Žolinių augalų preparatų Cistanche poveikis žolinių augalų preparatų Cistanche poveikiui in vitro N Vitro citokinų ekspresijai žiurkės osteoblastais

Kontaktai: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 El. paštas:audrey.hu@wecistanche.com

SANTRAUKA

Osteoblastai (OB) vaidina svarbų vaidmenį remodeliuojant kaulus, o osteoblastai (OB) vaidina svarbų vaidmenį remodeliuojant kaulus, išskirdami citokinus, pvz., citokinus, tokius kaip osteoprotegerinas (OOPG), branduolinio kappa faktoriaus receptorių aktyvatorius. B ligandas (RA PG), branduolinio faktoriaus kappa-B ligando NKL) ir osteopontino (OPN) receptorių aktyvatorius. Mūsų tyrimo tikslas buvo įvertinti Kinijos žolelių ekstraktų poveikįCistanche(Cistanche deserticola) apie šių citokinų ekspresiją in vitro žiurkės OB ląstelių kultūroje. Pirminės OB buvo išskirtos iš žiurkės kaukolės virškinant tripsiną ir kolagenazę. Ląstelių fenotipas buvo nustatytas šveicarišku dažymo metodu, dažymu šarmine fosfataze, Von Kossa dažymu ir Alizarino raudonu dažymu. OPG, RANKL ir OPN genų ekspresija buvo analizuojama kiekybine realaus laiko PGR. Visi Cistanche žolinių augalų ekstraktai padidino OPG ir RANKL genų ekspresiją po 72 kultivavimo valandų, ypač esant 5 × 10-2 mg/ml koncentracijoms, kurios žymiai skyrėsi nuo kontrolinių kultūrų. Gydymas žymiai sumažino OPG / RANKL santykio ekspresiją po 48 valandų ir OPN mRNR ekspresiją po 72 valandų kultivavimo. In vitro OB ekspozicija Cistanche augaliniam preparatui paskatino OPG ir RANKL genų ekspresiją ir sumažino OPG / RANKL ir OPN genų ekspresiją, todėl galėjo išlaikyti kaulų formavimosi ir rezorbcijos pusiausvyrą kaulų metabolizmo metu.

Raktiniai žodžiai:Cistanche, osteoblastai, osteoprotegerinas, RANKL, osteopontinas, žiurkės

anti-osteoblastai:Cistanche žolė

Įvadas

Kaulų stiprumą lemia struktūra ir sudėtis. Kaulinis audinys prisitaiko prisitaikyti prie įvairių apkrovų modeliuodamas augimo fazės metu ir remodeliuodamas visą gyvenimą. Kaulų remodeliavimasis mažėja senstant, nes sumažėja pagrindiniame daugialąsteliniame vienete susidarančio kaulo tūris, sumažėja lytinių hormonų trūkumas ir sumažėja periosto kaulo formavimasis (SEEMAN, 2008). Kaulų remodeliavimosi disbalansas gali sukelti su kaulais susijusias ligas, tokias kaip osteoporozė, ir padidinti lūžių riziką.

Osteoporozė, sukelianti lūžius, skausmą ir judėjimo sutrikimus, paveikia milijonus žmonių Jungtinėse Valstijose (NAYAK ir kt., 2012; SILVERMAN, 2010). Pagrindinis su kaulais susijusių ligų prevencijos procesas yra palaikyti kaulų remodeliavimosi pajėgumus.

Kaulų remodeliavimas yra dinamiška kaulų formavimosi ir rezorbcijos pusiausvyra (SEEMAN ir DELMAS, 2006). Šiuos procesus daugiausia kontroliuoja osteoblastai (OB) ir osteoklastai suaugusiųjų kauluose bei citokinų, augimo faktorių ir hormonų ekspresija (PARFITT, 2000). OB, kurie gaunami iš pirminių mezenchiminių ląstelių, randami ant kaulo paviršiaus. OB yra atsakingi už kaulų formavimąsi ir netiesiogiai veikia kaulų rezorbciją (MACKIE, 2003). OB ekspresuojami citokinai, tokie kaip osteoprotegerinas (OPG), branduolinio faktoriaus kappa-B ligando (RANKL) receptorių aktyvatorius ir osteopontinas (OPN), gali skatinti lūžių gijimą ir padidinti kaulų formavimąsi sergant osteoporoze (LINKHART ir kt., 1996). . OB vystymasis yra nuoseklus procesas, apimantis osteoprogenitorių proliferaciją, matricos brendimą ir ląstelių mineralizaciją (GIUSTINA ir kt., 2008). Šis procesas yra reguliuojamas daugelio su OB susijusių genų ir yra labai susijęs su kaulų formavimosi vystymusi (HUNG ir kt., 2010). Osteogeninės mineralizacijos progresavimas skatina kaulų formavimąsi kaulų lūžių gijimo metu. Taigi, osteogeninių citokinų raiškos ir jų poveikio kaulų mineralizacijai tyrimai yra būtini ieškant naujoviško ir veiksmingo natūralios kilmės terapinio agento, skirto su kaulais susijusių ligų profilaktikai.

Tradicinė kinų medicina tūkstančius metų buvo naudojama su kaulais susijusioms ligoms gydyti. Žolinis augalas Cistanche, plačiai naudojamas inkstų veiklai stiprinti ir kaulų ligoms gydyti, priklauso Orobanchaceae šeimos genčiai. Buvo pranešta, kad Cistanche rūšių sudedamosios dalys yra: feniletanoidiniai glikozidai (PhG), iridoidai, lignanai, alditoliai ir oligosacharidai (JIANG ir TU, 2009; LI ir kt., 2010). Cistanche augalai yra daugiamečiai parazitiniai augalai, kurie daugiausia auga dykumoje arba ant nevaisingų druskų laižymų, daugiausia paplitę sausringose ​​ir šiltose dykumose šiaurės vakarų Kinijoje. Tradicinėje kinų medicinoje Cistanche laikomas nepaprastu toniku ir yra pavadintas „dykumos ženšeniu“. Tyrimas, atliktas su žiurkėmis, kurių kiaušidės pašalintos (LIANG ir kt., 2011), parodė, kadCistanche ekstraktaivartojamas per burną, priklausomai nuo dozės, žymiai padidino kaulų mineralų tankį ir mineralų kiekį kauluose. Tačiau išsamūs Cistanche poveikio kaulų formavimuisi mechanizmai vis dar neaiškūs. Todėl šio tyrimo tikslas buvo įvertinti Cistanche poveikį OPG, RANKL ir OPN citokinų genų ekspresijai in vitro žiurkių OB ląstelių kultūrose ir įvertinti mechanizmus, kuriais Cistanche skatina kaulų gijimą arba užkerta kelią/kontroliuoja. su kaulais susijusios ligos.

Cistanche žolė, skirta su kaulu susijusių ligų profilaktikai

medžiagos ir metodai

Žiurkių osteoblastų paruošimas. Žiurkių OB buvo paruošti iš naujagimių žiurkių kalvarijų (<24 hours)="" and="" processed="" by="" the="" trypsin="" (sigma,="" usa)="" and="" collagenase="" ii（sigma,="" usa）digestion="" methods.="" the="" cells="" were="" cultured="" in="" dulbecco's="" modified="" eagle="" medium="" (dmem,="" gibco,="" usa)="" supplemented="" with="" 15="" %="" inactivated="" fetal="" calf="" serum,="" penicillin="" (100="" iu/ml),="" streptomycin="" (100="" iu/ml)="" and="" l-glutamine="" in="" 6="" well="" culture="" plates,="" and="" incubated="" at="" 37="" °="" c="" with="" 5="" %="" co2="" in="" the="" air.="" the="" cellular="" phenotype="" was="" determined="" by="" the="" swiss="" dyeing="" method,="" alkaline="" phosphatase="" staining,="" and="" von="" kossa="" and="" alizarin="" red="" dye="">

Cistanche vandeninių ekstraktų ruošimas serijiniu skiedimu. Šiame tyrime naudota Cistanche buvo pateikta iš Tongrentang Pharmacy Kinijoje. Sausi Cistanche gabaliukai buvo sumalti į miltelius. Cistanche skystieji ekstraktai buvo paruošti 1 valandą virinant 50 g vaistažolių miltelių. Tada preparatas buvo sukoncentruotas iki 100 ml, naudojant sukamąjį garintuvą ir filtruojamas per 0,22 mm filtrus. Filtras buvo laikomas 4 laipsnių temperatūroje tamsoje. Skystas Cistanche ekstraktas buvo atskiestas iki serijinės koncentracijos nuo 5 × 10 -1 iki 5 × 10-4 mg/mL DMEM skysčiu.

RNR išskyrimas ir atvirkštinės transkripcijos PGR. Trečios kartos kultivuoti OB buvo gydomi skirtingomis koncentracijomis Cistanche ekstraktais 24, 48 ir 72 valandas. OB ląstelių kultūros gydymas buvo atliktas trimis egzemplioriais. Ląstelės du kartus plaunamos fosfatu buferiniu fiziologiniu tirpalu (PBS), o RNR buvo išskirta iš ląstelių naudojant TransZol reagentą (Beijing TransGen Biotech Co., Ltd.; Pekinas, Kinija) pagal gamintojo instrukcijas ir ekstrahuota chloroformu, nusodinta izopropilu. alkoholio, išplauti 75 procentų etilo alkoholiu ir ištirpinti vandenyje. Atvirkštinė RNR (5 μL) transkripcija buvo atlikta naudojant TransScript First-Strand cDNA Synthesis Supermix (Trans, Pekinas, Kinija).

Realaus laiko PGR produktų patvirtinimas. Po elektroforezės 1,5 procento agarozės gelio buvo atlikta DNR seka, siekiant įrodyti, kad PGR produktai buvo OPG, RANKL ir OPN koduojantys genų segmentai žiurkės OB.

Plazmidės, turinčios tikslinį geną, sukūrimas. DNR seka 2 procentų agarozės gelyje buvo išgryninta ir išgauta ekstrahuojant EZNA geliu (Kangweishiji, Kinija) ir perkelta į pEASY-T3 klonavimo rinkinį (Beijing TransGen Biotech Co., Ltd.; Pekinas, Kinija). Ląstelių transformacija buvo pasiekta per sukonstruotą plazmidę, turinčią tikslinį geną. Teigiamos kolonijos buvo patikrintos mėlynai baltos dėmės atrankos testu ir vėliau sekvenuotos. Plazmidės, išskirtos iš teigiamų kolonijų, turinčių tikslinį geną, buvo proporcingai praskiestos dejonizuotu vandeniu, kad būtų pasiekta standartinė kreivė. Kiekybinė realaus laiko PGR (RTQ PGR). Konkretūs pradmenys buvo sukurti pagal paskelbtas genų sekas (NCBI, Nucleotide Database) ir susintetinti Liuhe-Nuada Gene (Pekinas, Kinija), kaip parodyta 1 lentelėje.

MRNR ekspresija mėginiuose buvo kiekybiškai įvertinta naudojant aukščiau aprašytas specifines plazmidės standartines kreives. Produktai buvo lyginami su namų tvarkymo genu -aktinu. Tikslinio geno kiekis buvo kiekybiškai įvertintas RTQ PGR, naudojant SYBR Green RealMaster Mix (TIANGEN, Kinija) pagal gamintojo protokolą. PGR sąlygos buvo tokios: 94 laipsniai 1 minutę, 58 laipsniai 30 sekundžių, 68 laipsniai 1 minutę ir kartojosi 40 ciklų. Duomenys buvo apskaičiuoti naudojant 7500 realaus laiko PGR sistemą (Applied Biosystems; Waltham, MA, JAV).

Statistinės analizės. Duomenys buvo apdoroti vienpusio ANOVA metodu, naudojant komercinę statistikos programinę įrangą (SPSS 17.0, IBM Corporation; Armonk, NY, JAV). Rezultatai buvo išreikšti kaip tikslinių genų ir -aktino santykio vidurkis ± standartiniai nuokrypiai. Skirtumai buvo laikomi reikšmingais P<0.05>

Cistanche žolės nauda: išvengiama kaulų ligų

Rezultatai

Žiurkių OB identifikavimas. OB buvo identifikuoti naudojant specifinius ląstelių dažymo metodus ir buvo fenotipiškai pademonstruoti, kaip parodyta 1 paveiksle. (A, B, C ir D)

Tikslinių genų patvirtinimas. Tikslinių genų juostų dydžiai buvo išanalizuoti 2 procentų agarozės gelyje ir buvo nustatyta, kad jie atitinka numatomą dydį (2 pav.).

Rezultatai, gauti OPG, RANKL, OPN ir -aktino genų segmentams, kuriuose buvo tikslinių genų plazmidžių sekos, buvo palyginti su atitinkamomis genų sekomis, anksčiau paskelbtomis GENBANK, atliekant BLAST-N analizę, ir buvo nustatyta: 100 proc., 100 proc. , atitinkamai 100 ir 99 procentai identiški.

Cistanche skystų ekstraktų poveikis OPG, RANKL ir OPN išraiškai. OPG mRNR lygis buvo sumažintas, kai OB buvo veikiami visomis pritaikytomis Cistanche koncentracijomis 24 valandas ir 48 valandas (2 lentelė).

Reikšmingi skirtumai buvo pastebėti esant 5×10-1, 5×10-2 ir 5×10-4 mg/mL koncentracijoms po 24 valandų ir 5×10-1 bei 5 ×10-2 mg/mL po 48 valandų kultivavimo (P<0.05). however,="" when="" compared="" with="" control="" cultures,="" the="" expression="" of="" opg="" was="" significantly="" increased="" after="" treatment="" with="" cistanche="" for="" 72="" hours,="" cistanche="" concentrations="" of="" 5×10-2="" mg/ml="" and="" 5×10-3="" mg/ml="" had="" particularly="" increased="" opg="" expression=""><0.01). in="" contrast,="" the="" rankl="" mrna="" expression="" was="" down-regulated="" after="" 24="" hours="" with="" the="" concentration="" of="" 5×10-1="" mg/ml="" and="" 5×10-2="" mg/ml="" cistanche="" extracts="" compared="" to="" the="" controls.="" however,="" rankl="" mrna="" was="" up-regulated="" after="" culturing="" with="" cistanche="" extracts="" for="" 48="" hours="" and="" 72="" hours,="" especially="" the="" cistanche="" extract="" concentrations="" of="" 5×10-2="" mg/ml,="" 5×10-3="" mg/mland="" 5×10-4="" mg/ml="" (table="" 3).="" the="" rankl="" content="" continued="" to="" increase="" signifi="" cantly="" after="" 72="" hours="" of="">

Diskusija

Osteoblastai (OB) atlieka svarbų vaidmenį ne tik kuriant kaulų struktūrą, bet ir kalcio homeostazę, reguliuodami osteoklastų aktyvumą (MACKIE, 2003). Yra tam tikrų kaulų ligų, susijusių su OB funkcija ar disfunkcija, pavyzdžiui, osteoporoze. OB atsiradimo fenotipiniai žymenys pirmiausia yra jų proliferacija ir diferenciacija, o antra – kaulų mazgų mineralizacija (PAN ir kt., 2005). OPG ir RANKL yra naviko nekrozės faktoriaus (TNF) citokinų šeimos nariai ir yra iš OB gauti baltymai, labai svarbūs reguliuojant ir palaikant kaulų masę (HUMPHREY ir kt., 2006; REINHOLZ ir kt., 2002). RANKL reguliuoja osteoklastų diferenciaciją, aktyvaciją ir išgyvenimą. RANKL taip pat gali padidinti kaulų rezorbciją, sąveikaudamas su jo receptoriais osteoklastinėje membranoje (SODEK ir kt., 2000). OPG yra RANKL apgaulės receptorius ir neleidžia RANKL prisijungti prie savo receptoriaus (RANK). RANK/RANKL/OPG ryšys kontroliuoja pusiausvyrą tarp kaulų formavimosi ir rezorbcijos, reguliuodamas OB ir osteoklastų veiklą (SODEK ir kt., 2000; HUMPHREY ir kt., 2006; MAZZIOTI ir kt., 2012). Atitinkamai galima daryti išvadą, kad sumažėjęs OPG/RANKL santykis gali paskatinti kaulų rezorbciją, padidindamas osteoklastų aktyvaciją.

Šiame tyrime visi apdorojimai žoliniais Cistanche preparatais padidino OPG ir RANKL ekspresiją po 72 valandų, ypač esant 5×10-2 mg/mL ir 5×10-3 mg/mL koncentracijoms, kurios buvo žymiai skiriasi nuo kontrolinių kultūrų.

Priešingai, OPG ekspresija buvo žymiai sumažinta po 24 ir 48 valandų kultivavimo su Cistanche ekstraktais. OPG / RANKL santykio išraiška buvo žymiai sumažinta, kai OB buvo gydomi Cistanche 24 valandas ir 48 valandas. Be to, Cistanche ekstraktas neturėjo reikšmingo poveikio OB kultūroms po 72 valandų gydymo. Manome, kad skysti Cistanche ekstraktai gali pagerinti osteoklastų aktyvaciją po 24 valandų ir 48 valandų per reguliuojamą OPG / RANKL ekspresiją, tačiau po 72 valandų gali neturėti jokio poveikio osteoklastų aktyvacijai. OPN turi keletą funkcinių kaulų formavimosi ir remodeliavimosi skirtumų, susijusių su pagrindiniais OPN vaidmenimis šeimininko gynyboje ir audinių atstatyme. Atrodo, kad pagrindinis OPN vaidmuo yra neigiamo grįžtamojo ryšio reguliavimas sisteminiu lygiu, OB ląstelių adhezijos skatinimas, ankstyvų kalcifikacijos įvykių indukcija, taip pat mineralinių kristalų dydžio ir formos kontrolė (SODEK ir kt., 2000). Be to, buvo patvirtinta, kad OPN gali būti tilto baltymas, padidinti arterijų standumą uždegimo metu, todėl gali pažeisti sąnarius ir padidinti širdies ir kraujagyslių ligų riziką pacientams, sergantiems reumatoidiniu artritu (BAZZICHI ir kt., 2009).

Savo tyrime parodėme, kad skystas Cistanche ekstraktas sumažino OPN ekspresiją. OPN koncentracijos mažėjimo tendencija OB kultūrose, palyginti su kontrolinėmis kultūromis, pastebėta po 24 ir 48 valandų auginimo, ir žymiai mažesnis lygis, užfiksuotas po 72 valandų, rodo, kad Cistanche gali pagerinti kaulų formavimąsi, kaip parodė eksperimentas in vitro.

OB kultūrų ekspozicija Cistanche in vitro reikšmingai padidino OPG ir RANKL genų ekspresiją po 72 valandų, sumažino OPG/RANKL genų ekspresiją po 24 valandų ir 48 valandų ir sumažino OPN ekspresiją po 72 valandų auginimo.

TheCistanche žolėvisada vartojamas kaip receptas, susidedantis iš kelių kiniškų žolelių, todėl šiame tyrime naudoto Cistanche klinikinis veiksmingumas ir skysto ekstrakto komponentai yra sudėtingi ir dar neaiškūs. Mūsų tyrimo rezultatai rodo, kad Cistanche ekstraktas veikia OPG ir RANKL ekspresiją, kai jis naudojamas žiurkės OB ląstelių kultūroje, tačiau ekspresijos lygis skiriasi priklausomai nuo Cistanche ekstraktų koncentracijos ir auginimo trukmės. Tinkama skystųjų Cistanche deserticola ekstraktų koncentracija kartu su atitinkama žiurkių OB poveikio trukme gali išlaikyti kaulų formavimosi ir rezorbcijos pusiausvyrą kaulų metabolizmo metu.

Reikia atlikti tolesnius tyrimus, kad pagerintume žinias apie biologiškai aktyvias Cistanche sudedamąsias dalis ir jų koncentracijas preparatuose, kad jie būtų patvirtinti kaip citokinų moduliatoriai kaulų atstatymui ir taisymui.

cistanche papildas: apsaugo nuo kaulų praradimo

Nuorodos

BAZZICHI, L., L. GHIADONI, A. ROSSI, M. BERNARDINI, M. LANZA, F. DE FEO, C. GIACOMELLI, I. MENCARONI, K. RAIMO, M. ROSSI, AM MAZZONE, S. TADDEI, S BOMBARDIERI (2009): Osteopontinas yra susijęs su padidėjusiu arterijų standumu sergant reumatoidiniu artritu. Mol. Med. 15, 402-406.

GIUSTINA, A., G. MAZZIOTTI, E. CANALIS (2008): Augimo hormonas, į insuliną panašūs augimo faktoriai ir skeletas. Endokr. Rev. 29, 535-559.

HUMPHREY, EL, JH WILLIAMS, MW DAVIE, MJ MARSHALL (2006): Disociuotų gliukokortikoidų poveikis OPG ir RANKL osteoblastinėse ląstelėse. Kaulas 38, 652-661.

HUNG, TY, TL CHEN, MH Liao, WP HO, DZ LIU, WC CHUANG, RM CHEN (2010): Drynaria fortunei J. Sm. skatina osteoblastų brendimą, skatindamas su diferenciacija susijusią genų ekspresiją ir apsaugodamas nuo oksidacinio streso sukeltų apoptotinių įžeidimų. J. Ethnopharmacol. 131, 70-77.

JIANG, Y., PF TU (2009): Cistanche rūšių cheminių sudedamųjų dalių analizė. J. Chromatogr. A. 1216, 1970-1979.

LI, Y., Y. SONG, H. ZHANG (2010): Pažanga tiriant cistanche chemines sudedamąsias dalis ir gydomąjį aktyvumą. Kinijos laukinių augalų ištekliai 29, 7-11.

LIANG, H., F. YU, Z. TONG, Z. HUANG (2011): Cistanches Herba vandeninio ekstrakto poveikis kaulų retėjimui žiurkių kiaušidėse. Tarpt. J. Mol. Sci. 12, 5060-5069.

LINKHART, TA, S. MOHAN, DJ BAYLINK (1996): Kaulų augimo ir atstatymo augimo faktoriai: IGF, TGF beta ir BMP. Kaulas 19, S1-S12.

MACKIE, EJ (2003): Osteoblastai: nauji vaidmenys orkestruojant skeleto architektūrą. Tarpt. J. Biochem. Cell Biol. 35, 1301-1305.

MAZZIOTTI, G., J. BILEZIKIAN, E. CANALIS, D. COCCHI, A. GIUSTINA (2012): Naujas osteoporozės supratimas ir gydymo būdai. Endokrininė 41, 58-69.

NAYAK, S., MS ROBERTS, SL GREENSPAN (2012): Bendrojo alendronato kainos poveikis osteoporozės patikros ir gydymo ekonomiškumui. PLoS ONE 7(3): e32879. doi:10.1371/journal.pone.0032879.

PAN, W., LD QUARLES, LH SONG, YH YU, C. JIAO, HB TANG, CH JIANG, H.

W. Deng, YJ LI, HH ZHOU, ZS XIAO (2005): Genisteinas stimuliuoja osteoblastinę diferenciaciją per NO/cGMP kaulų čiulpų kultūroje. J. Cell Biochem. 94, 307-316.

PARFITT, AM (2000): Sujungimo mechanizmas: kraujagyslių vaidmuo. Kaulas 26, 319-323. REINHOLZ, MM, SJ ITURRIA, JN INGLE, PC ROCHE (2002): diferencinis genas

TGF šeimos narių ir osteopontino ekspresija krūties naviko audinių analizėje realaus laiko kiekybine PGR. Breast Cancer Res. Gydyti. 74, 255-269.

SEEMAN, E. (2008): Kaulo kokybė: kaulų stiprumo medžiaga ir struktūrinis pagrindas. J. Kaulininkas. Metab. 26, 1-8.

SEEMAN, E., PD DELMAS (2006): Kaulo kokybė – kaulų stiprumo ir trapumo medžiaga ir struktūrinis pagrindas. N. Engl. J. Med. 354, 2250-2261.SILVERMAN, SL (2010): Osteoporozės terapija: sveikatos priežiūros duomenų bazių ir stebimųjų populiacijos tyrimų įrodymai. Kalcif. Tissue Int. 87, 375-384.

SODEK, J., B. GANSS, MD MCKEE (2000): Osteopontinas. Krit. Oral Biol. Med. 11, 279- 303.