Kaip Cistanche polisacharidas sumažina melanogenezę ir sumažina oksidacinį stresą?

Norėdami gauti daugiau informacijos, kreipkitės:Joanna.jia@wecistanche.com

Cistanche deserticola polisacharidas sukelia melanogenezę melanocituose ir mažina oksidacinį stresą

1 Dermatologijos skyrius, Trečioji Xiangya ligoninė, Centrinis Pietų universitetas, Čangša, Kinija

2 Urologijos skyrius, Trečioji Xiangya ligoninė, Centrinis Pietų universitetas, Čangša, Kinija

3 Medicinos eksperimentinis centras, Trečioji Xiangya ligoninė, Centrinis Pietų universitetas, Čangša, Kinija

Cistanchedeserticolaturi daug efektų, spustelėkite čia norėdami sužinoti daugiau

Abstraktus: Kaip pagrindinė pigmentacijos sutrikimų dalis, odos depigmentacijos ligos, tokios kaip vitiligo ir achrominis naevus, yra labai dažnos ir dabar sulaukia daugiau dėmesio. Depigmentacijos patogenezė apima melanocitų disfunkciją ir praradimą, kuriuos gali sukelti paveldimumas, autoimunitetas ir oksidacinis stresas. Tarp jų,oksidacinis stresasvaidina pagrindinį vaidmenį; tačiau keli klinikiniai gydymo būdai gali susidoroti su oksidaciniu stresu. Kaip pranešama,Cistanchedeserticola polisacharidas(CDP) yra veiksmingas antioksidantas; remdamiesi tuo, įvertinome jo vaidmenį melanocituose ir toliau atskleidėme mechanizmus. Šiame tyrime mes nustatėme, kad CDP gali skatinti melanogenezę žmogaus epidermio melanocituose (HEM) ir pelės melanomos B16F10 ląstelėse, taip pat sukėlė pigmentaciją zebrafijoje. Be to, CDP gali suaktyvinti mitogeno aktyvuotos baltymų kinazės (MAPK) signalo kelią, tada reguliuoti su mikroftalmija susijusio transkripcijos faktoriaus (MITF) ir pasroviui esančių genų TYR, TRP1, TRP2 ir RAB27A ekspresiją. Priešingu atveju nustatėme, kad CDP gali susilpninti H2O2-sukeltą citotoksiškumą ir apoptozę melanocituose. Kiti įrodymai atskleidė, kad CDP gali sustiprinti NRF2/HO-1 antioksidacinį kelią ir pašalinti tarpląstelinę ROS. Apibendrinant galima pasakyti, kad CDP gali skatinti melanogenezę ir užkirsti kelią melanocitams nuo oksidacinio streso sužalojimo, o tai rodo, kad CDP padeda palaikyti normalią melanocitų būklę. Taigi CDP gali būti naujas vaistas depigmentacijos ligoms gydyti.

RAKTINIAI ŽODŽIAI:

Cistanche deserticola polisacharidas, depigmentacijos liga, melanocitai, melanogenezė, NRF2,oksidacinis stresas

1. ĮVADAS

Odos depigmentacijos ligoms, tokioms kaip vitiligo ir achrominis naevus, būdinga dėmėta arba didelė odos depigmentacija.1 Nors odos pažeidimai retai sukelia sunkų fizinį sužalojimą, jie turi įtakos paciento išvaizdai ir sukuria didelę psichologinę naštą, netgi psichinės sveikatos sutrikimus. pagrindiniai patologiniai depigmentacijos pokyčiai yra melanocitų disfunkcija ir praradimas, kuris labai veikia melanino sintezę ir transportavimą3, todėl odoje melaninas kaupiasi nepakankamai.

Depigmentacijos mechanizmai šiuo metu nežinomi, tačiau tyrimai nustatė kai kuriuos susijusius veiksnius. Viena vertus, melanocitų funkcija iš dalies priklauso nuo su mikroftalmija susijusio transkripcijos faktoriaus (MITF), kuris yra gerai žinomas kaip skatinantis su melanogeneze susijusių genų, įskaitant tirozinazę (TYR), su tirozinaze susijusį baltymą 1 (TRP1), su tirozinaze susijusį baltymą, ekspresiją. baltymas 2 (TRP2), su ras susijęs baltymas Rab-27a (RAB27A) ir fascininis aktiną sujungiantis baltymas 1 (FSCN1).4 Tarp šių genų TYR vaidina pagrindinį vaidmenį melanino sintezėje, oksiduodamas l-dopą į dopachinonas.5 Kita vertus, tyrimai rodo kelių veiksnių, galinčių sukelti melanocitų praradimą, derinį, įskaitant paveldimumą, aplinką, autoimunitetą ir oksidacinį stresą.{17}} Tarp šių veiksnių oksidacinis stresas laikomas svarbiausiu. .

Mechanizmai,oksidacinis stresasiš dalies buvo atskleista depigmentacija; reaktyviųjų deguonies rūšių (ROS) perteklius yra vienas iš pagrindinių veiksnių.10 ROS perteklius depigmentacijos metu yra susijęs su pusiausvyros sutrikimu tarp pro ir antioksidacinių sistemų.11 Vienas iš elementų, dalyvaujančių šiame disbalanse, yra susijęs su branduoliniu eritroidiniu faktoriumi 2- 2 faktoriaus / antioksidacinio atsako elemento (NRF2/ARE) antioksidacinio kelio pažeidimas.12 Kelią sudaro NRF2 ir antioksidaciniai fermentai, tokie kaip hemo oksigenazė-1 (HMOX-1, HO-1) , katalazė (CAT), glutationo peroksidazė 1 (GPX1) ir NAD(P)H chinono dehidrogenazė 1 (NQO1).13 Kai melanocitai yra veikiami per daug ROS, NRF2 gali persikelti į branduolį ir prisijungti prie konservuoto ARE, tada skatina antioksidacinių fermentų ekspresija. Tačiau sergant kai kuriomis depigmentacijos ligomis, tokiomis kaip vitiligo, sutrikęs NRF2/ARE antioksidantų kelias negali veiksmingai pašalinti ROS.14 Klinikiniai gydymo būdai, dažniausiai naudojami depigmentacijai, yra vietiniai arba sisteminiai kortikosteroidai, kalcineurino inhibitoriai, siaurajuostis ultravioletinis B (NBUVB; 311) , 308-nm eksimerinė šviesa, autologinė epidermio transplantacija ir tradicinės kinų medicinos (TCM) terapija. Kortikosteroidai ir kalcineurino inhibitoriai gali sumažinti nenormalų imuninės sistemos aktyvavimą15, o fototerapija yra naudojama kaip pirmosios eilės gydymas; visų pirma, NBUVB skatina melanocitų proliferaciją ir T-ląstelių naikinimą16, o 308-nm eksimerinė šviesa sukelia T ląstelių apoptozę.17 Be to, TCM terapijos poveikis yra susijęs su melanogenezės skatinimu.18 Tam tikru mastu šie metodai padeda pagerinti depigmentaciją, tačiau kontroliuoti ligos progresavimą išlieka sudėtinga. Būtina sukurti naujus gydymo būdus, ypač oksidaciniam stresui, kuris anksčiau buvo apleistas.

Cistanche deserticolayra žinomas kaip „dykumos ženšenis“.19 Jo komponentai yra naudingi esant etanolio sukeltam kepenų pažeidimui ir žarnyno uždegiminei hiperplazijai; jis taip pat gali būti naudojamas kaip reagentas nuo nuovargio, priešuždegiminis ir priešnavikinis reagentas.{5}} Neseniai Guo ir kiti pranešė, kadCistanche deserticola polisacharidas(CDP), vienas iš pagrindinių jo komponentų, pasižymėjo antioksidaciniu ir hepatoprotekciniu aktyvumu20; kituose dviejuose tyrimuose buvo nustatytas jo vaidmuo apsaugant ląsteles nuo sužalojimo deguonies ir gliukozės trūkumo / reperfuzijos ir osteoporozės sąlygomis.23,24 Tačiau CDP vaidmuo sergant depigmentacijos ligomis nebuvo išaiškintas. Čia mes siekėme patvirtinti, ar CDP coksidacinis stresasgali paveikti melanogenezę ir apsaugoti melanocitus nuo oksidacinio streso.

2.|MEDŽIAGA IR METODAI

2.1|Cheminės medžiagos ir antikūnai

Cistanche deserticolapolisacharidas(CDP) ir l-dopa buvo įsigyti iš Yuanye Biotec (grynumas didesnis arba lygus 98 proc.; Šanchajus, Kinija). Vandenilio peroksidas (H2O2), dimetilsulfoksidas (DMSO), NaOH, Triton X-100, 4,5-dimetiltiazol-2-il-2, 5-difeniltetrazolio bromidas ( MTT) ir aneksino V-FITC apoptozės aptikimo rinkinys buvo įsigytas iš Sigma-Aldrich. 4 procentai neutralaus paraformaldehido buvo nupirkti iš Biosharp (Hefėjus, Kinija); ir imunofluorescencinis dažymo rinkinys (Alexa Fluor 488) ir 2,{15}}dichlorfluoresceino diacetatas (DCFH-DA) buvo įsigyti iš Beyotime Biotec (Šanchajus, Kinija). Fontana-Masson dėmių rinkinys ir nukleoplazminio baltymo ekstrahavimo rinkinys buvo įsigyti iš Sloarbio (Pekinas, Kinija). Žmogaus melanocitų augimo papildas (HMGS), Dulbecco modifikuota Eagle terpė (DMEM) ir terpė 254 buvo nupirkta iš Gibco. Fetalinis galvijų serumas (FBS) buvo įsigytas iš BI (Kibbutz Beit-Haemek, Izraelis). Pirminiai antikūnai prieš aktiną, TYR, TRP2, RAB27A, FSCN1, ERK, p-ERK, JNK, p-JNK,

p38, p-p38, NRF2 ir HO-1 buvo įsigyti iš Cell Signaling Technology, pirminis MITF antikūnas buvo nupirktas iš St John's Laboratory, pirminis antikūnas p-MITF buvo nupirktas iš Affinity Biosciences, pirminio antikūno. GAPDH buvo nupirktas iš Bioworld, o pirminis antikūnas TRP1 buvo nupirktas iš EMD Millipore.

2.2| Ląstelių kultūra ir gydymas

Pelės melanomos B16F10 ląstelės buvo kultivuojamos DMEM terpėje, papildytoje 10% FBS ir 1% penicilino-streptomicino antibiotikų mišinio. Žmogaus epidermio melanocitai (HEM) buvo atskirti nuo žmogaus apyvarpės (žr. mūsų ankstesnį tyrimą25) ir kultivuojami 254 terpėje, papildytoje HMGS, 5 procentais FBS ir 1 procento penicilino-streptomicino antibiotikų mišiniu. Visos ląstelės buvo kultivuojamos drėgname inkubatoriuje 37 laipsnių temperatūroje su 5 procentais CO2. CDP buvo ištirpintas DMSO ir praskiestas

su terpe prieš naudojimą galutinė DMSO koncentracija buvo mažesnė nei 0,1 proc. Prieš naudojimą H2O2 buvo praskiedžiamas terpe.

2.3|Zebrafish auginimas ir gydymas

Zebrafish embrionai ir terpė buvo įsigyti iš EzeRinka Biotech. Eksperimentinį protokolą patvirtino Centrinio Pietų universiteto etikos komitetas. Zebražuvės buvo auginamos 12-šulinėlių plokštelėse 37 laipsnių kampu toliau nuo šviesos ir apdorotos skirtingomis CDP koncentracijomis. Apverstas mikroskopas buvo naudojamas kasdien stebėti ir registruoti melaninus zebražuvių galvose ir uodegose. Po stebėjimo pakeitėme terpę ir vėl įtraukėme CDP. Melanino tankis zebrafish uodegose buvo išmatuotas naudojant J vaizdą, o vertės pateikiamos kaip integruoti optiniai tankiai (IOD).

2.4| Ląstelių gyvybingumas

Ląstelių gyvybingumas buvo matuojamas naudojant MTT tyrimą. Norint ištirti CDP citotoksiškumą, HEM ir B16F10 ląstelės buvo implantuojamos į 96-šulinėlių plokšteles, kurių tankis 2 × 1{{30}}3 ląstelės/šulinėlyje ir kultivuojamos iki ląstelės buvo pritvirtintos prie plokštelių. Tada ląstelės buvo apdorotos skirtingomis koncentracijomis (0, 2,5, 5, 10, 20, 40, 80, 160 ir 320 ug/ml) CDP 24, 48 arba 72 valandas. Prieš matavimą į kiekvieną šulinėlį buvo įpilta 20 μL MTT ir plokštelės buvo inkubuojamos 37 laipsnių temperatūroje 4 valandas. Po to išmetėme supernatantą ir į kiekvieną šulinėlį įpilame 160 μL DMSO, kad ištirpintume formazano kristalus. Absorbcijos vertė esant 490 nm buvo išmatuota daugiamodiu plokštelių skaitytuvu (PerkinElmer). Norint ištirti CDP poveikį H2O2- sukeltam citotoksiškumui, HEM ir B16F10 ląstelės buvo dedamos į 96-šulinėlių plokšteles, kurių tankis buvo 4 × 103 ląstelių/šulinėlių. Ląstelės buvo apdorotos skirtingomis CDP koncentracijomis (0, 20, 40 arba 80 ug/mL) 24 valandas, tada į kiekvieną šulinėlį įpylėme H2O2 (galutinės koncentracijos: 500 μm HEM ir 1,0 mm B16F10 ląstelėms). ir inkubavo ląsteles dar 24 valandas. Sukūrėme CDP apdorotas ir neigiamos kontrolės (NC) grupes. Aptikimo žingsniai buvo tokie patys, kaip aprašyta anksčiau.

2,5|NaOH melanino kiekio tyrimas

Ląstelės buvo kultivuojamos {{0}} mm Petri lėkštelėse ir 48 valandas apdorojamos skirtingomis koncentracijomis (0, 20, 40 ir 80 ug/ml) CDP, tada virškinamos tripsinu ir surenkamos į 1. 5-ml vamzdeliai. Mes du kartus nuplovėme ląsteles dvigubai distiliuotu vandeniu, resuspendavome jas 1 ml etanolio ir maišome, kad išsiskirtų melaninas. Tada centrifugavome (200 g, 5 minutes) mišinį ir išmetėme supernatantą, į kiekvieną mėgintuvėlį įpilame 1 ml 10 procentų DMSO (atskiesto 1 mm NaOH tirpalu) ir suspendavome nuosėdas. Suspensiją inkubavome 80 laipsnių vandens vonioje 1 valandą, kad ištirptų melaninas. Galiausiai 200 μL skysčio perpylėme į 96-šulinėlių plokštelę ir panaudojome daugiamodį plokštelių skaitytuvą, kad išmatuotume absorbcijos vertę esant 470 nm.

2.6|Tirozinazės aktyvumo matavimai

Ląstelės buvo kultivuojamos {{0}} mm Petri lėkštelėse ir prieš matavimą apdorotos CDP, suardytos tripsinu ir surenkamos į 15- ml mėgintuvėlius ir du kartus plaunamos fosfatiniu buferiniu tirpalu (PBS). ). Perkėlėme 106 ląsteles iš kiekvieno mėginio į naują mėgintuvėlį ir po centrifugavimo išmetėme supernatantą, tada į ląstelių nuosėdas įdėjome 1 ml 0,5 proc. Triton X-100 ir saugojome mišinį 0 laipsnių temperatūroje 15 minučių. Po to kaip substratą įdėjome 1 ml l-dopos (1 mm, praskiestos 0,1 M fosfatiniu buferiu) ir sumaišome tirpalą, 200 μL mišinio perkėlėme į 96-šulinėlių plokštelę. nedelsiant ir išmatuota absorbcijos vertė (A0) esant 475 nm, naudojant daugiamodį plokštelių skaitytuvą, kartojant matavimą po 10 minučių (A10). Tirozinazės aktyvumas buvo apskaičiuotas pagal (A10-A0)/105, o rezultatai išreiškiami procentais (procentais), palyginti su neigiama kontrole.

2,7| Fontana-Masson melanino dažymas

Ląstelės buvo kultivuojamos 12-šulinėlių plokštelėse, kol buvo pasiektas 50 procentų tankis. Po apdorojimo ląstelės buvo fiksuotos 4 procentų neutraliu paraformaldehidu 30 minučių ir plaunamos distiliuotu vandeniu. Tada į kiekvieną šulinį įpylėme 500 μL Fontana amoniako ir sidabro tirpalo ir 16 valandų laikėme plokšteles tamsoje, kad nudažytume melaniną. Tada ląsteles penkis kartus nuplovėme distiliuotu vandeniu (kiekvieną kartą po 1 minutę) ir 5 minutes mirkome 500 μl hiposulfito; galiausiai pašalinome hiposulfitą ir ląsteles dar kartą skalavome distiliuotu vandeniu 1 minutę. Tada mes naudojome apverstą mikroskopą melaninams stebėti ir įrašyti.

2,8|RNR ekstrahavimas ir kiekybinė atvirkštinės transkripcijos-polimerazės grandininė reakcija

Ląstelės buvo kultivuojamos 6-šulinėlių plokštelėse. Po apdorojimo ląstelės buvo virškinamos tripsinu ir surenkamos į 15- ml talpos mėgintuvėlius. Mes du kartus nuplovėme ląsteles PBS, tada įpilame 1 ml lizės buferio, sumaišome mišinį ir 5 minutėms padėjome mėgintuvėlius ant ledo, kad ląstelės visiškai lizuotų. RNR buvo išgauta naudojant Total RNA rinkinį (Omega Bio-Tek) ir atvirkštinė transkribuota (RT), naudojant ReverTra Ace qPCR RT Master Mix (TOYOBO). Kiekybinė atvirkštinės transkripcijos polimerazės grandininė reakcija (PCR) buvo atlikta naudojant KODSYBR qPCR Mix (TOYOBO). RT mišinio reakcijos tūris buvo 20 μL, o PGR mišinio reakcijos tūris buvo 20 μL (cDNR 1-8 μL, MIX 10 μL, pradmenys F 1 μL, pradmenys R 1 μL, įpilkite DEPC H2O iki 20 μL ). Eksperimentai buvo atlikti pagal protokolus. Pradmenų sekos išvardytos S1 lentelėje.

2,9|Baltymų ekstrahavimas ir Western blotting / imunofluorescencija

Ląstelės buvo kultivuojamos 100- mm Petri lėkštelėse. Po apdorojimo ląstelės buvo virškinamos tripsinu ir surenkamos į 15- ml talpos mėgintuvėlius. Ląsteles du kartus nuplovėme PBS, tada įpilame 500 μL RIPA lizės buferio (Thermo Fisher), papildyto 1 mm fenilmetilsulfonilfluoridu (Thermo Fisher) ir 1:100 praskiestu fosfatazės inhibitorių kokteiliu (Roche). Branduolinis ir citoplazmos baltymas buvo ekstrahuotas naudojant Nucleoplasmic Protein Extraction Kit pagal gamintojo protokolą. Mėgintuvėlius 30 minučių padėjome ant ledo ir kas 5 minutes maišome, kad ląstelės visiškai lizuotų. Centrifugavome ląsteles (200 g, 4 laipsniai, 15 minučių), perkėlėme supernatantą į naują mėgintuvėlį ir išmatavome viso baltymo koncentraciją naudodami BCA baltymų tyrimo rinkinį (KeyGEN Biotec). Baltymus virėme su 5 × pakrovimo buferiu (Beyotime Biotec, Kinija) 100 laipsnių temperatūroje 10 minučių, tada laikėme -80 laipsnių temperatūroje. Atliekant Western blot metodą buvo naudojamas poliakrilamido gelio elektroforezės (PAGE) metodas, atskirta po 20 ug kiekvienos grupės baltymų ir perkelta į polivinilidenfluorido membraną. Po antigeno blokavimo membraną inkubavome santykiu 1:1000 praskiestame pirminiame antikūne 16 valandų 4 laipsnių temperatūroje, tada membraną nuplovėme PBST ir 1 valandą 37 laipsnių temperatūroje inkubavome 1:10 000 praskiestuose fluorescenciniuose antriniuose antikūnuose. . Fluorescencijos intensyvumas buvo nustatytas naudojant Odyssey CLx Imaging System (LI-COR). Imunofluorescencija buvo atlikta naudojant Immunofluorescence Staining Kit (Alexa Fluor

488) su pirminio antikūno praskiedimu santykiu 1:100.

2.10|Ląstelių apoptozės matavimas

Ląstelės buvo kultivuojamos {{0}} mm Petri lėkštelėse ir 24 valandas apdorotos skirtingomis koncentracijomis (0, 20, 40 ir 80 ug/mL) CDP, pridėta H2O2 ( galutinės koncentracijos: 500 μm HEM, 1,0 mm B16F10 ląstelėms) į kiekvieną duobutę ir inkubuojama dar 24 valandas. Taip pat sukūrėme CDP apdorotas ir NC grupes. Po apdorojimo ląsteles virškinome tripsinu be EDTA ir surinkome jas į mėgintuvėlius, po to du kartus plauname ląsteles PBS ir resuspendavome 100 μl PBS. Ląstelės buvo nudažytos aneksino V-FITC apoptozės aptikimo rinkiniu pagal protokolą ir aptiktos srauto citometrija (FCM). Apoptozės greičiui analizuoti buvo naudojama „FlowJo“ programinė įranga.

2.11| Intraląstelinis ROS matavimas

Ląstelės buvo kultivuojamos {{0}}šulinėlių plokštelėse ir 24 valandas apdorojamos skirtingomis koncentracijomis (0, 20, 40 ir 80 ug/mL) CDP, į kurias pridedame H2O2 (galutinė koncentracija: 500 μm HEM,

1.{1}} mm B16F10 ląstelėms) į kiekvieną šulinėlį, inkubuokite juos kitam

24 valandas ir nustatykite CDP apdorotas bei NC grupes. Po apdorojimo ląsteles du kartus nuplovėme PBS, kad pašalintume visą terpę ir FBS, tada atskiedėme DCFH-DA zondą iki 1:1000 su terpe ir įdėjome į kiekvieną šulinėlį. Mes inkubavome ląsteles 37 laipsnių temperatūroje 30 minučių ir tris kartus nuplovėme terpe be serumo. Mes panaudojome an

apverstas fluorescencinis mikroskopas fluorescencijai stebėti ir įrašyti, tada fluorescencijos intensyvumui išmatuoti naudojo ImageJ.

2.12|Statistika ir analizė

Duomenys šiame darbe pateikiami kaip vidurkis ± standartinis nuokrypis (SD), o statistinė analizė atlikta naudojant GraphPad Prism (7 versija.0) arba SPSS (22 versija.0) ir Studento t testas arba vienpusė dispersinė analizė (ANOVA) buvo naudojamas kelių grupių palyginimui. WB baltymų juostų pilka reikšmė buvo standartizuota naudojant GAPDH arba -aktiną. P < 0,05="" reikšmės="" buvo="" laikomos="" reikšmingomis.="" visi="" eksperimentai="" buvo="" kartojami="" mažiausiai="" tris="">

3|REZULTATAI

3.1|CDP sukėlė melanogenezę HEM ir B16F10 ląstelėse

Prieš pradėdami, naudojome MTT tyrimą, kad ištirtume galimą CDP citotoksiškumą HEM ir pelių melanomos B16F10 ląstelėms. Ląstelės buvo apdorotos CDP skirtingomis koncentracijomis 24, 48 arba 72 valandas. HEM gyvybingumo tyrimai parodė, kad kai koncentracija buvo mažesnė nei 320 ug/mL, CDP neturėjo įtakos ląstelių gyvybingumui; tačiau gyvybingumas labai sumažėjo, kai koncentracija pasiekė 320 ug/ml po 24, 48 ir 72 valandų (P < 0,05;="" 1a="" pav.).="" b16f10="" ląstelių="" gyvybingumas="" taip="" pat="" sumažėjo="" po="" 48="" ir="" 72="" valandų,="" kai="" cdp="" pasiekė="" 320="" ug/ml="" (p="">< 0,01),="" tačiau="" esant="" žemesnėms="" koncentracijoms="" pokyčių="" nepastebėta="" (1b="" pav.).="" tada="" preliminariai="" ištyrėme="" cdp="" vaidmenį="" melanogenezėje="" ir="" palyginome="" jo="" poveikį="" su="" melanocitus="" stimuliuojančio="" hormono="" (-msh;="" koncentracijos:="" 20,="" 100="" ir="" 400="" nm)="" ir="" dmso="" (0,1="" proc.)="" poveikiu="" hem.="" melanino="" dažymo,="" tirozinazės="" aktyvumo="" ir="" melanino="" kiekio="" tyrimų="" rezultatai="" rodo,="" kad="" cdp="" buvo="" panašus="" į="" -msh,="" skatinantis="" melanogenezę,="" o="" 0,="" 1="" procento="" gydymas="" dmso="" neturėjo="" jokio="" skirtumo="" (s1="">

Mes atitinkamai patobulinome savo tyrinėjimą. HEM buvo apdoroti skirtingų koncentracijų CDP (20, 40 ir 80 ug/ml) 48 valandas; buvo atlikti melanino dažymo, melanino kiekio ir tirozinazės aktyvumo tyrimai, ir visi jie parodė reikšmingą padidėjimą po gydymo CDP, priklausomai nuo koncentracijos, o didžiausias rodiklis buvo 80 ug/ml grupėje (P < 0,05,="" 2a-c="" pav.)="" .="" tada="" išmatavome="" su="" melanogeneze="" susijusių="" genų="" (mitf,="" tyr,="" trp1,="" trp2,="" rab27a="" ir="" fscn1)="" mrnr="" ir="" baltymų="" lygius.="" cdp="" reikšmingai="" padidino="" tų="" genų="" mrnr="" lygį="" hem="" (p="">< 0,05;="" s2a="" pav.).="" be="" to,="" padidėjo="" mitf,="" tyr,="" trp1="" ir="" rab27a="" baltymų="" lygis,="" taip="" pat="" padidėjo="" fosforilinto="" mitf="" ir="" bendro="" mitf="" santykis="" (p="">< 0,05),="" o="" trp2="" ir="" fscn1="" nesiskyrė="" (2d="" pav.,="" e).="" rezultatai="" parodė,="" kad="" cdp="" gali="" skatinti="" melanogenezę="" ir="" reguliuoti="" su="" melanogeneze="" susijusių="" genų="" ekspresiją="" žmogaus="">

Be to, mes dar kartą patikrinome CDP poveikį su B16F10 ląstelėmis ir nustatėme, kad melanino kiekis B16F10 ląstelėse žymiai padidėjo (P < 0,01;="" s2b="" pav.).="" be="" to,="" cdp="">

3.2|CDP skatino melanogenezę zebrafijoje

Ištirti, ar CDP galėtų skatintimelanogenezėin vivo, mes naudojome zebrafish embrionus. Zebrafish embrionai buvo suskirstyti į keturias grupes ir nuolat apdoroti vien terpe (NC) arba CDP skirtingomis koncentracijomis (20, 40 ir 80 ug/ml); kiekvieną dieną buvo stebimas ir registruojamas melanino granulių tankis ir pasiskirstymas. Kai zebrafish embrionai auga, mes nustatėme, kad melanino tankis palaipsniui didėjo galvose ir uodegose. 3-ią dieną buvo galima atskirti tarpgrupinius skirtumus, o skirtumas toliau didėjo, kol eksperimentą baigėme 6-ą dieną (3A pav.). Naudojome vaizdą J, norėdami išmatuoti melanino tankį zebrafinių žuvų uodegose; CDP gydytų grupių melanino tankis buvo žymiai didesnis nei kontrolinėje grupėje (P < 0,05;="" 3b="">

3.3|CDP aktyvuotas MAPK signalo kelias HEM ir B16F10 ląstelėse

Atskleisti CDP skatinimo mechanizmusmelanogenezė, mes apdorojome HEM CDP skirtingomis koncentracijomis (20, 40 ir

80 ug/mL) 48 valandas, o tada ištyrė fosforilinto ir bendro ERK, JNK ir p38 baltymų kiekį MAPK signalizacijos kelyje. Vertinant Western blot metodu, p-ERK, p-JNK ir p-p38 lygiai po gydymo CDP padidėjo (P < 0,05),="" o="" bendras="" jų="" kiekis="" nepakito="" (4a,="" b="" pav.).="" eksperimentai="" buvo="" pakartoti="" su="" b16f10="" ląstelėmis,="" o="" erk,="" jnk="" ir="" p38="" baltymų="" fosforilinimo="" lygis="" buvo="" padidintas="" (p="">< 0,05),="" tačiau="" bendras="" mapk="" lygis="" nepakito="" (4c,="" d="" pav.),="" atitinka="" hem="" rezultatus.="">

3.4|CDP susilpnintas H2O2-sukeltas

citotoksiškumas ir apoptozė HEM ir B16F10 ląstelėse

Imituoti naudojome H2O2oksidacinis stresasaplinką ir toliau tyrinėjo CDP vaidmenį melanocituoseoksidacinis stresas. Galutinė H2O2 koncentracija HEM buvo 500 μm, o B16F10 ląstelėse – 1,0 mm. Norėdami ištirti CDP poveikį H2O2-sukeltam citotoksiškumui, HEM ir B16F10 ląsteles iš anksto apdorojome skirtingomis koncentracijomis (20, 40 ir 80 ug/ml) CDP 24 valandas, tada pridėjome H2O2 ir toliau jas gydėme. 24 valandas prieš atliekant stebėjimą ir MTT tyrimą.

H2O2 sukėlė akivaizdų membranos pūtimą ir ląstelių susitraukimą HEM, CDP iš anksto apdorotose grupėse padėtis palengvėjo. Gydymas vien CDP neturėjo jokio poveikio (5A pav.). MTT tyrimas parodė panašų rezultatą, nes gydymas H2O2 sumažino HEM gyvybingumą, o CDP žymiai sumažino šį žalingą poveikį.

3,5|CDP pašalintas H2O2-sukeltas tarpląstelinis ROS HEM ir B16F10 ląstelėse

Norėdami ištirti CDP H2O2- sukelto citotoksiškumo ir apoptozės mažinimo mechanizmus, toliau aptikome tarpląstelinę ROS HEM ir B16F10 ląstelėse, naudojant DCFH-DA fluorescenciją.

4|DISKUSIJOS IR IŠVADOS

Šiame tyrime ištyrėme CDP vaidmenį HEM ir B16F10 ląstelėse. Pirmą kartą nustatėme, kad CDP gali skatintimelanogenezėmelanocituose ir skatina zebražuvių pigmentaciją. Vėlesnis eksperimentas parodė, kad MAPK signalizacijos kelias buvo aktyvuotas gydant CDP. Mes toliau tyrėme jo vaidmenįoksidacinis stresasir nustatė, kad CDP gali susilpninti H2O2- sukeltą citotoksiškumą ir apoptozę melanocituose; tuo tarpu CDP gali suaktyvinti NRF2/HO-1 antioksidacinį kelią ir sunaikinti tarpląstelinę ROS.oksidacinis stresassąlygos.

Mitogeno aktyvuota baltymų kinazė yra gyvybiškai svarbus būdas, reguliuojantis MITF, pagrindinį transkripcijos faktorių, skatinantįmelanogenezė26,27 Mūsų tyrime ERK, JNK ir p38 aktyvacija melanocituose žymiai padidėjo po gydymo CDP; tuo tarpu MITF/p-MITF ir MITF valdomų TYR, TRP1, TRP2 ir RAB27A išraiškos

buvo atitinkamai reguliuojami. Taigi siūlome, kad CDP galėtų

skatintimelanogenezėsuaktyvinant MAPK kelią, tačiau kaip CDP suaktyvina MAPK, lieka nežinoma. Remiantis naujausiais tyrimais, į rinkliavą panašus receptorius 4 (TLR4) yra labai išreikštas melanocituose ir dalyvauja melanogenezėje.28,29 TLR4 yra svarbus transmembraninis baltymas, galintis specifiškai surišti lipopolisacharidą (LPS)30; tyrimai parodė, kad LPS gali sukelti melanogenezę.29 Įdomu tai, kad keletaspolisacharidaiIšgauti iš augalų ar grybų, kaip teigiama, aktyvuoti TLR ir pasroviui skirti signalizacijos keliai, tokie kaip MAPK ir branduolinis faktorius kappa beta (NF-κB).31,32 Todėl įtariame, kad CDP gali atpažinti ir susieti TLR, tada suaktyvinamas pasroviui esantis MAPK signalas. lingo kelią ir skatinamelanogenezė. Be to, žinoma, kad nukleotidus surišantys oligomerizacijos domeno tipo receptoriai (NLR) atpažįsta tarpląstelinius ligandus ir skatina MAPK ir NF-κB signalizacijos takų aktyvavimą.33,34 Kaip pranešama, iš Ganoderma lucidum ir Astragalus išgauti polisacharidai gali patekti į ląsteles. ir paveikti NLR.35,36 Taigi gali būti, kad CDP gali patekti į melanocitus ir reguliuoti MAPK signalizacijos kelią per NLR. Tačiau norint patvirtinti šią hipotezę, reikalingi tolesni tyrimai.

Kai kurie iki šiol atlikti tyrimai pranešė apie vaistažolių naudojimąpolisacharidaimelanogenezėje, kad slopintų melanino gamybą.37,38 Tačiau šiame tyrime CDP skatino melanogenezę

melanocitų, ir šis poveikis buvo dar labiau patvirtintas palyginus su -MSH. CDP taip pat yra savotiškaspolisacharidasIš žolelių išgautos, manome, kad priešingas CDP poveikis gali būti susijęs su struktūriniais CDP ir kitųpolisacharidai. Polisacharidai susidaro polimerizuojant monosacharidus, tačiau skiriasi monosacharidų tipas, monosacharidų sudėtis, glikozidinis ryšys, šoninės grandinės struktūra ir molekulinė masė39,40; Manoma, kad šie veiksniai lemia jų biologines funkcijas.41 Esamuose tyrimuose buvo pasiūlyta CDP struktūra ir teigiama, kad CDP struktūra vėliau įtakoja jos funkciją.42 Taigi, norint visiškai suprasti CDP ir patvirtinti mūsų hipotezę, reikia daugiau įrodymų.

Melanogenezė yra svarbus apsauginis pasipriešinimo mechanizmas

ultravioletinių spindulių pažeidimas ir kūno homeostazės palaikymas43; tuo pačiu

Laikui bėgant, melanocitai yra lengvai veikiami nepalankios aplinkos, tokios kaip ROS perkrova.11 Yra žinoma, kad ROS dalyvauja skatinantmelanogenezė, vienas iš mechanizmų yra MAPK aktyvinimas.44 Tačiau tyrimai taip pat atskleidė, kad šis poveikis egzistuoja tik tam tikrame ROS lygyje, o ROS perkrova žymiai pablogina melanogenezę.45 Ryšys tarp ROS, MAPK ir melanogenezės yra kintamas skirtingomis sąlygomis, todėl neabejotinai svarbi pusiausvyra tarp pro ir antioksidacinių sistemų. Sergant depigmentacijos ligomis, tokiomis kaip vitiligas, nesubalansuota antioksidantų sistema ir nekontroliuojamas ROS perteklius pažeis melanocitus ir sumažins ląstelių gyvybingumą.11,46 Šiame tyrime mes naudojome skirtingas H2O2 koncentracijas, kad imituotume ROS perteklių ląstelėse, o HEM parodė prastesnę toleranciją H2O2 nei B16F10 ląstelės. Kai melanocitai buvo gydomi H2O2, jų gyvybingumas ir apoptozės greitis pablogėjo, bet

Išankstinis CDP apdorojimas gali iš dalies pakeisti tendenciją. Tuo pačiu metu ROS buvo išvalytas. Kaip pranešama, NRF2/ARE antioksidacinio kelio aktyvinimas yra pagrindinis ROS pašalinimo odos ląstelėse metodas.14 Mūsų eksperimentuose NRF2 ir HO-1 baltymų kiekis melanocituose buvo padidintas po gydymo H2O2 be CDP; tai reiškia, kad H2O2-sukeltasoksidacinis stresasgali suaktyvinti NRF2/HO-1 kelią, tačiau jo nepakanka redokso pusiausvyrai palaikyti ir ląstelei apsaugoti nuo sužalojimų. Tačiau išankstinis CDP apdorojimas sustiprino NRF2/HO-1 antioksidacijos kelią ir atkūrė pusiausvyrą. Taigi siūlome, kad CDP gali apsaugoti melanocitus nuo oksidacinio streso sužalojimo, aktyvindamas NRF2/HO-1 antioksidacijos kelią ir pašalindamas ROS.

Mes nustatėme, kad gydymas vien CDP neturi įtakos ROS ar NRF2/HO-1 melanocituose. Šis rezultatas rodo, kad CDP gali paveikti redokso pusiausvyrą esant oksidaciniam stresui, bet ne normaliomis sąlygomis. Be to, pranešama, kad NRF2/HO-1 antioksidacijos kelią reguliuoja PI3K, NF-κB ir MAPK signalizacijos keliai.47,48 Mūsų tyrime CDP sugebėjo suaktyvinti MAPK signalizacijos kelią. Gali būti, kad CDP gali suaktyvinti NRF2/HO-1 kelią per aukštyn reguliuojančius MAPK. Kaip pranešė Slominskis, melanocitai yra streso jutikliai, dalyvaujantys reguliavimo tinkle, o jų funkcijos gali greitai keistis reaguodamos į aplinką.49 Siūlome, kad CDP vaidmeniui įtakos turi melanocitų būklė, jis gali skatinti melanogenezę nepaveikdamas antioksidanto. sistema normaliomis sąlygomis, bet atkurti redokso balansą pagaloksidacinis stresassąlygos. Todėl CDP melanocitų funkciją ir išgyvenimą gali palaikyti dviem skirtingais būdais. CDP padeda melanocitams palaikyti homeostazę, kuri taip pat yra svarbi melanogenezės funkcija.50,51

Apibendrinant, CDP gali skatintimelanogenezėmelanocitų

aktyvuojant MAPK signalizacijos kelią. CDP gali pagerinti melanocitų išgyvenimą aktyvindamas NRF2/HO-1 antioksidacinį kelią ir pašalindamas tarpląstelinę ROS oksidacinio streso sąlygomis. Mūsų išvados yra reikšmingos, nes parodo, kad CDP gali skatintimelanogenezėir apsaugoti melanocitus nuooksidacinis stresassužalojimas, kuris gali būti atsakingas už melanocitų disfunkciją ir praradimą. Šio tyrimo rezultatai rodo, kad CDP gali būti naujas vaistas depigmentacijos ligoms gydyti.

PADĖKA

Šį darbą rėmė Kinijos nacionalinis gamtos mokslų fondas (Nr. 81703101), Centrinio Pietų universiteto Trečiosios Xiangya ligoninės naujieji Xiangya talentų projektai (Nr. JY201623 ir Nr. 20170301), Hunano provincijos gamtos mokslų fondas (Nr. Nr. 2018JJ3788 ir Nr. 2018JJ3793) ir Hunano sveikatos komisijos projektas (Nr. C2019173). Daktaras Yibo Hu atliko pagrindinę tyrimo dalį ir parašė rankraštį; Profesorius Jing Chen ir Qinghai Zeng sukūrė studiją ir vadovavo rankraščio rašymui; Profesorius Jinhua Huang, Lihua Huang ir Hong Xiang suteikė techninę pagalbą ir analizavo duomenis; Daktarai Yixiao Li, Ling Jiang, Yujie Ouyang, Yumeng Li, Lun Yang ir Xiaojiao Zhao prisidėjo prie dalies eksperimentų.

INTERESŲ KONFLIKTAS

Autoriai patvirtina, kad interesų konfliktų nėra.

PAREIŠKIMAS APIE DUOMENIS

Duomenis, pagrindžiančius šio tyrimo išvadas, pagrįstu prašymu gali gauti atitinkamas autorius.

NUORODOS

1. Bleuel R, Eberlein B. Terapinis vitiligo gydymas. J Dtsch Dermatol Ges. 2018;16:1309-1313.

2. Taiebas A, Meurantas JM. Ar turėtume teikti pirmenybę psichologinėms intervencijoms gydant vitiligo? J Eur Acad Dermatol Venereol. 2018;32:2053-2054.

3. Picardo M, Dell'Anna ML, Ezzedine K ir kt. Vitiligo. Nat Rev Dis gruntai. 2015; 1:15011.

4. Slominski A, Tobin DJ, Shibahara S, Wortsman J. Melanino pigmentacija žinduolių odoje ir jos hormoninis reguliavimas. Physiol Rev. 2004;84:1155-1228.

5. Slominski A, Zmijewski MA, Pawelek J. L-tirozinas ir L-dihidroksifenilalaninas kaip į hormonus panašūs melanocitų funkcijų reguliatoriai. Pigment Cell Melanoma Res. 2012;25:14-27.

6. Spritz RA. Bendri genetiniai ryšiai, lemiantys generalizuotą vitiligo ir autoimuninę skydliaukės ligą. Skydliaukė. 2010;20:745-754.

7. Lin X, Tang LY, Fu WW, Kang KF. Vaikystės vitiligo Kinijoje: klinikiniai profiliai ir imunologiniai radiniai 620 atvejų. Esu J Clin Dermatol. 2011;12:277-281.

8. Boehncke WH, Brembilla NC. Autoreaktyvūs T-limfocitai sergant uždegiminėmis odos ligomis. Priekinis imunolis. 2019; 10:1198.

9. Iannella G, Greco A, Didona D ir kt. Vitiligo: patogenezė, klinikiniai variantai ir gydymo metodai. Autoimmun Rev. 2016;15:335-343.

10. Forrester SJ, Kikuchi DS, Hernandes MS ir kt. Reaktyviosios deguonies rūšys metabolinėje ir uždegiminėje signalizacijoje. Circ Res. 2018;122:877-902.

11. Denat L, Kadekaro AL, Marrot L ir kt. Melanocitai kaip oksidacinio streso kurstytojai ir aukos. J Invest Dermatol. 2014;134:1512-1518.

12. Qiu L, Song Z, Setaluri V. Oksidacinis stresas ir vitiligo: Nrf{1}}ARE

signalizacijos jungtis. J Invest Dermatol. 2014;134:2074-2076.

13. Hayes JD, Dinkova-Kostova AT. Nrf2 reguliavimo tinklas suteikia sąsają tarp redokso ir tarpinio metabolizmo. Trends Biochem Sci. 2014;39:199-218.

14. Marrot L, Jones C, Perez P, Meunier JR. Nrf2 reikšmė

(foto) oksidacinio streso atsako kelias žmogaus epidermio melanocituose ir keratinocituose. Pigment Cell Melanoma Res. 2008;21:79-88.

15. van Geel N, Speeckaert R, Mollet I ir kt. In vivo vitiligo indukcijos ir terapijos modelis: dvigubai aklas, atsitiktinių imčių klinikinis tyrimas. Pigment Cell Melanoma Res. 2012;25:57-65.

16. Nicolaidou E, Antoniou C, Stratigos A, Katsambas AD. Siaurajuostė ultravioletinė B fototerapija ir 308-nm eksimerinis lazeris gydant vitiligo: apžvalga. J Am Acad Dermatol. 2009;60:470-477.

17. Novak Z, Bonis B, Baltas E ir kt. Ksenono chlorido ultravioletinis B lazeris

yra veiksmingesnis gydant žvynelinę ir skatinant T ląstelių apoptozę nei siaurajuostis ultravioletinis B. J Photochem Photobiol B Biol. 2002;67:32-38.

18. Xu P, Su S, Tan C ir kt. Eclipse herba, Polygoni multiflora radix preparator ir Rehmanniae radix preparator vandeninių ekstraktų poveikis melanogenezei ir žmogaus melanocitų migracijai. J Etnopharmacol. 2017; 195:89-95.

19. Wang T, Zhang X, Xie W.Cistanche deserticolaYC Ma, „Dykumos ženšenis“: apžvalga. Am J Chin Med. 2012;40:1123-1141.

20. Guo Y, Cao L, Zhao Q ir kt. Preliminarūs apibūdinimai, antioksidacinis ir hepatoprotekcinis aktyvumaspolisacharidasišCistanche deserticola. Int J Biol Macromol. 2016;93:678-685.

21. Cai RL, Yang MH, Shi Y ir kt. Nuovargį mažinantis feniletanoidų turinčio ekstrakto išCistanche deserticola. Phytother Res. 2010;24:313-315.

22. Zhang H, Xiang Z, Duan X ir kt. Priešnavikinis ir priešuždegiminis oligosacharidų poveikis išCistanche deserticolaekstraktas nuo nugaros smegenų pažeidimo. Int J Biol Macromol. 2019;124:360-367.

23. Liu Y, Wang H, Yang M ir kt.Cistanche deserticola polisacharidaiapsaugo PC12 ląsteles nuo OGD / RP sukeltų sužalojimų. Biomed Pharmacother. 2018;99:671-680.

24. Daina D, Cao Z, Liu Z ir kt.Cistanche deserticola polisacharidasslopina osteoklastogenezę ir kaulų rezorbciją slopindamas RANKL signalizaciją ir reaktyviųjų deguonies rūšių gamybą. J Cell Physiol. 2018;233:9674-9684.

25. Fu C, Chen J, Lu J ir kt. Sumažėjęs TUG1 reguliavimas skatina melanogenezę ir UVB sukeltą melanogenezę. Exp Dermatol. 2019;28:730-733.

26. Johannessen CM, Johnson LA, Piccioni F ir kt. Melanocitų linijos programa suteikia atsparumą MAP kinazės kelio slopinimui. Gamta. 2013;504:138-142.

27. Vachtenheim J, Borovansky J. Pigmento susidarymo melanocituose „transkripcijos fiziologija“: pagrindinis MITF vaidmuo. Exp Dermatol. 2010;19:617-627.

28. Yu N, Zhang S, Zuo F ir kt. Kultivuoti žmogaus melanocitai išreiškia funkcinius į rinkliavą panašius 2–4, 7 ir 9 receptorius. J Dermatol Sci. 2009;56:113-120.

29. Ahn JH, Park TJ, Jin SH, Kang HY. Žmogaus melanocitai ekspresuoja funkcinius Toll tipo receptorius 4. Exp Dermatol. 2008;17:412-417.

30. Reed SG, Carteris D, Casper C ir kt. GLA šeimos adjuvantų veiklos koreliacijos. Semin Immunol. 2018;39:22-29.

31. Guo MZ, Meng M, Feng CC ir kt. Novelėpolisacharidasgautas iš Craterellus cornucopioides, reguliuodamas TLR4-NF-kappaB kelią sustiprina imunomoduliacinį aktyvumą imunosupresiniuose pelių modeliuose. Maisto funkcija. 2019;10(8):4792-4801.

32. Wei W, Xiao HT, Bao WR ir kt. TLR-4 gali tarpininkauti Astragalus signalizacijos keliuosepolisacharidasRAP sukelta RAW264.7 ląstelių citokinų ekspresija. J Etnopharmacol. 2016;179:243-252.

33. Chen H, Yang D, Han F ir kt. Bakterinis T6SS efektorius EvpP užkerta kelią NLRP3 uždegiminiam aktyvavimui, slopindamas nuo Ca (2 plius) priklausomą MAPK-Jnk kelią. Ląstelės šeimininko mikrobas. 2017;21:47-58.

34. Levy M, Shapiro H, Thaiss CA, Elinav E. NLRP6: daugialypis in-Nate imuninis jutiklis. Trends Immunol. 2017;38:248-260.

35. Chen YS, Chen QZ, Wang ZJ, Hua C. Ganoderma lucidum priešuždegiminis ir hepatoprotekcinis poveikispolisacharidaiprieš anglies tetrachlorido sukeltą kepenų pažeidimą Kunmingo pelėms. Farmakologija. 2019;103:143-150.

36. Tian Z, Liu Y, Yang B ir kt. Astragalaspolisacharidasslopina pelių kolitą slopindamas NLRP3 uždegimą. Planta Med. 2017;83:70-77.

37. Jiang L, Huang J, Lu J ir kt. Ganoderma lucidumpolisacharidassumažina melanogenezę slopindamas keratinocitų ir fibroblastų parakrininį poveikį per IL-6/STAT3/FGF2 kelią. J Cell Physiol. 2019;234:22799-22808.

38. Cai ZN, Li W, Mehmood S ir kt. PoveikispolisacharidasFMP{0}} iš Morchella esculenta dėl melanogenezės B16F10 ląstelėse ir zebrafijoje. Maisto funkcija. 2018;9:5007-5015.

39. Zhang C, Li Z, Zhang CY ir kt. Molekulinės charakteristikos ir biologinis aktyvumaspolisacharidaiiš liucernos (Medicago sativa L.). Maistinių medžiagų. 2019; 11:1181.

40. Coconi Linares N, Di Falco M, Benoit-Gelber I ir kt. Komponentų pėdsakų buvimas žymiai padidina Aspergillus niger molekulinį atsaką į guaro dervą. Nauja biotechnologija. 2019;51:57-66.

41. Ma H, Zhang K, Jiang Q ir kt. Augalo apibūdinimaspolisacharidaiiš Dendrobium officinale naudojant daugybę chromatografinių ir masės spektrometrinių metodų. J Chromatogr A. 2018;1547:29-36.

42. Dong Q, Yao J, Fang JN, Ding K. Dviejų šaltu vandeniu ekstrahuojamų medžiagų struktūrinis apibūdinimas ir imunologinis aktyvumaspolisacharidaiišCistanche deserticolaYC Ma. Carbohydr Res. 2007;342:1343-1349.

43. Slominski AT, Zmijewski MA, Plonka PM ir kt. Kaip UV šviesa per odą paliečia smegenis ir endokrininę sistemą ir kodėl. Endokrinologija. 2018;159:1992-2007.

44. Schalke S. Nauji duomenys apie hiperpigmentacijos sutrikimus. J Eur Acad Dermatol Venereol. 2017;31 (5 priedas):18-21.

45. Glassman SJ. Vitiligo, reaktyviosios deguonies rūšys ir T ląstelės. Clin Sci. 2011;120:99-120.

46. ​​Ristow M. Tiesos apie antioksidantus išaiškinimas: mitohormezė paaiškina ROS sukeltą naudą sveikatai. Nat Med. 2014;20:709-711.

47. Balogun E, Hoque M, Gong P ir kt. Kurkuminas aktyvina hemo oksigenazės-1 geną reguliuodamas Nrf2 ir į antioksidantus reaguojantį elementą. Biochem J. 2003;371:887-895.

48. Paine A, Eiz-Vesper B, Blasczyk R, Immenschuh S. Signalizacija

hemo oksigenazė-1 ir jos priešuždegiminis terapinis potencialas.

Biochem Pharmacol. 2010;80:1895-1903.

49. Slominski A, Paus R, Schadendorf D. Melanocitai kaip "sensorinės" ir reguliuojančios ląstelės epidermyje. J Theor Biol. 1993;164:103-120.

50. Slominski RM, Zmijewski MA, Slominski AT. Melanino pigmento vaidmuo sergant melanoma. Exp Dermatol. 2015;24:258-259.

51. Slominski A, Kim TK, Brozyna AA ir kt. Melanogenezės vaidmuo reguliuojant melanomos elgesį: melanogenezė skatina HIF-1alfa ekspresiją ir nuo HIF priklausomus kelius. Arch Biochem Biophys. 2014;563:79-93.