Amoniako azoto poveikio imuninei apsaugai, esančiam ant učango karšio (Megalobrama Amblycephala) blužnies ir galvos ir inkstų, įvertinimas
Nov 13, 2023
Santrauka:Amoniakas yra vienas iš svarbiausių aplinkos veiksnių vandens ekosistemose. Tačiau yra nedaug tyrimų apie lėtinio ar ilgalaikio amoniako streso poveikį ir jo galimą molekulinį mechanizmą žuvims. Šiuo tyrimu buvo siekiama ištirti imuninį atsaką ir molekulinius mechanizmus žuvų blužnyje ir galvos inkstuose po lėtinio amoniako poveikio.Megalobrama amblycephala(9.98 ± {{0}},48 g) 30 dienų buvo veikiamas skirtingos koncentracijos bendro amoniakinio azoto (0–30 mg/l). Amoniako ekspozicija žymiai padidino kortizolio kiekį ir sumažino lizocimo bei komplemento koncentracijas serume 3/4, o tai rodo, kad amoniako stresas slopina įgimtą imuninį atsaką. Amoniako poveikis taip pat sukėlė nuo koncentracijos priklausomą amoniako koncentracijos padidėjimą audiniuose, patologinius pažeidimus ir blužnies bei galvos-inkstų rodiklius. Be to, imunoglobulino M (IgM), interleukino 1 turinys (IL-1 ) ir naviko nekrozės faktorius (TNF- ), taip pat į rinkliavą panašių receptorių (TLR) / nuo mieloidinio diferenciacijos faktoriaus 88 (MyD88) nepriklausomų signalinių molekulių, esančių blužnyje ir galvos inkstuose, mRNR lygis buvo žymiai sumažintas po amoniako poveikio. Mūsų išvados rodo, kad dėl lėtinio amoniako poveikio slopinamas įgimtas ir adaptyvus imuninis atsakas, sumažinant nepriklausomą TLR/MyD{5}}signalizacijos reguliavimą. Neigiamas lėtinio amoniako streso poveikis blužnyje buvo sunkesnis nei galvos inkstuose.
Raktažodžiai: amoniakas; stresas; į rinkliavą panašūs receptoriai; blužnis; galvos-inkstų; imunitetas
SPUSTELĖKITE ČIA, KAD GAUTI ŽOLĖLIŲ CISTANČIŲ INKSTS
1. Įvadas
Ammonia is one of the most important environmental factors in aquatic ecosystems that affect the growth and health of aquatic animals [1]. Ammonia nitrogen generally comes in one of two ionized forms—NH4 + and the un-ionized form, NH3, in the aquatic environment. NH3 is extremely toxic to fish by reason of its ability to diffuse across cell membranes easily [2–4]. Over the past decades, high levels of ammonia frequently occur in aquatic environments due to disorderly discharges of sewage effluent, agricultural run-off, and high-density aquaculture [5–7]. Although the recommended level of ammonia nitrogen in drinking water is up to 3 mg/L (NH4/L) [8], the real ammonia level can reach much higher (>20 mg/L) kartais dėl neefektyvaus arba neegzistuojančio nuotekų valymo ar kitų priežasčių [9,10].
Įrodyta, kad imunosupresinis amoniako poveikis žuvims prisideda prie ligų protrūkių [11, 12]. Kai kuriuose Takifugu rubrikos, Scophthalmus maximus ir Pelteobagrus fulvidraco tyrimuose nustatyta, kad ūminis amoniako poveikis gali padidinti B ląsteles aktyvinančio faktoriaus, šilumos šoko baltymo 70/90, tnf- ir interleukino genų ekspresijos lygį- 1/1 /6/ 8/12 [13–15]. Wang ir kt. taip pat pranešė, kad lizocimo aktyvumas serume labai sumažėjo Acanthopagrus schlegelii po 24 valandų amoniako poveikio [16]. Panašiai, sumažėjęs komplemento C3 ir IgM mRNR lygis buvo pastebėtas Pelteobagrus vachellii ir Rhynchocypris lagowski blužnise esant ūminiam amoniako poveikiui [17, 18]. Nors daug dėmesio buvo skirta ūmaus amoniako poveikio poveikiui žuvų imunitetui, yra tik nedaug tyrimų apie lėtinio ar ilgalaikio amoniako streso poveikį ir jo galimą molekulinį mechanizmą. Be to, kai kurie tyrėjai pranešė apie neigiamą amoniako azoto poveikį TLR mRNR ekspresijai atlikdami transkripcijos analizę [16, 19–22]. Todėl mes manome, kad nuolatinis amoniako poveikis taip pat gali turėti įtakos žuvų imunitetui, kuriame TLR signalizacijos kelias gali atlikti svarbų vaidmenį.
Blužnis ir galvos inkstai yra pagrindiniai teleostinių žuvų imuniniai organai, atsakingi už pašalinių dalelių gaudymą ir pašalinimą bei stabilios vidinės aplinkos palaikymą [23, 24]. Jos taip pat yra pagrindinės imuninių antikūnų gamybos vietos [25–27]. Be to, žuvų įgimtą imuninę sistemą sudaro fiksuotos ir mobilios ląstelės, taip pat daugybė gynybinių molekulių (tokių kaip lizocimas, komplementas ir citokinai) [28, 29]. Vučangas karšis (Megalobrama amblycephala) yra kipridinė žuvis, kilusi iš Kinijos Jangdzės baseino, kuri 2014 m. užėmė 11 vietą pasaulyje pagal bendrą metinę šios žuvies produkciją [30]. Kaip pagrindinė akvakultūros rūšis, M. amblycephala yra gana jautri rūšis amoniakiniam azotui ir dažnai kenčia nuo streso, kurį sukelia amoniakinis azotas [31–33]. Atsižvelgiant į tai, kas išdėstyta pirmiau, Wuchang karšis buvo atliktas lėtinio poveikio eksperimentas, siekiant išsiaiškinti imuninio atsako ypatybes po lėtinio amoniako poveikio ir šio poveikio mechanizmą, nustatant serumo imuninių parametrų, histologijos ir su TLR keliu susijusių molekulių pokyčius. blužnyje ir galvoje-inkstuose. Mūsų rezultatai taip pat padeda stebėti M. amblycephala sveikatos būklę ir gerovę intensyvios akvakultūros sistemose.
2. Rezultatai
2.1. Amoniako kiekis blužnyje ir galvos inkstuose
1 paveiksle parodytas amoniako kiekis M. amblycephala blužnyje ir galvos inkste po 30 dienų poveikio įvairaus amoniako kiekiui. Žuvų, kurios buvo paveiktos 30 mg/L bendro amoniakinio azoto, blužnyje buvo pastebėtas reikšmingas amoniako kiekio padidėjimas, palyginti su kontroline grupe (p < 0,05). Amoniako koncentracijos galvos inkstuose statistinio skirtumo tarp visų amoniaku gydomų grupių ir kontrolinės grupės nebuvo (p > 0,05).
1 pav. Lėtinio amoniako poveikio įtaka amoniako kaupimuisi M. amblycephala blužnyje ir galvos inkste. Kiekvienas stulpelis rodo šešių dublikatų vidurkį ± SE. P < 0.05 reikšmės virš stulpelio pavaizduotos kaip „*“, atitinkamai nurodančios reikšmingus skirtumus, palyginti su kontrole.
2.2. Serumo kortizolio, lizocimo, C3 ir C4 lygiai
Kaip parodyta 2 paveiksle, kortizolio koncentracija serume reikšmingai padidėjo visose amoniako grupėse, palyginti su kontroline grupe (p < 0.05). Priešingai, lizocimų aktyvumas serume reikšmingai sumažėjo žuvims, kurios buvo veikiamos didesnės amoniako koncentracijos (20 ir 30 mg/l bendro amoniako azoto) (p < 0,05). Komplemento C3 ir C4 koncentracija serume buvo reikšmingai sumažinta grupėse, kurios buvo gydomos nuo 10 iki 30 mg/l bendro amoniakinio azoto (p < 0,01).
2 pav. Lėtinio amoniako poveikio poveikis kortizolio, lizocimo, C3 ir C4(AD) koncentracijai serume M. amblycephala. Kiekvienas stulpelis reiškia šešių dublikatų vidurkį + SE. P < 0.05 ir 0.0l reikšmės virš stulpelio pavaizduotos kaip "" ir "", atitinkamai nurodant reikšmingus skirtumus, palyginti su kontroline medžiaga.
2.3. Imuniteto organų indeksai
Tiek blužnies, tiek galvos ir inkstų indeksai padidėjo padidėjus bendrai amoniako azoto koncentracijai po ekspozicijos (3 pav.). Palyginti su kontroline grupe, blužnies indeksas buvo reikšmingai padidėjęs žuvims, apdorotoms didesniu bendruoju amoniakiniu azotu (20 ir 30 mg/L) (p < 0,05). Reikšmingo galvos ir inkstų indekso skirtumo tarp visų gydytų amoniaku grupių ir kontrolinės grupės nenustatyta (p > 0,05).
3 pav. Lėtinio amoniako ekspozicijos poveikis blužnies (A) ir galvos ir inkstų indeksams (B) sergant Mamblycephala. Reikšmės išreiškiamos nuo min iki maksimalios (n=18). Vertės p < 0.{5}}5 ir 0,01 virš stulpelio vaizduojamos kaip"" ir "u", atitinkamai nurodant reikšmingus skirtumus, palyginti su kontroline medžiaga.
2.4. Patologinis įvertinimas
Kontrolinės grupės Wuchang karšių blužnis atrodė normaliai, jame buvo daug eritrocitų ir leukocitų (4A pav.). Po 30 dienų amoniako poveikio buvo pastebėtas nežymus eritrocitų skaičiaus padidėjimas ir melano-makrofagų centrų atsiradimas žuvų, kurios buvo paveiktos 5 mg/l bendro amoniakinio azoto, blužnyje (4B pav., 1 lentelė). Panašūs, bet rimtesni pokyčiai buvo pastebėti žuvyse, apdorotose nuo 10 iki 30 mg/l bendro amoniakinio azoto, pavyzdžiui, padidėjo melanomos-makrofagų centrų skaičius ir dydis, taip pat žymiai padidėjo eritrocitų skaičius (4C, D pav.). Be to, citoplazmos vakuolizacija taip pat buvo aptikta žuvų, kurios buvo paveiktos 30 mg/l bendro amoniakinio azoto, blužnyje (4E pav., 1 lentelė).
Kalbant apie galvos inkstus, 5A paveiksle parodyta normali galvos ir inkstų audinio struktūra kontrolinėse žuvyse po poveikio. Žuvų, kurios buvo veikiamos mažesnio bendrojo amoniakinio azoto (5 mg/L) galvoje-inkstuose, akivaizdžių patologinių požymių nepastebėta (5B pav., 1 lentelė). Nežymiai padidėjo melanomos-makrofagų centrų skaičius žuvyse, kurios buvo veikiamos 10 ir 20 mg/l bendro amoniakinio azoto (5C, D pav., 1 lentelė). Melanomos-makrofagų centrų dydis ir skaičius padidėjo 30 mg/l bendro amoniako azoto grupėje (5E pav., 1 lentelė).
2.5. Audinių imuninių parametrų analizė
Įgimtų imuninių parametrų (TNF-, IL-1) ir įgytų imuninių parametrų (IgM) lygiai blužnyje ir galvos inkstuose sumažėjo kartu su padidėjusiu amoniako poveikio lygiu (6 pav., S1 papildoma lentelė). Blužnyje TNF- ir IgM kiekis ir mRNR kiekis buvo reikšmingai sumažėjęs visose amoniako grupėse, palyginti su kontroline grupe (p < 0.{{10}}5). Tuo tarpu blužnies IL-1 kiekis ir mRNR ekspresijos lygis buvo žymiai sumažintas žuvims, kurios buvo paveiktos daugiau nei 20 mg/l bendro amoniakinio azoto (p < 0,05). Priešingai, tik IL-1 kiekis ir mRNR lygis, taip pat tnf- ekspresijos lygis galvos inkstuose buvo žymiai sumažintas amoniako grupėse, palyginti su kontrolinėmis grupėmis (p < 0,05). Tarp amoniaku gydytų ir kontrolinės grupės IgM baltymo ir genų ekspresijos lygių bei TNF koncentracijos galvos inkstuose reikšmingų skirtumų nebuvo (p > 0,05).
6 pav. Santykiniai TLR signalizacijos kelio genų mRNR lygiai, taip pat TNF-, IL- 1 ir IgM kiekis M. amblycephala blužnyje ir galvos inkstuose. Vertės, išreikštos šešių dublikatų vidurkiais ± SE. igm: imunoglobulinas M, il-1: interleukinas 1, tnf-: naviko nekrozės faktorius, jnk1: c-Jun N terminalo kinazė1, erk1: ekstraląsteliniu būdu reguliuojama baltymų kinazė 1, p38: mitogeno aktyvuota baltymų kinazė p38, b1nf-κ /2: branduolinio faktoriaus-κ-geno surišimas 1/2, pi3 k: fosfatidilinozitolio 3-kinazė, akt: proteinkinazė B, myd88: mieloidinės diferenciacijos faktorius 88, traf6: su naviko nekrozės faktoriaus receptoriais susijęs faktorius 6, tlr1 /2/3/4/5: į rinkliavą panašus receptorius 1/2/3/4/5. P reikšmės < 0.05 ir 0,01 virš stulpelio pavaizduotos kaip „*“ ir „**“, atitinkamai nurodančios reikšmingus skirtumus, palyginti su kontroline medžiaga.
Siekiant išsiaiškinti lėtinio amoniako toksiškumo imuninei sistemai molekulinį mechanizmą, buvo nustatyti pagrindinių genų, susijusių su TLR signalizacijos keliu, transkripcijos pokyčiai kartu su TNF-, IL-1 ir IgM lygiais. Blužnyje labai sumažėjo į rinkliavą panašių receptorių genų (tlr2, tlr4), su MyD88-nepriklausomu keliu susijusio geno traf6, su NF-κB signalizacijos keliu susijusio geno nf-κb2 ir su MAPK signalizacijos keliu susijusio geno erk1 mRNR lygis. -reguliuojamas amoniako gydymo grupėse, palyginti su kontroline (p < 0.05), tuo tarpu tlr1, tlr3, tlr5, pi3 k, akt, myd88 raiškos pokyčių nebuvo. , nf-κb1, jnk1 ir p38a (p > 0.05). Panašiai tlr1, tlr2, tlr5, akt, traf6, nf-κb1, erk1 ir jnk1 transkripcijos lygiai buvo reikšmingai raudoni, tlr3, tlr4, myd88, pi3 k, nf-κb2 ir p3dney galvoje ekspresija reikšmingai nesiskyrė. tarp apdorotų amoniaku grupių ir kontrolinės grupės (p > 0,05).
2.6. Koreliacijos analizė
Kaip parodyta 7 paveiksle ir papildomoje lentelėje S2, amoniako poveikio koncentracija reikšmingai neigiamai koreliavo su TNF-, IL-1 ir IgM kiekiu, taip pat su transkripcijos tnf-, il-1, igm, tlr2, traf6, nf-кb2 ir jnk1 blužnyje. Tuo tarpu blužnies TNF-, IL-1 ir IgM turinys ir transkripcijos lygiai rodė reikšmingą teigiamą koreliaciją tarpusavyje (p < 0.05). Blužnies IgM koncentracija parodė reikšmingą teigiamą koreliaciją su tlr2 ir nf-кb2, o TNF- ir IL-1 parodė reikšmingą teigiamą koreliaciją su tlr2, traf6 ir nf-кb2 (p < 0). 53}}5). Tačiau galvos inkstuose amoniako poveikio lygiai buvo tik nepaprastai neigiamai koreliuojami su IL-1 kiekiu ir genų tnf-, il-1, tlr1/2/4/5, traf6, akt, raiška, nf-кb1, jnk1 ir erk1 (p < 0,05). Galvos ir inkstų IL-1 teigiamai koreliavo su IgM, igm, il-1, tlr4, myd88, traf6, akt, nf-кb1, erk1 ir jnk1, o IgM ir TNF koreliavo su p38 a ir tlr2 atitinkamai (p < 0,05).
7 pav. Spearmano koreliacijos koeficientai ® tarp amoniako poveikio koncentracijos ir imuninių parametrų, susijusių su TLR signalizacijos keliu M. amblycephala blužnyje ir galvos inkstuose po lėtinio amoniako poveikio. P reikšmės < 0.05 ir 0,01 virš stulpelio pavaizduotos kaip „*“ ir „**“, o tai rodo reikšmingus skirtumus, palyginti su kontroline medžiaga, atitinkamai
2.7. IBR indeksai
IBR reikšmės buvo apskaičiuotos pagal standartizuotus 22 biožymenų duomenis Wuchang karšių blužnyje ir galvos inkstuose esant skirtingiems aplinkos amoniako lygiams po 30-dienos ekspozicijos (2 lentelė, 8 pav.). Didėjant amoniako ekspozicijos koncentracijai, IBR vertės didėjo tiek blužnyje, tiek galvos inkstuose. IBR reikšmės buvo didesnės blužnyje
„Wecistanche“ – didžiausio cistansų eksportuotojo Kinijoje – pagalbinė tarnyba:
El. paštas:wallence.suen@wecistanche.com
WhatsApp / Tel.:+86 15292862950
Įsigykite daugiau specifikacijų:
https://www.xjcistanche.com/cistanche-shop
