Herba Cistanche ekstraktas pagerina mitochondrijų glutationo būklę ir kvėpavimą žiurkių širdyse, sukeldamas galimą baltymų atsijungimą

Įvadas

Anksčiau išeminio miokardo reperfuzija sukelia daugybę mitochondrijų pokyčių, įskaitant padidėjusį reaktyviųjų deguonies rūšių (ROS) gamybą, Ca.2+perkrova ir adenozino trifosfato (ATP) gamybos sumažėjimas, o visa tai gali sukelti nekrozę ir (arba) apoptozės sukeltą ląstelių mirtį (Redegeld ir kt., 1992; Lemasters ir kt., 1998). Kadangi mitochondrijos vaidina lemiamą vaidmenį nustatantAtsižvelgiant į kardiomiocitų likimą po išemijos / reperfuzijos (I/R), apsauga nuo miokardo I/R pažeidimo turėtų būti nukreipta į mitochondrijų struktūrinio ir funkcinio vientisumo išsaugojimą. Mitochondrijų energijos apykaitos palaikymas po I/R iššūkio yra ypač svarbus, nes širdies susitraukimo funkcija beveik visiškai priklauso nuo mitochondrijų generuojamo ATP. Kardiomiocitai, kurie yra gyvi, bet nesusitraukia, yra labai mažai naudingi.

NATŪRALŪS CISTANCHE TUBULOSA MUUNITUI STIPRINTI PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Herba Cistanche, visas džiovintas augalasCistanche deserticolaYC Ma (Orobanchaceae) yra parazitinis augalas, augantis daugiausia dykumose šiaurės ir šiaurės rytų Kinijoje. Herba Cistanche, kinų medicinoje klasifikuojama kaip "Yang gaivinanti" vaistažolė, skiriama esant inkstų nepakankamumui, moterų nevaisingumui ir vidurių užkietėjimui, atsirandančiam dėl žarnyno sausumo senyviems pacientams (Chen, 1998). Ankstesni mūsų laboratorijoje atlikti tyrimai parodė, kad metanolisHerba Cistanche ekstraktaspadidina miokardo ATP generavimo pajėgumą (Leung & Ko, 2008) ir apsaugo nuo žiurkių miokardo I/R pažeidimo (Leung, 2006). Nors ATP generavimo pajėgumo stimuliavimas buvo lygiagretus su mitochondrijų elektronų pernašos padidėjimu (Leung ir Ko, 2008), širdies apsauga nuo I/R sužalojimų, suteiktų gydant Herba Cistanche, buvo susijusi su miokardo ATP išeikvojimo sumažėjimu (Leung, 2006). Šiame tyrime, siekdami apibrėžti mitochondrijų vaidmenį Herba Cistanche kardioprotekciniame veikime, ištyrėme gydymo Herba Cistanche poveikį mitochondrijų glutationo būklei, Ca2+ kiekiui, membranos potencialui ir kvėpavimo dažniui žiurkių širdyse. .

medžiagos ir metodai

Žolinė medžiaga

Herba Cistanche buvo nupirkta iš vietinio (Honkonge įsikūrusio) žolelių pardavėjo (Lee Hoong Kee). Vaistažolės autentiškumą patvirtino tiekėjas, o kupono pavyzdys (HKUST00301) buvo deponuotas Honkongo mokslo ir technologijų universiteto (HKUST) Biochemijos katedroje. Žolės ekstrahavimas metanoliu buvo atliktas remiantis ankstesniais tyrimais, rodančiais, kad toks ekstraktas padidino mitochondrijų ATP susidarymą ir apsaugojo nuo I/R pažeidimo žiurkių širdyse (Leung, 2006; Leung & Ko, 2008). Trumpai tariant, Herba Cistanche (400 g) buvo supjaustytas mažais gabalėliais ir ekstrahuotas kaitinant su grįžtamu šaldytuvu 300 ml metanolio 60 laipsnių temperatūroje 2 valandas, kaip aprašyta anksčiau (Leung & Ko, 2008). Procedūra buvo pakartota du kartus. Sujungtas ekstraktas džiovinamas išgarinant tirpiklį sumažintame slėgyje; išeiga buvo 42 % (m/m), skaičiuojant nuo žalios žolės kiekio. Ekstraktas iki naudojimo buvo laikomas 4 laipsnių temperatūroje. Nors kiniškos žolės tradiciškai ekstrahuojamos vandeniu, skirtos vartoti per burną, metanolis buvo naudojamas mūsų ankstesniame tyrime, kad būtų patogiau apdoroti ir laikyti mėginius (Yim & Ko, 2002), ir mes nustatėme, kad metanolio ekstrahavimas visais atžvilgiais yra patenkinamas.

Gyvūnų priežiūra ir gydymas nuo narkotikų

Suaugusios Sprague-Dawley žiurkių patelės (8–10 savaičių amžiaus; 200–230 g) buvo laikomos drėgmei kontroliuojamoje patalpoje su 12 valandų tamsos / šviesos ciklu, maždaug 22 laipsnių temperatūroje, ir leista valgyti ir vandenį ad libitum. Gyvūnai buvo atsitiktinai suskirstyti į skirtingas grupes, kiekvienoje grupėje po penkis gyvūnus. Žiurkės gavoCistanche žolelių ekstraktasintragastriniu būdu ({{0}},2 g/ml vandenyje) po 0,5 g/kg arba 1,0 g/kg 3 dienas iš eilės. Kontroliniai (negydyti) gyvūnai gavo tik vandens. Praėjus dvidešimt keturioms valandoms po paskutinės dozės, iš anestezuotų gyvūnų buvo paimtas širdies skilvelio audinys biocheminei analizei. Visus eksperimentinius protokolus patvirtino Tyrimų praktikos komitetas, HKUST.

Mitochondrijų frakcijų paruošimas

Susmulkinti širdies skilvelių audiniai (~{0}},6 g) buvo homogenizuoti 10- karto (m/t) pertekliniame ledo sacharozės buferio [0,32 M sacharozės, 1 mM etileno diamino tetraacto rūgšties (EDTA), 50 mM Tris/HCl; pH 7,4] naudojant tefloninio stiklo homogenizatorių, esant 4000 aps./min., su 25–30 smūgių. Mitochondrijų granulės buvo paruoštos iš audinių homogenatų centrifuguojant 800 × g 4 laipsnių temperatūroje 30 minučių, o grynumas buvo nustatytas matuojant santykinį sukcinato dehidrogenazės ir laktato dehidrogenazės aktyvumą supernatante ir nuosėdose, kaip aprašyta anksčiau (Evans, 1992). Mitochondrijų granulės buvo suspenduotos 1 ml homogenizuojančio buferio.

Mitochondrijų sumažinto glutationo ir oksiduoto glutationo lygio matavimas

Mitochondrijų sumažinto glutationo (GSH) lygis buvo nustatytas fermentiniu būdu, naudojant 5,59-ditiobisą (2- nitrobenzenkarboksirūgštį) (DTNB) ir glutationo reduktazę (GR), pagal protokolą, modifikuotą pagal Griffith (198{17}). }). Alikvotinė dalis (210 µL) mitochondrijų frakcijos buvo sumaišyta su 90 µL 10 % (t/v) 5-sulfosalicilo rūgšties (SSA) ir mišinys centrifuguojamas 600 x g 10 min. Norint išmatuoti oksiduoto glutationo (GSSG) lygį, 100 µL SSA supernatantų buvo sumaišyti su 10 µL 20 % (m/v) 2-vinilpiridino ir 10 µL 60 % (t/v) trietanolamino mikrofugų mėgintuvėliuose. Kiekvienam mėgintuvėliui buvo leista stovėti kambario temperatūroje mažiausiai 1 valandą. Reakcijos mišinys, kuriame yra 0,63 mM DTNB ir 0,053 mM NADPH (redukuoto nikotinamido adenino dinukleotido fosfato) fosfatiniame buferyje (0,1 M, su 5 mM Na2 EDTA; pH 7,5), buvo iš anksto inkubuotas 30 laipsnių temperatūroje 2 minutes. Alikvotinė dalis (30 µL) SSA mėginio supernatanto (bendras glutationas) arba GSSG mėginys buvo įdėtas į 96-šulinėlių mikrotitravimo plokštelės šulinėlį ir 180 µL iš anksto pašildyto reakcijos mišinio, kuriame yra 0,525 U/ Tada buvo pridėta ml GR. Absorbcijos pokyčiai esant 412 nm buvo stebimi spektrofotometriškai 5 minutes. GSH ir GSSG koncentracijos buvo apskaičiuotos pagal kalibravimo kreives, naudojant GSH ir GSSG [ištirpintas 3 % (m/t) SSA] kaip etalonus ir išreikštas nmol/mg baltymo. GSH lygis buvo įvertintas iš viso GSH atėmus dvigubą GSSG kiekį.

NATŪRALUS CISTANCHE TUBULOSA LYTINEI FUNKCIJAI GERINTI PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Mitochondrijų Ca{0}} kiekio matavimas

Mitochondrijų Ca{{0}} kiekis buvo matuojamas naudojant Ca2+-jautrią fluorescencinį zondą, Fluo-5N AM esterį (Molecular Probes, Eugene, OR), naudojant Victor2 kelių etikečių skaitiklį (142 modelis0; PerkinElmer, Turku, Suomija), kaip aprašyta Menze ir kt. (2005). Ca2+ disociacijos konstantos (Kd reikšmės) buvo nustatytos naudojant Ca2+ kalibravimo rinkinį, galiojantį koncentracijų diapazone 1–1000 µM; pagal rinkinio gamintojo duomenis apskaičiuotos Kd vertės buvo 90–100 µM, labai patikimos. Alikvotinė dalis (25 µL) mitochondrijų frakcijos (0,5 mg baltymo/ml galutinė koncentracija) buvo sumaišyta su 25 µL inkubaciniu buferiu {100 mM KCl ir 30 mM MOPS [3-(N-morfolino)propansulfonrūgštis]; pH 7,2} 96-šulinėlio juodoje mikrotitravimo plokštelėje. Mišinys inkubuojamas 25 laipsnių temperatūroje 15 min.; Tada buvo pridėta 25 µL digitonino (50 µg/mL) ir 25 µL Fluo-5N AM esterio (1 µM 0,005 % (m/t) Pluronic F-127). Palengvindamas membranos prasiskverbimą, digitoninas sąlygojo fluorescencinių dažų patekimą į mitochondrijas. Mes nustatėme, kad Fluo-5N kiekis žiurkių širdies mitochondrijų preparatuose padidėjo 20-kartą, kai yra digitonino. Reakcijos mišiniai buvo inkubuojami 25 laipsnių temperatūroje 30 minučių, o fluorescencijos rodmenys buvo matuojami esant 488 nm sužadinimo bangos ilgiui ir 532 nm emisijos bangos ilgiui. Mitochondrijų Ca2+ kiekis buvo įvertintas naudojant kalibravimo kreivę ir išreikštas µmol/mg baltymo.

Mitochondrijų membranos potencialo matavimas

Membranos potencialas (ΔΨm) buvo įvertintas metodu, modifikuotu iš Bonavita ir kt. (2003), naudojant fluorescencinius dažus, lipofilinį katijoninį zondą 5 596, 69- tetrachloro-1, 193,39- tetraetilbenzimidazolilkarbocianino jodidą, paprastai vadinamą JC-1. Mitochondrijų frakcijų alikvotinės dalys (50 µL) (pataisytos iki 1 mg baltymo/ml) buvo inkubuojamos 37 laipsnių temperatūroje su 50 µL substrato tirpalo (kuriame yra 6 mM piruvato ir 6 mM malato), 25 µL iš anksto apdoroto adenozino difosfato, 30 (ADP) tirpalo. ir 25 µL 3 µM JC-1 tamsoje. ΔΨm reikšmės buvo gautos matuojant fluorescenciją ties 535 nm (FL1), palyginti su 580 nm (FL2), naudojant Victor2 MultiLabel skaitiklį. JC-1 sudaro agregatus mitochondrijose, todėl susidaro didelės FL2 fluorescencijos vertės ir rodomas normalus mitochondrijų potencialas. Dėl ΔΨm praradimo sumažėja FL2 fluorescencija (JC-1 agreguojasi mažiau) ir kartu padidėja FL1 fluorescencija (nuo JC-1 monomerų). Duomenys buvo išreikšti FL1/FL2 fluorescencijos verčių santykiais. Tyrimui patvirtinti buvo naudojamas karbonilcianido m-chlorfenilhidrazonas (CCCP), ΔΨm žlugdantis agentas.

Mitochondrijų kvėpavimo matavimas

Mitochondrijų kvėpavimo dažnis buvo matuojamas 37 laipsnių kampu, naudojant Hansatech Oxygraph-Plus instrumentą su Clark tipo deguonies elektrodu (Sarasota, FL, JAV). Mitochondrijų frakcijos (0,6 mg baltymo/ml) buvo suspenduotos kvėpavimo buferyje, kuriame yra 125 mM KCl, 20 mM MOPS, 10 mM Tris, 0,5 mM etilenglikolio tetraacto rūgšties (EGTA) ir 2 mM KH2 PO4; pH 7,2. Po inkubacijos 37 laipsnių temperatūroje 2 minutes, kiekvienas mėginys gavo 50 µL substrato tirpalo (5 mM piruvato ir 5 mM malato). Kvėpavimo dažnis buvo matuojamas esant (3 būsena) 1 mM ADP ir po viso ADP fosforilinimo į ATP (4 būsena). 3 būsenos: 4 būsenos kvėpavimo dažnių santykis yra kvėpavimo kontrolės indeksas, rodantis kvėpavimo ir fosforilinimo ryšio sandarumą (Javadov ir kt., 2005; Kuwabara ir kt., 1997). Prieš pridedant substrato tirpalo, 1 būsenos kvėpavimo dažnis buvo matuojamas iki 2 būsenos kvėpavimo pradžios, o 2 būsenos kvėpavimo dažnis buvo įvertintas prieš pridedant ADP.

Statistinė analizė

Duomenys buvo analizuojami taikant vienpusę dispersijos analizę (ANOVA), skirtą kelių grupių palyginimams. Mažiausiai reikšmingo skirtumo (LSD) reikšmės buvo naudojamos reikšmingiems skirtumams tarp dviejų grupių nustatyti, kai p reikšmės buvo < 0.05.

NATŪRALUS CISTANCHE TUBULOSA LYTINEI FUNKCIJAI GERINTI PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Rezultatai

Kaip parodyta 1 ir 2 paveiksluose, apdorojimas metanoliuHerba Cistanche ekstraktas({0}},5 arba 1,0 g/kg per dieną × 3) reikšmingai pagerino mitochondrijų glutationo būklę žiurkių širdyse, kaip rodo nuo dozės priklausomas GSH koncentracijos padidėjimas (11–30 %) ir sumažėjimas GSSG lygiai (31 proc.).

Gydymas Herba Cistanche, priklausomai nuo dozės, sumažino mitochondrijų Ca2+ kiekį žiurkių širdyse, palyginti su kontrolinėmis grupėmis; slopinimas buvo 41 % vartojant 1.0 g/kg dozę (3 pav.).

Gydymas Herba Cistanche padidino mitochondrijų ΔΨm, kaip rodo FL1/FL2 santykio sumažėjimas (14–16%). CCCP (100 µM) sukėlė ΔΨm žlugimą, kaip rodo FL1/FL2 santykio padidėjimas (4 pav.).

Herba Cistanche gydymaspadidėjęs mitochondrijų kvėpavimas, kaip rodo žymiai didesnis 3 būsenos kvėpavimo dažnis (84 %) bandomiesiems gyvūnams, palyginti su kontroliniais gyvūnais (1 lentelė). 2 būsenos ir 4 būsenos kvėpavimo lygiai padidėjo atitinkamai 47 ir 80%, tačiau 4 būsenos kvėpavimo stimuliavimą visiškai nuslopino 1 mM guanozin-5'-difosfatas, 2/3 atsijungiančio baltymo inhibitorius. Gydymas Herba Cistanche neturėjo įtakos kvėpavimo kontrolės indeksui, apskaičiuotam pagal 3 būsenos / 4 būsenos kvėpavimo dažnių santykį.

Diskusija

Mitochondrijos, išskirtos iš Herba Cistanche gydytų žiurkių širdžių, padidino glutationo būklę, kaip rodo padidėjęs GSH kiekis ir sumažėjęs GSSG lygis. Mitochondrijų glutationo redokso būsenos palaikymas yra labai svarbus siekiant apsaugoti širdį nuo I/R traumų (Chiu & Ko, 2003). Citozolinis Ca2+ kiekis padidėja miokardo išemijos metu, kai jį pasisavina vidinės membranos Ca2+ uniporteris (Ataka ir kt., 1992; Grover ir kt., 1990), todėl mitochondrijose susidaro Ca{{6} } kaupimas. Mūsų rezultatai rodo, kad gydymas Herba Cistanche ekstraktu pagerino mitochondrijų glutationo redokso būklę ir sumažino mitochondrijų Ca2+ lygį, o tai gali apsaugoti nuo miokardo I/R pažeidimo (Leung, 2006). Gydymo Herba Cistanche nesugebėjimas didesne 1,0 g/kg doze toliau mažinti GSSG ir Ca2+ koncentraciją gali būti susijęs su savaime ribojančiu reguliavimo mechanizmu, turinčiu įtakos glutationo redokso potencialui ir kalcio būklei. mitochondrijose.

Mitochondrijos sukuria elektrocheminį protonų gradientą per vidinę membraną, pernešdamos elektronus. Šį gradientą ATP sintazė naudoja ADP fosforilinti į ATP. Sumažėjęs mitochondrijų membranos potencialas, kaip ir esant hipoksijai / reoksigenacijai po kultivuotų kardiomiocitų sužalojimo (Chiu ir kt., 2008), sumažėja ATP susidarymas. Gydymas Herba Cistanche, kuris gali padidinti miokardo mitochondrijų membranos potencialą, galbūt padidina ATP susidarymą, ypač po išeminės reperfuzijos. Vėlgi, savaime ribojantis reguliavimo mechanizmas gali paaiškinti, kodėl Herba Cistanche gydymo poveikis mitochondrijų membranos potencialui nepriklauso nuo dozės.

Gydymas Herba Cistanche labai padidino 3 būklės kvėpavimo dažnį žiurkės širdies mitochondrijose, įvertinus deguonies suvartojimą. Šis atradimas atitinka rezultatus, gautus iš in vitro ir situ matuojant mitochondrijų ATP generavimo pajėgumą (Leung & Ko, 2008). Įdomu tai, kad nors gydymas Herba Cistanche sumažino pastovų miokardo ATP lygį (duomenys nerodomi), gydymas padidino mitochondrijų ATP susidarymą. Atsieto kvėpavimo įtraukimas gali paaiškinti šiuos prieštaringus pastebėjimus. Atsietas oksidacinis fosforilinimas įvyksta, kai protonai perkeliami per mitochondrijų vidinę membraną atgal į mitochondrijų matricą, taip išsklaidant membranos potencialą, susidarantį elektronų transportavimo grandinės. Dėl to sumažėja protonų varomoji jėga, kuri skatina ATP susidarymą (Garvey, 2003). Dėl to Ca2+ koncentracija ir ROS gamyba mitochondrijose labai susilpnėja (Teshima ir kt., 2003). Šis pasiūlymas atitinka šio tyrimo rezultatus, kurie parodė mitochondrijų Ca2+ kiekio sumažėjimą Herba Cistanche gydytose širdyse. Kalbant apie atsietą kvėpavimą, gydymas Herba Cistanche gali paskatinti atsijungiančių baltymų (UCP) sintezę. Yra žinoma, kad UCP atskiria oksidacinį fosforilinimą, o UCP1 ekspresija transgeninėse pelių širdyse apsaugota nuo I/R sukelto miokardo pažeidimo (Hoerter ir kt., 2004). UCP atjungimo poveikį slopino purino nukleotidų difosfatai ir trifosfatai (tokie kaip ADP, ATP, guanozindifosfatas (GDP) ir GTP) (Echtay ir kt., 2002). Šiame tyrime mitochondrijų parametrai, tokie kaip membranos potencialas ir kvėpavimo dažnis, buvo matuojami esant ADP (kaip substratui); todėl UCP atjungimo efektas buvo slopinamas. Tačiau, kai buvo matuojamas 4 mitochondrijų būsenos kvėpavimo dažnis, kai nebuvo ADP, šis dažnis buvo didesnis mitochondrijose, paruoštose iš Herba Cistanche gydytų širdžių, nei neapdorotų kontrolinių grupių širdyse. 4 būsenos kvėpavimo dažnis atspindi deguonies suvartojimą mitochondrijose, kai protonai nuteka atgal į mitochondrijų matricą per mechanizmą, kuriame nedalyvauja F1 F0 -ATPazė (Garvey, 2003). Galimas UCP įtraukimas į Herba Cistanche sukeltą 4 būsenos kvėpavimo padidėjimą patvirtina išvada, kad šį padidėjimą slopino BVP (Bento ir kt., 2007).

Apibendrinant galima pasakyti, kad gydymas Herba Cistanche gali pagerinti mitochondrijų glutationo būklę, sumažinti mitochondrijų Ca{0}} kiekį ir padidinti mitochondrijų membranų potencialą bei kvėpavimo dažnį žiurkių širdyse. Mitochondrijų glutationo būklės ir funkcinių gebėjimų pagerėjimas bei numanoma UCP indukcija gali būti susiję su širdies apsauga, kurią suteikiaHerba Cistanche gydymaspo I/R traumos.

NATŪRALUS CISTANCHE TUBULOSA AUGALŲ CISTANCHE EKSTRAKTAS PHGS75% ECH 30% ACT 12%