL). Migracijos kiekybinis įvertinimas parodytas 4F paveiksle. Palyginti su BSA, pastebėtas reikšmingas migracijos sumažėjimas, kai CASC buvo inkubuojami su 400 ug/mL AGE (4E pav., F; 75 proc. ± 5 in 400 ug/mL AGE).

3.4. Žalingą AGE poveikį CASC sukelia RAGE aktyvinimas

Norint įvertinti RAGE aktyvacijos indėlį į pastebėtą žalingą AGE poveikį, buvo įvertintas CASC proliferacija, išgyvenamumas ir migracija po inkubacijos su RAGE antagonistu FPS-ZM1. Prieš veikiant 400 ug/mL AGE, CASC buvo iš anksto inkubuojami 2 valandas su 10 arba 25 uM FPS-ZM1. Vien tik FPS-ZMl (10 ir 25 uM) taikymas neturėjo įtakos CASC proliferaciniam pajėgumui ar išgyvenimui (S2 pav.). CASC proliferacija (5A–C pav.) buvo įvertinta po 24 (A), 48 (B) ir 72 (C) val. Kaip parodyta 1 paveiksle, neigiamas AGE poveikis CASC proliferacijai po išankstinio inkubavimo su 25 uM FPS-ZM1 gerokai sumažėja (5A-C pav.). Iš tiesų, po 24 ir 48 valandų CASC proliferacija žymiai pagerėjo, 400 ug/mL AGE ekspozicija (24 val., 5A pav.; 104 proc. 士8 25 μM FPS-ZM1 lyginant su 79 procentais ±5 per 400 ug/mL AGEs; 48 val., 5B pav.; 95 procentai ± 5 colių 25 μM FPS-ZM1, palyginti su 70 procentų ± 4 coliais 400 ug/mL AGEs）. Po 72 valandų buvo pastebėta ta pati tendencija. Proliferacija pagerėjo, kai RAGE buvo slopinamas (pav.: 80 proc. ± 8in25 μMFPS-ZM1, palyginti su 67 proc. ± 5 in 400 ug/mL AGE, p=0.06）). Išgyvenamumas (6A–C pav.) buvo įvertintas po 24 (A), 48 (B) ir 72 (C) val. Neigiamas AGE poveikis CASC išgyvenimui (2 pav.) gerokai pagerėjo po išankstinio inkubavimo su 25 uM FPS-ZM1 (6A-C pav.). Po 24 val. išgyvenamumas žymiai pagerėjo (6A pav.; 104 proc. ±7 25 μM FPS- ZM1 palyginti su 91 proc. ±4 400 ug/mL AGES. Ši tendencija taip pat pastebėta po 48 val. (6B pav.; 91 proc. ±5 25 μM FPS-ZM1, palyginti su 81 proc. ±5 400 ug/mL AGES, p. =0.07). Reprezentatyvūs CASC migracijos po 72 h inkubacijos su 400 ug/mL AGE ir FPS-ZMl pavyzdžiai yra pateikti paveiksle ir kiekybiškai įvertinti paveiksle. CASC išankstinis inkubavimas su 25 uM FPS-ZMI gali užkirsti kelią sumažėjusiam CASC migracijos pajėgumui, pastebėtam esant AGE ekspozicijai ( 7B pav. 98 proc. ±6 25 uM FPS-ZM1, palyginti su 7 proc. ±8 in 400 ug/mL AGE, p=0.07）.

4. Diskusija

Mūsų tyrimas yra pirmasis, parodantis, kad AGE turi įtakos CASC savybėms, būtent išgyvenimui, proliferacijai, migracijai ir apoptozei in vitro. Mūsų duomenys rodo, kad šie poveikiai iš dalies priklauso nuo RAGE aktyvinimo priklausomai nuo dozės.

4.1. AGE vaidmuo sergant MI

Kraujotakos AGE lygis yra žymiai padidėjęs pacientams, sergantiems ūminiu MI [24, 25] Tačiau, kaip jie dalyvauja MI patofiziologijoje, lieka neaišku. Reaktyviosios deguonies rūšys (ROS) yra pagrindiniai veiksniai, dalyvaujantys AGE sintezėje. Oksidacinis stresas gali sukelti reaktyvių karbonilo junginių susidarymą ir Amadori produktų glioksidaciją Maillardo reakcijoje. Taigi AGE negrįžtamai susidaro ir kaupiasi širdyje po MI ir manoma, kad jie gali dar labiau pabloginti nepageidaujamą širdies fenotipą [26, 27]. Be to, neutrofilai ir aktyvuoti makrofagai, dalyvaujantys MI uždegiminiame procese, yra pagrindiniai AGE sintezės veiksniai [28, 29]. Šios imuninės ląstelės išskiria AGE ir, kaip pranešama, yra pagrindiniai AGE formavimosi induktoriai sergant MI. 4.2. Fiziologinė AGE koncentracijų svarba

Savo tyrime mes išbandėme platų AGE koncentracijų diapazoną (nuo 50 iki 400 ug/mL). Kituose in vitro tyrimuose, kuriuose buvo tiriamas AGE poveikis kamieninėms ląstelėms, AGE koncentracija svyruoja nuo 15 iki 500 ug/mL 【20】. Naudojamos koncentracijos labai skiriasi, tačiau didesnis AGE lygis paprastai atspindi fiziologinę koncentraciją plazmoje pacientams, sergantiems keliomis ligomis. Iš tiesų, AGEs-albumino koncentracija diabetu sergantiems pacientams svyruoja nuo 50 iki 400 ug/ml[30]. AGE lygis gali padidėti iki 200 ug/ml pacientams, sergantiems širdies ir kraujagyslių ligomis [31,32]. Taip pat pranešama, kad pacientams, sergantiems ankstyvos stadijos Alzheimerio liga, mažesnė AGE koncentracija nanoskalės diapazone [33]. Tačiau dėl skirtingų analitinių metodų, naudojamų AGE matuoti, ir skirtingų tipų AGE nevienalytiškumo, patikimų AGE koncentracijų in vivo įvertinimas išlieka techniškai sudėtingas ir tikriausiai nepakankamai įvertintas [34].

4.3. AGE turi neigiamą poveikį CASC savybėms

Net jei CASC transplantacija rodo daug žadantį širdies regeneracijos potencialą po MI, ląstelių išgyvenamumas ir regeneracinis pajėgumas išlieka problema. Yra žinoma, kad išeminės zonos yra priešiška aplinka, kurioje padidėjęs oksidacinio streso, uždegimo ir fibrozės lygis kartu su padidėjusiu AGE kiekiu audiniuose. Nežinoma, ar AGE turės įtakos CASC regeneraciniam gebėjimui, tačiau tai gali būti svarbios žinios širdies regeneracijos ir perspektyvių CASC regeneracinių pajėgumų kontekste[12]. Savo tyrime parodėme, kad AGE mažina CASC išgyvenimą, dauginimąsi ir migraciją in vitro. priklausomai nuo koncentracijos ir laiko. Be to, dėl AGE poveikio laipsniškai didėja CASC apoptozė. Mūsų duomenys atitinka tyrimus, kuriuose tiriamas AGE poveikis daugelio tipų kitoms kamieninėms ląstelėms, kurių proliferacinis pajėgumas yra pakitęs ir padidėja apoptozė [20]. Iš tiesų, Zhu ir kt. parodė reikšmingą EPC proliferacijos sumažėjimą po skirtingų AGE koncentracijų poveikio[16]. Tą patį poveikį įvertino Sun ir kt. taip pat EPC, kur apoptozės greičio padidėjimą sąlygojo p38 MAPK kelio aktyvacija [35]. NSC, veikiami AGE, lėmė nuo dozės priklausomą kamieninių ląstelių proliferacijos sumažėjimą, kurį sąlygojo PPARy kelias [36]. Riebalinio audinio kamieninėse ląstelėse (ADSC) padidėjus kaspazės 3 aktyvacijai, padidėja apoptozės greitis [37]. Yang ir kt. pranešė apie mažesnius proliferacijos ir migracijos pajėgumus MSC, priklausomai nuo AGE koncentracijos. Šį poveikį lėmė per didelė ROS gamyba[18]. Dar reikia nustatyti, ar žalingas poveikis CASC, labai skirtingai širdies kilmės kamieninių ląstelių populiacijai, taip pat yra sąlygotas per didelės ROS gamybos.

Buvo įrodyta, kad pagrindiniai mechanizmai, kuriuose AGE daro neigiamą poveikį organų funkcijai, yra priklausomi ir (arba) nepriklausomi nuo RAGE receptorių aktyvacijos [15]. Daugelio tipų kamieninių ląstelių tyrimai rodo, kad AGE tarpininkauja savo poveikiui daugiausia aktyvindami RAGE ar kitus apoptozinius kelius [20]. RAGE aktyvinimas AGE sukelia MAPK aktyvavimą, dėl kurio fosforilinamas JNK ir p38] Šie fosforilinti baltymai padidina skirtingų proapoptotinių transkripcijos faktorių transkripciją branduolyje, todėl padidėja apoptozė. Be to, gali būti suaktyvinti kaspazės keliai, sukeldami AGE sukeltą apoptozę [39]. Tebėra būtini tolesni tyrimai, siekiant išsiaiškinti molekulinius mechanizmus, kuriais CASC sukeliamas AGE poveikis. Tačiau mes parodėme, kad FPS-ZM1 blokavus RAGE, pastebėtas AGE poveikis CASC buvo neryškus. Todėl mūsų duomenys aiškiai rodo, kad AGE tarpininkauja savo poveikiui CASC, greičiausiai prisijungdami ir aktyvuodami RAGE. Ar yra susiję su Jak / STAT, PI3K / Akt, MAPK, per didelė ROS gamyba ar kitais signalizacijos keliais, dar reikia nustatyti. Mūsų duomenys taip pat atitinka Zhang ir kt. aprašytą darbą, kur FPS-ZMl taip pat panaikino neigiamą AGE poveikį ADSC blokuodamas RAGE, dar labiau patvirtindamas svarbų RAGE aktyvavimo, kaip žalingo poveikio, kurį sukelia AGES[40].

4.4. Širdies ir kraujagyslių ligų anti-AGE terapijos ateities perspektyvos ir dabartiniai apribojimai

In vivo patvirtinimas dėl anti-AGE terapijos naudojimo ir galimos pridėtinės vertės kamieninių ląstelių transplantacijai po MI turi būti patvirtintas gyvūnų modeliu, kad tai būtų galima perkelti į kliniką. Daugelio in vitro tyrimų metu buvo įrodyta, kad PPARy inhibitorius roziglitazonas [41,42], MAPK inhibitoriai [18,35,43] arba antioksidantai [4] gali susilpninti AGE sukeltą poveikį kamieninėms ląstelėms. Tačiau jų įtaka in vivo kaip terapinė intervencija kartu su kamieninių ląstelių transplantacija iki šiol nebuvo sprendžiama. Yra keletas strategijų, kaip sumažinti AGE lygį organizme. Piridoksaminas (PM) yra AGE susidarymo inhibitorius, sumažindamas Amadori konversiją į AGE ir pašalindamas karbonilo junginius. PM gydymo veiksmingumas ir saugumas buvo įrodytas klinikiniais tyrimais su diabetu sergančiais pacientais [45]. Tačiau 2014 m. atliktas klinikinis NephroGenex tyrimas, tiriant piridoriną [(ty PM) kaip antidiabetinį gydymą, buvo sustabdytas dėl finansinių problemų [46]. Jokie kiti klinikiniai tyrimai šiuo metu netiria PM kaip gydymo. Tačiau AGE susidarymo slopinimas naudojant PM gali būti strategija, skirta pagerinti kamieninių ląstelių potencialą širdies regeneracijos tikslais. Be to, kiti AGE susidarymo inhibitoriai, tokie kaip aminoguanidinas, ateityje galėtų būti naudojami siekiant sumažinti AGE lygį po MI. ACTION II klinikinis tyrimas parodė aminoguanidino veiksmingumą diabetu sergantiems pacientams. Nors aminoguanidinas nesugebėjo reikšmingai sumažinti pirminės vertinamosios baigties – padvigubinti laiką, per kurį pasiekia maksimali kreatinino koncentracija serume šiems pacientams, buvo parodytas kitas kliniškai svarbus poveikis diabeto komplikacijoms, pvz., proteinurijos ir kraujotakos lipidų koncentracijos sumažėjimas. Tačiau dėl grįžtamo neigiamo poveikio, pavyzdžiui, autoantikūnų susidarymo, į gripą panašių simptomų ir anemijos, šis tyrimas buvo nutrauktas, o vertimas į kliniką tebėra ribotas [47, 48]. Be to, naudojant antioksidantus, tokius kaip N-acetil-L-cisteinas (NAC) arba glutationą kaip papildą mūsų mitybai, galima gauti tam tikrų naudingų kamieninių ląstelių terapijos rezultatų, nes jie padidina genomo stabilumą, pagerina sukibimą ir skatina kamieninių ląstelių dauginimąsi. 49]. Tačiau ląstelėms būdingi veiksmai skiriasi priklausomai nuo kamieninių ląstelių tipų, todėl norint įvertinti jų terapinį veiksmingumą, kai jie naudojami kartu su kamieninių ląstelių transplantacija, reikia atlikti klinikinius tyrimus su atsaku į dozę. Kita galimybė – suskaidyti AGE taikant ALT-71 terapiją. ALT-711 gali suskaidyti anglies ir anglies jungtis tarp karbonilų ir taip nutraukti kryžminius ryšius AGE molekulėse. Tačiau keli klinikiniai tyrimai nepatvirtino teigiamo ALT-711 poveikio, pastebėto atliekant tyrimus su gyvūnais. Be to, RAGE inhibitoriai (pvz., FPS-ZM1) arba pasroviui esančių molekulių inhibitoriai RAGE kelyje gali trukdyti AGE/RAGE ląstelių signalizacijos ašiai ir taip blokuoti AGE sukeltą poveikį kamieninėse ląstelėse. Įvairių tipų mažų molekulių ir inhibitorių veiksmingumas blokuoti AGE kamieninėse ląstelėse buvo įrodytas daugybe in vitro eksperimentų [18, 35, 44], tačiau niekada anksčiau nebuvo išbandytas su gyvūnų modeliais. Todėl galime tik daryti prielaidą, kad šie inhibitoriai yra veiksmingi blokuojant AGE in vivo situacijoje, tačiau reikalingi įrodymo koncepcijos eksperimentai. Galiausiai, kita galimybė blokuoti AGE kartu su kamieninių ląstelių terapija yra genetiškai modifikuoti pačias kamienines ląsteles. Yra žinoma, kad per didelė sRAGE ekspresija sustiprina AGE (ir kitų RAGE ligandų, tokių kaip amiloidas) pašalinimą, kad pagerintų ląstelių terapijos veiksmingumą. Tai buvo įrodyta sRAGE išskiriančiose MSC kaip Alzheimerio ligos [50, 51], artrito [52] ir Parkinsono ligos [53] gydymas. sRAGE išskiriantys MSC išgyveno ilgiau, turėjo didesnį migracijos pajėgumą, buvo geriau apsaugoti nuo apoptozės ir turėjo priešuždegiminių savybių. Be to, sumažintas RAGE reguliavimas, taip sumažinant kamieninių ląstelių jautrumą AGE, galėtų būti galimybė pagerinti ląstelių funkcionalumą. Ar šios strategijos taip pat gali būti taikomos nustatant MI ir širdies atstatymą, dar reikia ištirti. Apibendrinant galima pasakyti, kad visomis šiomis strategijomis siekiama kovoti su AGE, siekiant pagerinti kamieninių ląstelių funkcionalumą ir išlaikymą. Tačiau šios terapinės galimybės išlieka hipotetinės ir turi būti ištirtos in vivo kartu su CASC terapija, kad būtų galima pritaikyti klinikinei aplinkai. 5. Išvados

Mes nustatėme, kad AGE turėjo nuo laiko ir koncentracijos priklausomą, laipsnišką poveikį CASC savybėms, padidindami apoptozę ir sumažindami išgyvenimą, proliferaciją ir migraciją in vitro. Šio poveikio veikimo mechanizmai dar turi būti toliau tiriami, nors mes parodėme, kad RAGE aktyvinimas yra svarbus šių su AGE susijusių neigiamų padarinių veiksnys. Ar taikymas į AGE in vivo gali pagerinti CASC terapinį pajėgumą po MI, dar reikia toliau tirti.

Šis straipsnis yra ištrauktas iš J. Clin. Med. 2021, 10, 2964. https://doi.org/10.3390/jcm10132964 https://www.mdpi.com/journal/jcm