Nannochloropsis Sp. Ekstraktas kosmetikos reikmėms

Raktiniai žodžiai:Nannochloropsis; antioksidantas; anti-melanogeninis; odos drėkinimas; UV apsauga;anti-senėjimo

Spustelėkite čia, jei norite gauti daugiau informacijos apie „Cistanche“, skirtą senėjimui

1. Įvadas

Oda yra didžiausias organas, apimantis visą žmogaus kūną ir suteikiantis fizinębarjeras, apsaugantis vidinius audinius nuo išorinių dirgiklių, tokių kaip ultravioletiniai (UV)radiacija, cheminės medžiagos, patogenai ir fizinis stresas [1,2]. Be to, jis turi fiziologiškaivaidina svarbų vaidmenį padedant išlaikyti organizmus, įskaitant jų išsaugojimąvandens, imunologinių funkcijų, juslinio suvokimo ir kūno temperatūros reguliavimo [3,4]. Oda susideda iš trijų sluoksnių: epidermio, dermos ir hipodermos. Vidujeepidermis, keratinocitai, Langerhansas, melanocitai ir riebalinės liaukos vaidina svarbų vaidmenįvaidina odos pažeidimus, nustatant odos spalvą, apsaugant odą nuo UV spinduliųspinduliuote, suteikiant imunitetą ir tepant odą. Dermoje, esančioje apačiojeepidermį, vyraujančios fibroblastų ląstelės gamina kolageną ir elastines skaidulas. Kolagenassuteikia atsparumą tempimui ir atsparumą deformacijai, o elastinas suteikiaelastingumas ir lankstumas, leidžiantys audiniams po pašalinimo grįžti į pradinę formądeformuojanti jėga. Kolagenas ir elastinas yra kryžmiškai sujungti, kad užtikrintų struktūrinę paramąoda [4–7]. Hialurono rūgštis (HA), glikozaminoglikanas, yra pagrindinė sudedamoji dalisekstraląstelinė matrica (ECM). HA yra pagrindinė odos drėgmės išlaikymo molekulėgebėjimas surišti ir išlaikyti vandens molekules, iki 1000 kartų didesnes už savo svorį [8,9]. HAsugerdamas vandenį sudaro gelį ir suteikia audiniams atsparumą suspaudimui. Thehipoderma, kurią daugiausia sudaro riebalai ir laisvas jungiamasis audinys, kaupia energijąir suteikia kūno izoliaciją [5,6]. 

Odos senėjimas yra sudėtingas biologinis procesas, kurį sukelia vidiniai ir išoriniai veiksniai [10,11]. Vidinis senėjimas yra neišvengiamas fiziologinis ir genetinis procesasbėgant laikui keičiasi, atsiranda smulkių raukšlių, laipsniška odos atrofija irplona ir sausa oda [10,12,13]. Išorinį senėjimą sukelia kaupiamasis poveikisaplinkos veiksniai, įskaitant UV spinduliuotę, rūkymą ir oro taršą. Šios aplinkosYra žinoma, kad veiksniai skatina fiziologinius ir morfologinius odos pokyčius,sukelia priešlaikinį odos senėjimą [12–14]. Tarp aplinkos veiksnių, poveikisUV spinduliuotė yra pagrindinė išorinio odos senėjimo priežastis ir vadinama fotosenėjimu [14–16]. Skirtingai nuo iš esmės pasenusios odos, dažniausiai per anksti fotosenėjusi odarodomas šiurkštumas, netaisyklinga, marga pigmentacija, sustorėjęs epidermis, gilios raukšlės,laisvumas ir šiurkštumas [5,10,17]. Nepaisant vidinio odos senėjimo ir išorinio odos senėjimokurias sukelia skirtingi veiksniai, abu turi panašius molekulinius mechanizmus. Visų pirma,reaktyviosios deguonies rūšys (ROS) susidaro dėl oksidacinio ląstelių metabolizmo ir žaidžia apagrindinis vaidmuo abiejuose procesuose [18]. ROS sukelia mitogeno aktyvuoto baltymo aktyvavimąkinazės (MAPK) ir vėlesnis branduolinis faktoriusκB (NF-κB) ir transkripcijos faktoriaus aktyvatoriusbaltymo -1 (AP-1), dėl kurių padidėja metaloproteinazių (MMP: MMP-1) reguliavimas,MMP-3 ir MMP-9) ir sumažėjęs prokolageno-1 reguliavimas, todėl sumažėjakolageno kiekis senstančioje odoje [2,19]. ROS taip pat gali suaktyvinti kraujo neutrofilus, kad jie prasiskverbtųodą ir išskiria elastazę, kuri skaido elastines skaidulas ir praranda odos elastingumą [20]. Odasenėjimas taip pat stipriai susijęs su odos drėgmės praradimu. Buvo pranešta, kad aryškus HA sumažėjimas epidermyje dėl odos senėjimo sukelia netekimąodos drėgmė [8,21]. HA sintetina hialurono sintazės (HAS; HAS-1, -2, -3,)epidermio keratinocitai ir odos fibroblastai [8]. Melaninas gaminamas konvertuojantL-tirozinas virsta L-dihidroksifenilalaninu (L-DOPA), kurį katalizuoja tirozinazė.Melaninas yra atsakingas už odos spalvą ir atlieka svarbų vaidmenį saugant odą nuožala dėl saulės spindulių poveikio. Tačiau ROS kaupimasis padidina aktyvumątirozinazės, dėl kurios atsiranda hiperpigmentacija, pvz., senatvinės dėmės ir melasma dėl perteklinio kiekiomelanino gamyba. Todėl hiperpigmentaciją gali sušvelninti laisvieji radikalaivalikliai ir tirozinazės inhibitoriai [22,23].

Pastaraisiais dešimtmečiais sveiko senėjimo strategijos buvo privalomos, nes padaugėjogyvenimo trukmė. Be to, didėja susidomėjimas išlaikyti jauną ir gražiąišvaizda, nes odos sveikata ir grožis suvokiami kaip svarbūs biologiniai veiksniaireprezentuojanti žmogaus gerovę. Taip pat laikoma, kad jaunatviška ir graži išvaizdagali turėti teigiamos įtakos socialiniam elgesiui [10,13]. Todėl milijonai vartotojų naudojasikosmetinių odos priežiūros produktų kasdien, o prognozuojama pasaulinė kosmetikos gaminių rinkaiki 2023 m. pasiekti 805 mlrd.iki 2023 m. [24,25]. Dėl nepageidaujamo sintetinės kosmetikos gaminių šalutinio poveikio yraauga paklausa naudoti natūralius produktus, įskaitant augalų, gyvūnų molekules,ir jūrų organizmai. Kosmetikos gaminiai gaunami iš kosmetikos ir farmacijos,Tai kosmetikos gaminiai, kurių sudėtyje yra biologiškai aktyvių ingredientų, turinčių UV funkcijąapsauga, balina odą, mažina raukšles ir stabdo senėjimą [26]. Kosmetikos pramonėje,kosmetikos gaminiai yra sparčiausiai augantis sektorius, o natūralūs produktai atsiranda kaip naujovėpotencialių bioaktyvių medžiagų šaltinis kosmetikos reikmėms [25]. 

Cistanche yra prokariotiniai arba eukariotai fotosintetiniai mikroorganizmai, kurie galigreitai auga ir išgyvena ekstremaliomis aplinkos sąlygomis (pvz., temperatūros svyravimai,anaerobiozė, druskingumas, fotooksidacija, osmosinis slėgis ir UV spinduliuotė) [27]. Cistanchetaip pat yra pranašesni už sausumos augalus dėl didelio produktyvumo, riboto sezoniškumo,lengvesnis išgavimas ir daug žaliavų [27]. Cistanche yra nuolat veikiamiaplinkos stresui. Taigi jie vystėsi kurdami įvairias strategijas, tokias kaip ultrastruktūriniai, fiziologiniai ir biocheminiai pokyčiai [28]. Natūralūs produktai, gautiiš Cistanche, kurios gali būti naudojamos kosmetikos ar kosmetikos tikslais, apima fotosintezępigmentai, lipidai, fenoliniai junginiai, aminorūgštys, peptidai, angliavandeniai,ir vitaminai [25]. Tarp natūralių produktų yra karotinoidų, kurie žinomi kaip stiprūsAntioksidantai ir laisvųjų radikalų valikliai gali būti naudojami senėjimui stabdymui ir fotoapsaugaitikslai [29]. Tarp karotinoidų – astaksantinas, pasižymintis didesniu antioksidaciniu aktyvumunei -karotinas ir askorbo rūgštis, turi įdomią depigmentacijos funkciją, kuri galiapsaugoti odą nuo senatvinių dėmių, sumažinant melanino sintezę 40 procentų [30,31]. Zeaksantinas irkiti karotenoidai taip pat rodo UV sugerties ir tirozinazės slopinimo aktyvumą.32]. Cistanchedažnai turi daug lipidų, įskaitant polinesočiąsias riebalų rūgštis (PUFA).PUFA vaidina svarbų vaidmenį apsaugant nuo foto, palaikant membranos sklandumą iružkirsti kelią tarpląsteliniam ledo kristalų susidarymui, kuris leidžia išgyventi ekstremaliose aplinkosetokiomis sąlygomis kaip didelis šviesos intensyvumas, UV spinduliuotė ir žema temperatūra [33,34]. Omega{0}} riebalų rūgštys, pvz., dokozaheksaeno rūgštis (DHR) ir eikozapentaeno rūgštis (EPA)turi teigiamą poveikį mažinant odos fotosenėjimą, nes slopina UV sukeltas metaloproteinazes(MMP) ir priešuždegiminė veikla [35]. Taip pat buvo praneštakad -linoleno rūgštis turi tam tikrą kosmetinį poveikį, pavyzdžiui, atgaivina odą ir sulėtinasenėjimo procesus, o linolo rūgštis naudojama odos hiperplazijai gydyti [36]. Yra žinoma, kad fenoliniai junginiai iš Cistanche pasižymi įvairia veikla, pvzantioksidacinės, antialerginės, priešuždegiminės ir UV apsaugos funkcijos [2,37].

Nannochloropsisrūšys, maži vienaląsčiai eustigmatofiziniai dumbliai, yra atpažįstamidėl didelio lipidų kiekio ir didelio fotoautotrofinio biomasės produktyvumo, taip patuž sėkmingą jų auginimą dideliu mastu [38]. Nannochloropsisbuvo išnaudotaskaip nesočiųjų riebalų rūgščių (įskaitant EPA) šaltinis akvakultūroje užaugintam maistuijūrų bestuburiai. Juose taip pat yra fenolinių junginių, vitaminų ir įvairiųpigmentai, turintys antioksidacinį poveikį [39]. Be to, jie negamina toksinų irJų toksikologinis saugumas buvo įrodytas dėl ilgalaikio jų naudojimo kaip jūrų žuvų maistasir vėžiagyvių lervos [40]. Nors jie turi įvairių vertingų biologiškai aktyvių junginių,yra nedaug pranešimų apie taikymąNannochloropsiskosmetikai ir kosmetikaitikslai [41]. Atsižvelgiant į tai, kad Cistanche biocheminė sudėtis turi įtakos kosmetikaipoveikis gali būti skirtingas net tarp tos pačios rūšies izoliatų [42], tolimesnis tyrimasšios mikrodumblių rūšies reikia norint patenkinti didėjantį natūralių irsaugios kosmetikos priemonės. Šiame tyrime mes ištyrėme kosmeceutinį potencialąekstraktas išNannochloropsissp. G1-5 (NG15) yra izoliuotas nuo pietinės Vakarų jūrosKorėjos Respublika. Išanalizavome įvairią jo biologinę veiklą, įskaitant anti-melanogeninį poveikį, antioksidantas, odą drėkinantis, priešuždegiminis, raukšlių ir UVapsaugos funkcijas. Toliau analizavome jo biocheminį turinį ir sudėtįriebalų rūgštys, karotenoidai ir fenolio junginiai.

2. Rezultatai

2.1. Nannochloropsis sp. G1-5 ir biocheminės sudėties analizė

Šiame tyrime išskyrėme rusvos spalvos koloniją, rodančią, kad yrakarotinoidų ir polifenolių pigmentų, kurie buvo gauti paskleidus jūros vandenįmėginiai ant F/2 agaro plokštelių. Mes nustatėme izoliatą naudodami 18S rDNR PGRpagal seką ir pavadino jį kaipNannochloropsissp. G1-5 (NG15). Po auginimoNG15 ir ekstrahavimas etanoliu, riebalų rūgščių metilo esterių sudėtis ir kiekisNG15 ekstrakte buvo nustatyti (FAME), karotenoidai ir fenoliniai junginiai.Bendras riebalų rūgščių, karotinoidų, fenolių irflavonoidųžaliojeekstraktas buvo atitinkamai 58,2 proc , 1,6 proc , 7,7 proc , ir 2.{7}} proc.1–3). Tiksliau, žaliavinisekstrakte buvo įvairių PUFA lipidų, pvz -linoleno, linolo rūgšties irEPA, kurie turi senėjimą stabdantį, fotoapsaugą ir priešuždegiminį poveikį (lentelė1). Taitaip pat turėjo įvairių karotinoidų junginių, įskaitant astaksantiną, - karotenas, zeaksantinas,kantaksantinas ir violaksantinas (lentelė2, S1 paveikslas, S1 lentelė), kurie buvo žinomituri antioksidacinių, fotoapsauginių ir anti-melanogeninių funkcijų. Be to, iš visofenolių ir flavonoidų kiekis neapdorotame NG15 ekstrakte (lentelė3) buvo palygintididelis, palyginti su kitais anksčiau praneštais Cistanche [43–45].

2.2. NG15 ekstrakto citotoksiškumas in vitro

NG15 ekstrakto poveikis B16F10 gyvybingumui, CCD-986sk, normalus hužmogaus odos fibroblastai (NHDF) ir NF-κB luciferazės reporterio NIH3T3 ląstelės buvo stabiliosnustatyta MTT tyrimu, kai koncentracija yra 100–1500µg/mL. Gydymas suNG15 ekstraktas reikšmingai nesumažino visų iki šiol tirtų ląstelių linijų gyvybingumokoncentracija 1000µg/mL, bet šiek tiek sumažėjo iki 1500µg/mL (pav1a–d). 

2.3. Anti-melanogeninis NG15 ekstrakto aktyvumas

Norėdami įvertinti, ar NG15 ekstraktas turi odą balinantį poveikį, išanalizavome jo sudėtį.įtakos tirozinazės aktyvumui ir intracelulinei melanino sintezei. Dėl tirozinazės slopinimotyrime pastebėjome, kad tirozinazės aktyvumas sumažėjo gydant NG15nuo dozės priklausomu būdu. Tirozinazės slopinimo veikla buvo7.84 ± 2.54, 19.68 ± 2.64, 26.24 ± 1.21, 40.16 ± 0.55 ir 59.2± 0.48 proc. po gydymo NG15ekstraktas, kurio koncentracija yra 100, 250, 500, 750 ir1000 µg/mL, atitinkamai, o arbutinas(300 µM), naudojamas kaip teigiama kontrolė, parodė tirozinazę slopinantį aktyvumą47.52 ± 3,09 proc(Pav2a). NG15 ekstrakto tirozinazės slopinimo aktyvumas esant1000 µg/mLbuvo aukštesnisnei arbutino (300µM). Nustatyti anti-melanogeninį NG15 aktyvumąekstraktas, B16F10 ląstelės buvo stimuliuojamos - melanocitus stimuliuojantis hormonas ( -MSH,100 nM) ir melanino kiekis B16F10 ląstelėse, apdorotose NG15 ekstraktu arba arbutinubuvo išmatuoti. NG15 ekstraktas turėjo reikšmingą slopinamąjį poveikį melaninuisintezė priklauso nuo dozės. Palyginti su neapdorotomis ląstelėmis, melanino kiekispo gydymo ekstraktu buvo212.53 ± 4.72, 171.06 ± 3,57 ir128.60 ± 3,67 procadresukoncentracija 250, 500 ir1000 µg/mL, atitinkamai. Melanino kiekis B16F10ląstelės apdorotos tik -MSH (100 nM) rodė 247,65± 4,15 proc. Šis rezultatas atspindifaktas, kad NG15 ekstraktas sumažino melanino kiekį - MSH apdorotos B16F10 ląstelėsiki 48 proc. Teigiama kontrolė, arbutinas (300µM), parodė 88,27± 1,50 procento melanino kiekiopalyginti su neapdorotomis ląstelėmis, atitinkančiomis 64 proc. sumažintą melanino kiekį -MSH apdorotos B16F10 ląstelės (Pav2b). 

1 pav. NG15 ekstrakto (0-1500 ug/mL) poveikis (a) B16F1{{10}, (b) NHDF, (C) NF-KB luciferazės reporterioNIH3T3 gyvybingumui stabilios ląstelės ir (d) CCD{8}}sk ląstelės. Kontrolė – ląstelių gyvybingumas be NG15 ekstrakto; * žymi ap reikšmę < 0,05, n=3, Studento f testą; ** reiškia ap reikšmę < 0,01, n=3, Stjudento t testą.

2.4. NG15 antioksidacinė, priešuždegiminė ir apsauga nuo UV spindulių

Ekstraktas DPPH tyrimas buvo naudojamas NG15 ekstrakto antioksidaciniam aktyvumui įvertinti. NG15 ekstrakto DPPH radikalų šalinimo aktyvumas padidėjo priklausomai nuo dozės, kai koncentracija yra 100-1000 ug/mL. Tiksliau, DPPH radikalų šalinimo veikla buvo 8.71 士 1.38,20.12 土 1.38, 51.65  1.88, 54.95 土 2.38 ir 57.{{20}}. 52 proc. po apdorojimo atitinkamai 100, 250, 500, 750 ir 1000 ug/ml NG15 ekstrakto, o askorbo rūgštis (5 ug/mL) parodė 54.86 土 0,31 proc. DPPH radikalų šalinimo aktyvumo. DPPH radikalų šalinimo aktyvumas esant 1000 ug/mL NG15 ekstrakto buvo šiek tiek didesnis nei askorbo rūgšties (5 ug/mL) (3a pav.). Norėdami ištirti NG15 ekstrakto priešuždegiminį aktyvumą, išanalizavome ekstrakto poveikį TNF-a sukeltai NF-B aktyvacijai nuo NF-kB priklausomu luciferazės reporterio tyrimu. Kai NF-kB luciferazės reporterio NIH3T3 stabilios ląstelės buvo apdorotos įvairių koncentracijų NG15 ekstraktu, TNF-a sukeltas liuciferazės aktyvumas sumažėjo priklausomai nuo dozės iki 15,40 plius 0,38 proc., esant 1000 ug/ml, lyginant su ląstelėmis, apdorotomis tik TNF-a (3b pav.). Nustatyti apsauginį NG15 ekstrakto poveikį odos ląstelėms po UVB poveikio, gyvybingumąCCD-986sk ląstelių buvo išmatuotas MTT tyrimu. CCD{1}}sk ląstelių gyvybingumas poekspozicija iki 30 mJ/cm2 UVB sumažėjo iki 79,01± Kontrolinių ląstelių 2,57 proc. Tačiaugydymas NG15 ekstraktu žymiai sumažino UVB sukeltą ląstelių mirtį anuo dozės priklausomu būdu. CCD-986sk, apdoroto NG15 ekstraktu, ląstelių gyvybingumas buvo87.49 ± 7.49, 89.00 ± 2.89, 97.17 ± 7.19, 100.45 ± 5,62 ir 109,48± Po gydymo 8,25 procsu 100, 250, 500, 750 ir 1000µg/mL NG15 ekstrakto, atitinkamai, lyginant su kontroline medžiagaląstelės (pav3c). 

2 pav. Anti-melanogeninis NG15 ekstrakto poveikis. (a) NG15 ekstrakto tirozinazės slopinimo aktyvumas in vitro prieš grybų tirozinazę.** reiškia p reikšmę < 0.01, palyginti su normalia (negydyta) grupe. # reiškia ap reikšmę < 0.01, palyginti su sarbutinu apdorotomis ląstelėmis; n=3: mokinio f testas. b) NC15 ekstrakto poveikis melanino kiekiui a-melanocitus stimuliuojančio hormono (MSH) stimuliuojamose B16F10 ląstelėse. ## ir ** denoe ap vertė < 0,01, palyginti su tik c-MSH apdorotomis ląstelėmis; n=3; Mokinio testas. Arbutinas (300 uM) buvo naudojamas kaip teigiama kontrolė.

2.5. NG15 ekstrakto odos drėkinamoji ir priešraukšlinė veikla

Įvertinti NG15 ekstrakto odos drėkinimo aktyvumą, raiškąTURI-2 (su drėkinimu susijęs genas) NHDF ląstelėse buvo tiriamas naudojant qPCR. TheTURI-2mRNR ekspresija buvo žymiai sustiprinta gydant NG15 ekstraktu anuo dozės priklausomu būdu. Santykinis mRNR ekspresijos lygisTURI-2palyginti su negydytaisląstelės buvo 199,88± 10.63, 263.91 ± 2,47 ir 274,58± 1,37 proc , po gydymo su250, 500 ir 1000µg/mL NG15 ekstrakto atitinkamai 24 val., tuo tarpuTURI-2mRNRNHDF ląstelių, apdorotų retino rūgštimi (50 nM), ekspresijos lygis buvo 316,31± 8,89 proc(Pav4a). Nustatyti NG15 ekstrakto poveikį kolageno skaidymui irsintezė, išraiškaMMP{0}}irCol1A1buvo analizuojamas naudojant qPCR. TheMMP{0}}NHDF ląstelių mRNR ekspresija sumažėjo gydant NG15 ekstraktupriklausomai nuo dozės, iki 26,71 proc., esant 1000µg/mL, palyginti su neapdorotaisvaldymas (pav4b). TheCol1A1NHDF ląstelių mRNR ekspresija, apdorotaNG15 ekstraktas neparodė statistiškai reikšmingo skirtumo vartojant mažesnes nei 500 dozesµg/ml,bet jis padidėjo 15,53± 2,75 procento prie 1000µg/mL, palyginti su neapdorota kontrole(Paveikslas4c). Taip pat ištyrėme NG15 ekstrakto poveikį elastazės slopinimuiveikla. NG15 ekstraktas parodė elastazę slopinantį aktyvumą priklausomai nuo dozės,iki 24.88 val± 0.80 proc. prie 1000µg/mL, palyginti su neapdorota kontrole (Pav4d)

3 pav. NG15 ekstrakto antioksidacinė, priešuždegiminė ir apsauga nuo UV spindulių. a ) NG15 ekstrakto DPPH laisvųjų radikalų šalinimo aktyvumas. L-askorbo rūgštis (5 ug/ml) buvo naudojama kaip teigiama kontrolė. ** reiškia p reikšmę < 0.01, palyginti su normalia (neapdorota) grupe. n {{1{{30}}}}; Studento t testas. (b) NG15 ekstrakto poveikis nuo NF-xB priklausomam TNF-a indukuotos NF-B luciferazės reporterio NlH313 stabiliose ląstelėse. ** reiškia, kad apytiksumas < 0,01, palyginti su tik TNF-a apdorotomis ląstelėmis. n=3; Studento t testas. (C) Apsauginis NG15 ekstrakto poveikis CCD-986sk ląstelių gyvybingumui po UVB (30 m)/cm' poveikio. ## reiškia p reikšmę < 0,01, palyginti su normalia (neapdorota ir neveikiama UVB) grupe. ** reiškia ap reikšmę < 0,01, palyginti su grupe, kuri gydyta tik UVB spinduliais. n=3; Mokinio f testas.

4 pav. NG15 ekstrakto odos drėkinamoji ir priešraukšlinė veikla. (a) HAS-2b)MMP-1 ir (C) Col1A1 mRNR ekspresijos lygis. (d) NG15 ekstrakto elastazės slopinimo aktyvumas in vitro prieš elastazę iš NHDF ląstelių reiškia p reikšmę < 0.05, palyginti su normalia (neapdorota) grupe. reiškia ap reikšmę < 0,01, palyginti su normalia (neapdorota) grupen=3; Mokinio t testas. Kaip teigiama kontrolė buvo panaudota atitinkamai retinoinė rūgštis (50 nM), TCF-3 (5 ng/ml ir fosforamidono dinatrio druska (10 uM)). Kiekvieno geno mRNR ekspresijos lygis buvo normalizuotas iki B. - aktino genas.