Delfinidino antiangiogeninio poveikio stiprinimas, kai jis yra inkapsuliuotas į mažas ekstraląstelines pūsleles, 1 dalis

Prašau susisiektioscar.xiao@wecistanche.comDaugiau informacijos

Santrauka:(1)Pagrindas: antocianinas delfinidinas pasižymi antiangiogeninėmis savybėmis tiek in vitro, tiek in vivo angiogenezės modeliuose. Tačiau in vivo delfinidinas prastai absorbuojamas, todėl jo nedidelis biologinis prieinamumas ir stabilumas sumažina jo antiangiogeninį poveikį. Šiame darbe naudojamos mažos tarpląstelinės pūslelės (EV) savybės, kad padidėtų delfinidino stabilumas ir veiksmingumas. Kapsuliuotas į SEV, delfinidinas slopina skirtingus angiogenezės etapus žmogaus aortos endotelio ląstelėse (HAoEC).(2) Metodai: buvo gaminami sEV iš nesubrendusių dendritinių ląstelių ir į juos įkeliamas delfinidinas. UHPLC-HRMS pagrįstas metodas buvo įgyvendintas delfinidino metabolitams įvertinti SEV. Proliferacijos tyrimas, azoto oksido (NO) gamyba ir Matrigelio tyrimas buvo įvertinti HAoEC.(3) Rezultatai: delfinidinas, 3-O- -rutinosidas ir peonidino-3-galaktozidas buvo rasti abu delfinidino ir delfinidino pakrautas sEVs.sEV pripildytas delfinidinas padidino laisvo delfinidino potencialą 2-kartą endotelio proliferacijai,10-kartą endotelio NO gamybai ir 100-karto kapiliarų formavimuisi . Taigi, sEV pakrautas delfinidinas daro poveikį skirtingiems angiogenezės etapams. (4) Išvados: sEV gali būti laikomas perspektyviu metodu, kuriuo delfinidiną galima pristatyti į su angiogeneze susijusias ligas, įskaitant vėžį ir patologijas, susijusias su pernelyg dideliu vaskuliarizavimu.

Norėdami sužinoti daugiau, spustelėkite čia

Raktažodžiai: delfinidinas; endotelio ląstelės; angiogenezė; mažos tarpląstelinės pūslelės; vėžys; širdies ir kraujagyslių ligų

1. Įvadas

Polifenoliai daugiausia randami augalinės kilmės maisto produktuose ir gėrimuose ir suteikia augalinio maisto skonį bei spalvą. Be to, epidemiologiniai tyrimai parodė, kad dėl dietos, kurioje gausu polifenolių, sumažėja širdies ir kraujagyslių ligų bei vėžio rizika [1-3.

Delfinidinas (2-(3,4,5-tri-hydroxyphenyl)chromenylium-3,5,7-triolis) yra antocianinas, gausiai randamas pigmentuotose daržovėse ir vaisiuose, ypač uogose ir raudonųjų vynuogių. Anksčiau pranešėme, kad delfinidinas turi tokį patį farmakologinį profilį kaip ir bendras raudonojo vyno polifenolinių junginių ekstraktas, skatinantis kalcio koncentracijos padidėjimą ląstelėje ir tirozino kinazių aktyvavimą [3], dėl kurio po estrogeno receptorių alfa susidaro endotelio azoto oksidas (NO). (ERo)stimuliacija [4]. Be to, pranešėme, kad delfinidinas per ERo veikia kaip imunomoduliuojanti ir priešuždegiminė molekulė, galinti pakeisti T limfocitų proliferaciją ir diferenciaciją pacientams, turintiems širdies ir kraujagyslių rizikos veiksnių [5].

Galiausiai parodėme, kad delfinidinas pasižymi antiangiogeninėmis savybėmis tiek in vitro, tiek in vivo angiogenezės modeliuose ir sumažina melanomos auglio augimą in vivo [6-10]. Iš tiesų delfinidinas slopina endotelio ląstelių dauginimąsi, įtraukdamas ciklino D1- ir nuo A priklausomus kelius [6,7]. Taip pat pranešėme apie galimą ryšį tarp delfinidino VEGF sukeltos mitochondrijų biogenezės slopinimo Akt keliu ir jo antiangiogeninio poveikio [8]. Be to, delfinidinas sumažina melanomos naviko ląstelių augimą in vivo, veikdamas konkrečiai endotelio ląstelių proliferaciją. Šis mechanizmas reiškia ryšį tarp VEGF sukeltos proliferacijos slopinimo per VEGFR2 signalizaciją, MAPK, PI3K ir CREB/ATF1 faktorių transkripcijos lygiu bei fosfodiesterazės2 slopinimą [9]. Įdomiausia, kad didelės delfinidino dozės sumažino neovaskuliarizaciją in vivo angiogenezės modelyje, kurį sukėlė išemija, naudojant žiurkės šlaunikaulio arterijos ligatūros modelį [10]. Kartu šie duomenys rodo, kad delfinidinas yra perspektyvus junginys, padedantis užkirsti kelią patologijoms, susijusioms su širdies ir kraujagyslių sutrikimais ir naviko atsiradimu.

Tačiau delfinidinas yra mažiau stiprus, kad sukeltų šį teigiamą poveikį, palyginti su visu raudonojo vyno polifenolio ekstraktu, ypač sukeldamas nuo endotelio priklausomą NO sukeltą vazodilataciją [11]. Iš tiesų delfinidinas yra jautrus šviesai ir stabilus tik esant pH<3; therefore,="" it="" degrades="" rapidly="" under="" physiological="" conditions.="" moreover,="" delphinidin="" is="" poorly="" absorbed,="" and="" thus="" its="" modest="" bioavailability="" and="" stability="" reduce="" its="" effects="" both="" in="" vitro="" and="" in="" vivo.="" the="" measurement="" of="" delphinidin="" and="" its="" conjugated="" metabolites="" in="" plasma="" indicates="" its="" low="" bioavailability="" [12].="" hence,="" it="" is="" important="" to="" find="" new="" strategies="" to="" enhance="" delphinidin="" bioavailability="" and="">

Viena iš tokių problemų sprendimo strategijų yra tarpląstelinių pūslelių (EV) naudojimas kaip vaistų tiekimo sistema. Neseniai nustatėme, kad EV, įskaitant didelius ir mažus EV (sEV), yra nanostruktūros, atsirandančios dėl skirtingų tarpląstelinio skyriaus savybių, įveikiančios klasikinių nanoformulių apribojimus. SEV mažina nestabilumą ir imunogeniškumą, pagerina biologinį prieinamumą ir tikslinį selektyvumą [13]. Kai kuriose ataskaitose pabrėžiamas apsauginis EV, kurį išskiria ląstelės, apdorotos polifenoliais, poveikis. Iš tiesų, sEV, praturtinti miR-21 iš ląstelių, apdorotų kurkuminu, sumažino naviko ląstelių augimą ir angiogenezę, pakoregavo endotelio pralaidumą ir sumažino skirtingų vėžio ląstelių linijų ląstelių gyvybingumą [14]. Be to, miR{5}} praturtinti SEV iš ląstelių, apdorotų epigalokatechino galatu, slopino naviko augimą [15].

Cistanche gali pagerinti imunitetą

Šiame tyrime pasinaudojome sEV savybėmis, kad padidintume delfinidino stabilumą ir veiksmingumą. sEV pakrautas delfinidinas sukelia angiogenezės slopinimą, naudojant žmogaus aortos endotelio ląsteles (HAoEC). Taip pat buvo nustatytas delfinidino kiekis metabolitų atžvilgiu šiuose EV.

2. Medžiagos ir metodai

2.1.Ląstelių kultūra

HAoECs (Promocell, Heidelbergas, Vokietija) buvo kultivuojamos 37 laipsnių temperatūroje ir 5 procentais CO2 endotelio ląstelių auginimo terpėje MV2 (Promocell), papildytoje 1 procentu penicilino/streptomicino (Sigma-Aldrich, St. Quentin Fallavier, Prancūzija). Ląstelės buvo tripsinizuojamos 70/80 procentų santakoje ir buvo naudojamos tarp 3 ir 6 pasažų visiems eksperimentams.

JAWS II dendritinė ląstelių linija buvo įsigyta iš Amerikos tipo kultūrų kolekcijos (CRL-1194; ATCC; Manassas, VA, JAV). JAWS II ląstelės buvo auginamos 37 laipsnių temperatūroje ir 5 procentų CO, pilnoje auginimo terpėje, sudarytoje iš alfa minimumo esminės terpės (Lonza; Bazelis, Šveicarija), turinčios ribonukleozidų ir dezoksiribonukleozidų ir papildytos 20 procentų galvijų vaisiaus serumu (FBS) (Gibco, Life). Technologies; Grand Island, NY, JAV), 4 mM L-glutamino (Lonza), 1 mM natrio piruvato (Lonza), 1 procento penicilino / streptomicino (penicilino / streptomicino, Sigma-Aldrich) ir 5 ng / ml pelių GM-CSF (Miltenyi Biotec; San Diegas, CA, JAV). Ląstelės buvo tripsinizuojamos 70/80 procentų santakoje ir buvo naudojamos tarp 8 ir 16 pasažų visiems eksperimentams.

2.2.sEVIizoliacija

JAWS II ląstelės buvo pasėtos 5 × 10 laipsnių ląstelių tankiu į T175 ląstelių kultūros kolbą pilnoje auginimo terpėje ir prieš bet kokį išskyrimą badavo FBS. Ląstelių terpė buvo centrifuguojama 300 × g ir 2 000 × g 10 minučių, kad būtų pašalintos atitinkamai ląstelės ir ląstelių nuolaužos. Gautas supernatantas buvo centrifuguojamas 20,000 × g greičiu 30 min., kad būtų išvengta didelių EV. Supernatantas buvo centrifuguojamas esant 200, 000 × g (Optima MAX-XP ultracentrifuga ir MLA{12}} rotorius, Beckman Coulter, Villepinte, Prancūzija) 2 valandas, kad būtų susmulkinti sEV. Tada sEV buvo plaunami fosfatiniu buferiniu tirpalu (PBS) (NaCl 137 mM, KCl 2,7 mM, Na2HPO410 mM, KH2PO41,8 mM, pH =7.4) ir pakartotinai centrifuguojami 200 000 x g 2 valandas. Galiausiai, sEV granulės buvo resuspenduotos 1 ml PBS ir laikomos 4 laipsnių temperatūroje iki tolesnio naudojimo. SEV kiekis buvo nustatytas Lowry metodu, standartu naudojant galvijų serumo albuminą (Sigma-Aldrich). SEV buvo naudojami 10 ug/ml.

2.3. Delfinidinas įkeliamas

Delfinidinas buvo paruoštas vandenyje, kurio pH{{0}} su {{10}},1 proc. DMSO, kad būtų pasiekta 10 ug/mL koncentracija. Buvo pridėta SEV (2 mg), tirpalas maišomas ir po to maišomas 10 min. Po 2 valandų ultracentrifugavimo esant 200, 000 × g, gautos nuosėdos buvo atkurtos 1 ml 0,1 procento DMSO arba PBS. Delfinidino absorbcija buvo išmatuota esant 530 nm, ir buvo atlikta standartinė kreivė su skirtingomis laisvo delfinidino koncentracijomis (nuo 0,1 iki 10 ug/mL). SEV pakrovimo efektyvumo procentas buvo 9 proc., nepriklausomai nuo naudojamos delfinidino koncentracijos (duomenys nerodomi). Taigi delfinidino kiekis buvo pakoreguotas taip, kad būtų gauta norima koncentracija (0, 1–5 ug / ml) per 10 ug / ml sEV. Norint pašalinti laisvą delfinidiną, šios pūslelės buvo plaunamos du kartus.

2.4. Nanodalelių sekimo analizė (NTA)

sEV mėginiai buvo atskiesti steriliu NaCl 0,9 proc., o dydžio pasiskirstymas buvo analizuojamas naudojant NanoSight NS300 (Malvern Instruments Ltd., Malvern, JK). Buvo įrašyti vaizdo įrašai. NTA programinė įranga nustatė dydžio pasiskirstymą naudodama Stokso-Enšteino lygtį.

2.5. Perdavimo elektroninė mikroskopija

SEV pirmą kartą buvo fiksuoti per naktį 4 laipsnių temperatūroje su 2,5 procento glutaraldehidu (LFG Distribution, Lionas, Prancūzija) 0,1 M PBS. Tada sEV du kartus plaunami PBS, centrifuguojant 100,{6}} × g 70 min. SEV buvo nusodinami ant varinių grotelių 2 min. ir neigiamai nudažyti 20 μL 5 procentų uranilo acetato (atskiesto 50 procentų etanoliu). ) 30 s. Tada tinkleliai buvo stebimi Jeol JEM 1400 mikroskopu (Jeol, Croissy sur Seine, Prancūzija), veikiančiu 120 keV.

2.6. Delfinidino metabolitų nustatymas SEV

Mėginys buvo paruoštas taip: Į 10 ug sEV, atkurtų PBS, buvo pridėta 250 μl metanolio (MeOH), ir mėginiai buvo 20 minučių ultragarsu. Dar buvo pridėta du šimtai ul MeOH, mėginiai centrifuguojami (10,000 × g, 10 min, 4 laipsniai) ir išgarinami miVac duo koncentratoriuje (Genevac Ltd., Ipswich, JK). Sausas ekstraktas buvo ištirpintas 200 μL LC-MS klasės vandens, kuriame yra 1 procentas skruzdžių rūgšties. Mišinys buvo antrą kartą centrifuguotas (10, 000 × g, 5 min., 4 laipsniai), prieš atliekant itin aukštos kokybės skysčių chromatografiją, kartu su didelės skiriamosios gebos masės spektrometrijos (UHPLC-HRMS) analize, kad būtų galima analizuoti. delfinidino metabolitai, tiksliai matuojant masę.

Chromatografinis atskyrimas buvo atliktas naudojant Kinetex@ 1,7 μm XB C18,150 × 2,1 mm kolonėlę kartu su atitinkama SecurityGard C18 kolonėlė (Phenomenex). Mobiliosios fazės sudarė H O kanale A ir acetonitrilo kanale B, abiejose jų buvo 0,1 proc. skruzdžių rūgšties. Eliuacijos gradientas (A∶B, o/ø) buvo toks∶ išlaikant pradines sąlygas 95:5 2 min., po to linijinis gradientas nuo 95:5 iki 0:100 virš 6 min. periodą, palaikykite ties 0:100 3 min., grįžkite į pradines sąlygas 95:5 ir palaikykite šias sąlygas 3,5 min. Buvo naudojamas pastovus 0,300 ml/min srauto greitis; injekcijos tūris buvo 10 μl.

Visas nuskaitymas ir tiksliniai SIM masės spektrai buvo gauti teigiamos jonizacijos režimu, naudojant 70 skiriamąją gebą, 000 Visas plotis esant pusei maksimalaus (FWHM) su automatinio stiprinimo valdymo (AGC) tikslu 3 × 10 laipsnių jonais ir maksimaliu jonų įpurškimu. laikas (IT) 200 ms. Nuo duomenų priklausomi MS / MS eksperimentai buvo gauti „Top5“ nuo duomenų priklausomu režimu.

Buvo stebimi literatūroje aprašyti metabolitai [16-18]: delfinidinas, aldehidas, florogliucinolio aldehidas, galo rūgštis, chalkonas, petunidino-3-galaktozidas, petunidino-3-arabinozidas, petunidinas {{4} }O-rutinosidas, delfinidino-3-arabinozidas, delfinidino-3-galaktozidas, delfinidino 3-O-(6-kumaroilgliukozidas), delfinidinas 3-O- - rutinosidas, cianidino-3-galaktozidas, cianidino 3-O- -rutinosidas, peonidino-3-galaktozidas ir malvidino-3-galaktozidas.

Kasdienis prietaiso kalibravimas buvo atliktas naudojant Pierce LTO Velos ESI teigiamo / neigiamo kalibravimo rinkinius, kaip rekomendavo gamintojas. Duomenims rinkti buvo naudojama Xcalibur 2.2 programinė įranga (Thermo Fisher Scientific, San Chosė, CA, JAV), o duomenims apdoroti buvo naudojama TraceFinder 3.{4}} programinė įranga (Thermo Fisher Scientific).

2.7. Ląstelių gyvybingumo tyrimas

1 × 104 HAoEC buvo pasėtos į 96-šulinėlių plokštelę ir kultivuojamos 24 valandas ir apdorotos delfinidinu (nuo 1 iki 10 ug/mL). Tada 5 ug/mL 3-(4,5-dime-tiltiazol-2-il）-5-（3-karboksimetoksifenilo)-2-({ {15}}sulfofenilas)-2H-tetrazolis (MTS reagentas, Promega, WI, JAV) buvo įdėta į kiekvieną šulinėlį ir inkubuojama 37 laipsnių temperatūroje 120 min. Absorbcija buvo matuojama CLARIOstar (BMG LABTECH, Ortenberg, Vokietija) spektrofotometru esant 490 nm.

2.8. Proliferacijos tyrimas

Proliferacijos tyrimai buvo atlikti naudojant CyQUANT Cell proliferation Assay rinkinį (Invitrogen, Carlsbad, CA, JAV) pagal gamintojo rekomendacijas. Trumpai tariant, 1,5 × 10* ląstelės buvo pasėtos į 96-šulinėlių plokštelę. Ląstelės buvo badaujamos serume 2 valandas, o po to buvo apdorotos delfinidinu, natūraliais sEV arba sEV, įpiltais skirtingomis koncentracijomis delfinidinu. Po 24 valandų inkubacijos ląstelės buvo plaunamos PBS ir pridedamas dažus surišantis tirpalas. Ląstelės buvo inkubuojamos 37 laipsnių temperatūroje 30 min. Fluorescencijos matavimui buvo naudojamas fluorescencinis mikroplokštelių skaitytuvas (CLARIOstar9, BMG LABTECH, Ortenbergas, Vokietija) su filtrais 485 nm sužadinimui ir 530 nm emisijai.

2.9. NĖRA gamybos patikrinimo

HAoEC buvo pasėtos į 8-šulinėlių stiklelį (Ibidi, Gräfelfing, Vokietija) 3 × 104 ląstelių viename šulinyje (ty 3 × 104 ląstelių/cm²) greičiu 300 μl terpės. Esant 70-80 procentų santakai, ląstelės buvo stimuliuojamos 24 valandas delfinidinu, natūraliais sEV arba sEV pakrautu delfinidinu. Adenozino trifosfatas (ATP) buvo naudojamas kaip teigiama kontrolė (10 μM, Sigma-Aldrich) NO gamybai skatinti. Po 24 valandų kiekvieno šulinėlio terpė buvo pašalinta ir pridėtas diaminofluoresceino diacetato (DAF-2 DA) zondas (5 μM 30 min., Santa Cruz Biotechnology, Santa Kruzas, CA, JAV). Tada šuliniai buvo plaunami PBS. Ląstelės buvo fiksuotos paraformaldehidu (4 proc., 20 min.). Fluorescencija buvo nuskaityta konfokaline mikroskopija (Zeiss, Jena, Vokietija, LSM700). Buvo gautos keturios nuotraukos, o kiekybiniam įvertinimui panaudota „ImageJ“ programinė įranga.

2.10.Matrigel tyrimas

HAoEC buvo pasėtos į duobutes, padengtas Matrigel (Engelbreth-Holm-Swarm, Sigma-Aldrich pelių sarkomos ekstraląstelinės matricos gelis). Trumpai tariant, į kiekvieną 15-šulinėlio Ibidi μ- šulinį buvo įdėta 10 μL skysčio Matrigel. stiklelis Angiogenezės plokštelė (lbidi), tada inkubuojama 45 min 37 laipsnių temperatūroje, kad susidarytų gelis. Tada HAoEC buvo pasėtos ir inkubuojamos 37 laipsnių ir 5 procentų CO temperatūroje 45 minutes prieš gydymą delfinidinu, natūraliais sEV arba sEV pakrautu delfinidinu , po to inkubuojama 12–14 valandų 37 laipsnių temperatūroje ir 5 procentų CO. „Į kapiliarus panašių struktūrų“ susidarymas buvo stebimas optiniu mikroskopu (Olympus CK40). Kiekybinis įvertinimas atliktas išmatuojant į kapiliarus panašių struktūrų skaičių naudojant Vaizdo programinė įranga.

2.11.Statistinė analizė

Rezultatai išreiškiami kaip vidurkis ± SEM. Skirtumų tarp grupių reikšmingumas buvo nustatytas dispersijos analize (ANOVA), po kurios buvo atliktas Tukey daugelio palyginimų testas. p vertės<0.05 were="" considered="">

3. Rezultatai

3.1.sEV Delfinidino apibūdinimas ir įkėlimas

Remiantis literatūra, delfinidinas, pakrautas į SEV, nesukėlė pūslelių dydžio pokyčių, ty 118,7 ± 2,9 ir 111,7 ± 1,8 nm atitinkamai tuščioms SEV ir delfinidino pakrautoms sEV, kaip nustatyta nanodalelių sekimo analize (pav. 1A) ir patvirtinta elektronine mikroskopine analize (1B pav.). Be to, abiejų tipų sEV, vietiniai ir pakrauti delfinidinu, panašiais lygiais išreiškė egzosominius žymenis, tokius kaip ALIX, CD63 ir TSG101 (1C pav.), tuo tarpu jie neišreiškė ß-aktino, didelių EV žymeklio.

1 pav. SEV apibūdinimas. (A) Natūralių SEV ir SEV, pakrautų delfinidinu, dydžio pasiskirstymas pagal NTA matavimus. (B) Reprezentatyvus perdavimo elektronų mikroskopinis vietinių SEV ir SEV, pakrautų delfinidinu, vaizdas. Mastelio juosta=100 nm.(C) Western Blot analizė, rodanti Alix, CD63, TSG101 ir ß-Aktino raišką SEV ir SEV, kuriuose yra delfinidino.

Šis straipsnis ištrauktas iš Nutrients 2021, 13, 4378. https://doi.org/10.3390/nu13124378