Čia yra glaustesnė pavadinimo versija: šešių komponentų nustatymas vienu metu Cistanche Tubulosa naudojant infraraudonųjų spindulių spektroskopiją

1. Įvadas

Cistanche (Hoffmg. Et Link) yra daugiametė fanerogaminė Orobanchaceae augalų gentis. Dauguma rūšių, priklausančių Cistanche genčiai, tūkstantmečius buvo naudojamos kaip vaistinis augalas Kinijoje; turėti aukščiausios kokybės toniko reputaciją; ir yra žinomi kaip „dykumų ženšenis“. Cistanche tubulosa yra privalomas daugiamečio augalo Tamarix chinensis šaknų parazitas. Jis buvo dokumentuotas Kinijos farmakopėjoje kaip autentiškas šaltinisCistanches Herba(kiniškas pavadinimas: Roucongrong) iš 2005 m. leidimo. Šiuolaikiniai Cistanche rūšių farmakologiniai tyrimai buvo pradėti devintajame dešimtmetyje. Farmakologiniai tyrimai parodė, kad Cistanche augalų ekstraktai pasižymi plačiu veikimo spektru, pavyzdžiui, gydo inkstų trūkumą ir senatvinį vidurių užkietėjimą, gerina gebėjimą mokytis ir įsiminti, kovoja su Alzheimerio liga, stiprina imunitetą, stabdo senėjimą, nuo nuovargio ir kt. Per pastaruosius tris dešimtmečius išsamūs ir sistemingi farmakologiniai tyrimai buvo derinami su fitocheminiais tyrimais, siekiant išsiaiškinti naudingo Cistanche augalų šaknų poveikio pagrindą. Šios apklausos rodo, kad feniletanoidiniai glikozidai (PhG) buvo pagrindiniai veiksmingi Cistanche augalų komponentai, vaidinantys pagrindinį vaidmenį gydant inkstų trūkumą, impotenciją, stabdant senėjimą ir Alzheimerio ligą. Kinijos farmakopėjoje buvo reikalaujama dviejų PhG (echinakozido ir verbaskozido) turinio. Tuo tarpu angliavandeniai, tokie kaip manitolis, sacharozė, gliukozė ir fruktozė, Cistanche augaluose atlieka vidurius laisvinančią funkciją ir angliavandenių grupes.Cistanche augalaibuvo naudojami vidurių užkietėjimui gydyti.

NATŪRALŪS CISTANCHE TUBULOSA, SUDĖTI TESTOTERONĄ PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Laukiniai C. tubulosa ištekliai daugiausia paplitę Taklamakano dykumos apylinkėse pietiniame Sindziango autonominiame regione Kinijoje. Panašiai kaip ir daugelis kitų rūšių, naudojamų kaip tradiciniai kinų vaistai (TCM), C. tubulosa turi didelę ekonominę vertę ir yra beveik išnykusi laukinėje buveinėje dėl per didelio surinkimo. C. tubulosa pradėta auginti 1990-aisiais Kinijoje, siekiant užtikrinti Cistanches Herba žaliavų tiekimą ir apsaugoti laukinius augalų išteklius. 2017 m. Sindziango Hotano prefektūroje yra beveik 13 tūkst. ha auginamų C. tubulosa. Sodinimo technologijų pažanga reikalinga siekiant išplėsti auginimą ir gerinti C. tubulosa kokybę.

Pagrindinis C. tubulosa auginimo tikslas yra išauginti Cistanches Herba, kurioje gausu šių veiksmingų komponentų. Tačiau veiksmingų komponentų turinysCistanches Herba, pvz., PhG ir oligosacharidai, gamybos metu gali labai paveikti daug veiksnių. Reikėtų ištirti C. tubulosa kokybės aptikimo realiuoju laiku sistemą. Todėl būtina sukurti didelio našumo metodą, kad būtų įvykdytas reikalavimas išanalizuoti didelį mėginių skaičių per trumpą laiką. Tradiciškai tie pirminiai veiksmingi C. tubulosa komponentai, tokie kaip PhG ir angliavandeniai, buvo nustatyti naudojant aukštos kokybės skysčių chromatografiją (HPLC). Nors tai yra tiksli ir patikima, duomenų rinkimas ir apdorojimas užima daug laiko ir pastangų. Be to, daug laiko ir pastangų reikalauja ir mėginio paruošimas, kuris paprastai apima HPLC tyrimų pulverizavimą, ekstrahavimą ir filtravimą. Todėl norint gauti gana didelį duomenų kiekį, reikalingas aiškus principas ir lengvai valdomas įrankis. Laimei, artimojo infraraudonųjų spindulių spektroskopija (NIRS) buvo plačiai naudojama žemės ūkio produktams, maistui, medicininiams pavyzdžiams ir farmacijos produktams įvertinti, nes ji yra greita ir neardoma. Todėl NIRS galėtų tiksliai atitikti efektyvių TCM matavimų reikalavimus, ir, nenuostabu, NIRS buvo taikomas kokybiniam junginių identifikavimui ir kiekybiniam TCM matavimui.

Šiame tyrime šešių veiksmingų komponentų turinys, įskaitantechinakozidas, verbaskozidas, manitolis, sacharozė, gliukozė ir fruktozė116 partijų C. tubulosa mėginių, kurie buvo paimti iš Hotano prefektūros Sindziange 2013–2015 m., pirmą kartą buvo nustatyti HPLC. Vėliau šių šešių komponentų kalibravimo modeliai buvo sukurti dalinės mažiausių kvadratų regresijos (PLSR) metodu. Tada šie modeliai buvo patvirtinti koreliacijos koeficientais ir prognozavimo paklaidomis kalibravimo rinkiniuose. Rezultatai parodė, kad sukurtas metodas gali būti naudojamas kaip patikimas C. tubulosa kiekybinės analizės metodas.

2. Rezultatai

2.1. HPLC analizė

Turinysechinakozidas ir verbaskozidasbuvo nustatyti literatūroje gerai apibrėžtu HPLC-UV metodu, o keturi angliavandeniai (manitolis, sacharozė, gliukozė ir fruktozė) buvo nustatyti literatūroje gerai apibrėžtu HPLC-ELSD metodu visiems 116 mėginių. Mėginių paruošimo ir nustatymo metodai aprašyti 3.1 ir 3.3 skyriuose. 1 paveiksle parodytos mišrių etalonų būdingos chromatogramos. Galima pastebėti, kad visi šeši veiksmingi komponentai buvo atskirti pagal pradinį lygį, todėl juos galima kiekybiškai įvertinti. HPLC metodas buvo patvirtintas prieš mėginio tyrimą. Pagrindiniai HPLC metodo rezultatai pateikti 1 lentelėje. Rezultatuose parodytas palankus tiesinis ryšys (r=0.9998) ir echinakozido nustatymo metodo išgavimas (98,5%), toks pat rezultatas kaip ir visų penkių. komponentai. Todėl šešių veiksmingų komponentų turinį galima tiksliai nustatyti. Visi nustatyti turinio diapazonai yra apibendrinti 1 lentelėje.

2.2. NIRS analizė

2 paveiksle pavaizduoti C. tubulosa mėginių NIR spektrai (4000–10,000 cm-1 ). Reikšmingi absorbcijos smailės buvo nuo 4000 cm-1 iki 7500 cm-1 visuose mėginiuose, o švelnūs svyravimai buvo nuo 7500 cm-1 iki 10 000 cm-1. Pradinis NIR spektrų poslinkis įvyko, nes mėginį lengvai paveikė tokie veiksniai kaip dalelių dydis ir spalva (2A pav.). Matematinis išankstinis spektrų apdorojimas buvo naudojamas tam tikru mastu sumažinti nereikalingos informacijos įtaką. Matematinis išankstinis apdorojimas apėmė pirmąjį išvedimą (1-ą išvedimą), antrąjį išvedimą (2-ąjį išvedimą), standartinę normaliąją įvairovę (SNV) ir dauginamą sklaidos korekciją (MSC). 2B paveiksle parodytas 2-asis C. tubulosa NIR spektrų išvedimas ir pastebimi reikšmingi skirtumai iš trijų sričių – 4000–4500 cm–1, 5000–5500 cm–1 ir 7000–7500 cm–1.

2.3. Kiekybinio kalibravimo modelių sukūrimas

Dalinė mažiausių kvadratų regresija (PLSR) yra klasikinis modeliavimo metodas ir dėl aukštos rezultatų kokybės jis plačiai taikomas kiekybiniuose modeliuose. PLSR pranašumai apima geras prognozavimo galimybes ir santykinį paprastumą. PLSR taip pat buvo plačiai taikomas kuriant kiekybinius TCM kalibravimo modelius [25]. Remiantis iš anksto apdorotais NIR spektrais, buvo sukurtas šešių veiksmingų C. tubulosa komponentų NIR kiekybinės analizės modelis, naudojant PLSR metodą su HPLC analizės duomenimis kaip tikrosiomis reikšmėmis. 116 mėginių buvo atsitiktinai suskirstyti į kalibravimo ir patvirtinimo rinkinius santykiu 3:1. Tinkamiausios sąlygos kalibravimui parinktos pagal žemą RMSEC ir aukštą koreliacijos koeficientą.

NATŪRALUS CISTANCHE TUBULOSA LYTINEI FUNKCIJAI GERINTI PHGS75% ECH 30% ACT 12%

2.3.1. Bangų juostos pasirinkimas kalibravimo modeliams

Tinkamos bangų juostos parinkimas buvo svarbus žingsnis kuriant kalibravimo modelį. Šiame tyrime buvo lyginami 4000–7500 cm–1 (rekomenduojama TQ analitiko programinės įrangos) ir 4000–10 000 cm–1 NIR intervalo spektrai. Pastebėta, kad šis diapazonas netinkamas kalibruoti intervalu tarp 4000 cm–1 ir 7500 cm–1 iš 2 lentelės. Taigi, atliekant dabartinį tyrimą, visi šešių cheminių sudedamųjų dalių spektriniai intervalai buvo parinkti iš intervalo 4000–10 000 cm−1, lyginant RMSEC ir koreliacijos koeficiento charakteristikas.

2.3.2. Optimalaus kalibravimo modelių faktorių skaičiaus parinkimas

PLSR paaiškina maksimalų duomenų kintamumą sumažindamas spektro duomenų matmenį skaičiuojant veiksnius. „Nepakankamo pasirengimo“ problema atsirado dėl nepakankamos informacijos, kuri atsirado dėl riboto skaičiaus veiksnių; tačiau pasirinkus veiksnius, didesnius už modelyje įvestas optimalias reikšmes, atsiras „per didelio pritaikymo“ problema. Arba „nepakankamas pritaikymas“ arba „per didelis pritaikymas“ sumažins nustatytų modelių nuspėjamąją galią [22]. 3 paveiksle parodytas ryšys tarp RMSECV ir faktorių visiems šešiems junginiams. Todėl pasirinkome tuos veiksnius, atitinkančius mažiausias RMSECV reikšmes. Optimalus kalibravimo modelių faktorių pasirinkimas pateiktas 3 lentelėje.

2.3.3. Spektrinio išankstinio apdorojimo pasirinkimas kalibravimo modeliams

Kitas svarbus veiksnys, turintis įtakos kalibravimo modeliams, yra išankstinis spektrinis apdorojimas, kuriuo siekiama sumažinti sklaidos ir bazinės linijos dreifo įtaką, padidinti signalo ir triukšmo santykį ir pašalinti netaisyklingus pokyčius. Radiacijos sklaidos įtakai pašalinti buvo naudojami multiplikacinės sklaidos korekcijos (MSC) ir standartiniai normalaus kintamumo (SNV) metodai. Norint išspręsti bazinės linijos dreifo poveikį, buvo lyginami 1-asis ir 2-asis darinių spektrai ir parinktas 2-asis darinys. Siekdami pageidaujamo efekto, prieš išvesdami išlyginome spektrus naudodami Savitzky-Golay (SG) filtro algoritmą, kad išvengtume triukšmo padidinimo. 3 lentelėje pateikta informacija apie išankstinį spektrinį apdorojimą ir kalibravimo modelių rezultatus.

2.4. Sukurtų modelių įvertinimas

Geras NIRS kalibravimo modelis turėtų turėti mažas RMSEC ir RMSEP vertes, taip pat aukštą koreliacijos koeficientą (r) ir nedidelius skirtumus tarp RMSEC ir RMSEP. Šešių pasirinktų junginių kalibravimo modeliai buvo sukurti pagal aukščiau paminėtas procedūras (3 lentelė). Echinakozido kalibravimo rinkinio RMSEC ir r vertės buvo atitinkamai 27,6 ir 0,9808. Kitų cheminių junginių modelių veikimo parametrai pateikti 3 lentelėje, iš kurios galime daryti išvadą, kad sukurti modeliai duoda patenkinamus prognozavimo rezultatus ir gali būti naudojami greitai kiekybinei C. tubulosa analizei. Šešių cheminių junginių sklaidos diagramos parodytos 4 paveiksle, kad kalibravimo modeliai būtų labiau aprašomi ir būtų stebimi vizualiai. Kaip parodyta 4 paveiksle, tarp nuspėjamųjų ir išmatuotų verčių atsirado nedideli skirtumai, nes dauguma taškų buvo paskirstyti aplink regresinę kreivę su lygtimi kaip y=x. Todėl 4 paveiksle buvo pastebėti puikūs nuspėjamieji rezultatai.

3. Medžiagos ir metodai

3.1. Mėginio paruošimas

Šimtas šešiolika C. tubulosa mėginių buvo paimta iš Hotano prefektūros Sindziango autonominiame regione nuo 2013 m. iki 2015 m. Visi mėginiai buvo auginami, tačiau jie buvo paimti skirtingais augimo tarpsniais. Šviežias mėginių svoris svyravo nuo 20 g iki 1000 g. Po džiovinimo saulėje džiovinti mėginiai buvo susmulkinti ir persijoti per 60-tinklelio sietelį.

3.2. NIR spektroskopinių duomenų rinkimas

Mėginių NIR spektrai buvo renkami 8 cm–1 intervalu per 4000–10 000 cm–1 spektro sritį, naudojant Antaris MXFT-NIR sistemą (Thermo Scientific, Madison, WI, JAV), turinčią rankinis optinio pluošto atspindžio adapteris. Kiekvienas spektras buvo gautas vidutiniškai 64 skenavimus. Prieš NIR spektrų nuskaitymą visiems mėginiams buvo leista susibalansuoti iki kambario temperatūros (25 ◦C), siekiant užtikrinti, kad mėginiai būtų analizuojami toje pačioje temperatūroje. Drėgmė laboratorijoje buvo palaikoma aplinkos lygyje.

NATŪRALUS CISTANCHE TUBULOSA INKSTU FUNKCIJAI GERINTI PHGS75% ECH 30% ACT 12%

3.3. HPLC duomenų rinkimas

3.3.1. Ekstrahavimo paruošimas

Vienas gramas C. tubulosa miltelių buvo ekstrahuotas 50 ml 50% metanolio kūginėje kolboje ultragarsu (500 W, 40 KHz) 30 min. Ekstraktas buvo laikomas 4 ◦C temperatūroje. Ekstrakto supernatantas buvo filtruojamas, kad būtų gautas mėginys HPLC analizei.

3.3.2. Echinakozido ir verbaskozido nustatymas vienu metu naudojant HPLC-UV

Skysčių chromatografinė analizė buvo atlikta naudojant Shimadzu UHPLC sistemą (Shimadzu, Kioto, Japonija), kurią sudaro du LC-20ADXR tirpiklio tiekimo įrenginiai, LC-20AD siurblys, SIL-20ACXR auto mėginių ėmiklis, CTO-20kintamosios srovės kolonėlės krosnis, SPD-M20A DAD detektorius, DGU-20A3R degazatorius ir CBM-20A valdiklis.

Grace Prevail Carbohydrate ES kolonėlė (15{6}} × 2,1 mm, 2,7 mm), naudojama chromatografiniam atskyrimui, buvo palaikoma 35 ◦C temperatūroje. Mobilioji fazė susideda iš acetonitrilo (A) ir 0,1 % vandeninės skruzdžių rūgšties (B) ir buvo pristatyta pagal gradiento programą taip: 0–7 min., tiesinis gradientas 10–20 % A; 7–15 min., 20 % A; ir 15–20 min., tiesinis gradientas 20–10 % A. Judančios fazės srautas buvo 0,4 ml/min. UV stebėjimas buvo atliktas esant 330 nm.

3.3.3. Vienu metu manitolio, sacharozės, gliukozės ir fruktozės nustatymas naudojant HPLC-ELSD

HPLC buvo atlikta naudojant Agilent 1100 serijos LC sistemą (Palo Alto, CA, JAV), kurią sudaro G1322A degazatorius, G1311A ketvirtinis siurblys, G1311A automatinis mėginių ėmiklis, G1316A kolonėlės temperatūros reguliatorius ir G1315B DAD detektorius.

Chromatografiniam atskyrimui buvo naudojama Sigma Prevail Carbohydrate ES kolonėlė (4,6 × 25{7}} mm, 5 µm) ir palaikoma 25 ◦C kolonėlės temperatūroje. Mobilioji fazė buvo sudaryta iš acetonitrilo ir vandens (77:23, v/v) ir izokratinio sąjungininko, tiekiamo 0,7 ml/min srauto greičiu. Nuotekos buvo stebimos naudojant garavimo šviesos sklaidos detektorių (ELSD) su nustatytais parametrais.

3.4. Duomenų apdorojimas

TQ Analyst (8 versija.0, Thermo Scientific, Madison, WI, JAV) buvo naudojamas kalibravimo ir patvirtinimo rinkinių padalijimui, matematiniam išankstiniam spektrų apdorojimui, kalibravimo modelių kūrimui ir kitiems skaičiavimams atlikti. . Figūroms gaminti buvo naudojama kilmė (9.1 versija).

4. Išvados

Šiame tyrime pasiūlėme greitą ir neardomąjį metodą, skirtą vienu metu analizuotiechinakozidas, verbaskozidas, manitolis, sacharozė, gliukozė ir fruktozėNIRS C. tubulosa. RMSEC, koreliacijos koeficiento, RMSEP ir Rp reikšmių analizė parodė, kad nustatyti kiekybiniai NIR modeliai gali būti naudojami tiksliai numatyti šešių pasirinktų veiksmingų C. tubulosa komponentų turinį. Palyginti su HPLC, šiame tyrime aprašytas NIRS metodas gali sutaupyti daug darbo ir laiko, kartu išlaikant patenkinamus kiekybinės analizės gebėjimus. Todėl čia aprašytas metodas gali būti naudojamas C. tubulosa kokybės kontrolei ir taip vadovaujamasi C. tubulosa auginimo ir apdorojimo technologijos plėtrai.

NATŪRALUS CISTANCHE TUBULOSA LYTINEI FUNKCIJAI GERINTI PHGS75% ECH 30% ACT 12%