Gomisin N slopina melanogenezę reguliuodamas PI3K / Akt ir MAPK / ERK signalizacijos kelius melanocituose

Kontaktas:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Santrauka: Gomisinas NĮvairių tyrimų metu buvo įrodyta, kad vienas iš Schisandra Chinensis randamų lignano junginių turi antioksidacinį, priešnavikinį ir priešuždegiminį poveikį. Pirmą kartą pranešame apie Gomisin N antimelanogeninį veiksmingumą žinduoliams. ląstelėse, taip pat zebrafish embrionuose. Gomisin N žymiai sumažino melanino kiekį be toksiškumo ląstelėms. Nors jis negalėjo moduliuoti grybų katalizinio aktyvumotirozinazėin vitro,Gomisinas Nsumažino pagrindinių baltymų, kurie veikia, ekspresijos lygiusmelanogenezė. Gomisin N sumažino melanokortino 1 receptorių (MC1R), adenililciklazės 2, su mikroftalmija susijusio transkripcijos faktoriaus (MITF), tirozinazės,tirozinazėsu tirozinaze susijęs baltymas-1(TRP-1) ir su tirozinaze susijęs baltymas-2 (TRP-2). Be to, Gomisin N apdorotose Melan-A ląstelėse buvo padidėjęs p-Akt ir p-ERK lygis, o tai reiškia, kad PI3K/Akt ir MAPK/ERK kelių aktyvinimas gali slopinti.melanogenezė. Taip pat patvirtinome, kad „Gomisin“ sumažino melanino gamybą slopindamas MITF ekspresiją,tirozinazė, TRP-1 ir TRP-2pelės ir žmogaus ląstelėse bei besivystančiose zebrafijos embrionuose. Bendrai darome išvadąGomisinas Nslopina melanino sintezę slopindamas MITF ir melanogeninių fermentų ekspresiją, tikriausiai moduliuodamas PI3K/Akt ir MAPK/ERK kelius.

Raktiniai žodžiai:Schisandra Chinensis;Gomisinas N; lignano;melanogenezė; odos balinimas

cistanche turi odos balinimo funkciją

1. Įvadas

Melaninas yra pigmentas, randamas daugumoje gyvūnų organų, įskaitant odą, plaukus, akis, vidinę ausį, kaulus, širdį ir smegenis [1,2].Melanogenezėyra sudėtingas procesas, kuriame dalyvauja keli signalizacijos keliai. Melanokortino 1 receptorius (MC1R) yra pagrindinis reguliatoriusmelanogenezė, signalizuoja per savo ligandus, tokius kaip melanocitus stimuliuojantis hormonas (MSH) ir adrenokortikotropinis hormonas (AKTH) [3]. Odos melaniną biosintetina epidermio melanocitai, o po to perkeliamas į keratinocitus, kur jie vaidina svarbų vaidmenį odos apsaugai sugerdami saulės spindulių UV spinduliuotę ir sulaikydami reaktyvius laisvuosius radikalus [4,5]. Melanino sintezę ir pernešimą odoje bei plaukų folikuluose reguliuoja jo pirmtakų prieinamumas [6]. L-tirozinas ir L-dihidroksifenilalaninas (L-DOPA), pagrindiniai melanogeninių fermentų substratai, taip pat veikia kaip į hormonus panašūs reguliatoriai melanogenezėje [7]. Kita vertus, dėl melanino perprodukcijos atsiranda nepageidaujamų odos problemų, tokių kaip strazdanos ir melasma [8,9]. Melanogenezė gali paveikti normalių ir piktybinių melanocitų elgesį, moduliuodama ląstelių elastines savybes [10]. Nors serotonino ir melatonino receptoriai, išreikšti odos ląstelėse, atlieka pagrindinį vaidmenį palaikant ląstelių homeostazę, per didelė melanino gamyba dėl nekontroliuojamų hormoninių pokyčių gali sukelti patologines odos sąlygas [11].

Taigi buvo daug pastangų siekiant išsiaiškinti molekulinius mechanizmus, kurie kontroliuoja melanogenezę kaip pagrindinį žingsnį gydant hiperpigmentinius odos sutrikimus. Be to, įvairių tipųodos balinimasagentai, slopinantys melanino sintezę, buvo nustatyti iš augalų ir ne augalinių ekstraktų ir komerciškai naudojami kosmetikos gaminiuose [12,13]. Plačiausiai naudojamos balinančios medžiagos yra hidrochinonas, mechinolis, arbutinas, kojo rūgštis, askorbo rūgštis ir retino rūgštis [12,14]. Tačiau yra įvairių jų naudojimo apribojimų gydant ūminius ar lėtinius žmonių hiperpigmentacijos simptomus. Pavyzdžiui, hidrochinonas, nors ir ilgą laiką buvo naudojamas depigmentacijai nuo septintojo dešimtmečio, gali sukelti odos dirginimą ir kontaktinį dermatitą [15,16]. Tai taip pat sukelia DNR pažeidimą, nes padidina reaktyviųjų deguonies rūšių gamybą ir žinduolių ląstelėse išsivysto egzogeninė ochronozė [17, 18]. Kiti gerai žinomitirozinazėinhibitoriai, tokie kaip Kojic rūgštis ir askorbo rūgštis, ne tik blogai prasiskverbia į odą, stabilizuojasi ir balina, bet ir gali sukelti citotoksiškumą, dermatitą ir eritemą dėl ilgalaikio vartojimo [19, 20]. Šiuo atžvilgiu didėja poreikis sukurti saugesnes ir veiksmingesnes balinimo priemones, skirtas žmogaus odos hiperpigmentacijai gydyti. Natūralios žolelės, naudojamos tradicinėje medicinoje, gali būti alternatyvūs šaltiniai nustatant naujus balinimo agentus, kurie kontroliuoja pagrindinius veiksmusmelanogenezėturintis mažiau šalutinių poveikių arba jo neturintis [21].

Schisandra chinensis, taip pat žinomas kaip šiaurinės puikaus skonio uogos, natūraliai randamas šiaurės rytų Kinijoje, tolimųjų rytų Rusijoje, Japonijoje ir Korėjoje [22]. Šis augalas tradicinėje rytų medicinoje jau seniai naudojamas naktiniam aklumui, odos nudegimui, aseptiniam uždegimui ir kepenų ligoms gydyti [23,24]. Nustatyta, kad S. chinensis vaisių ekstraktas ir jo lignano junginiai turi įvairių farmakologinių poveikių pelių ląstelių linijose. Pavyzdžiui, Schisandra A ir C turi antioksidacinį poveikį, o Schisandra B turi antifibrozinį, priešuždegiminį, antioksidacinį ir antiapoptotinį poveikį [25]. Kitas lignano junginysGomisinas NBuvo pranešta, kad (1A pav.) slopina oksidacinio streso sukeltą apoptozę, slopindamas citochromo C išsiskyrimą iš mitochondrijų į citoplazmą, kaspazės 3 ir PARP skilimą bei Ca2 plius sukeltą mitochondrijų pralaidumo perėjimą H9c2 žiurkės kardiomiocituose [7, 8]. Įdomu tai, kad keli tyrimai, naudojant pelių modelius ir žmogaus odos ląstelių linijas, atskleidė terapinį S. chinensis potencialą gydant odos sutrikimus. Lee et al. pranešė, kad S. chinensis vaisių metanolinis ekstraktas sumažino kontaktinio dermatito simptomus, sumažindamas uždegimą skatinančių citokinų, tokių kaip TNF ir IFN, gamybą, kai buvo vartojamas lokaliai [8, 24]. Kang ir kt. parodė, kad Schisandra Fructus vandens ekstraktas slopina IκB aktyvaciją, taip slopindamas TNF-, IL-6 ir GM-CSF gamybą žmogaus putliųjų ląstelių linijoje HMC-1 [26]. Šie atradimai leido daryti prielaidą kad S. chinensis lignans gali paveikti odos ląstelių funkcijas plačiau. Šiame tyrime siekėme ištirti numanomusGomisinas N, vienas iš pagrindinių S. Chinensis lignano junginių, reguliuojantmelanogenezė, tokiu būdu įvertinant jo galimą naudojimą kaip kosmeceutinį agentą. Čia mes tai pranešameGomisinas Nslopina melanino biosintezę be toksiškumo ląstelėms žmogaus ir pelių ląstelėse, taip pat zebrafijos embrionuose.

2. Rezultatai

2.1. Gomisin N poveikis melanino susidarymui ir ląstelių gyvybingumui

Norėdami patikrinti Gomisin N poveikįmelanogenezė, apdorojome skirtingų koncentracijų pelių melanocitusGomisinas N72 valandas, o po to įvertino melanino kiekio pokyčius. Gydymas gomisinu sumažino melanino kiekį tiek normalioje melanocitų ląstelių linijoje Melan-A, tiek B16F10 melanomos ląstelėse, priklausomai nuo dozės, be toksiškumo ląstelėms (1B, C pav.). Pastebėjome, kad Gomisin N slopino -MSH sukeltą melanino gamybą B16F10 ląstelėse, o tai buvo palyginama su rezultatais, gautais gydant PTU [27] (1C pav.). Įvertinti, ar sumažėja melanino kiekisGomisinas Ngydymas atsirado dėl sumažėjusio tirozinazės aktyvumo, atlikome L-DOPA dažymo tyrimą normaliose žmogaus epidermio melanocitų (NHEM) ląstelėse. Kaip parodyta 1E paveiksle, NHEM ląstelėse, apdorotose Gomisin N, buvo sumažėjęs L-DOPA lygis, palyginti su neapdorotomis ląstelėmis. Tačiau slopinantis Gomisin N poveikis melanino gamybai nebuvo reikšmingas žmogaus melanomos MNT-1 ląstelėse (1D pav.) .

2.2. Gomisin N poveikis tirozinazės aktyvumui

Norėdami ištirti, arGomisinas Nslopinatirozinazėaktyvumui in vitro, naudojome grybų tirozinazę ir B16 melanomos ląstelių lizatus. Kojic rūgštis, gerai žinomas tirozinazės inhibitorius, buvo naudojama kaip teigiama kontrolė. Gydant grybų tirozinaze, o kojic rūgštis žymiai sumažino fermentinį aktyvumą, gomisinas N nesukėlė jokių L-DOPA virtimo dopachromu pokyčių (2A pav.). Tačiau, gydant B16 melanomos ląstelėmis, gomisinas N sumažino jo fermentinį aktyvumą. intirozinazėląstelių lizato aktyvumas priklausomai nuo dozės (2B pav.). Be to, kai kartu apdorojama -MSH inB16 ląstelėse,Gomisinas Npanaikino dopachromo susidarymo padidėjimą, skatinamą -MSH (3C pav.). Pažymėtina, kad gomisinas N buvo veiksmingesnis už kojic rūgštį slopindamas ląsteles.tirozinazės aktyvumasB16 ląstelių po -MSH dirgiklio. Šie radiniai rodo, kad pelės ir žmogaus ląstelėse pastebėtas GomisinN slopinamasis poveikis melanino gamybai (1 pav.) nėra susijęs su jo funkcija tiesiogiai slopinti tirozinazės katalizinį aktyvumą. Tačiau vis dar įmanoma, kad Gomisin N reguliuoja tirozinazės ar kitų baltymų, vaidinančių pagrindinį vaidmenį, ekspresiją.melanogenezė.

2.3. Gomisin N poveikis MC1R signalizacijos kelio inaktyvavimui

Mes siekėme išsiaiškinti pagrindinį mechanizmą, atsakingą už slopinamąjį GomisinN poveikį melanino gamybai. Mes tai samprotavomeGomisinas Ngali reguliuoti signalinius baltymus, kurie dalyvaujamelanogenezėir taip slopina melanino sintezę. Melanokortino 1 receptorius (MC1R) yra amelanocitinis G baltymo receptorius, kuris veikia kaip pagrindinis melanino sintezės reguliatorius. MC1R aktyvinimas jo ligandu -MSH arba adrenokortikotropiniu hormonu (AKTH) padidina adenililciklazės kiekį, o tai savo ruožtu padidina cAMP koncentraciją ląstelėse [2, 3]. Vadinasi, MITF transkripcijos lygis padidėja per baltymų kinazės-C (PKA) / reaguojančio elementą surišančio baltymo (CREB) kelią [2, 28]. Norėdami įvertinti Gomisin N reguliuojamąjį poveikį MC1R signalizacijos keliui, patikrinome MC1R ir jo pasroviui signalizuojančių molekulių ekspresijos lygius po Melan-A ląstelių apdorojimo Gomisin N. Pastebėjome, kad Gomisin N žymiai sumažino tiek MC1R, tiek adenililciklazės 2 baltymų kiekį. priklausomai nuo dozės (3A–C pav.). Kaip ir tikėtasi,Gomisinas N- apdorotose ląstelėse taip pat sumažėjo MITF ir žinomų jo taikinių tirozinazės, TRP-1 ir TRP-2 baltymų kiekis (3A pav., D–G). Šie radiniai rodo, kad Gomisin N slopina melaniną gaminančius fermentus, inaktyvuodamas MITF per MC1R signalizacijos kelią.

2.4. Gomisin N poveikis Akt ir ERK1/2 fosforilinimui Melan-A ląstelėse

Yra žinoma, kad PI3K / Akt ir MAPK / ERK keliai dalyvauja melanogenezėje pagal transkripciją arba po transkripcijos reguliuojantį MITF [29, 30]. Norėdami įvertinti, ar GomisinN veikia šiuos signalizacijos kelius, mes įvertinome Akt ir ERK1/2 fosforilinimo būseną Western blot analize. Kaip parodyta 3H–J paveiksle, gydymas didelėmis dozėmis (30 µM).Gomisinas Nžymiai padidino Akt ir ERK fosforilinimą. Šie duomenys rodo, kad slopinantis Gomisin N poveikismelanogenezėgreičiausiai yra susijęs su P13K/Akt ir MAPK/ERK keliais.

2.5. Gomisin N slopino melanogenezę zebrafish embrionuose

Toliau siekėme ištirti, ar Gomisin N veiksmingai slopinamelanogenezėin vivo. Šiuo tikslu zebrafish embrionus apdorojome Gomisin N 72 valandas 1, 10, 20 ir 30 µM koncentracijomis, tada išmatavome melanogeninių baltymų ekspresijos lygius. Pastebėjome, kad gydymas Gomisin N slopino melanino susidarymą besivystančiose zebrafijos embrionuose.Gomisinas N- apdorotų embrionų melanino kiekis sumažėjo priklausomai nuo koncentracijos, palyginti su negydytu kontroliniu (4 pav.). Taip pat nustatėme, kad baltymų kiekistirozinazė, MITF, TRP-1 ir TRP-2 sumažėjo gydant Gomisin N (5 pav.). Šie rezultatai rodo, kad Gomisin N slopina melanogenezę in vivo reguliuodamas transkripcijos faktorių MITF ir jo taikiniustirozinazė, TRP-1 ir TRP-2.

2.6. Gomisin N pakeitė rapamicino sukeltą melanogenezę žmogaus MNT-1

Nors Gomisin N reikšmingai slopinomelanogenezėMelan-A ir B16 ląstelėse, taip pat inzebrafish embrionuose, nepastebėjome jo poveikio žmogaus MNT-1 melanomos ląstelėms. Tikėjomės, kad Gomisin N poveikis gali būti aptinkamas MNT-1 ląstelėse, kai melanogenezę reguliuoja atitinkamas stimulas. Įrodyta, kad rapamicinas skatina melanogenezę padidindamas tirozinazės aktyvumą ir MITF, tirozinazės, TRP-1 ir TRP-2 [31] baltymų kiekį, iš dalies aktyvindamas autofagiją [32]. Stebėjome lygiustirozinazė, MITF, TRP-1 ir TRP-2 MNT-1 ląstelėse pagal Western blot analizę, po bendro gydymo Gomisin N andrapamicinu. Gydymas rapamicinu reikšmingai sukėlė MITF, TRP-1 ir TRP-2 lygius, bet neturėjo jokio poveikiotirozinazėlygiai (6 pav.). Tačiau gydymas Gomisin N reikšmingai pakeitė rapamicino poveikį MITF, TRP-1 ir TRP-2 priklausomai nuo koncentracijos. Atvirkštinis poveikisGomisinas Nprieš rapamiciną buvo perspektyvesnis esant 20 ir 30 µM koncentracijai nei 10 µM. Šie rezultatai rodo, kad gomisin N slopinamelanogenezėžmogaus MNT-1 melanomos ląstelėse, reguliuojant transkripcijos faktorių MITF ir jo taikinius TRP-1 ir TRP-2.

3. Diskusija

Pagrindinė melanino funkcija yra apsaugoti odos ląsteles nuo UV spindulių [33–35]. Hiperpigmentacija, dėl melanino pertekliaus odoje, sukelia nepageidaujamų kosmetinių rūpesčių ir yra susijusi su dermatitu bei odos vėžiu. Keli pranešimai siūlėmelanogenezėkaip svarbus metastazavusios melanomos gydymo taikinys [36,37]. Taigi, didėja poreikis sukurti anti-melanogeninius agentus, reguliuojančius melanogenezę be toksiškumo ląstelėms [38]. Yra keletas odos melanogenezės būdų [39, 40]. Sujungus ligandą, MC1R sustiprina adenililciklazės aktyvumą, o tai vėliau padidina cAMP koncentraciją ląstelėse [41,42]. Plačiai pranešta, kad nuo cAMP priklausomas PKA / CREB kelio aktyvavimas padidina MITF transkripcijos lygį ir taip sustiprina melanino sintezę [43]. MITF veikia kaip pagrindinis trijų pagrindinių melanogeninių fermentų tirozinazės, TRP-1 ir TRP-2, reguliatorius stuburiniams gyvūnams [3, 21, 44]. Šie fermentai yra transmembraniniai baltymai, esantys melanocitų melanosominėje membranoje. Tirozinazė reguliuoja greičio ribojimo žingsnįmelanogenezėpaverčiant L-tirozinazę į L-DOPA [23]. TRP-1 ir TRP-2 taip pat atlieka svarbų vaidmenį melanino sintezėje, nors jų funkcijos nėra visiškai suprantamos.

Šiame tyrime Gomisin N, S. chinensis lignano junginys, parodė depigmentacinį aktyvumą be toksiškumo ląstelėms. Gomisin N slopino melanino sintezę kultivuotų žinduolių ląstelių linijose, taip pat zebrafijos embrionuose. Atrodė, kad Gomisin N buvo veiksmingesnis už teigiamą kontrolinį PTU, slopinantį melanino gamybą Melan-A ląstelėse (1B pav.). Gomisin N sumažino melanino kiekį priklausomai nuo koncentracijos. Palyginti su negydyta kontroline grupe, 10 µM išGomisinas Nsumažino melanino kiekį maždaug 40 procentų, be toksiškumo ląstelėms. Anti-melanogeninis 10-µM Gomisin N aktyvumas buvo panašus į 100-µM PTU Melan-A ląstelėse. Panašiai Gomisinas pasirodė esąs stipresnis už PTU -MSH aktyvuotose B16F10 ląstelėse, kur 5- ir10-µM Gomisin N poveikis buvo panašus į 10- ir {{12 }}µM PTU atitinkamai (1C pav.). NHEM ląstelėse, apdorotose Gomisin N, sumažėjo L-DOPA kiekis, o tai rodo, kad GomisinN slopinatirozinazėaktyvumas kultivuojamose ląstelėse (1E pav.). Šie atradimai paskatino mus toliau tirti pagrindinį mechanizmą, kuriuo Gomisin N slopina melanogenezę.

Ištyrėme, arGomisinas Ntiesiogiai moduliuoja katalizinį aktyvumątirozinazėin vitro. Skirtingai nei Kojic rūgštis, Gomisin N neturėjo slopinančio poveikio grybų tirozinazės aktyvumui (2A pav.). Tačiau ląstelių tirozinazės aktyvumas B16 melanomos ląstelių lizatuose buvo žymiai sumažintas Gomisin N tiek gydant MSH, tiek be jo (2B, C pav.). Nustatyta, kad Gomisin N ląstelių tirozinazės aktyvumo slopinimas veikiant -MSH stimului yra reikšmingesnis nei teigiamos kontrolės Kojic rūgšties (2C pav.).

Teigėme, kad anti-melanogeninė Gomisin N funkcija gali atsirasti dėl tirozinazės ir su tirozinaze susijusių baltymų (TRP) transkripcijos arba po transkripcijos reguliavimo. Norėdami tai patvirtinti, išmatavome signalinių molekulių ekspresijos lygius MC1R kelyje, kuris yra pagrindinis tirozinazės veiksnys. melanino gamybos melanocituose kiekis ir kokybė. Tikimasi, kad mes pastebėjome, kad Gomisin N sumažino MC1R ir adenililciklazių 2 kiekį Melan-A ląstelėse (3A–C pav.). Be to,Gomisinas Nsumažino MITF ir jo tikslinių baltymų, įskaitant tirozinazę, TRP-1 ir TRP-2, ekspresiją (3A, D–G pav.). Šie rezultatai rodo, kad sumažėjęs melanino kiekis po gydymo Gomisin N atsiranda dėl MC1R kelio deaktyvavimo.

Kita vertus, PI3K / Akt ir MAPK / ERK keliai gali fosforilinti MITF ir taip po transkripcijos moduliuoti jo aktyvumą [45]. Tačiau bendras PI3K/Akt ir MAPK/ERK kelių aktyvinimo poveikismelanogenezėyra prieštaringas. Tiek PI3K / Akt, tiek MAPK / ERK keliai yra iš esmės aktyvuojami žmogaus melanomose dėl susikaupusių mutacijų [46]. Yra žinoma, kad C 2- keramido sukelta depigmentacija Mel-Ab ląstelėse atsiranda dėl p-Akt lygio sumažėjimo [47]. Yra keletas natūralių junginių, kurie aktyvina melanogenezę padidindami p-ERK lygį B16 melanomos ląstelėse [28]. Priešingai, taip pat yra įrodymų, kad padidėjęs p-ERK ir p-Akt kiekis slopina melanino sintezę [28, 48]. Melanogenezės sudėtingumo reguliavimą iš dalies galima paaiškinti tuo, kad fosforilinimas sustiprina MITF transkripcijos aktyvumą, bet tuo pačiu sukelia nuo visur esančios proteosomos priklausomą MITF skaidymą [26, 49–51]. Mūsų duomenys parodė, kad tiek p-Akt, tiek p-ERK lygiai buvo sureguliuoti Gomisin N apdorotose Melan-A ląstelėse (3H – J pav.). Tai reiškia, kad PI3K / Akt ir MAPK / ERK keliai gali prisidėti prie melanino gamybos slopinimo.

Mes taip pat patvirtinome anti-melanogeninį Gomisin N aktyvumą zebrafish in vivo modelyje. Gomisin N apdorotų zebrafinių embrionų melanino pigmentacija reikšmingai sumažėjo (4 pav.). Be to, Gomisin N žymiai sumažinotirozinazė, MITF, TRP-1 ir TRP-2 zebrafinių embrionų vystymuisi. Šios išvados kartu rodo, kadGomisinas Nindukuoja depigmentaciją, sumažindamas MITF ir melanogeninių fermentų ekspresiją in vivo. Anti-melanogeninis Gomisin N aktyvumas buvo toliau patvirtintas žmogaus melanomos MNT-1 ląstelėse, kurias stimuliuoja rapamicinas. Nors Gomisin N sukėlė tik nedidelius melanino kiekio pokyčius MNT-1 ląstelėse (1D pav.), jis veiksmingai panaikino rapamicino sukeltą MITF, TRP-1 ir TRP-2 reguliavimą. priklausomai nuo koncentracijos (6A, C–E pav.). Kartu paėmus reguliavimo poveikįGomisinas Nant MITF ir melanogeninių fermentų buvo atkuriamas pelių ir žmogaus ląstelėse, taip pat zebrafish embrionuose.

Apibendrinant, šis darbas rodo, kad „Gomisin N“ gali turėti didelį romano potencialąodos balinimasagentas. Atrodo, kad gomisin N slopinamelanogenezėslopinant MITF ekspresiją per MC1R kelią, o ne tiesiogiai moduliuojant katalizinį aktyvumątirozinazėirTRP. Nors detalūs mechanizmai dar turi būti išaiškinti, Gomisin N sukelta depigmentacija greičiausiai bus susijusi su PI3K/Akt ir MAPK/ERK takų aktyvavimu (7 pav.).

4. Medžiagos ir metodai

4.1. Medžiagos

RPMI1640 buvo įsigytas iš Gibco-BRL (Gaithersburg, MD, JAV). Dulbecco modifikuota Eagle terpė (DMEM), vaisiaus galvijų serumas (FBS) ir penicilinas-streptomicinas (PS) buvo įsigyti iš Hyclone (Carlsbad, CA, JAV). Melanocitų auginimo terpė buvo įsigyta iš PromoCell (Heidelbergas, Vokietija). Fenilmetilsulfonilfluoridas (PMSF), 12-O-tetradekanoilforbolo-13-acetatas (TPA), kojo rūgštis, 1-fenil-2-tiokarbamidas (PTU), grybų tirozinazė, 3,{{ 9}}dihidroksi-l-fenilalaninas (L-DOPA), -MSH, dimetilsulfoksidas (DMSO) ir paraformaldehidas buvo įsigyti iš SigmaChemical Co. (St. Louis, MO, JAV).Gomisinas Njunginį pateikė Chul Young Kim (Hanyang universitetas, Ansanas, Korėja). Rapamicinas buvo pirktas iš Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, JAV).

4.2. Ląstelių kultūros

Pelės melanomos ląstelių linija B16F10 buvo pateikta iš Korean Cell Line Bank (Seulas, Korėja). Pelės melanocitų Melan-A ląstelės [52] buvo dosni daktaro Byeong Gon Lee (SkinResearch Institute, Amore Pacific Co., Yongin) dovana. -si, Korėja). Žmogaus MNT-1 melanomos ląsteles dosniai aprūpino Aeyeong Lee (Dongguko universiteto medicinos koliažas, Goyang-si, Korėja). Pirminiai normalūs žmogaus epidermio melanocitai (NHEM) buvo įsigyti iš PromoCell (Heidelbergas, Vokietija). Melan-A ląstelės buvo auginamos RPMI 1640 terpėje (Gibco, Carlsbad, CA, JAV), papildytos 10% FBS, 1% PS ir 200 nM TPA. Melan-A ir NHEM ląstelėms palaikyti buvo naudojamas DMEM, papildytas 10 procentų FBS ir 1 procentu PS. Visos ląstelės buvo inkubuojamos 37 ◦C temperatūroje 5 procentų CO2 inkubatoriuje.

4.3. Melanino kiekio matavimas

Melan-A ląstelės buvo pasėtos į 24-šulinėlių plokštelę (1 × 105 ląstelės šulinėlyje), apdorotosGomisinas N, o po to inkubuojamas 72 val. Po 72 valandų buvo išmatuotas melanino kiekis, kaip aprašyta anksčiau [53]. Trumpai tariant, pašalinus auginimo terpę, ląstelės tris kartus plaunamos PBS. Po to į kiekvieną šulinėlį įpilama natrio hidroksido tirpalo (1 ml, 1 N), kad ištirptų melaninas. Sugertis ties 405 nm buvo išmatuota naudojant mikroplokštelių skaitytuvą. Šis tyrimas buvo pakartotas naudojant B16F10 ląsteles (2 × 104 ląstelės / duobutėje) ir MNT{10}} ląsteles taikant tą patį metodą.

4.4. Western blot analizė

Melan-A ląstelės buvo pasėtos į 100 mm lėkštes (1 × 106 ląstelės / lėkštelėje) ir apdorotos 1, 5 arba 10 µMGomisinas Ntris dienas 37 ◦C temperatūroje. Ląstelės buvo plaunamos PBS ir surenkamos naudojant grandiklį. Atskirtos ląstelės buvo dedamos į 1 ml PBS ir centrifuguojamos 75 00 aps./min. greičiu 5 min. Pašalinus viršutinį tirpalą, ląstelių granulės buvo lizuojamos lizės buferiu (50 mM Tris-HCl, pH 8.{15}}, 0,1 proc. SDS, 150 mM NaCl, 1 proc. NP-40, 0,02 procento natrio azido, 0,5 procento natrio deoksicholato, 100 µg/mL PMSF, 1 g/mL aprotinino) 24 valandas 4 °C temperatūroje. Bendri baltymai buvo ekstrahuojami ultracentrifuga esant 12, 000 aps./min. 30 min., esant 4 ◦C. Baltymų kiekis buvo matuojamas naudojant Bradfordo testą. Baltymai (30 µg) buvo atskirti naudojant 10 procentų natrio dodecilsulfato-poliakrilamido gelio elektroforezės (SDS-PAGE) gelį ir perkelti į anitroceliuliozės membraną. Membrana 1 valandą buvo užblokuota 5 procentų nugriebto pieno tirpalu Tris-buferiniame fiziologiniame tirpale su Tween-20 (TBST), o po to 12 valandų inkubuojama 4 ◦C temperatūroje su pirminiais antikūnais, nukreiptais į tubuliną (Santa Cruz, CA, JAV). ), MITF (ląstelių signalizacija, Danvers, MA, JAV), tirozinazė (ląstelių signalizacija), ERK (ląstelių signalizacija), fosfo-ERK (ląstelių signalizacija), AKT (ląstelių signalizacija), fosfo-AKT (ląstelių signalizacija), MC1R ( Santa Cruz), adenililo ciklazės 2 (Santa Cruz), TRP-1 (Santa Cruz) ir TRP-2 (Santa Cruz). Pašalinus pirminius antikūnus, membranos tris kartus plaunamos TBST ir inkubuojamos su antrine. antikūnų (triušio anti-ožkų IgG-HRP; pelės anti-triušio HRP, Santa Cruz) 1 val. Membranos buvo apdorotos sustiprintu chemiliuminescenciniu reagentu, naudojant ChemiDoc XRS plus vaizdo gavimo sistemą (Bio-Rad, Hercules, CA, JAV). Densitometrinė juostų analizė buvo atlikta naudojant Image MasterTM 2D Elite programinę įrangą (3.1 versija, GE Healthcare, Chicago, IL, JAV).

4.5. Tirozinazės aktyvumo tyrimas

Įvertinti Gomisin N slopinamąjį poveikį grybamstirozinazėaktyvumas, tirozinazė buvo inkubuojama su 1, 5 arba 10 µMGomisinas Narba teigiama kontrolė Kojic rūgštis. Kiekvienas mėginys buvo ištirpintas metanolyje. L-DOPA (8,3 mM) ir grybų tirozinazė (125 V) buvo praskiesti 80 mM fosfatiniu buferiu (pH 6,8). 40 µL kiekvieno mėginio ir 120 µL L-DOPA buvo sumaišyti 96-šulinėlių plokštelėje, po to pridėta 40 µL praskiestos grybų tirozinazės. Tada plokštelės buvo inkubuojamos 15 minučių, o absorbcija buvo išmatuota esant 490 nm, naudojant mikroplokštelių skaitytuvą.

Tirozinazėaktyvumas B16 melanomos ląstelių lizatuose buvo išmatuotas gydant -MSH arba be jo, kaip anksčiau aprašė Ohguchi ir kt. [54], su nedideliais pakeitimais. Ląstelių lizatas buvo paruoštas, kaip aprašyta aukščiau Western Blot analizės dalyje. Bendras baltymų kiekis supernatante buvo išmatuotas Bradfordo tyrimu, naudojant galvijų serumo albuminą kaip standartą [55]. Toks pat baltymų kiekis buvo atskiestas ir naudojamas tirozinazės aktyvumo tyrimui.

slopina tirozinazės aktyvumą

4.6. L-DOPA dažymas NHEM ląstelėse

NHEM ląstelės buvo pasėtos į {{0}}šulinėlių plokštelę ir 72 valandas inkubuojamos su Gomisin N. Ląstelės buvo fiksuojamos 4% paraformaldehidu 40 min., po to apdorotos 0,1% Triton X{ {6}} 2 min. Į kiekvieną duobutę buvo pridėta L-DOPA (0,1 proc.), po to inkubuojama 2 valandas. Pašalinus tirpalą, ląstelės du kartus plaunamos PBS. Vaizdai fotografuoti mikroskopu.

4.7. Zebrafish eksperimentai

Zebrafish embrionai buvo gauti iš Zebrafish Resource Bank (Daegu, Korėja). Embrionai buvo gydomi Gomisin N 72 valandas. Depigmentuojantis poveikisGomisinas Nzebrafish embrionai buvo stebimi stereomikroskopu. Western blot analizei Gomisin N apdoroti embrionai buvo lizuojami naudojant lizės buferį, iš kurio buvo paruošti visi baltymai, kaip minėta aukščiau.

5. Išvados

Mūsų rezultatai patvirtina nuomonę, kad Gomisin N turi didelį potencialą naudoti kaip funkcinį maistą irodos balinimasagentas.Gomisinas Nyra vienas iš pagrindinių S. Chinensis lignano junginių. Tiesą sakant, S. Chinensis yra augalinis vaistas, naudojamas daugelio žmonių ligų gydymui. Tačiau norint įrodyti Gomisin N saugumą ant odos, reikia atlikti papildomus epidemiologinius tyrimus. Todėl in vivo tyrimai ir klinikiniai tyrimai galės aiškiau parodyti GomisinN veiksmingumą. Apibendrinant, šis tyrimas rodo, kadGomisinas Ngali būti potencialus hipopigmentinis agentas ir natūralusodos balinimaskandidatas į kosmetikos pramonę.

cistanche pagerina balinimą

Nuorodos

1. Alalufas, S.; Atkinsas, D.; Baretas, K.; Blountas, M.; Carteris, N.; Heath, A. Epidermio melanino įtaka objektyviems žmogaus odos spalvos matavimams. Pigment Cell Res. 2002, 15, 119–126. [CrossRef] [PubMed]

2. D'Mello, SA; Finlay, GJ; Baguley, BC; Askarian-Amiri, ME signalizacijos keliai melanogenezėje. Tarpt. J. Mol. Sci. 2016, 17, 1144. [CrossRef] [PubMed]

3. Slominskis, A.; Tobinas, didžėjus; Šibahara, S.; Wortsman, J. Melanino pigmentacija žinduolių odoje ir jos hormoninis reguliavimas. Physiol. Rev. 2004, 84, 1155–1228. [CrossRef] [PubMed]

4. Herrling, T.; Jungas, K.; Fuchs, J. Melanino, kaip apsaugos nuo laisvųjų radikalų odoje, vaidmuo ir jo, kaip laisvųjų radikalų rodiklio plaukuose, vaidmuo. Spectrochim Acta A Mol. Biomol. Spectrosc. 2008, 69, 1429–1435. [CrossRef] [PubMed]

5. Brozyna, AA; Jozwickis, W.; Roszkovskis, K.; Filipiak, J.; Slominski, AT Melanino kiekis melanomametastazėse turi įtakos radioterapijos rezultatams. Oncotarget 2016, 7, 17844–17853. [CrossRef] [PubMed]

6. Slominskis, A.; Wortsman, J.; Plonka, PM; Schallreuter, KU; Pausas, R.; Tobin, DJ Plaukų folikulų pigmentacija.J. Ištirti. Dermatolis. 2005, 124, 13–21. [CrossRef] [PubMed]

7. Slominskis, A.; Zmijevskis, MA; Pawelek, J. L-tirozinas ir L-dihidroksifenilalaninas kaip į hormonus panašūs melanocitų funkcijų reguliatoriai. Pigment Cell Melanoma Res. 2012, 25, 14–27. [CrossRef] [PubMed]

8. Lee, AY Naujausia melazmos patogenezės pažanga. Pigment Cell Melanoma Res. 2015, 28, 648–660. [CrossRef][PubMed]9. Speeckaert, R.; van Gele, M.; Speeckaert, MM; Lambertas, J.; van Geel, N. Hiperpigmentacijos sindromų biologija. Pigment Cell Melanoma Res. 2014, 27, 512–524. [CrossRef] [PubMed]

10. Slominskis, RM; Zmijevskis, MA; Slominski, AT Melanino pigmento vaidmuo melanomoje. Exp. Dermatol.2015, 24, 258–259. [CrossRef] [PubMed]11. Slominskis, A.; Wortsman, J.; Tobin, DJ Odos serotoninerginė / melatoninerginė sistema: vietos po saule apsauga. FASEB J. 2005, 19, 176–194. [CrossRef] [PubMed]

12. Šarkaras, R.; Arora, P.; Garg, KV Cosmeceuticals, skirtas hiperpigmentacijai: kas yra prieinama? J. Odos estetika. Surg. 2013, 6, 4–11. [CrossRef] [PubMed]

13. Mijamura, Y.; Coelho, SG; Volberis, R.; Milleris, SA; Wakamatsu, K.; Zmudzka, BZ; Ito, S.; Smuda, C.;Passeron, T.; Choi, W.; ir kt. Žmogaus odos pigmentacijos ir atsako į ultravioletinę spinduliuotę reguliavimas. Pigment Cell Res. 2007, 20, 2–13. [CrossRef] [PubMed]

14. Davis, EK; Callender, VD Použdegiminė hiperpigmentacija: odos spalvos epidemiologijos, klinikinių ypatybių ir gydymo galimybių apžvalga. J. Clin. Estetas. Dermatolis. 2010, 3, 20–31. [PubMed]

15. Sales-Campos, H.; Souza, PR; Peghini, BC; da Silva, JS; Cardoso, CR Oleino rūgšties moduliuojamojo poveikio sveikatai ir ligoms apžvalga. Mini. Med. kun. Chem. 2013, 13, 201–210. [CrossRef] [PubMed]

16. Parvezas, S.; Kangas, M.; Chung, HS; Cho, C.; Honkongas, MC; Shin, MK; Bae, H. Odos depigmentavimo ir šviesinimo priemonių tyrimas ir mechanizmas. Fitoteris. Res. 2006, 20, 921–934. [CrossRef] [PubMed]

17. Luo, L.; Jiang, L.; Gengas, C.; Cao, J.; Zhong, L. Hidrochinono sukeltas genotoksiškumas ir oksidacinis DNR pažeidimas HepG2 ląstelėse. Chem. Biol. Bendrauti. 2008, 173, 1–8. [CrossRef] [PubMed]

18. Enguita, FJ; Leitao, AL Hidrochinonas: Aplinkos tarša, toksiškumas ir mikrobų atsakymai. BioMed Res. Tarpt. 2013, 2013, 542168. [CrossRef] [PubMed]

19. Draelos, ZD Odos šviesinimo preparatai ir ginčas dėl hidrochinono. Dermatolis. Ten. 2007, 20 308–313. [CrossRef] [PubMed]

20. Koo, JH; Lee, I.; Yun, SK; Kim, HU; Parkas, BH; Park, JW Muilintas nakvišų aliejus sumažina melanogenezę B16 melanomos ląstelėse ir sumažina UV sukeltą odos pigmentaciją žmonėms. Lipidai 2010, 45, 401–407. [CrossRef] [PubMed]

21. Cordell, GA; Colvard, MD Natūralūs produktai ir tradicinė medicina: paradigmos įjungimas. J. Nat. Prod.2012, 75, 514–525. [CrossRef] [PubMed]

22. Panosianas, A.; Wikman, G. Schisandra Chinensis Bail farmakologija: Rusijos tyrimų ir panaudojimo medicinoje apžvalga. J. Ethnopharmacol. 2008, 118, 183–212. [CrossRef] [PubMed]

23. Chen, P.; Pang, S.; Yang, N.; Meng, H.; Liu, J.; Džou, N.; Zhang, M.; Xu, Z.; Gao, W.; Chen, B.; ir kt. Teigiamas Schisandrin B poveikis širdies funkcijai pelių miokardo infarkto modelyje. PLoS ONE 2013, 8, e79418. [CrossRef] [PubMed]

24. Lee, HJ; Jo, S.; Ryu, J.; Jeong, HS; Lee, G.; Ryu, MH; Jungas, MH; Kim, H.; Kim, BJ SchisandraChinensis Turcz efektai. vaisiai nuo kontaktinio dermatito, kurį sukėlė dinitrofluorbenzenas pelėms. Mol. Med. Ataskaita 2015,12, 2135–2139. [CrossRef] [PubMed]

25. Chun, JN; Cho, M.; Taigi, aš; Jeon, JH Apsauginis Schisandra Chinensis vaisių ekstrakto ir jo lignanų poveikis nuo širdies ir kraujagyslių ligų: molekulinių mechanizmų apžvalga. Fitoterapija 2014, 97, 224–233.[CrossRef] [PubMed]

26. Kangas, OH; Chae, HS; Choi, JH; Choi, HJ; Parkas, PS; Cho, SH; Lee, GH; Taigi, HY; Choo, YK;Kweon, OH; ir kt. Schisandra Fructus vandens ekstrakto poveikis citokinų išsiskyrimui iš žmogaus putliųjų ląstelių linijos. J. Med. Maistas 2006, 9, 480–486. [CrossRef] [PubMed]

27. Poma, A.; Bianchini, S.; Miranda, M. L-tirozino sukeltų mikrobranduolių gamybos slopinimas feniltiokarbamidu žmogaus melanomos ląstelėse. Mutat. Res. 1999, 446, 143–148. [CrossRef]

28. Kimas, HJ; Kim, IS; Dongas, Y.; Lee, IS; Kim, JS; Kim, JS; Woo, JT; Cha, BY Melanogenezę sukeliantis cirsimaritino poveikis padidinant su mikroftalmija susijusį transkripcijos faktorių ir tirozinazės ekspresiją. Tarpt. J. Mol. Sci. 2015, 16, 8772–8788. [CrossRef] [PubMed]

29. Busca, R.; Abbe, P.; Mantoux, F.; Aberdamas, E.; Peyssonnaux, C.; Eychene, A.; Ortonne, JP; Ballotti, R. Ras skatina nuo cAMP priklausomą ekstraląstelinių signalų reguliuojamų kinazių (ERK) aktyvavimą melanocituose.EMBO J. 2000, 19, 2900–2910. [CrossRef] [PubMed]

30. Busca, R.; Ballotti, R. Ciklinis AMP pagrindinis pasiuntinys reguliuojant odos pigmentaciją. Pigment Cell Res.2000, 13, 60–69. [CrossRef] [PubMed]

31. Hah, YS; Cho, HY; Lim, TY; Parkas, DH; Kim, HM; Yoon, J.; Kimas, JG; Kim, CY; Yoon, TJ Rapamicino sukeliama melanogenezės indukcija žmogaus MNT-1 melanomos ląstelėse. Ann. Dermatolis. 2012, 24, 151–157. [CrossRef][PubMed]

32. Yun, WJ; Kim, EY; Parkas, JE; Jo, SY; Bang, SH; Chang, EJ; Chang, SE Su mikrotubuliais susijusi lengvoji baltymų grandinė 3 dalyvauja melanogenezėje, reguliuojant MITF ekspresiją melanocituose. Sci. Report.2016, 6, 19914. [CrossRef] [PubMed]

33. Spritz, RA; Klausa, VJ, Jr. Genetiniai pigmentacijos sutrikimai. Adv. Hum. Genet. 1994, 22, 1–45. [PubMed]

34. Kadekaro, AL; Chen, J.; Yang, J.; Chen, S.; Jamesonas, J.; Swing, VB; Čengas, T.; Kadakia, M.; Abdel-Malekas, Z. -melanocitus stimuliuojantis hormonas slopina oksidacinį stresą per ap53-tarpininkaujantį signalizacijos kelią žmogaus melanocituose. Mol. Cancer Res. 2012, 10, 778–786. [CrossRef] [PubMed]

35. Wasmeier, C.; Hume, AN; Bolasco, G.; Seabra, MC Melanosomos trumpai. J. Cell Sci. 2008, 121,3995–3999. [CrossRef] [PubMed]

37. Brozyna, AA; Jozwickis, W.; Carlson, JA; Slominski, AT Melanogenezė turi įtakos bendram ir be ligos išgyvenamumui pacientams, sergantiems III ir IV stadijų melanoma. Hum. Pathol. 2013, 44, 2071–2074. [CrossRef] [PubMed]

38. Slominskis, A.; Kimas, TK; Brozyna, AA; Janjetovičius, Z.; Bruksas, DL; Schwab, LP; Skobowiat, C.; Jozwicki, W.; Seagroves, TN. Melanogenezės vaidmuo reguliuojant melanomos elgesį: Melanogenezė skatina HIF-1 ekspresiją ir nuo HIF priklausomus kelius. Arch. Biochem. Biofizė. 2014, 563,79–93. [CrossRef] [PubMed]

38. Kimas, HJ; Lee, JH; Shin, MK; Hyun Leem, K.; Kim, YJ; Lee, MH Gastrodia elata ekstrakto melanogenezės slopinamasis poveikis HM3KO melanomos ląstelėse. J. Kosmetas. Sci. 2013, 64, 89–98. [PubMed]

39. Hemesath, TJ; Kaina, ER; Takemoto, C.; Badalianas, T.; Fisher, DE MAP kinazė susieja transkripcijos faktorių Mikroftalmija su c-Kit signalizacija melanocituose. Gamta 1998, 391, 298–301. [PubMed]

40. Kaina, ER; Dingas, HF; Badalianas, T.; Bhattacharya, S.; Takemoto, C.; Yao, TP; Hemesath, TJ; Fisher, DELineage specifinis signalizavimas melanocituose. C-kit stimuliacija pritraukia p300/CBP į mikroftalmiją.J. Biol. Chem. 1998, 273, 17983–17986. [CrossRef] [PubMed]

41. Bertolotto, C.; Abbe, P.; Hemesath, TJ; Bilė, K.; Fisher, DE; Ortonne, JP; Ballotti, R. Mikroftalmiageno produktas kaip signalo keitiklis cAMP sukeltame melanocitų diferenciacijoje. J. Cell Biol. 1998, 142 827–835. [CrossRef] [PubMed]

42. Pogenbergas, V.; Ogmundsdottir, MH; Bergsteinsdottir, K.; Schepsky, A.; Phung, B.; Deineko, V.; Milewski, M.;Steingrimsson, E.; Wilmanns, M. Ribota leucino užtrauktuko dimerizacija ir melanocitų pagrindinio reguliatoriaus MITF DNR atpažinimo specifiškumas. Genes Dev. 2012, 26, 2647–2658. [CrossRef] [PubMed]

43. Flaherty, KT; Hodis, FS; Fisher, DE Nuo genų iki vaistų: tikslinės melanomos strategijos. Nat. Vėžys, 2012 m., 12, 349–361. [CrossRef] [PubMed]

44. Lee, TH; SEO, JO; Baek, SH; Kim, SY Resveratrolio slopinamasis poveikis melanino sintezei ultravioletinių spindulių B sukeltai pigmentacijai jūrų kiaulytės odoje. Biomol. Ten. 2014, 22, 35–40. [CrossRef] [PubMed]

45. Su, TR; Linas, JJ; Tsai, CC; Huangas, TK; Yang, ZY; Wu, MO; Zheng, YQ; Su, CC; Wu, YJ Melanogenezės slopinimas galo rūgštimi: galimas PI3K/Akt, MEK/ERK ir Wnt/-kateninsignalizacijos takų dalyvavimas B16F10 ląstelėse. Tarpt. J. Mol. Sci. 2013, 14, 20443–20458. [CrossRef] [PubMed]

46. ​​Jadžima, I.; Kumasaka, MY; Thang, ND; Goto, Y.; Takeda, K.; Jamašita, O.; Iida, M.; Ohgami, N.; Tamura, H.; Kawamoto, Y.; ir kt. RAS/RAF/MEK/ERK ir PI3K/PTEN/AKT signalizacija piktybinės melanomos progresavimo ir terapijos metu. Dermatolis. Res. Praktika. 2012, 2012, 354191. [CrossRef] [PubMed]

47. Kimas, DS; Kimas, SY; Mėnulis, SJ; Chung, JH; Kimas, KH; Cho, KH; Park, KC Ceramidas slopina ląstelių dauginimąsi per AKT/PKB inaktyvavimą ir mažina melanino sintezę Mel-Ab ląstelėse. Pigment Cell Res. 2001, 14, 110–115. [CrossRef] [PubMed]

48. Kimas, JH; Baek, SH; Kimas, DH; Choi, TY; Yoon, TJ; Hwang, JS; Kimas, MR; Kwon, HJ; Lee, CHD, melanino sintezės reguliavimas naudojant A ir jo taikymas in vivo žaibo modeliui. J.Investig. Dermatolis. 2008, 128, 1227–1235. [CrossRef] [PubMed]

49. Hartmanas, ML; Czyz, M. MITF sergant melanoma: jo išraiškos ir aktyvumo mechanizmai. Cell Mol.Life Sci. 2015, 72, 1249–1260. [CrossRef] [PubMed]

50. Kimas, DS; Hwang, ES; Lee, JE; Kimas, SY; Kvonas, SB; Park, KC sfingozino-1-fosfatas mažina melanino sintezę dėl nuolatinio ERK aktyvinimo ir vėlesnio MITF skilimo. J. Cell Sci. 2003, 116,1699–1706. [CrossRef] [PubMed]

51. Xu, W.; Gongas, L.; Haddad, MM; Bischof, O.; Campisi, J.; Taip, ET; Medrano, EE Su mikroftalmija susijusio transkripcijos faktoriaus MITF baltymų lygio reguliavimas, susiejant su ubikvitiną konjuguojančiu fermentu hUBC9. Exp. Cell Res. 2000, 255, 135–143. [CrossRef] [PubMed]

52. Benetas, Kolumbija; Cooperis, PJ; Hart, IR Nenavikinių pelių melanocitų linija, singeniška su B16 melanoma ir kuriai augti reikalingas naviko promotorius. Tarpt. J. Cancer 1987, 39, 414–418. [CrossRef][PubMed]

54. Meira, WV; Heinrichas, TA; Cadena, SM; Martinez, GR Melanogenezė slopina kvėpavimą B16-F10 melanomos ląstelėse, o padidina mitochondrijų ląstelių kiekį. Exp. Cell Res. 2017, 350, 62–72. [CrossRef][PubMed]

54. Ohgučis, K.; Tanaka, T.; Ilija, I.; Ito, T.; Iinuma, M.; Matsumoto, K.; Akao, Y.; Nozawa, Y. Gnetol kaip potencirozinazės inhibitorius iš Gnetum genties. Biosci. Biotechnol. Biochem. 2003, 67, 663–665. [CrossRef] [PubMed]

55. Uchida, R.; Išikava, S.; Tomoda, H. Tirozinazės aktyvumo ir melanino pigmentacijos slopinimas 2-hidroksitirozoliu. Acta Pharm. Sinica B 2014, 4, 141–145. [CrossRef] [PubMed]