Favonoidų ir fitooksilipino atsakai granatų (Punica Granatum L.) lapuose 1 dalis

Prašau susisiektioscar.xiao@wecistanche.comDaugiau informacijos

Santrauka:Augaluose gaminamas metilo jazmonatas (MeJA) gali tarpininkauti jų reakcijai į aplinkos įtempimą. Taip pat įrodyta, kad egzogeninis MeJA taikymas suaktyvina signalizacijos kelius ir sukelia fitoaleksino kaupimąsi daugelyje augalų rūšių. Norint suprasti, kaip granatų augalai biochemiškai reaguoja į aplinkos įtampą, buvo atlikta metabolitų analizė granatų lapuose, kuriems taikoma MeJA, ir atskleidė unikalius hidrolizuojamų taninų, flavonoidų ir fitooksilipinų pokyčius. Be to, imituojant ir MeJA apdorotų granatų lapų transkripto ir realaus laiko qPCR analizė nustatė skirtingai išreikštus metabolinius genus ir transkripcijos veiksnius, kurie gali būti susiję suhidrolizuojamastanino, flavonoidų ir fito-oksilipino keliai. Vienintelis molekulinis, biocheminis ir bioinformatinis apibūdinimaslipoksigenazėsu ilgalaike MeJA sukelta ekspresija parodė, kad ji gali oksiduoti polinesočiąsias riebalų rūgštis, nors ir nėra tarpląsteliniame skyriuje, kur buvo gaminami ne jamonato (ne JA) fito-oksilipinai. Šie rezultatai kartu rodo, kad nors platus flavonoidų ir antocianinų slopinimas yra bent iš dalies kontroliuojamas transkripcijos lygiu, sukelta ne JA biosintezė.Fitooksilipinaigreičiausiai nėra reguliuojamas transkripcijos būdu. Apskritai, geresnis supratimas, kaip granatų lapai reaguoja į aplinkos įtampą, ne tik pagerins augalų sveikatą ir produktyvumą, bet ir turės įtakos žmonių sveikatai, nes granatų augalų vaisiai yra turtingas maistinių junginių šaltinis.

Raktiniai žodžiai:Metilo jazmonatas.Flavonoidas·Antocianinas · Riebalų rūgštis.Fitooksilipinas· Lipoksigenazė

Norėdami sužinoti daugiau, spustelėkite čia

Įvadas

Sužeisti ar užpulti žolėdžių ir patogenų, augalai gamina ir išskiria metilo jazmonatą (MeJA), kurį nesužeisti augalų audiniai ir kaimyniniai augalai suvokia, kad suaktyvintų gynybos atsaką (Cheong ir Choi 2003). Be to, buvo įrodyta, kad egzogeninis MeJA panaudojimas augalui sukelia signalizacijos kelius, taip pat su patogeneze susijusių baltymų ir gynybinių cheminių medžiagų, žinomų kaip fitoaleksinai, gamybą. Fenoliniai fitoaleksinai, pvz., flavonoidai ir antocianinai, padidino kaupimąsi reaguojant į gydymą MeJA įvairiuose augaluose, tokiuose kaip Arabidopsis thaliana, vynuogės (Vitis vinifera), bananas (Musa acuminate), obuolys (Malus Domestica) ir raudonosios avietės (Rubus ) (Pandey ir kt., 2016; Portu ir kt., 2015; De Geyteret al., 2012; Shafiq ir kt., 2011; Flo-res ir Ruiz del Castillo 2014). Flavonoidų ir antocianinų biosintezė prasideda nuo naringenino chalkono susidarymo iš kumaroilo CoA ir trijų malonilo CoA molekulių, katalizuojamų chalkono sintazės (CHS), o vėliau naringenino chalkoną izomerizuojant į naringeniną chalkono izomera. Tada naringeninas naudojamas pagrindiniams flavonoidų ir antocianinų skeletams generuoti, kurie toliau modifikuojami glikozilo, metilo, hidroksilo ir prenilo funkcinėmis grupėmis, kad susidarytų įvairios struktūros ir funkcijos (Tian ir kt., 2008).

Cistanche gali pagerinti imunitetą

In addition to phenolic phytoalexins, the production of Phyto-oxylipins upon MeJA induction has also been reported in a few plant species (Deboever et al.2020). Phyto-oxylipins are oxygenated fatty acids and derivatives that play a role in plant growth, development, stress response, and innate immunity(Wasternack and Feussner 2018). The initial step of Phyto-oxylipin biosynthesis involves oxidation of polyunsaturated fatty acids(PUFAs) to fatty acid hydroperoxides (HPOs)by lipoxygenases(LOXs)(Andreou and Feussner 2009). Plant LOXs are grouped into two subfamilies according to their protein sequences; type ILOXs are highly homologous(>75 procentų panašumo) ir neturi signalinio peptido, o II tipo LOX bendras sekos panašumas yra mažas (<35%)but all="" contain="" a="" chloroplast="" target="" peptide="" (feussner="" and="" wasternack="" 2002).="" plant="" loxs="" can="" also="" be="" classified="" based="" on="" enzymatic="" activities;9-loxs="" and="" 13-loxs="" target="" the="" c-9="" and="" c-13="" position="" of="" the="" fatty="" acid="" substrate,="" respectively="" (feussner="" and="" wasternack="" 2002).="" hpos="" generated="" by="" loxs="" can="" be="" further="" transformed="" to="" various="" phyto-oxylipins,="" such="" as="" hydroxy="" fatty="" acids="" by="" reductases,="" keto="" fatty="" acids="" by="" loxs,="" epoxy="" fatty="" acids="" by="" per-oxygenases(pxgs),="" and="" dihydroxy="" fatty="" acids="" by="" loxs="" or="" α-dioxygenase="" α-doxs).="" notably,13-hydroperoxy-linolenic="" acid(an="" hpo)produced="" from="" linolenic="" acid="" by="" 13-lox="" can="" initiate="" a="" series="" of="" reactions="" to="" form="" jasmonic="" acid(ja),="" meja,="" and="" the="" bioactive="" ja-isoleucine="">

Granatai (Punica granatum L.) – tai specialus sodininkystės augalas, vertinamas dėl gausių fenolio junginių vaisiuose, tokių kaip flavonoidai, antocianinai ir hidrolizuojami taninai (HT), kurie gaunami iš tarpinio šikimo kelio (Ono ir kt., 2016). ). Iki šiol daugelis tyrimų buvo sutelkti į granatų fenolių vaidmenį mažinant žmonių stresą ir ligas (Wu ir Tian 2017). Priešingai, mažai žinoma apie fenolių ir kitų fitochemikalų funkciją saugant granatus nuo abiotinių ir biotinių veiksnių (pvz., žaizdos, patogenai, MeJA indukcija) lapuose ir vaisiuose. Dvi naujausios ataskaitos įvertino MeJA apdorojimą prieš derliaus nuėmimą dėl granatų vaisių kokybės po derliaus nuėmimo (Koushesh Saba ir Zarei 2019; Garcia-Pastor ir kt., 2020). Bendras MeJA apdorotų vaisių, bet ne lapų, antocianinų, flavonoidų ir fenolių kiekis buvo analizuojamas kartu naudojant spektrofotometrą. Viename iš tyrimų taip pat buvo analizuojami atskiri antocianinai naudojant masių spektrometriją (Garcia-Pastor ir kt., 2020). Tačiau lieka neaišku, kaip granatų augalų audiniai, tiek lapai, tiek vaisiai, reaguoja į aplinkos įtampą prieš vaisiaus mezgimą.

Norėdami pradėti išskaidyti granatų augalų ir aplinkos veiksnių sąveiką, ištyrėme granatų lapų metabolinį atsaką į egzogeninį MeJA panaudojimą, naudodami aukštos kokybės skysčių chromatografiją (HPLC) ir skysčių chromatografijos-elektropurškimo jonizacijos tandeminę masės spektrometriją (LC-ESI-MS / MS). . MeJA apdorotuose granatų lapuose buvo pastebėti unikalūs HT, flavonoidų ir antocianinų pokyčiai, taip pat lipidų, riebalų rūgščių ir fitooksilipinų pokyčiai. Lyginamoji transkripto analizė, patvirtinta realaus laiko qPCR analize, atskleidė, kad struktūriniai ir (arba) reguliuojantys genai, dalyvaujantys HT, flavonoidų, antocianino ir fitooksilipino metabolizme, buvo skirtingai išreikšti imitaciniais ir MeJA apdorotuose granatų lapuose. Vienintelis LOX genas, kurio MeJA apdorotuose lapuose buvo nuolat reguliuojama ekspresija, buvo atliktas tolesnis molekulinis, biocheminis ir filogenetinis apibūdinimas.

medžiagos ir metodai

Gliukogalino ir pentagalloilo gliukozės standartai buvo įsigyti iš Shanghai Yuanye Bio-Technology Co. Ltd (Šanchajus, Kinija). LOX tyrime naudotos cheminės medžiagos buvo gautos iš šių pardavėjų: 3-(dimetilamino)benzenkarboksirūgštis (DMAB) (Adamas Reagent, Co., Ltd., Šanchajus, Kinija), linolo rūgštis (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, JAV), 3-metil-2-benzotiazolinonas (MBTH) ir hemoglobinas (Sangon Biotech Co., Ltd., Šanchajus, Kinija).

Augalinės medžiagos Granatų vaisius ir sėklas (Cv. Wonderful) dosniai suteikė Panzhihua žemės ūkio ir miškų mokslų akademija, o Šanchajaus Čenšano botanikos sode identifikavo dr. Binjie Ge. Kupono pavyzdys (Nr. CSHO173966) buvo deponuotas Šanchajaus Chenshan botanikos sodo herbariume, Šanchajuje, Kinijoje. Granatų daigai buvo auginami kontroliuojamos temperatūros augimo patalpoje 6 savaites 25 laipsnių temperatūroje ir 16 valandų šviesoje / 8 valandas tamsoje. Pranešama, kad MeJA koncentracija purškiant augalų audinius svyruoja nuo 100 iki 250 μM (Ku ir kt., 2014); Hickman ir kt.2017). Iš pradžių granatų lapams buvo pritaikytos skirtingos MeJA koncentracijos, iš kurių 200 μM MeJA sukėlė pastebimą metabolinį atsaką preliminarioje analizėje ir buvo naudojamas šiame tyrime aprašytoms metabolitų ir genų ekspresijos analizėms. Prieš gydymą MeJA pusė granatų augalų buvo perkelta į kitą augimo patalpą su panašiomis sąlygomis. Vienoje auginimo patalpoje esantys augalai buvo purškiami 200 μM MeJA, o kitoje auginimo patalpoje esantys augalai buvo purškiami vandeniu (ty netikra kontrole). 2-h,3-h,6- h,12-h,24-h, 30-h,36-h,48-h ir72-h po gydymo, išvyksta nuo 3 buvo sujungti 5 imitaciniais arba MeJA apdoroti augalai, kurie sudaro vieną biologinį pakartojimą. Trys biologiniai pakartojimai buvo surinkti imitaciniams ir MeJA gydymo eksperimentams; kiekvienas biologinis replikatas buvo padalintas į alikvotas metabolitų profiliavimui ir genų ekspresijos analizei.

Metabolitų profiliavimo analizė

Granatų lapai buvo liofilizuoti, pasverti ir sumalti į smulkius miltelius, naudojant cirkonio granules granulių plakiklyje (Mixer Mill MM 400, Retsch GmbH, Haanas, Vokietija) 90-aisiais 30 Hz dažniu. HPLC analizei lapų mėginys buvo ekstrahuotas 70 procentų metanoliu 60 minučių ultragarsu ir centrifuguojamas 13, 000 aps./min. greičiu 10 min. Supernatantas buvo perkeltas į HPLC buteliuką, iš kurio 30 μL buvo įšvirkšta į atvirkštinės fazės HPLC (Agilent 1200, Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA) ir analizuojama, kaip aprašyta anksčiau (Wil-son ir kt., 2019). Metabolitai buvo aptikti UV absorbcija 254 nm, 280 nm, 320 nm ir 360 nm. Sudarytos standartinės -gliukogalino ir pentagalloilo gliukozės kalibracinės kreivės; jie buvo naudojami smailių plotams, atitinkantiems -gliukogalino ir pentagalloilo gliukozės sulaikymo laiką ir absorbcijos spektrus, konvertuoti į atitinkamas koncentracijas.

For LC-ESI-MS/MS analysis, the homogenized leaf sample(100 mg) was extracted in 1 mL of 70% methanol at 4℃Covernight.On the following day, the methanolic extract was centrifuged at 10,000×g for 10 min and the supernatant was passed through a CNWBOND Carbon-GCB SPE cartridge（ANPEL, Shanghai, China） and a 0.22-μm syringe filter(ANPEL) prior to metabolite analysis. The extract （2 μL） was analyzed using LC-ESI-MS/MS (Shim-pack UFLC, Shimadzu, Kyoto, Japan; QTRAP6500, Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)and a reverse phase C1s column(ACQUITY UPLC HSS T3,1.8 βm, 2.1 mm×100 mm, Waters, Milford, MA, USA).Metabolites were eluted using solvents(A)water containing 0.04%acetic acid,and(B)acetonitrile containing0.04% acetic acid at a gradient of 0-11 min,95-5%A;11-12 min,5% A;12-12.1 min,5-95%A;12.1-15min,95%A.The flow rate was maintained at 0.4 mL min-1. Linear ion trap (LIT) and triple quadrupole(QQQ)MS scans were acquired in positive-and negative-ion modes. The turbo spray ion source was operated at 500℃C with an ionization voltage of 5500 V. The ion source gas I, gas I, and curtain gas were set at 55 psi,60 psi, and 25 psi, respectively. The collision gas (nitro-gen) was set at 5 psi. For the MRM analysis, declustering potential (DP)and collision energy(CE) were optimized for each precursor-product ion transition. For metabolite identification, the LC-ESI-MS/MS data were compared with an MS2T library of commercial standards and previously identified compounds published in mass spectral databases (when commercial standards are not available)(Chen et al.2013). Pomegranate metabolites were annotated based on the retention times, accumulate m/z values, and fragmentation patterns that match the MS2T library entries(Chen et al.2013). Metabolite quantification was performed using the MRM method as described by Dresen et al. (Dresen et al.2010). The biological replicates of each treatment (mock or MeJA)were averaged for comparative metabolite analysis. The Variable Importance in Projection(VIP) value was obtained from the Orthogonal Partial Least Squares Discriminant Analysis(OPLS-DA)model. Metabolites with ILog, FCl>1, and VIP>=1 buvo laikomi reikšmingai pakeistais.

Transkripto analizė

Bendra RNR buvo išgauta iš granatų lapų naudojant TRIzol reagentą (Invitrogen, Carlsbad, CA, JAV) ir kiekybiškai įvertinta naudojant Nanodrop2000 (ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, JAV). RNR mėginių vientisumas buvo patikrintas atskyrus ant agarozės gelio (be matomo skilimo) ir nustatant OD20/28o santykį (tarp 1,8 ir 2,2), naudojant Nanodrop2000. MRNR praturtinimas iš bendros RNR buvo atliktas naudojant oligo (dT) magnetines granules (Invitrogen). mRNR-Seq bibliotekos buvo sukurtos naudojant Truseq RNR bibliotekos paruošimo rinkinį (Illumina, San Diego, CA, JAV). Transkripto analizė buvo atlikta naudojant „Illumina HiSeq4000“ ir kiekvienai pavyzdinei bibliotekai buvo gauta 55-60 mln. 150-bp porinio galo skaitymo (PE150). Neapdoroti sekos duomenys buvo apdoroti pašalinus adapterio sekas ir trumpą (<50 bp),="" low="" quality=""><30), and="" poly(="">10%)reads using SeqPrep (https://github.com/jstjohn/seqprep)and Sickle (HTTPS: GitHub. com/Joshi/sickle). Over 95% of the cleaned reads were uniquely mapped to the reference pomegranate genome for each sample library using HISAT2(Kim et al.2015) and the mapped reads were assembled using StringTie(Pertea et al.2015). The assembled transcriptome sequences were annotated using NCBI NR(ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/blast/db/). Transcript abundance was determined by the RNA-Seq by Expectation-Maximization(RSEM) method and expressed as Transcripts Per Kilobase Million(TPM)(Li and Dewey 2011). Differential gene expression analysis was performed using DESeq2 (Love et al.2014), with a thresh-old of the log, FCl>1, ir pakoreguota P vertė<>

Realaus laiko qPCR analizė

Bendra RNR buvo išgauta iš imituojamų ir MeJA apdorotų granatų lapų, naudojant RNAprep Pure Plant Kit (Tiangen Biotech Co., Ltd., Pekinas, Kinija). Atvirkštinė transkripcija (RT) buvo atlikta naudojant bendrą RNR ir PrimeScriptTM RT reagentų rinkinį (Takara Bio Inc., Kusatsu, Japonija). Kiekybinė PGR (qPCR) buvo atlikta naudojant TB GreenTM Premix Ex Taq TM(Tli RNaseH Plus) rinkinį ( Takara) ir StepOnePlus realaus laiko PGR sistema (Ther-moFisher Scientific). Lydymosi kreivės analizė buvo atlikta ir parodė vieną amplifikacijos produktą kiekvienai pradmenų porai. Atliekant RT-qPCR analizę, buvo ištirti trys biologiniai pakartojimai ir kiekvienas su trimis techniniais pakartojimais, siekiant nustatyti imitacinius ir MeJA apdorotus mėginius. Genų ekspresija buvo analizuojama lyginamuoju C,(△AC) metodu (Livak ir Schmittgen 2001), o reikšmingumo lygiai nustatyti naudojant dvipusį Stjudento t testą. Pradmenų sekos realiojo laiko qPCR analizei ir pradmenų porų amplifikacijos efektyvumas parodytos S1 lentelėje.

Rekombinantinių baltymų ekspresija ir gryninimas bei fermentų tyrimai

Atviras Pgr025417 skaitymo rėmas (koduojantis numanomą LOX) buvo susintetintas optimaliam kodono naudojimui E. coli (Genewiz, Suzhou, Kinija) ir klonuotas į pET28a. Rekombinantinė plazmidė buvo transformuota į E. coli BL21 (DE3) ląstelės. Iš vienos kolonijos buvo pradėta 5-mL Luria Bertani (LB) kultūra su 50 ug ml-ikanamicino ir inkubuojama per naktį kratant 37 °C temperatūroje. Vienos nakties kultūra buvo naudojama 100- ml LB terpei pasėti 50 ug mL-kanamicino ir leista išaugti iki OD600 0,5. Tada buvo pridėta izopropil- -D-tiogalaktozido (IPTG) iki galutinės 0,1 mM koncentracijos baltymų ekspresijai sukelti. Po 18 valandų inkubacijos kratant 16 laipsnių temperatūroje ląstelės buvo surenkamos centrifuguojant. Ląstelių nuosėdos buvo resuspenduotos lizės buferyje (50 mM NaH, PO, pH 7,4, 300 mM NaCl, 10 mM imidazolo) ir homogenizuotos naudojant ląstelių ardiklį (Constant Systems Ltd, Northants, JK). Jo žymėti baltymai buvo išgryninti naudojant Ni-NTA granulės (ThermoFisher Scientific) su plovimo buferiu (50 mM NaH, PO, pH 7,4 300 mM NaCl, 25 mM imidazolo) ir eliuavimo buferiu (50 mM NaH, PO, pH 7,4 300 mM NaCl, 500 mM) imidazolas). Išgryninti baltymai buvo atskirti 10 procentų SDS-PAGE gelyje, kad būtų galima vizualizuoti baltymų grynumą. Išgrynintų baltymų koncentracija buvo nustatyta naudojant Bradfordo tyrimą (Bradford 1976).

Atliekant LOX tyrimą, linolo rūgštis buvo naudojama kaip substratas taikant dviejų pakopų kolorimetrinį metodą su nedideliais pakeitimais (Anthon ir Barrett 2008). 500-μL reakcijos mišinys, įskaitant 50 mM Na-fosfato, pH 6, 10 mM DMAB, 0,5 mM linolo rūgšties ir įvairius kiekius išgrynintų rekombinantinių baltymų (1,5 mg ml). -), buvo inkubuojamas 25 laipsnių temperatūroje 10 min. Į reakcijos mišinį buvo pridėtas antras tirpalas (500 μL), turintis 0,2 mM MBTH ir 0,1 mg ml-hemoglobino, kuris buvo inkubuojamas dar 5 minutes. Reakcija buvo nutraukta pridedant 500 μL 1 % (m/t) natrio laurilsulfato. Nustatyta šviesos sugertis esant 598 nm. Subląstelinė lokalizacija ir filogenetinės analizės Atlikus anotuoto granato genomo paiešką (Qin ir kt., 2017), buvo nustatyta 1 l numanomų viso ilgio LOX (nuo 786 aa iki 970 aa), įskaitant Pgr025413, Pgr020032, Pgr020032, Pgr025413, Pgr020032, Pgr02541, Pgr020032, Pgr025025gr18,81,8,8,8 -ilgio seka GenBank XP_031395793), Pgr009839, Pgr008562, Pgr025678 ir PgrO13780. Granatų LOX signalinių peptidų subląstelinė lokalizacija ir skilimo vietos buvo numatytos naudojant TargetP 2.0 (http://www.cbs.dtu.dk/servi ces/TargetP/) (Almagro Armenteros ir kt., 2019).

TF surišančios vietos analizė

Norint prognozuoti TF surišimo vietas, 1000 bp prieš srovę nuo tikslinių genų ATG pradžios kodono buvo gauta iš GenBank ir buvo atlikta Eucalyptus Grandis TF paieška PlantRegMap (5 versija) (Tian ir kt., 2020). Ribinė surišimo vertė svetainės identifikavimas buvo nustatytas P Mažiau arba lygus le-4. Statistinė metabolitų kiekybinio nustatymo, transkripto ir realaus laiko qPCR duomenų analizė aprašyta atitinkamuose skyriuose.

Rezultatai

MeJA moduliuoja ląstelių signalizaciją ir medžiagų apykaitos kelius granatų lapuose

Norint suprasti genomo masto granatų transkripcijos atsaką į MeJA iššaukimą, granatų lapų transkriptai 2-h,6-h,24-h ir 72-h po MeJA arba buvo ištirtas netikras gydymas (kiekvienas su trimis biologiniais pakartojimais) (S1 pav.). Kiekvienam transkriptui buvo gauti maždaug 55 milijonai neapdorotų sekos nuskaitymų (2 × 150 bp suporuotas galas), kurio GC kiekis buvo apie 52 proc., o Q30 reikšmės svyravo nuo 91,6 iki 95 procentų (S2 lentelė). Visų transkriptų atveju daugiau nei 96 procentai išvalytų sekų buvo susieti su etaloniniu granato genomu (Qin ir kt., 2017) (S3 lentelė). Dauguma surinktų transkriptų buvo mažesni nei 1000 bp (34,3 proc.), 1000 bp. 2000 bp (32,9 proc.) arba 2000 bp-3000 bp (18,1 proc.) (S4 lentelė).

To identify pathways that are significantly enriched with differentially expressed genes (DEGs)at the above-mentioned time points, genes that show significantly different expression(log, FCl>1, pakoreguotas P<0.05)between meja-="" and="" mock-treated="" leaves="" were="" compared="" to="" the="" kyoto="" encyclopedia="" of="" genes="" and="" genomes(kegg)database="" (fig.s1).="" application="" of="" meja="" modulated="" the="" expression="" of="" genes="" in="" plant="" hormone="" and="" mitogen-activated="" protein="" kinase="" (mapk)signaling="" pathways="" as="" well="" as="" fatty="" acid="" metabolism="" at="" all="" time="" points,="" with="" the="" only="" exception="" of="" those="" in="" plant="" hormone="" pathways="" at="" 24-h="" (fig.="" s1).="" while="" changes="" in="" aromatic="" amino="" acid="" metabolic="" (including="" the="" shikimate="" pathway)genes="" became="" evident="" at="" 6-h="" after="" meja="" treatment="" (fig.s1b),="" a="" surge="" of="" modified="" expression="" of="" flavonoid="" metabolic="" genes="" was="" observed="" for="" the="" 24-h="" and="" 72-h="" post-meja="" treatment="" leaves="" (figs.="" slc="" and="" s1d).="" shikimate="" and="" ht="" pathway="" genes="" and="" ht="" metabolites="" were="" induced="" in="" meja-treated="" pomegranate="" leave="" as="" revealed="" in="" the="" transcriptome="" and="" kegg="" pathway="" enrichment="" analysis,="" three="" shikimate="" biosynthetic="" path-way="" genes="" showed="" upregulated="" expression="" in="" meja-treated="" leaves="" relative="" to="" mock="" controls="" at="" 6-h,="" including="" 3-deoxy-d-arabinose-heptulosonate-7-phosphate="" synthase="" (dahps),="" 3-dehydrogenate="" synthase(dhs),="" and="" the="" bifunctional="" 3-dehydrogenate="" dehydratase/shikimate="" dehydrogenase="" (dhq/sdh;="" abbreviated="" as="" sdh)(figs.s1b="" and="" la).in="" particular,="" three="" isoforms="" of="" pomegranate="" sdhs="" were="" identified="" and="" showed="" differential="" expression="" in="" the="" transcriptome="" analysis,="" pgr020271,="" pgr019030,="" and="">

Norint nustatyti, ar šikimato ir HT biosintetinių genų nuorašų kiekio pokyčiai gali turėti įtakos metabolitų, gautų iš šių kelių, lygiui, fenoliniai metabolitai buvo išgauti iš lapų, nuskintų 24-h, 30-h. 36-h,48-h ir 72-h po MeJA arba netikro taikymo ir analizuojami HPLC (2 pav.). Reikėtų pažymėti, kad šie laiko taškai buvo pasirinkti atsižvelgiant į laiką, reikalingą baltymų sintezei ir metabolitų gamybai bei kaupimuisi po pastebėtų šikimato ir HT biosintetinių genų ekspresijos pokyčių 6- val. Dviejų metabolitų, eliuuotų po 4,57 min. (1 smailė) ir 24,98 min. (2 smailė), sulaikymo laikas ir sugerties spektrai atitiko atitinkamai HT kelio tarpinių produktų – gliukogalino ir Penta lydinių – gliukozės sulaikymo laiką ir absorbcijos spektrus (la ir 2a pav.). Abi smailės rodė reikšmingus integruotų smailių plotų pokyčius keliais laiko momentais (2b pav.). Konkrečiai, 1 smailė padidėjo MeJA apdorotuose lapuose, palyginti su netikra kontrole, 30-h, 36-h ir 48-h (2b pav.). Įdomu tai, kad MeJA apdorotų lapų smailės 2 iš pradžių sumažėjo 24- val., bet vėliau padidėjo 30- ir 36- val., o po to grįžo į lygį, panašų į netikrą kontrolę 48- h ir 72-h (2b pav.). MeJA apdorotuose granatų lapuose pastebimas daugumos flavonoidų ir antocianinų sumažėjimas, taip pat padidėjęs metilintų flavonų ir flavonolių kiekis.

To investigate whether exogenous application of MeJA may trigger broad-scale metabolic changes in pomegranate, metabolite profiling analysis was conducted on leaves collected at 72-h after mock- or MeJA treatment using LC-ESI-MS/MS. Metabolite annotation and quantification were performed using an MS/MS spectral tag (MS2T)library and multiple reaction monitoring(MRM), respectively. Of the 658 metabolites that were detected,29 showed increased and 73 exhibited decreased accumulation in MeJA-treated leaves compared to the mock controls (ILog, FCl>1; S5 ir S6 lentelės). Skirtingai kaupiamų metabolitų atveju buvo bendras metabolitų, dalyvaujančių augalų antriniame / specializuotame metabolizme (67 iš 102), ypač fenolio junginių (63 iš 102) praturtėjimas (S6 lentelė).

Tarp fenolių, MeJA apdorotuose lapuose buvo pastebėtas bendras įvairių flavonoidų ir antocianinų (42 iš 73 sumažėjusių junginių) sumažėjimas (3 pav.; S6 lentelė). Įdomu tai, kad MeJA apdorotuose lapuose padaugėjo trijų mono- arba di-O-metilintų flavonų ir flavonolių, įskaitant di-O-metilkvercetiną, chrizoberil-O-heksozil-O-heksozidą ir parduodamą 5-O-heksozidą. (3 pav.; S6 lentelė). Keletas flavonoidų ir antocianinų kelių tarpinių junginių, įskaitant liuteoliną, chrizoberilą, dihidrokaempferolį, dihidrokvercetiną, dihidromiricetiną, epikatechiną, delfinidiną ir pelargonidiną, buvo aptinkami, tačiau reikšmingų pokyčių MeJA apdorotuose lapuose neparodė (3 pav.; Table S5). Hidroksicino-namoilo dariniai, izoflavonai ir kumarinai buvo tarp kitų fenolių, kurie sumažino kaupimąsi po MeJA indukcijos (S6 lentelė). Priešingai, dviejų fenolio rūgščių, 2,3-dihidroksibenzenkarboksirūgšties ir protokatecho rūgšties (3,4-dihidroksibenzenkarboksirūgšties) ir kumarino, 6-metilkumarino, padaugėjo MeJA apdorotuose lapuose. (S6 lentelė).

Dviejų pagrindinių flavonoidų ir antocianinų biosintezės fermentų nuorašai atitinka labai sumažintą flavonoidų ir antocianinų kiekį MeJA apdorotuose granatų lapuose. CHS(Pgr005566) ir CHI (Pgr025966) reikšmingai sumažėjo po 6-h ir 24-h po MeJA panaudojimo pagal transkripto analizę (4 pav.). Realaus laiko qPCR analizė buvo atlikta siekiant ištirti CHS ir CHI išraišką su papildomais laiko taškais, įskaitant 2-h, 3-h, 6-h,12-h,{{ 11}}h, 48-h ir 72-h (4 pav.). CHS nuorašai nukrito MeJA apdorotuose lapuose po 3-h ir išliko žymiai mažesni nei pavyzdiniai kontroliuoja iki 72-h, o didžiausias sumažėjimas - 12-val. Priešingai, CHI ekspresijos sumažėjimas buvo reikšmingas tik 24-h, 48-h ir 72-h po gydymo MeJA (4 pav.).

Šis straipsnis ištrauktas iš Planta (2021) 254:89 https://doi.org/10.1007/s00425-021-03735-9