Cistanches Herba ekstrakto veiksmingumas ir mechanizmas gydant žiurkių reprodukcinę disfunkciją, kuri

AnotacijaŠis tyrimas tiriareprodukcinis apsauginis efektasirGalimas cistanches Herba ekstrakto mechanizmas(Che) ant žiurkių modelioInkstų-yang trūkumassukeltas adenino. Žiurkės atsitiktine tvarka buvo suskirstytos į penkias grupes: normalus, modelis, mažos dozės che (0. mg · kg -1 · d -1). Žiurkėms buvo skiriamas adeninas (200 mg · kg {-1 · d -1), gaudant pirmąsias 14 dienų, kad sukeltų inkstų yang trūkumą, tuo pačiu metu gydant vaistus. Po 14 dienų modeliavimas buvo nutrauktas, tačiau gydymas nuo narkotikų tęsėsi 49 dienas. Che komponentų kiekis buvo išanalizuotas naudojant aukštos kokybės skysčių chromatografiją (HPLC). Adenino sukeltas inkstų-yang trūkumo modelis buvo įvertintas apibūdinant simptomų apibūdinimą ir testosterono (T) lygio matavimą, naudojant fermentus sujungtą imunosorbento tyrimo (ELISA) rinkinį. Patologinis sėklidės ir epididimio pažeidimas buvo įvertintas remiantis šlapiu svoriu ir atliekant hematoksilino-eozino (HE) dažymą. Spermos tankis ir judrumas buvo matuojami naudojant kompiuterinę spermos analizę (CASA), o spermos gyvybingumas buvo įvertintas naudojant gyvų/negyvų spermos dažymo rinkinius, o spermos morfologija buvo įvertinta naudojant eozino dažymą, taip nustatant žiurkių spermos kokybę. Metabolomi CS buvo naudojami analizuoti metabolitų serumo pokyčius, praturtinti susijusius metabolizmo kelius ir ištirti Che mechanizmą gerinant žiurkių su reprodukcinės funkcijos pažeidimais su žiurkėmis, turinčiomis žiurkių, turinčių žiurkių su reprodukcinės funkcijos pažeidimais, turinčiais žiurkių su reprodukcinės funkcijos pažeidimais, naudojant žiurkių su reprodukcinės funkcijos pažeidimais su žiurkių su reprodukcinės funkcijos pažeidimais su žiurkių su reprodukcine funkcija.Inkstų-yang trūkumo sindromas. Palyginti su įprasta grupe, modelių grupė pasižymėjo reikšmingaInkstų-yang trūkumo simptomai, sumažėjęs T lygis, sumažėjęs sėklidžių ir epididiminių šlapių svoriai bei reikšmingas patologinis sėklidės ir epididimio pažeidimas. Spermos tankis, judrumas ir gyvybingumas, padidėjus spermos anomalijoms. Priešingai, žiurkėms, gydytoms Che, pastebimai pagerėjo inkstų-yang trūkumo simptomai, atkurtas T lygis, sušvelnino patologinę sėklidės ir epididimio pažeidimą bei pagerino įvairius spermos parametrus. Metabolomikos rezultatai atskleidė 286 diferencialinius metabolitus tarp normalių ir modelių grupių (191 padidėjęs ir 95 sumažėjęs). Tarp modelio ir mažų dozių Che grupių buvo nustatyta septyniasdešimt penki diferencialiniai metabolitai (21 padidėjęs ir 54 reguliuojamas). Iš viso buvo nustatyta 24 paprasti diferencialiniai metabolitai iš trijų grupių. 22 iš šių metabolitų buvo priešingos reguliavimo tendencijos tarp dviejų palyginimo grupių. Šie metabolitai pirmiausia buvo susiję su linolo rūgšties metabolizmu, eteriu lipidų metabolizmu, pantoteno rūgštimi ir koenzimu A biosinteze, taip pat metabolitais, įskaitant 13- hidroperoksilinolo rūgštį ({13- hpode), lizofosfatidilcholino ir paneterino. CHE gali pagerinti žiurkių inkstų-yang trūkumo simptomus, palengvinti reprodukcinių organų pažeidimus ir pagerinti spermos kokybę. Lipidų metabolizmo reguliavimas gali būti potencialus mechanizmas, per kurį Che pagerina žiurkių reprodukcinę funkciją suInkstų-yang trūkumas. Galimi bioaktyvūs Che junginiai apimaEchinacosidas, verbaskosidas, Salidroside, Betaine ir Cistanoside A.

 

Raktiniai žodžiai Cistanches Herba ekstraktas; Inkstų-yang trūkumas; Oligasthenospermija; adeninas; metabolomas; Lipidų metabolizmas

 

 

Klientų kelionėApie „Cistanche“ reprodukcinės funkcijos gerinimą

 

 

 

Inkstų yang trūkumo sindromasyra tam tikro tipo trūkumas, kurį sukelia inkstų yang trūkumas, atšilimo funkcijos nesėkmė ir Qi transformacijos nesėkmė. Šiuolaikinė medicina mano, kad tai yra metabolinė liga, kurią sukelia neuroendokrininiai sutrikimai, įskaitant pagumburio-hipofizės-gonadalinės (HPG) ašį. Klinikiniai vyrai pacientai paprastai pasireiškia tokiais simptomais kaip sumažėjęs libido, mažo spermos tūris, mažo spermos judrumas ir apatinės nugaros dalies skausmai. Sunkūs simptomai gali sukelti nevaisingumą ir apsigimimus [1]. Inkstų yang sušildymas yra pagrindinis tradicinės kinų medicinos gydymo metodas vyrų nevaisingumui, kurį sukelia inkstų yang trūkumas [2]. Cistanche Deserticola yra džiovintas mėsingas stiebas su žvynuotais Orobanchaceae šeimos augalų desercicola ycma lapais. Tai daro inkstų yang tonizuojantį ir naudos esmę bei kraują. Jis dažnai naudojamas inkstų yang trūkumui, impotencijai ir nevaisingumui gydyti [3]. Remiantis statistika, „Cistanche Deserticola“ taip pat yra dažniausiai vartojamas vaistas inkstų tonizuojančiuose ir Yang stiprinančiuose receptuose per amžius [4]. Šiuolaikiniai farmakologiniai tyrimai patvirtino, kad cistanche dykumos dykumos ekstraktai, tokie kaip bendri glikozidai ir oligosacharidai, gali reguliuoti HPG ašies homeostazę ir pagumburio-hipotiškos-antinksčių ašį žiurkėms, kurioms inkstų Yang trūkumas [5]. Cistanche desercicola ekstraktas taip pat gali pagerinti spermatogenezę ir seksualinę disfunkciją žiurkėms, turinčioms inkstų yang trūkumą [{6-7]. Tačiau galimi šių terapinio poveikio mechanizmai nebuvo išsamiai ištirti. Metabolomika dinamiškai sujungia metabolitų pokyčius su biologiniais procesais bendrai, atskleidžiant fiziologinių ir ligų procesų metabolinį pobūdį ir vaistų farmakodinaminius mechanizmus. Ši holistinė ir dinamiška savybė atitinka tradicinės kinų medicinos koncepciją [8]. Todėl šiame tyrime buvo naudojama metabolomikos technologija, siekiant ištirti Cistanche dykumos dykumos ekstrakto veiksmingumą ir mechanizmą žiurkių reprodukcinės funkcijos pažeidimams, kuriems yra inkstų Yang trūkumas, kurį sukėlė adeninas, ir paaiškinti šiuolaikinę mokslinę cistranche desercola konotaciją tonizuojant inkstą Yang.

1 medžiagos

1.1 Gyvūnai

50 SPF klasė 9- savaitės senumo SD žiurkės, sveriančios 330-340 g, buvo įsigyti iš Pekino Huafukang Biotechnology Co., Ltd., licencijos numeris SCXK (Pekinas) 2019-0008. Gyvūnai buvo laikomi Kinijos Materia Medica instituto Eksperimentinio gyvūnų centro SPF kambaryje, Kinijos Kinijos medicinos mokslų akademijoje, su natūraliu cirkadiniu apšvietimu, nuolatine drėgme ir temperatūra bei laisva dieta ir veikla. Eksperimentas su gyvūnais priėmė etinę Kinijos Materia Medica instituto eksperimentinės gyvūnų gerovės apžvalgą, Kinijos Kinijos medicinos mokslų akademijos (etinio patvirtinimo numeris 2021B166).

 

1.2 Narkotikai

Cistanche dykumos skiltelės buvo įsigytos iš Pekino Tongrentango („Chongwenmen Store“), partijos numeris 1806016, ir juos identifikavo Zhu Jingjing, Kinijos materijos medicinos instituto, Kinijos Kinijos medicinos mokslų akademijos instituto tyrėjas. Sverkite 500 g cistanche deserticola ir pridėti
10 kartų didesnis nei 70% etanolio į refliukso ekstraktą 2,5 valandos, filtruokite, įpilkite 8 kartus didesnį 70% etanolio kiekį į liekaną ir refliukso ekstraktą 2,5 val., Filtruokite, sujunkite du filtratus ir sumažinkite slėgį, kad sujungtas ekstraktas būtų išdžiūvęs iki miltelių. Sausų miltelių išeiga yra 47%, ir laikoma sausoje būsenoje.

1.3 reagentai

Echinacoside, verbascoside, salidroside, betaine, cistancheside A, tubuloside A, and caffeic acid were purchased from Chengdu Gelipu Biotechnology Co., Ltd., with batch numbers JOT-10172, JOT-10007, JOT-10012, JOT-10165, JOT -11356, atitinkamai JOT11627 ir JOT -10196; Chromatografinio laipsnio acetonitrilas, chromatografinis metanolio ir analitinės rūšies fosforo rūgštis buvo įsigyti iš Chengdu Zhongjinlong Technology Development Co., Ltd., atitinkamai su partijomis Sigma-WXBF1922V, Sigma-WXBF2452V ir 20240220; Adeninas buvo įsigytas iš Šanchajaus Yuanye Biotechnology Co., Ltd., su partijos numeriu S18009; „L-Carnitine“ (LC) buvo įsigytas iš „Shenyang Nr. 1 Pharmaceutical Co., Ltd.“, su partijos numeriu 210372;
Kalceino/PI ląstelių aktyvumas ir citotoksiškumo aptikimo rinkiniai buvo įsigyti iš „Pekino Biolab Technology Co., Ltd.“, partijos numeris HR0444; Testosterono (T) su fermentais susijęs imunosorbento tyrimo (ELISA) rinkinys buvo įsigytas iš „Wuhan elaruite Biotechnology Co., Ltd.“, partijos numeris E-El -0155 c; Amoniako vanduo buvo įsigytas iš „Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.“, 10002108 partijos numeris; Hematoksilino-eozino (HE) dažymo tirpalas buvo įsigytas iš Pekino Zhongshan Jinqiao Biotechnology Co., Ltd., Batch numeris BSBA -4025.

 

2.2 Cistanche deserticola ekstrakto cheminių komponentų analizė

2.2.1 Nuorodos atsargų sprendimo paruošimas

Svarstykite 10,41 mg salidrosido, 11,19 mg echinacosido, 10. 86 mg cistancheside A, 10,19 mg tubulozido A, 10,28 mg verbascosido ir 10,67 mg šūvių, o šūvių, o šūvių, o šūvių, o 0,67 mg - 0,67 mg, o šūviai - 0,67 mg, o šūviai - 0,67 mg, o šūviai - 0,67 mg.

 

2.2.2 Mišriojo etaloninio tirpalo paruošimas

Tiksliai pipete 1 ml etaloninio tirpalo tirpalo salidrosidas, 5 ml echinacosido, 2 ml cistancheside A, 100 μl tubulozido A, 350 μl verbaskozido ir 100 μl kofeino rūgšties į tą patį 25 ml tūrinį tūrinį kolbą, vandens, kad būtų galima plečia, gerai, kad gautumėte sumaišytą pamatinį sprendimą. Tikslai pasverkite 12,24 mg betaino į 10 ml tūrinės kolbos, įpilkite 50% metanolio, kad ištirpintumėte ir praskiestumėte prie žymės, gerai suplaktumėte ir gautumėte betaino etaloninį tirpalą.

2.2.3 Bandymo tirpalo paruošimas

Tiksliai pasverkite 310,14 mg bandinio mėginio į 25 ml tūrio kolbą, įpilkite vandens, kad ištirpintumėte ir praskiestumėte prie žymės, gerai purtytumėte ir filtruotumėte.

 

2.2.4 Chromatografinės sąlygos
Betaino aptikimo metodas: Xamido kolona (4,6 mm × 250 mm, 5 μm); Mobilioji fazė acetonitrilo-vandenis (80:20); stulpelio temperatūra 30 laipsnių; Srauto greitis 1 ml · min -1; injekcijos tūris 10 μl.
Kitos komponentų aptikimo sąlygos: Kromasil 100-5- C18 stulpelis (4,6 mm × 250 mm, 5 μm); Mobilioji fazė acetonitrilas (A)

ir {{{0}}. 1% fosforo rūgšties tirpalas (b); stulpelio temperatūra 30 laipsnių; Srauto greitis 1 ml · min -1; Injekcijos tūris 10 μl, gradiento eliuavimas (0 ~ 10 min, 10%a; 10 ~ 20 min, 10%~ 15%a; 20 ~ 25 min, 15%a; 25 ~ 40 min, 15%~ 22%a).

 

2.3 Rodyklės aptikimas

2.3.1 Epididimaliniai spermos dinaminiai parametrai

Buvo išpjaustyta žiurkės pilvo ertmė, kad būtų galima atskleisti kairę epididimį. Kairioji epididiminė uodega greitai buvo nukirsta ir įdėta į 2 ml fenolio be raudonojo DMEM kultūros terpės, įkaitintos 37 laipsnių vandens vonioje. Jis buvo supjaustytas iš oftalmologinės žirklės, šiek tiek sukrėstas ir dedamas į 37 laipsnių vandens vonią 10 minučių inkubacijai, kad visos spermos galėtų plaukti iš epididimio ir paruošti spermos suspensiją. Ant spermos skaičiavimo skaidrės buvo numesta 10 μl spermos suspensijos, o CASA technika buvo naudojama stebėti ir registruoti spermos tankį, vidutinį kelio greitį (VAP), kreivinį greitį (VCL), linijiškumą (LIN), voblerį (WOB), artėjimą (STR) ir ritmo kryžminį dažnį (BCF).

 

2.3.2 Spermos judrumas ir deformacijos greitis

Pipetė 20 μl šviežiai paruoštos spermos suspensijos į iš anksto paruoštą propidium jodidą (PI) (praskiestas 3 000}) ir kalceino-Am (praskiestas 200 kartų) mišrių dažymo tirpalų, inkubuokite 37 laipsnių vandens vonioje 30 minučių ir stebėkite fluorescencinio mikroskopu. Suskaičiuokite bendrą išlikusių spermos ir pereinamojo laikotarpio spermos skaičių kiekvienoje 200 spermos skirtinguose matymo srityse. Gyvi sperma: spermos galvutė, kūnas ir uodega yra žalias fluorescencinis, o spermos aktyvumas gali būti matomas po mikroskopu. Pereinamoji sperma: Spermos galvutė yra raudona fluorescencinė, o kūnas akivaizdžiai žalias fluorescencinis. Šiuo metu sperma yra pereinamasis mirties laikotarpis. Negyvoji sperma: Tik spermos galvutė yra raudona fluorescencinė, o visas kūnas neturi žalios fluorescencijos.
Paimkite 100 μl spermos suspensijos ir padėkite į 60 laipsnių vandens vonią, kad būtų galima inaktyvuoti 10 min., Tada nupieškite 5 μl ir numeskite ant skaidrės, paskirstykite tolygiai ir išdžiovinkite, pritvirtinkite metanoliu, nudažykite eozino dažais, nuplaukite tekančiu vandeniu, leiskite jam atsistoti ir išdžiovinkite, padarykite skaidrų su xylen ir uždarykite jį neutraliomis derliais. Suskaitykite nenormalių spermos skaičių kiekviename 200 spermos skirtinguose laukuose po mikroskopu ir apskaičiuokite santykį.

 

2.3.3 Epididimio ir sėklidės patologinis dažymas

Po fiksavimo 4% paraformaldehido kambario temperatūroje 48 valandas, epididimis ir sėklidės audiniai buvo dedami į įterpimo dėžutes, dehidratuotos su rūšies etanoliu, įterptame į parafiną ir supjaustytas. Po vaško ir hidratacijos buvo atliktas dažymas, o patologiniai sėklidės ir epididimizo audinių pokyčiai buvo stebimi optiniu mikroskopu, siekiant nustatyti sėklidžių sėklidžių siuvimo kanalėlių struktūros pažeidimų laipsnį ir spermos tankio pažeidimus.

 

2.3.4 S serumo turinys

Po orbitos kraujo surinkimo jis buvo paliktas kambario temperatūroje 2,5 valandos, centrifuguojama ties 3 000 R · min -1 20 min., O supernatantas buvo paimtas norint nustatyti S serumo lygį pagal T rinkinio nurodymus.

 

2.4 Metabolomikos analizė

2.4.1 Serumo mėginio paruošimas

Mėginių ėmimo dieną žiurkės buvo anestezuojamos, o per pilvo aortą buvo surinkta visas kraujas. Kraujas buvo laikomas kambario temperatūroje 2,5 val. Ir centrifuguotas ties 3 000 r · min -1 2 {0 min. Supernatantas buvo padalintas į 2 ml centrifugos vamzdelius su atitinkamais skaičiais ir laikomas -80 laipsniu. Atšildymas 4 laipsniais prieš bandymą, sūkurys sumaišykite mėginius, tiksliai perkelkite 5 0 μl serumo mėginių į 0,5 ml EP vamzdžių, įpilkite 300 μl 20% acetonitrilo-metanolio vidinio standartinio ekstrakto, sūkurio mišinio, po to centrifuge 4 laipsniais,} 10 mln. supernatanto ir sudėkite į kitą švarų 0,5 ml EP vamzdelį, leiskite jam stovėti ties -20 laipsniu 30 min., Tada centrifuga 4 laipsniais, 12 000 r · min -1 3 min., Paimkite 180 μl supernatanto, kad būtų galima injekcijai.

 

2.4.2 Chromatografinės sąlygos

Vandens įsigijimo UPLC HSS T3 C18 stulpelis (2,1 mm × 1 0 0 mm, 1,8 μm). Mobilios fazės buvo 0. 1% skruzdžių rūgštis vandenyje (a) ir 0,1% skruzdžių rūgšties-acetonitrilo tirpalas (b), su gradiento eliuacija ({0-11 min, 5% -90% b; 11-12 min, 90% b; 12-12 1 min. B; Kolonos temperatūra buvo 40 laipsnių, o srauto greitis buvo 0,40 ml · min {-1.

 

2.4.3 Masės spektrometrijos sąlygos

Elektros purškimo jonų šaltinis buvo nuskaitytas teigiamais ir neigiamais jonų režimais. Purškimo dujos buvo 50 psi (1 pSIN 6.895 kPa), pagalbinės šildymo dujos buvo 60 psi, užuolaidų dujos buvo 35 psi, o jonų šaltinio temperatūra buvo 550 laipsnių. Teigiamo jonų režimu jonizacijos įtampa buvo {5 500 v, buvo pasirinktas aukšto jautrumo režimas, sklidimo įtampa buvo 60 V, o susidūrimo energija buvo 30 V. Neigiama jonų režimu, jonizacijos įtampa buvo -4 500 v, sklidimo įtampa buvo -60} v, o susidūrimo energija buvo {12} {12 t. Buvo priimtas pusiau kiekybinių duomenų jautrumo skenavimo būdas.

 

2.4.4 Duomenų apdorojimas ir analizė

Neapdoroti LC-MS aptikimo duomenys buvo paversti MZML formatu „ProteOwizard“ programinė įranga, o XCMS programinės įrangos paketas buvo naudojamas didžiausio ekstrahavimo, išlyginimo ir sulaikymo laiko pataisai. Peako plotui ištaisyti buvo naudojama atramos vektoriaus regresijos analizė (SVR), o smailės, kurių trūkstama greitis viršija 5 0%, buvo filtruojamos. Po atrankos smailės buvo integruotos į viešąją biblioteką, duomenų bazę, kurią sukūrė „Wuhan Metwell Biotechnology Co., Ltd.“, ir „MetDNR“ algoritmas, kad būtų galima nustatyti metabolitų struktūrinę informaciją. Vėliau R paketas buvo naudojamas atliekant nevienarūšę statistinę analizę ir daugiamatę statistinę analizę, naudojant atitinkamai studento t-testo metodą ir ortogonalias dalinių mažiausių kvadratų diskriminacinę analizę (OPLS-DA). Diferencialinės metabolitų atrankos sąlygos buvo nustatytos kintamai svarbai projekcijoje (VIP)> 1, dvipusis bandymas p <0. Gautas CPD _ ID buvo įvestas į „Metabo Analyst 6.0“ svetainę
(https://www.metaboanalyst.ca/) praturtėjimo analizei. Hipergeometrinio bandymo P buvo naudojamas norint nustatyti pagrindinius kelius su reikšmingu praturtėjimu.

 

2.5 Statistinė analizė

𝑥̅ ± S buvo išreikšta kaip vidurkis ± standartinis nuokrypis (𝑥̅ ± S), ir norint palyginti duomenis tarp kelių grupių, buvo naudojama vienpusė dispersijos analizė. P<0.05 was considered statistically significant.