Feniletanoidinių glikozidų ekstrahavimas iš Cistanche Tubulosa naudojant didelio greičio kirpimo homogenizavimo ekstrakciją

Kontaktai: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 El. paštas:audrey.hu@wecistanche.com

Wenjing Pei ir Ruili Guo

Fonas:

Cistanche tubulosayra gerai žinoma tradicinė kinų medicina, kilusi iš Sindziango. Jis plačiai paplitęs Šiaurės Afrikoje, Indijoje ir kt. Tikslas: pagrindinis biologiškai aktyvus komponentasC. tubulosayra feniletanoidiniai glikozidai (PhG). Echinakozidas ir akteozidas yra orientaciniai komponentai PhG nustatymui ir daugiausia naudojami kepenų apsaugai, imuninei apsaugai ir kt. Todėl labai svarbu išskirti PhG iš C. tubulosa. Metodai: Šiame tyrime buvo lyginami ekstrahavimo ultragarsu (JAE), mikrobangų pagalba (MAE) ir didelio greičio šlyties homogenizavimo ekstrahavimo (HSHE) metodai. Be to, buvo optimizuotos HSHE metodo ekstrahavimo sąlygos. Rezultatai: Rezultatai parodė, kad HSHE metodas buvo geresnis nei JAE ir MAE metodai, o optimalūs HSHE ekstrahavimo parametrai buvo 50 procentų etanolio koncentracija, 70 laipsnių ekstrahavimo temperatūra, sukimosi greitis 16000 aps./min., ekstrahavimo laikas 2 min., kietosios ir skysčio santykis 1:9 ir vienas ekstrahavimo ciklas. Echinakozido ir akteozido išeiga buvo atitinkamai 1,366 ir 0,519 proc., o echinakozido ir akteozido perdavimo greitis siekė atitinkamai 87 ir 94 procentus. Išvados: Galima daryti išvadą, kad HSHE metodas yra paprastas, greitas ir efektyvus PhG ekstrahavimo iš C. tubulosa metodas. Svarbiausi dalykai: buvo ištirtas efektyvus ir ekologiškas HSHE metodas, skirtas PhG išgauti iš C. tubulosa. Gautos optimalios HSHE metodo sąlygos PhG ekstrahavimui iš C. tubulosa. Šis tyrimas suteikia naują metodą pramoniniam PhG išgavimui išC. tubulosa.

Cistanche tubulosa

Cistanche tubulosayra paplitusi tradicinė kinų medicina, kilusi iš Sindziango. Jis plačiai paplitęs Šiaurės Afrikoje, Arabijos pusiasalyje, Pakistane ir Indijoje, o 2010 m. oficialiai įrašytas į Kinijos farmakopėją. Pagrindinis biologiškai aktyvus komponentasC. tubulosayra feniletanoidiniai glikozidai (PhG) – vandenyje tirpių natūralių produktų klasė, įskaitant echinakozidą, akteozidą, izoakteozidą ir 2-acetillakteozidą (1, 2). PhG struktūrą sudaro cinamono rūgšties ir hidroksifeniletilo dalys, kurios abi yra prijungtos prie gliukopiranozės atitinkamai esterio ir glikozidinėmis jungtimis (3). Farmakologiniai tyrimai parodė, kad C. tubulosa PhG turi daug vaistinių funkcijų, tokių kaip anti-nuovargis (4), neuroprotekcinis (5–7), kepenų apsauginis (8–10) ir imunoprotekcinis poveikis (11). Todėl efektyvus PhG ekstrahavimas iš C. tubulosa turi didelę reikšmę natūralių produktų kūrimui ir panaudojimui.

Dabartiniai tradiciniai PhG ekstrahavimo metodai yra ekstrahavimas karštu refliuksu, ekstrahavimas ultragarsu (JAE) ir ekstrahavimas mikrobangų pagalba (MAE; 12–16). Šie metodai turi įvairių trūkumų, tokių kaip mažas efektyvumas, ilgas ekstrahavimo laikas ir didelės sąnaudos. Palyginti su tradiciniais metodais, didelio greičio šlyties homogenizavimo ekstrahavimo (HSHE) metodas yra naujas, naujas ekstrahavimo metodas, kurio pranašumai yra greitesnis ekstrahavimo laikas, mažiau tirpiklių atliekų, didesnis derlius, paprastesnis įrenginys ir lengvesnis veikimas (17). HSHE metodo veikimo principas pagrįstas besisukančiu vidiniu pjaustytuvu, varoma didelio greičio varikliu. Vidiniai ir išoriniai pjaustytuvai sukuria galingą kirpimo jėgą, kad suardytų ir sumaišytų mėginius. Tuo tarpu pjaustytuvas su dideliu sukimosi greičiu sukelia slėgio skirtumus tarp vidinės ir išorinės pjaustytuvo ertmių, todėl masė perkeliama tarp mėginių ir tirpiklių. Derinant didelę šlyties jėgą, susidūrimo jėgą, slėgį ir kitas jėgas, galima greitai pasiekti tirpią pusiausvyrą tarp kietų mėginių ir tirpiklių (18). Taigi HSHE išgavimo procesas gali būti baigtas per kelias minutes ir net keliasdešimt sekundžių (19–22).

Pastaruoju metu HSHE buvo tiriamas išgaunant biologiškai aktyvius komponentus iš įvairių natūralių produktų (23–25). Cheng ir kt. panaudojo HSHE, kad iš Schisandra Chinensis (26) vaisių išgautų penkis lignanus. Rezultatai parodė, kad optimalios sąlygos buvo 75 procentų etanolio koncentracija, 1 min. ekstrahavimo laikas, 1:19 kietojo ir skysčio santykis, 180 V ekstrahavimo įtampa ir mėginio dalelė. 120 akių dydis. Bendra penkių lignanų išeiga optimizuotomis sąlygomis buvo 13,89 ± 0,014 mg/g. Tang ir kt. naudojo HSHE, kad gautų biologiškai aktyvų aliejų iš perilių sėklų (27). Optimalios sąlygos buvo 2 min ekstrahavimo laikas, 1:10 kietojo ir skysčio santykis, 150 V ištraukimo įtampa ir du ekstrahavimo ciklai. Perilių sėklų aliejaus derlius siekė 59,3 proc. Aukščiau pateikti rezultatai rodo, kad HSHE pranašumai yra trumpi ištraukimo laikas, mažos sąnaudos ir didelis derlius. Tačiau trūksta tyrimų apie PhG išgavimą HSHE.

Šiame tyrime HSHE buvo naudojamas siekiant ištirti galimą jo taikymą išskiriant PhG išC. tubulosa. PhG išeiga buvo nustatyta HPLC. Trys ekstrahavimo metodai – HSHE, JAE ir MAE – buvo lyginami tomis pačiomis sąlygomis. Ištirtas etanolio koncentracijos, ekstrahavimo temperatūros, sukimosi greičio, ekstrahavimo laiko, kietosios ir skysčių santykio bei išeigos ekstrahavimo ciklų skaičiaus įtaka. Lyginami ir aptariami šio darbo bei literatūros privalumai ir trūkumai.

Medžiagos ir metodai

Medžiagos ir cheminiai reagentai

C. tubulosabuvo įsigytas iš Xinjiang Congrongtang Biological Technology Co., Ltd (Sindziangas, Kinija). Echinakozido (grynumas didesnis arba lygus 98 proc.) ir akteozido (grynumas didesnis arba lygus 98 proc.) standartai buvo įsigyti iš Shanghai Standard Biological Technology Co., Ltd (Šanchajus, Kinija). Acetonitrilas, metanolis ir acto rūgštis buvo HPLC kokybės (Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ). Analitinės kokybės etanolis buvo įsigytas iš Tianjin Yongsheng Fine Chemical Co., Ltd (Tianjinas, Kinija). Viso eksperimento metu buvo naudojamas dejonizuotas vanduo.

HPLC analizė

HPLC analizė buvo atlikta naudojant Waters e2695 skysčių chromatografiją (Waters, Milford, MA), turinčią 2489 UV / matomą detektorių ir Symmetry C18 kolonėlę (Waters), 250 × 4,6 mm, 5 μm dalelių dydžio. Echinakozido ir akteozido koncentracijos buvo analizuojamos HPLC metodu. Mobiliąją fazę sudarė (1) acetonitrilas ir (2) 2 procentų ledinės acto rūgšties vandeninis tirpalas. Gradiento eliuavimo programa pateikta 1 lentelėje.

Aptiktas bangos ilgis buvo 330 nm, srautas 1 ml/min., įpurškimo tūris 10 μL, o krosnelės temperatūra nustatyta 30 laipsnių. Analitės chromatografinė smailė buvo patvirtinta palyginus jos sulaikymo trukmę su etalonų sulaikymo trukme. Kiekybinis įvertinimas buvo atliktas integruojant smailę naudojant išorinį standartinį metodą.

Tikslumo testas buvo atliktas penkis kartus įpurškiant tuos pačius ekstrahavimo mėginius. Atliekant stabilumo testą, tie patys mėginiai buvo analizuojami kas 0, 1, 2, 4, 12, 24 ir 48 val. Echinakozido ir akteozido regeneravimo testai buvo atlikti pridedant etalonų į ekstrahavimo mėginius. Buvo užregistruoti visi echinakozido ir akteozido piko plotai ir sulaikymo laikas. Echinakozido ir akteozido kalibravimo kreivių rezultatai pateikti 2 lentelėje.

Pajamingumo apskaičiavimas

Echinakozidas ir akteozidas buvo naudojami kaip orientaciniai komponentai PhGs nustatyti. Echinakozido arba akteozido išeiga buvo apskaičiuota naudojant šią lygtį:

T=CV/P × 100 procentų (1)

kur Y=echinakozido arba akteozido išeiga (procentais); C=echinakozido arba akteozido koncentracijos (mg/mL); V=ekstrahavimo tirpalo tūris (mL); ir W=C. tubulosa miltelių masė (mg).

PhG ekstrahavimo metodai

C. tubulosa stiebai pirmiausia buvo sumalti elektriniu šlifuokliu (JC-500g; Yongkang Kaiyuan Industry & Trade Co., Ltd, Yongkang, Kinija) ir nufiltruoti filtravimo sietu (apie 380 μm). Tada C. tubulosa milteliai buvo džiovinami orkaitėje 70 laipsnių temperatūroje, kol masė pasidarė pastovi. Penki gramai C. tubulosa miltelių buvo sumaišyti su ekstrahavimo tirpikliu ir sudėti į ekstrahavimo butelį. Po to skystas mišinys 5 minutes buvo kaitinamas (30–80 laipsnių) pastovios temperatūros vandens vonioje (DF-101S; Jintan Analytical Instrument Co., Ltd, Jintan, Kinija).

(a) HSHE metodas. HSHE buvo atlikta naudojant FA25 sistemą (FLUKO Co., Ltd, Šanchajus, Kinija), kurią sudarė besisukantis pjaustytuvas, greitaeigis variklis ir valdiklis. Vidinės frezos sukimosi greitis buvo reguliuojamas 10000–28000 aps./min. intervale, o ištraukimo laikas – 2–15 min.

b) JAE metodas. Penki gramai džiovinto mėginio ir 300 ml metanolio buvo tiksliai pasverti ir supilti į ekstrahavimo butelį. Ekstrahavimo butelis buvo panardintas į ultragarso vonią ir 10 min. atliekamas 300 W ultragarso galia. Ištraukimo temperatūra buvo nustatyta 30 laipsnių.

c) MAE metodas. Penki gramai džiovinto mėginio ir 300 ml metanolio buvo tiksliai pasverti ir supilti į ekstrahavimo butelį. Ekstrahavimo butelis buvo įdėtas į mikrobangų reaktorių ir veikiamas 180 W galia 10 min. Ištraukimo temperatūra buvo nustatyta 30 laipsnių.

HSHE metodas buvo lyginamas su JAE ir MAE metodais, turinčiais tą patį ekstrahavimo tirpiklį, ekstrahavimo laiką, ekstrahavimo temperatūrą, kietojo ir skysčio santykį ir ekstrahavimo ciklo skaičių. Ekstrahavimo tirpalas filtruojamas 0,22 μm membrana ir analizuojamas naudojant HPLC, siekiant nustatyti echinakozido ir akteozido koncentracijas. Visi ekstrahavimo procesai kartojami tris kartus

Pervedimo kursų nustatymas

Remiantis standartiniu metodu, pateiktu 2015 Kinijos farmakopėjoje, buvo nustatytas echinakozido ir akteozido kiekis C. tubulosa milteliuose (28). Vienas gramas C. tubulosa miltelių ir 50 ml 50 procentų metanolio buvo tiksliai pasverti ir supilti į 50 ml rudą matavimo kolbą. Skystas mišinys pasveriamas ir mirkomas 30 min. Tada ruda matavimo kolba buvo panardinta į ultragarso vonią ir 40 min. atliekama esant 250 W ultragarso galiai ir 35 kHz dažniui. Skystas mišinys dar kartą pasvertas ir įpilama 50 procentų metanolio, kad būtų išvengta tirpiklio praradimo. Ekstrahavimo tirpalas buvo filtruojamas 0, 22 μm membrana ir buvo analizuojamas naudojant HPLC, siekiant nustatyti echinakozido ir akteozido koncentracijas. Ekstrahavimo procesai kartojami tris kartus.

Echinakozido arba akteozido perdavimo greitis buvo apskaičiuotas naudojant šią lygtį:

X= M1/M2 × 100 procentų (2)

kur X=echinakozido arba akteozido perdavimo greitis (procentais); M1=echinakozido arba akteozido kokybė ekstrakte (mg); ir M2=echinakozido arba akteozido C. tubulosa milteliuose kokybė (mg).

Rezultatai ir DISKUSIJA

HPLC metodo patvirtinimas

Echinakozido ir akteozido HPLC profiliai iš C. tubulosa naudojant HSHE parodyti 1 paveiksle. Echinakozido ir akteozido smailių plotų RSD buvo atitinkamai 1,89 ir 1,4 0 proc. Rezultatai parodė, kad HPLC metodas turi gerą tikslumą atliekant kiekybinę echinakozido ir akteozido analizę. Įvairiu laiku (0–48 val.) echinakozido ir akteozido smailių sričių RSD buvo atitinkamai 1,71 ir 1,7 0 proc., o tai rodo, kad mėginys buvo stabilus per 48 valandas. Echinakozido ir akteozido regeneracija buvo atitinkamai 99,3 ir 99,1 proc., o jų RSD buvo atitinkamai 0,70 ir 0,67 proc., o tai patvirtino HPLC metodo patikimumą.

Įvairių ekstrahavimo metodų palyginimas

Atliktas HSHE metodo palyginimas su MAE ir JAE metodais dėl echinakozido ir akteozido išeigų, kurių rezultatai pateikti 2 pav. Pastebėta, kad HSHE gautos echinakozido ir akteozido išeigos buvo didesnės nei gautos. tiek MAE, tiek JAE. Palyginti su MAE, HSHE gautas echinakozido ir akteozido derlius buvo atitinkamai 20,5 ir 20,8 procento didesnis. Ir, palyginti su JAE, HSHE gautas echinakozido ir akteozido derlius buvo atitinkamai 6,6 ir 7,4 procento didesnis. Šie rezultatai rodo, kad HSHE gali žymiai padidinti PhG derlių.

HSHE metodo optimizavimas

PhG ekstrahavimo HSHE parametrai apima etanolio koncentraciją, ekstrahavimo temperatūrą, sukimosi greitį, ekstrahavimo laiką, kietojo ir skysčio santykį ir ekstrahavimo ciklų skaičių (26, 29).

Etanolio koncentracijos poveikis PhG ekstrahavimui

Etanolio koncentracija yra svarbus veiksnys, turintis įtakos PhG išeigai. Kaip parodyta 3 paveiksle, buvo tiriamas echinakozido ir akteozido išeiga iš C. tubulosa esant skirtingoms etanolio koncentracijoms. Atskleidė, kad echinakozido išeiga padidėjo nuo 0 iki 30 procentų, o vėliau sumažėjo nuo 30 iki 90 procentų, didėjant etanolio koncentracijai. Akteozido išeiga padidėjo nuo 0 iki 70 procentų, o vėliau, didėjant etanolio koncentracijai, sumažėjo nuo 70 iki 90 procentų. Kai etanolio koncentracija buvo 50 proc., echinakozido ir akteozido derliaus suma buvo didžiausia. Skirtingos etanolio koncentracijos turi skirtingą poliškumą, todėl skiriasi echinakozido ir akteozido tirpumas. Taigi optimali etanolio koncentracija buvo 50 proc.

Sukimosi greičio įtaka PhG ekstrahavimui

5 paveiksle parodytas skirtingų sukimosi greičių poveikis PhG derliui. Echinakozido ir akteozido derlius didėjo didėjant sukimosi greičiui. Sukimosi greičio padidėjimas gali padidinti vidinio ir išorinio pjaustytuvo kirpimo jėgą, taip padidindamas PhG išeigą. Optimalus sukimosi greitis buvo 16000 aps./min.

Ekstrahavimo laiko įtaka PhG ekstrahavimui

Echinakozido ir akteozido išeiga, esant skirtingam ekstrahavimo laikui, parodyta 6 paveiksle. Echinakozido ir akteozido išeiga buvo stabili didėjant ekstrahavimo laikui. Todėl galima daryti išvadą, kad PhG iš C. tubulosa galima visiškai išskirti per 2 min., o optimalus ekstrahavimo laikas buvo 2 min.

Kietosios medžiagos ir skysčio santykio įtaka PhG ekstrahavimui

Kaip parodyta 7 paveiksle, buvo aptartas echinakozido ir akteozido derlius, esant skirtingiems kietųjų medžiagų ir skysčių santykiams. Echinakozido ir akteozido derlius padidėjo nuo 1:3 iki 1:9 ir tapo stabilus nuo 1:9 iki 1:24. Kadangi nedidelis ekstrakcijos tirpiklio kiekis negali visiškai ištirpinti echinakozido ir akteozido, masės perdavimo greitis buvo sumažintas. Per didelis tirpiklių ekstrahavimas sukėlė nereikalingų atliekų. Todėl optimalus kietojo ir skysčio santykis buvo 1:9.

Ekstrahavimo ciklų skaičiaus įtaka PhG ekstrahavimui

8 paveiksle parodyta, kad daugelio ekstrahavimo ciklų poveikis PhG derliui. Echinakozido ir akteozido derlius didėjo didėjant ekstrahavimo ciklų skaičiui. Tačiau ištraukimo laikas žymiai pailgėjo didėjant išgavimo ciklams ir buvo sunaudota daugiau energijos. Optimalus ekstrahavimo ciklų skaičius buvo vienas.

HSHE metodo palyginimas su kitais PhG ekstrahavimo metodais

HSHE metodo rezultatai, palyginti su kitais ekstrahavimo metodais, skirtais ekstrahuoti PhG iš C. tubulosa, yra pateikti 3 lentelėje. HSHE yra paprastesnis ir lengvesnis už sujungimo metodus, tokius kaip ultragarsinis vandens dvifazis ekstrahavimas ir ultragarso mikrobangų ekstrahavimo technologija. metodus. Be to, HSHE ekstrahavimo slėgis yra mažesnis nei suslėgto skysčio ekstrahavimo metodas, o pirmojo veikimo sąlygos yra saugesnės. Dar svarbiau, kad iš 3 lentelės matyti, kad HSHE rodo trumpiausią ekstrahavimo laiką ir mažiausią tirpiklio suvartojimą tarp visų ekstrahavimo būdų. Galima daryti išvadą, kad HSHE metodas turi daug privalumų, tokių kaip didelis efektyvumas, švelnios eksploatavimo sąlygos, mažas suvartojimo lygis, paprasta įranga ir paprastas veikimas natūralių produktų gavybai.

Išvados

Šiame tyrime buvo ištirtas efektyvus ir ekologiškas HSHE metodas, skirtas PhG išgauti iš C. tubulosa. Palyginti su JAE ir MAE metodais, naujasis HSHE metodas tomis pačiomis sąlygomis sukuria didesnį PhG derlių. Palyginti su MAE metodu, echinakozido ir akteozido derlius padidėjo atitinkamai 20,5 ir 20,8 proc. Ir, palyginti su JAE, echinakozido ir akteozido derlius padidėjo atitinkamai 6,6 ir 7,4 procento. Buvo optimizuoti PhG iš C. tubulosa HSHE ekstrahavimo parametrai. Pagal optimizuotus parametrus echinakozido ir akteozido išeiga siekė atitinkamai 1,366 ir 0,519 proc., o echinakozido ir akteozido – atitinkamai 87 ir 94 proc. HSHE metodas pasižymi dideliu efektyvumu, švelniomis eksploatavimo sąlygomis, mažu suvartojimo lygiu, paprasta įranga, paprastu valdymu ir mažomis sąnaudomis. Šis tyrimas suteikia naują PhG pramoninės gavybos iš C. tubulosa metodą.