Žmogaus TH17 ląstelės sutraukia Gasdermin E poras, kad išlaisvintų IL-1 aktyvinant NLRP3 uždegimą

Įrodyta, kad įgimtas imuninis atsakas gali įgyti adaptacines savybes, tokias kaip atmintis. Nežinoma, ar T ląstelės naudoja įgimtus imuninės sistemos signalizacijos kelius, kad įvairintų savo efektorinių funkcijų repertuarą. Gasdermin E (GSDME) yra membranos poras formuojanti molekulė, kuri, kaip įrodyta, vykdo piroptozinę ląstelių mirtį ir tokiu būdu yra galimas vėžio kontrolės taškas. Šiame tyrime parodome, kad žmogaus T ląstelės ekspresuoja GSDME ir, stebėtinai, ši išraiška yra susijusi su ilgalaikiu gyvybingumu ir yra skirta signalininio interleukino (IL) išsiskyrimui -1. Ši savybė buvo apribota žmogaus pagalbininkų 17 tipo T ląstelių pogrupiu, pasižyminčiu Candida albicans specifiškumu ir reguliuojamu T ląstelėms būdingo NLRP3 uždegimo ir jos įsitraukimo į nuoseklių kaspazės -8, kaspazės{{6} proteolitinę kaskadą. }}, ir GSDME skilimas po T ląstelių receptorių stimuliacijos ir kalcio licencijuoto kalpaino subrendimo pro-IL-1 formai. Mūsų rezultatai rodo, kad GSDME porų susidarymas T ląstelėse yra netradicinio citokinų išsiskyrimo mechanizmas. Ši išvada paįvairina mūsų supratimą apie T ląstelių funkcinį repertuarą ir mechaninę įrangą ir turi įtakos priešgrybeliniam imunitetui.

cistanche tubulosa - stiprina imuninę sistemą

Pagalbinės T ląstelės (TH ląstelės) yra svarbios antigenui specifinių efektorių atsakų vykdytojai, išskirdamos skirtingus citokinus. 17 tipo pagalbinės T ląstelės (TH17 ląstelės), ypač atpažįstamos dėl savo priešgrybelinių funkcijų, išskiriant jiems būdingą citokiną IL-17A, kurį reguliuoja su transkripcijos faktoriumi susijęs RAR našlaičių receptorius (ROR). t1. Jie taip pat yra pagrindiniai autoimuninių ligų patogenezės kaltininkai2. TH1Anksčiau buvo pripažinta, kad 7 ląstelės turi funkcinį nevienalytiškumą3. Priešuždegiminės arba priešuždegiminės funkcijos pasireiškia skirtingai koekspresuojant IL-17 su interferonu (IFN) arba IL-10, atitinkamai4–7. Apskritai tai suformavo TH17 ląstelių dualizmo koncepciją ir paskatino signalų ir molekulinių taikinių, kurie kontroliuoja dviejų funkcinių TH17 ląstelių rezultatų dichotomiją terapiniams tikslams, tyrimus 3, 4, 8, 9. Tačiau gilus supratimas apie patogeninių ir imunoreguliacinių TH17 ląstelių likimų tapatybę ir mechaninį pagrindą lieka sunkiai suprantamas. TH17 ląstelėse, turinčiose priešgrybelinių ar antibakterinių tikslinių savybių, taip pat gali veikti papildomi efektorių mechanizmai, kurių dar nėra. IL-1 citokinai, kurių ryškiausi nariai yra IL-1 ir IL-1, daro didelį uždegiminį poveikį. Išsilaisvinusios iš antigenus pateikiančių ląstelių (APC), jos ne tik sukelia greitus įgimtus uždegiminius atsakus, bet ir sukuria adaptyvųjį imunitetą, skatindamos TH17 ląstelių poliarizaciją ir T ląstelių patogeniškumą, prisijungdamos prie jų bendro IL-1R1 receptorių4,10,11. . IL-1-nepriklausomas TH17 ląstelių pradėjimas, kuris taip pat buvo aprašytas anksčiau, sukelia priešuždegiminių TH17 ląstelių gamybą4. Todėl IL-1 iš įgimtų ląstelių šaltinių yra keitimo veiksnys, lemiantis priešingų priešuždegiminių TH17 ląstelių likimų dichotomiją. Skirtingai nuo daugelio kitų citokinų, IL-1 citokinams trūksta signalinio peptido, todėl juos išskiria netradicinis endoplazminis tinklas (ER) – nuo ​​Golgi nepriklausomas mechanizmas.

Pro-IL-1 reikalauja fermentinio skilimo prieš išleidžiant į tarpląstelinę erdvę ir įsijungiant į receptorių. NLRP3 uždegimas yra multimerinis citozolinis baltymų kompleksas, kuris sujungia mikrobų infekciją ir ląstelių pažeidimus bei įtraukia kaspazę -1 tolesniam pro-IL-1 skilimui12. IL-1 pasišalinimui taip pat reikalingas kaspazės-1-sukeltas dujų dermino D (GSDMD) skilimas ir porų susidarymas vykstant procesui, vadinamam piroptoze – uždegimine ląstelių mirties forma13,14. Kita vertus, manoma, kad IL-1 yra apdorojamas nepriklausomai nuo NLRP3 uždegimo, taikant reguliavimo kontrolės punktus, kurie vis dar menkai suprantami10. Nepaisant šių visiškai skirtingų IL-1 ir IL-1 brendimo ir išsiskyrimo būdų, abu citokinus kartu gamina įgimtos imuninės sistemos ląstelės, o tai rodo, kad egzistuoja dar nenustatytos. bendro reguliavimo kelius. Šiame tyrime parodome, kad žmogaus TH17 ląstelių pogrupis dalyvauja nuo NLRP3-priklausančios signalizacijos kaskados, kad sukeltų membranos porų susidarymą GSDME, kuri padeda autokrininiam priešuždegiminio IL-1 išsiskyrimui. Šis atradimas atskleidžia netradicinį žmogaus T ląstelių citokinų sekrecijos būdą ir taip paįvairina T ląstelių funkcinį ir mechaninį repertuarą.

cistanche nauda vyrams - stiprina imuninę sistemą

Rezultatai

IL{0}} gamyba yra žmogaus TH ląstelių savybė

Norėdami ištirti žmogaus TH17 ląstelių pogrupio heterogeniškumą ir atskleisti skirtingas funkcijas bei jų molekulinę kontrolę, atlikome aktyvuotų žmogaus TH17 ląstelių, kurios ex vivo buvo išskirtos iš periferinio kraujo, vienos ląstelės RNR sekos (scRNA-seq) nustatymą. jų unikali chemokino receptorių paviršiaus žymenų išraiška15. Tiriamoji analizė taikant vienodą kolektoriaus aproksimaciją ir projekciją (UMAP) ir visų TH17 ląstelių Leideno klasterizavimą nustatė šešias atskiras grupes (1a pav.). Skirtinga ir reta (6%) IL1A ekspresuojančių TH17 ląstelių populiacija buvo selektyviai praturtinta 1 klasteryje (1a, b pav.). Palyginus visus 1 klasterio genus su visomis kitomis grupėmis, paaiškėjo, kad IL1A yra žymiai padidintas (1 papildoma lentelė). Tai buvo netikėta, nes manoma, kad IL-1 nepriklauso kanoniniam T ląstelių efektorinių citokinų repertuarui, o yra įgimtas pavojaus signalas16. Tačiau IL1A nebuvo tarp geriausių skirtingai išreikštų genų (DEG) 1 klasteryje, todėl reikėjo gilesnės paieškos strategijos, kad būtų atskleistas reikšmingas jos padidėjimas TH17 ląstelių subpopuliacijoje (papildomas 1 pav.). Baltymų lygiu TH17 ląstelių klonai taip pat išsiskyrė į skirtingus IL-1 + ir IL-1 – T ląstelių klonus, taip palaikydami IL-1 baltymo ekspresijos heterogeniškumą vienos ląstelės lygmenyje. TH17 ląstelių populiacija (1c pav.). Norėdami palyginti IL1A ekspresiją TH17 ląstelėse su kitų imuninių ląstelių tipų, ypač anksčiau praneštų bona fide IL -1 gamintojų, ekspresija, apklausėme kelis viešus žmogaus periferinio kraujo mononuklearinių ląstelių (PBMC) scRNA-seq duomenų rinkinius. Keista, bet tai neatskleidė jokios IL1A ekspresijos įvairiose ramybės būsenos PBMC imuninių ląstelių tipuose, įskaitant T ląsteles, B ląsteles, natūralias žudikas (NK) ląsteles, NKT ląsteles, monocitus ir dendritines ląsteles (papildomas 2a, b pav.). Net monocitai nerodė jokios IL1A ekspresijos vienos ląstelės lygmeniu, nebent šioms ląstelėms buvo pritaikytas specifinis IL1A sukeliantis stimulas, ypač lipopolisacharidas (LPS) (papildomas 2c, d pav.), kuris atskleidė jų gebėjimą gaminti IL1A. ir IL1A ekspresijos susiejimas su vykstančiu uždegiminiu įgimtu imuniniu atsaku (papildomas 2e pav.). Įdomu tai, kad vienos ląstelės transkriptominis DEG tarp IL1A+ ir IL1A– ląstelių iš TH17 ląstelių palyginimas su monocitais parodė, kad genų koekspresija (IL1A ir CCL3) beveik nesutampa, o tai labai rodė skirtingą IL1A reguliavimo būdą T. ląstelės, palyginti su monocitais (1d pav.). Apibendrinant, šie rezultatai rodo, kad TH17 ląstelių pogrupyje egzistuoja atskira IL{54}}išreiškiančių ląstelių subpopuliacija.

IL{0}}gaminantis TH17 ląstelių pogrupis yra priešuždegiminis

Norėdami ištirti IL1A ekspresijos fiziologinę reikšmę žmogaus TH17 ląstelėse, atlikome nešališką IL1A+ ir IL1A – TH17 ląstelių transkriptominį palyginimą po scRNA-seq. Genų rinkinio sodrinimo analizė (GSEA), skirta genams, ekspresuojamiems kartu su IL1A TH17 ląstelėse, taip pat sodrinimo analizė naudojant DEG atskleidė ryškų IL1A ryšį su T ląstelių aktyvacija ir proliferacija po nešališko visų turimų genų ontologijos (GO) terminų apklausos. 2a pav. ir papildomas 3 pav.). Šis atradimas ginčijo anksčiau priskirtą IL-1 vaidmenį senstant ir ląstelių mirtyje naujame T ląstelių kontekste17. Praturtinimo analizė taip pat atskleidė, kad keletas GO terminų, susijusių su „uždegimu“, yra per daug, o tai rodo, kad IL1A ekspresija TH17 ląstelėmis prisidėjo prie patogeninės T ląstelių tapatybės su vaidmenimis sergant uždegiminėmis ligomis (2a pav.). Šią idėją patvirtino genų, pažymėtų GO terminu „ląstelių atsakas į interleukiną-1“, reguliavimas, atsižvelgiant į anksčiau praneštą priešuždegiminį IL-1 poveikį bendram TH17 ląstelių funkcionalumui4 ir slopinamąjį poveikį. autokrininės IL-1 IL-10 išraiškos (išplėstiniai duomenys 1a–c pav.). Tiesioginis IL1A+ ir IL1A–TH17 ląstelių palyginimas visuose klasteriuose parodė, kad IL1A+ TH17 ląstelės turėjo žymiai sustiprintą priešuždegiminį, bet sumažintą priešuždegiminį poveikį (2b pav.) 7. Be to, 1 klasteris, praturtintas IL1A+ TH17 ląstelėmis, buvo žymiai daugiau priešuždegiminių ir mažiau priešuždegiminių nei visos kitos penkios grupės, kaip rodo GSEA (2b pav.). Įdomu tai, kad masinis priešuždegiminių TH17 ląstelių pogrupių transkriptominis palyginimas atskleidė, kad IL1A netgi yra vienas iš aukščiausiai reguliuojamų genų priešuždegiminių TH17 ląstelių pogrupyje (2c, d pav. ir išplėstiniai duomenys 2 pav.). Vietoj to, IL10 buvo labai sumažintas, kaip tikėtasi pagal ankstesnes ataskaitas 4, 7 . Ši abipusė IL-1 ir IL-10 ekspresijos koreliacija TH17 ląstelėse taip pat buvo pastebėta baltymų lygiu srauto citometrijos metodu (2e pav.). DEG praturtinimo analizė parodė, kad KEGG (Kioto genų ir genomų enciklopedija) yra per daug autoimuninių ligų, tokių kaip „reumatoidinis artritas“ ir „uždegiminė žarnyno liga“ (2f pav.), o tai patvirtino IL1A ekspresuojančio TH17 priešuždegiminį pobūdį. ląstelių pogrupis. Tiesą sakant, pacientams, sergantiems jaunatviniu idiopatiniu artritu (JIA), labai uždegimine reumatoidinio artrito forma vaikams, kurių patogenezė anksčiau buvo siejama su įgimtu IL-1 ir IL-1 18,19, atskleidė reikšmingai ir stipriai. padidėjusi IL-1 ekspresija IL-17+ TH ląstelėse, palyginti su IL-17+ TH ląstelėmis iš sveiko kontrolinio kraujo (2g pav.). Nebuvo pastebėtas IFN padidėjimas IL-17+ TH ląstelėse iš JIA sergančių pacientų kraujo, palyginti su kontroliniu donoro krauju, nepaisant anksčiau pranešto IFN-ryšio su TH17 ląstelių patogeniškumu (2g pav., dešinysis skydelis) 4. Be to, sinovinio skysčio, atitinkančio kraują, analizė parodė labai didelį IL-1 + TH ląstelių dažnį, o tai rodo, kad T ląstelės, be įgimtų ląstelių, taip pat gali būti svarbus su liga susijusios IL{{74} šaltinis. } uždegimo vietoje.

Cistanche tubulosa privalumai- stiprinti imuninę sistemą

IL-1 išraišką reguliuoja TH17 programa

Norėdami ištirti, ar IL-1 ekspresija yra bendra T ląstelių savybė, praturtinome atskirus TH ląstelių pogrupius iš PBMC pagal jų skirtingą chemokinų receptorių ekspresiją (3 pav. išplėstiniai duomenys) ir palyginome jų IL-1 sekrecija. IL-1 specialiai gamino TH17 ląstelių pogrupis, bet ne TH1 ląstelių pogrupis, TH2 ląstelių pogrupis arba reguliuojančios T ląstelės (Treg ląstelės) (3a–c pav.). Stebėtina, kad jo sekrecijos lygis, stimuliuojant anti-CD3 ir anti-CD28 monokloniniais antikūnais, atitiko žmogaus monocitų, stimuliuojamų LPS ir nigericinu, sekrecijos lygį, o tai rodo, kad žmogaus TH17 ląstelės, nepaisant jų prisitaikančios imuninės tapatybės, yra pagrindinis pavojaus signalo IL šaltinis. -1 (3a pav.). Intraląstelinio IL-1 baltymo ekspresijos nebuvo šviežiai izoliuotose ramybės būsenos TH ląstelėse, bet ji buvo indukuojama T ląstelių receptorių (TCR) aktyvinimu ir žymiai praturtėjo TH17 ląstelės, palyginti su TH1, TH2 ir Treg ląstelėmis praturtintomis TH ląstelėmis (3b pav. , c). Atrodo, kad šie radiniai būdingi žmogaus imuninei sistemai, nes ankstesnėse ataskaitose nebuvo nurodyta, kad pelių T ląstelės gamina IL{21}}16. Unikalus IL-1 ryšys su TH17 ląstelių pogrupiu paskatino mus mechaniškai išskaidyti šio citokino reguliavimą. Įdomu tai, kad IL-1 ekspresija sumažėjo dėl specifinio ROR-t, pagrindinio TH17 ląstelių transkripcijos faktoriaus, slopinimo (3d, e pav.) 1. Šie duomenys atitinka numanomų surišimo vietų buvimą. ROR- t ir ROR- IL1A promotorių ir stiprintuvų srityse (Išplėstiniai duomenys 4a, b pav.). Tam tikro TH ląstelių pogrupio likimą lemia atskira poliarizuojanti citokinų mikroaplinka naivios T ląstelių stimuliacijos metu. Didžiausią tarpląstelinę IL-1 ekspresiją ir sekreciją stebėjome naivių T ląstelių pradinimu TH17 ląsteles poliarizuojančiomis sąlygomis (IL-1 ir transformuojantis augimo faktorius (TGF)-) (3f, g pav.). Tačiau vienkartinis gydymas IL-1 arba TGF- nesukėlė reikšmingos IL-1 ekspresijos naiviose T ląstelėse, pabrėždamas kombinatorinių TH17 ląsteles pirmaujančių citokinų sinerginį poveikį de novo indukcijai IL-1 (papildomas 4 pav.). Priešingai, TH1 (IL-12) ir TH2 (IL-4) ląstelių pradėjimo sąlygos reikšmingai nepakeitė IL-1 sekrecijos, palyginti su stimuliacija, kai nėra poliarizuojančių citokinų. Kartu šie radiniai rodo, kad naivios T ląstelės įgyja gebėjimą gaminti IL-1 per TH17 ląsteles poliarizuojančius citokinus. Atminties TH ląstelės taip pat parodė reikšmingą tolesnį savo IL-1 efektoriaus citokino reguliavimą IL-1 ir TGF- mikroaplinkose (3h pav.).

1 pav.|Atskiras žmogaus TH17 ląstelių pogrupis gali ekspresuoti IL-1.

TH ląstelių pogrupių tapatumas taip pat pasižymi skirtingomis migracijos savybėmis, kurios yra susijusios su skirtinga chemokino receptorių ekspresija20. Pastebėjome, kad IL-1 ekspresija buvo praturtinta CCR6+, bet ne CCR6–T ląstelėse ir sumažėjo CXCR3–T ląstelėse, palyginti su CXCR3+ T ląstelėmis, nors nebuvo jokio skirtumo IL-1 ekspresija tarp CCR4+ ir CCR4–T ląstelių (3i pav.). Šie duomenys rodo, kad IL{10}}gaminančios ląstelės rodo migracijos modelį, anksčiau priskirtą IL-17-gaunančioms ląstelėms15. Visi šie duomenys nuosekliai rodo, kad IL-1 yra unikali žmogaus TH17 ląstelių funkcija.

2 pav.|IL-1 gaminančios TH17 ląstelės yra priešuždegiminės

3 pav.|T ląstelių IL-1 gamyba apsiriboja TH17 ląstelių likimu

Kalpainas yra būtina TH17 ląstelių IL-1 sekrecijos sąlyga

Norėdami ištirti IL-1 sekrecijos mechanizmą, TH17 ląsteles apdorojome baltymų eksporto inhibitoriumi brefeldinu A (BFA) ir nustatėme, kad IL-1 sekrecija nebuvo paveikta, skirtingai nei įprastų citokinų, pvz. kaip IL-17A (išplėstiniai duomenys 5a–c pav.). Tai patvirtina netradicinio ER-Golgi nepriklausomo IL-1 sekrecijos kelio T ląstelėse egzistavimą ir atitinka ankstesnes ataskaitas apie įgimtus ląstelių tipus 21, 22. Unikali savybė, kuri anksčiau buvo priskirta IL-1, yra jo lokalizacija vienu metu citoplazmoje ir plazmos membranoje23. Tačiau mes nustatėme, kad TH17 ląstelės, priešingai nei monocitai, neparodė su membrana susieto IL-1 (išplėstiniai duomenys, 5d pav.). Nors norint sukurti bioaktyvų tarpląstelinį IL-1, reikalingas pro-IL-1 skilimas, žinoma, kad IL-1 pasyviai išsiskiria ląstelėms mirus ir, prisijungęs prie IL{, išnaudoja savo bioaktyvų potencialą. {19}}RI nesuskaidyta arba suskaidyta forma24. Norėdami nustatyti, ar pro-IL-1 yra apdorojamas tarpląsteliniu būdu, kad būtų kontroliuojamas žmogaus T ląstelių išsiskyrimas, įvertinome pilno ilgio ir subrendusias IL-1 formas aktyvuotų TH17 ląstelių supernatante. Norėdami pašalinti bet kokius užteršiančius monocitus kaip galimą išskiriamo IL-1 šaltinį, per 2 savaites sukūrėme TH17 ląstelių klonus ir dar 5 dienas prieš imunoblotavimą juos stimuliavome anti-CD3 ir anti-CD28 monokloniniais antikūnais. Visuose šešiuose ištirtuose TH17 ląstelių klonuose mes nustatėme, kad kultūrų supernatantuose pirmenybė buvo praturtinta suskaidyta IL-1 forma (4a pav.). Priešingai, TH17 ląstelių lizatai, kaip ir tikėtasi, parodė pirmenybę neskaldytos pro-IL -1 formos praturtėjimą (papildomas 5a pav.). Šie rezultatai neįtraukia pasyvaus pro-IL-1 išsiskyrimo ląstelių nekrozės metu, kaip numatytojo IL-1 išėjimo iš T ląstelių būdo, ir vietoj to rodo, kad žmogaus TH17 ląstelės turi turėti pro-IL{{ molekulinį mechanizmą. 46}} skilimas, kad gyvybingos T ląstelės galėtų kontroliuoti šios stiprios bioaktyvios molekulės ekstraląstelinį išsiskyrimą, priešingai nei įgimtos ląstelės (papildomas 5b pav.). Tačiau tai neatmeta papildomo T ląstelių nekrozės indėlio į biologiškai aktyvios IL -1 proformos išlaisvinimą (papildomas 5a pav.). Pro-IL-1 apdorojimą skirtingose ​​skilimo vietose gali katalizuoti kelios proteazės17, 25, 26. Kalpainas yra nuo kalcio priklausoma cisteino proteazė, kuri gali sukelti brandų IL-1 p17 fragmentą26, kurį mes nustatėme čia. Mes nustatėme kalpaino aktyvumą TH17 ląstelėse. Jis padidėjo aktyvuojant anti-CD3 ir anti-CD28 monokloniniais antikūnais (4b pav.). IL-1 sekrecija TH17 ląstelėse priklausė nuo T ląstelėms būdingo kalpaino aktyvumo, nes farmakologinis kalpaino slopinimas sumažino aktyvuotų TH17 ląstelių IL-1 sekreciją į tarpląstelinę erdvę priklausomai nuo dozės (4c pav.) . Atitinkamai, kalpaino slopinimas ląstelėje lėmė pro-IL-1 kaupimąsi (4d pav.). Siekdami patvirtinti IL-1 sekrecijos priklausomybę nuo kalpaino, mes taip pat genetiškai pašalinome kalpainą žmogaus TH17 ląstelėse, naudodami sugrupuotus reguliariai tarpais esančius trumpus palindrominius pasikartojimus (CRISPR) – Cas9. Tai atskleidė CAPN2, bet ne CAPN1, vaidmenį žmogaus TH17 ląstelių IL-1 sekrecijoje (4e pav.). Priešingai, monocitų LPS/nigericino sukelta IL-1 sekrecija nuo kalpaino nepriklausė (4f pav.). Šie duomenys atitiko žmogaus T ląstelių pogrupių CAPN2, bet ne CAPN1, preferencinę ekspresiją, priešingai nei dendritinės ląstelės, kurios rodė atvirkštinį kalpaino geno ekspresijos modelį (papildomas 6 pav.). IL-1 sekrecija TH17 ląstelėse padidėjo dėl kalcio kaupimosi ląstelėje ir sarko-/ER Ca2+ ATPazės slopinimo su tapsigarginu (4g pav.) ir sumažėjo dėl ekstraląstelinio kalcio chelatacijos su (etilenbis(oksinitridu) )tetraacetatas (EGTA) (4h pav.), atitinkantis nuo kalcio priklausomą kalpaino funkciją ir nuo TCR priklausomą IL-1 sekreciją26. Kartu šie duomenys parodė, kad nuo kalcio priklausomos proteazės kalpaino proteolitinis aktyvumas yra būtina sąlyga netradicinei IL{103}} sekrecijai TCR aktyvintose žmogaus TH17 ląstelėse.

IL-1 sekreciją TH17 ląstelėse reguliuoja NLRP3 uždegimo aktyvacija

Nepaisant esminio kalpaino vaidmens pro-IL-1 brendime, mechanizmas, vedantis į suskaidyto IL-1 ekstraląstelinį išėjimą, liko nežinomas, todėl buvo sprendžiamas toliau. Ekstraląstelinis IL-1 išsiskyrimas iš mieloidinių ląstelių anksčiau buvo siejamas su NLRP3 uždegiminiu aktyvavimu, nefermentiniu kaspazės -1 aktyvumu ir IL-1 16,27 išsiskyrimu. Ištyrėme, ar žmogaus TH17 ląstelės turi NLRP3 uždegimo molekulinį karkasą, ir nustatėme NLRP3 baltymo ekspresiją ir adapterio molekulę – su apoptoze susijusį dėmelių pavidalo baltymą, turintį CARD (ASC), žmogaus TH17 ląstelėse (išplėstiniai duomenys 6a pav., b). Mes stebėjome vykstantį uždegiminį aktyvavimą TCR aktyvuotose TH17 ląstelėse, identifikuodami ASC dėmes, naudodami ImageStream technologiją (5a, b pav.) 28, 29. Stebėtina, kad padidėjęs ASC dėmių dažnis buvo unikaliai apribotas TH17 ląstelių pogrupyje (5b pav., kairėje). TH17 ląstelės netgi priartėjo prie LPS ir ATP stimuliuojamų makrofagų ASC dėmės susidarymo (5b pav., dešinėje). Priešingai, TH1 ir TH2 ląstelių pogrupiuose buvo rodomi fono ASC dėmės lygiai (5b pav., kairėje). Be to, esant specifiniam NLRP3 uždegimo inhibitoriui MCC950, ASC dėmės ir NLRP3-dėmės susidarymas buvo visiškai panaikintos, o tai patvirtina nuolatinį NLRP3 uždegiminio aktyvumo buvimą TH17 ląstelėse (5b pav., kairėje ir išplėstiniai duomenys Fig. 6c). TH17 ląstelių selektyvų NLRP3 uždegimo įsitraukimą dar labiau patvirtino stiprus NLRP3 transkriptų indukcija T ląstelių stimuliavimui esant TH17 ląsteles poliarizuojantiems citokinams IL-1 ir TGF- (5c pav.). Svarbu tai, kad TH17 ląstelių IL-1 sekrecija buvo žymiai sumažinta specifiniu NLRP3 uždegimo slopinimu MCC950 (5d pav.), taip parodydamas kritinį NLRP3 uždegimo vaidmenį išskiriant IL-1. žmogaus TH17 ląstelės. Kaspazė{55}} yra kanoninis efektorinis baltymas NLRP3 uždegiminiame komplekse30. Stebėjome pro-kaspazės{59}} ekspresiją aktyvuotose žmogaus TH17 ląstelėse (5e pav.). Tačiau, priešingai nei LPS ir nigericino stimuliuojamuose monocituose, žmogaus TH17 ląstelių lizatuose skilusios kaspazės -1 neaptikta (5e pav.). Šį stebėjimą patvirtino kaspazės-1 FLICA dažymo nebuvimas TH17 ląstelėse, kurios buvo stimuliuojamos, kai yra IL-1 skatinančių citokinų dirgiklių arba jų nėra (išplėstiniai duomenys, 7a–e pav.). Be to, ELISA metodu pašalinome ekstraląstelinį kaspazės -1 išsiskyrimą po TH17 ląstelių stimuliavimo anti-CD3 ir anti-CD28 monokloniniais antikūnais 5 dienas (5f pav.). Net ir esant IL-1 dirgikliui IL-1, kaspazės-1 sekrecija nebuvo indukuojama ir išliko tokia pat maža kaip ramybės būsenos monocituose (5f pav.). Farmakologinis kaspazės-1 slopinimas naudojant Ac-YVAD-CMK nesumažino IL-1 sekrecijos, kai IL-1 indukuoja IL-1 arba jos nėra. Atvirkščiai, stebėjome šiek tiek padidėjusį IL-1 sekreciją dėl kaspazės-1 slopinimo (papildomas 7a, b pav.). Svarbu tai, kad TH17 ląstelės nepakeitė IL-1 sekrecijos dėl CRISPR–Cas9- inžinerinio CASP1 ekspresijos išeikvojimo (5g pav.). Kadangi nėra biologiškai aktyvios kaspazės{97}}, nepastebėjome, kad žmogaus TH17 ląstelės išskiria IL{98}}. Tai buvo priešingai nei monocitų atveju, kurie, stimuliuojant LPS ir ATP, parodė kaspazės priklausomą IL{101}} sekreciją (išplėstiniai duomenys, 7f pav.). Be to, TH17 ląstelėse ar TH17 ląstelių klonuose IL-1poliarizuojančiais citokinais nebuvo aptinkamas ar indukuojamas viduląstelinis IL{103}} arba aptinkamas aktyvuotose TH17 ląstelėse atliekant scRNA-seq analizę (išplėstiniai duomenys, 7g, h pav., i). Tai priešingai nei monocitų, kurie kartu ekspresavo IL-1 ir IL-1 vienos ląstelės lygmeniu, išvados, atitinka anksčiau pasiūlytą abiejų IL-1 sekrecijos ir tariamo koreguliavimo modelį. citokinai (Išplėstiniai duomenys 7g pav.)16,27. Visi šie duomenys rodo, kad žmogaus TH17 ląstelės gamina IL-1 nepriklausomai nuo kaspazės-1 ir IL-1, skirtingai nei monocitai ir, tikėtina, kitos įgimtos imuninės ląstelės, nepaisant aiškaus NLRP3 uždegimo dalyvavimo.

cistanche tubulosa - stiprina imuninę sistemą

Spustelėkite čia norėdami pamatyti Cistanche Enhance Immunity produktus

【Klauskite daugiau】 El. paštas:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

IL-1a išeina iš TH17 ląstelių per GSDME poras

Gasderminai priklauso neseniai identifikuotų poras formuojančių efektorių molekulių šeimai, kurios leidžia išskirti uždegiminius mediatorius31. Mūsų transkripto analizė atskleidė selektyvų GSDME ekspresijos reguliavimą priešuždegiminių IL-1 -stimuliuojamų TH17 ląstelių pogrupyje, bet nereguliuoja jokio kito gastrino šeimos nario (6a pav.). Tai buvo stebina, turint omenyje, kad GSDME ekspresija niekada anksčiau nebuvo pranešta pirminėse T ląstelėse. Priešingai, GSDMD, kuris, kaip žinoma, yra reguliuojamas NLRP3 uždegimo ir yra kaspazės -1 taikinys (31 nuoroda), nebuvo reguliuojamas, o tai palaiko nekanoninio NLRP3 uždegimo signalizacijos idėją. Anksčiau buvo įrodyta, kad GSDME formuoja membranines poras įgimtose imuninėse ląstelėse, kurios gali būti kanalai tarpląsteliniam signalinų išsiskyrimui ir inicijuoti piroptozinę ląstelių mirtį, panašią į GSDMD32. Norėdami patikrinti GSDME ryšį su TH17 ląstelių pogrupiu, įvertinome, ar TH17 ląsteles poliarizuojantys citokinai kartu reguliuoja GSDME. Tik TGF- derinys su IL-1 (TH17), bet ne IL-12 (TH1) ar IL-4 (TH2), padidino GSDME nuorašo lygį, įvertintą atvirkštinės transkripcijos metodu. PGR (RT–qPCR) (6b pav.). Tai patvirtino tariamos surišimo vietos su TH17 ląstelėmis susijusių transkripcijos faktorių ROR- ir BATF (pagrindinis leucino užtrauktuko transkripcijos faktorius, panašus į ATF) GSDME promotorių regionuose (išplėstiniai duomenys 8a, b pav.)33. GSDMD ekspresija, priešingai, nebuvo reguliuojama T ląsteles poliarizuojančiais citokinais (papildomas 8 pav.). Šis rezultatas paskatino mus įvertinti GSDME ekspresiją baltymų lygiu žmogaus TH17 ląstelėse. GSDME proforma buvo indukuojama aktyvinant TCR. GSDME baltymo indukcija, reaguojant į šį adaptyvų imuninį signalą, buvo netikėta, bet dar labiau paremta spėjamų į TCR signalus reaguojančių transkripcijos faktorių, tokių kaip NFAT, FOS, JUN ir RELA, surišimo vietos GSDME promotorių regionuose (išplėstiniai duomenys 8a pav. ,b). GSDME buvo išreikštas jau 24 valandas po polikloninės stimuliacijos. Suskaldytas N-galą poras formuojantis GSDME buvo aptinkamas vėlyvu metu, praėjus 3–4 dienoms po TH17 ląstelių TCR stimuliacijos (6c pav.). Viso ilgio GSDMD buvo sukeltas aktyvinant T ląsteles. Priešingai, GSDMD skilimo nepastebėta, kaip buvo prognozuota dėl kaspazės-1 ir IL-1 sekrecijos nebuvimo, todėl GSDMD vaidmuo TH17 ląstelėse liko atviras tolesnei analizei (6c pav.). Toliau siekėme ištirti, ar GSDME poros yra kanalai tarpląsteliniam IL-1 išsiskyrimui TH17 ląstelėse. Todėl mes pašalinome GSDME su CRISPR–Cas9 technologija ir ELISA metodu stebėjome IL-1 išsiskyrimą į supernatantą laikui bėgant. GSDME, bet ne GSDMD nebuvimas reikšmingai slopino IL-1 išsiskyrimą iš TH17 ląstelių (6d pav.). Tai aiškiai parodo, kad GSDME porų susidarymas yra netradicinio IL-1 išsiskyrimo iš žmogaus TH17 ląstelių mechanizmas.

4 pav|Kalpainas yra būtina sąlyga, kad žmogaus TH17 ląstelės išskirtų suskaidytą IL-1

5 pav|Netradicinis NLRP3 uždegiminis aktyvinimas reguliuoja žmogaus TH17 ląstelių IL-1 gamybą

Kaspazės{0}}/3 GSDME skilimo kaskada įgalina NLRP3-priklausomą IL-1 sekreciją

Toliau ištyrėme mechaninio susikirtimo tarp NLRP3 uždegiminio aktyvavimo ir GSDME skilimo žmogaus TH17 ląstelėse galimybę. Neseniai buvo įrodyta, kad kaspazė-3 skaldo GSDME, kuri savo ruožtu yra NLRP3 uždegiminės sąveikos kaspazės-8 taikinys (34, 35 nuorodos). Iš tiesų, TH17 ląstelėse buvo aptikta ir prokaspazė-8, ir prokaspazė-3. Mes nustatėme, kad abiejų kaspazių skilimas įvyko stimuliuojant TCR ir prieš GSDME skilimą (6e pav.). Priešingai, nigericino ir LPS stimuliuojamuose monocituose kaspazės -8 ir kaspazės-3 skaidytų produktų neaptikta (6e pav.). Norėdami nustatyti šių kaspazių priežastinį vaidmenį skaidant GSDME ir išskiriant IL-1 T ląstelėse, mes farmakologiškai blokavome kaspazės-3 arba kaspazės-8 aktyvumą inhibitoriumi Z-DEVD. -FMK arba Z-IETD-FMK, atitinkamai. Kaspazės -8 aktyvumo slopinimas naudojant Z-IETD-FMK panaikino pasroviui esančios tikslinės kaspazės-3 skilimą, kaip ir ankstesnėse ataskaitose apie kitus ląstelių tipus36. Abu gydymo būdai sumažino GSDME skilimą, kartu panaikindami IL-1 sekreciją (6f–i pav. ir išplėstiniai duomenys, 9a, b pav.). Vietoj to, kaspazės-1 slopinimas neturėjo įtakos kaspazės-3 arba GSDME skilimui (papildomas 9 pav.). Šie duomenys aiškiai parodė, kad kaspazės-8–kaspazės-3–GSDME ašis veikė žmogaus TH17 ląstelėse, kai buvo aktyvuota TCR, ir kad ji reguliavo IL-1 sekreciją šiose ląstelėse. Siekdami galutinai nustatyti ryšį tarp šios proteolitinio skilimo kaskados ir NLRP3 uždegimo, stimuliuotoms TH17 ląstelėms pritaikėme MCC950, dėl kurių 5 dieną iš tikrųjų sumažėjo kaspazės -3 ir GSDME skilimas (6f pav., g). ir išplėstiniai duomenys 9c pav.). Tačiau tuo pačiu analizės momentu kaspazės -8 skilimo sumažėjimas buvo ne toks ryškus, o tai atitiko ankstesnį aktyvavimo laiko langą (6e, f pav.). Apibendrinant galima pasakyti, kad tikslingai slopinant kiekvieną atskirą molekulinį žaidėją, NLRP3 uždegimo-kaspazės{50}}-kaspazės{50}}-GSDME kaskadas yra proteolitinis kelias, susijęs su žmogaus bioaktyvaus IL{52}} ekstraląsteliniu išsiskyrimu. TH17 ląstelės.

6 pav.|NLRP3-casp8/3 skilimo kaskada veda į GSDME poras IL-1 išlaisvinimui

TH17 ląstelės yra atsparios piroptozei, nepaisant GSDME porų

Gasdermino porų susidarymas anksčiau buvo siejamas su piroptotine ląstelių mirtimi įvairių tipų ląstelėse 13, 14, 37. Mes nustatėme suskaldytų poras formuojančių N-GSDME vieneto ekspresiją plazmos membranoje, bet ne citozolyje, kuri palaikė GSDME poras formuojančią funkciją T ląstelėse (7a pav.). Keista, bet nepažeistų GSDME ir CRISPR-Cas9 genų redaguotų, GSDME trūkumų turinčių masinių žmogaus TH17 ląstelių transkriptominis palyginimas GSEA atmetė įvairių ląstelių mirties formų skirtumus; tačiau ypač atskleidė, kad paveikti procesai ir keliai TH17 ląstelėse, kuriose trūksta GSDME, daugiausia buvo susiję su genais, kontroliuojančiais transmembraninį transportą, atsižvelgiant į N-GSDME suformuotus poras formuojančius kanalus (7b pav. ir papildomas 10 pav.). . Atskirų TH17 ląstelių, atrinktų pagal GSDME raiškos buvimą ir nebuvimą, vienos ląstelės transkriptominis palyginimas patvirtino GSDME ekspresuojančių TH17 ląstelių gyvybingumą, nes jų genų rinkinys buvo praturtintas proliferacijai (7c pav.). Galiausiai patvirtinome žmogaus GSDME ekspresuojančių TH17 ląstelių atsparumą piroptozei, parodydami, kad CRISPR – Cas9 geno redaguotose, GSDME trūkumo ir GSDME nepažeistose TH17 ląstelėse, stimuliuojant TCR, nėra jokio laktato dehidrogenazės (LDH) išsiskyrimo skirtumo (1 pav. . 7d). Tada palyginome IL-1 + ir IL-1 – TH17 ląsteles pagal jų gyvybingumą ir dauginimosi potencialą, nes TH17 ląstelės nerodė jokios IL-1 paviršiaus ekspresijos, priešingai nei IL{{36 }}gaminančios kitų ląstelių linijų ląsteles, pvz., monocitus (išplėstiniai duomenys 5d pav.). Palyginus IL-1 + ir IL-1 – TH17 ląsteles, reikėjo atlikti naminį IL-1 -sekrecijos tyrimą, leidžiantį išskirti gyvybingas IL-1 + - TH17 ląsteles fiksuojant išskiriamas ląsteles. autokrininis IL-1 į ląstelės paviršių po forbol-12-miristato-13-acetato (PMA) ir jonomicino stimuliacijos. TH17 ląstelių, kurios buvo nusodintos kaip atskiros ląstelės, klonavimo efektyvumas nesiskyrė po rūšiavimo pagal paviršiaus IL -1 buvimą ar nebuvimą (papildomas 11 pav.). Šis atradimas atmetė IL-1 + ir IL-1 – TH17 ląstelių gyvybingumo ir išsiplėtimo skirtumus vienos ląstelės lygmeniu. Toliau klonavome TH17 klonus, kurie buvo tikrinami, remdamiesi įvairaus laipsnio tarpląsteline IL-1 ekspresija, ir stebėjome atitinkamą jų klonavimo efektyvumą. Jei GSDME įgalintas IL-1 išsiskyrimas buvo susijęs su piroptotine ląstelių mirtimi, atvirkštinė koreliacija tarp IL-1 ekspresijos T ląstelių klonuose ir klonų auginimo dažnio jų individualaus perklonavimo metu (klonavimo efektyvumas) buvo būti tikimasi. Tačiau T ląstelių perklonavimo efektyvumas nepriklauso nuo IL-1 ekspresijos lygių TH17 ląstelių klonuose ir buvo panašus į kontrolinių T ląstelių klonų, atrinktų pagal skirtingus IFN ekspresijos lygius, nesant IL-1 koekspresija (7e pav.). Svarbu tai, kad IL-1 + TH17 ląstelių klonai ir toliau iš naujo ekspresavo IL-1 pasikartojančių TCR restimuliacijos ciklų metu (7f pav.). Taigi, su ląstelių mirtimi susijęs IL-1 -gaminančių ląstelių iš atitinkamų kloninių T ląstelių populiacijos praradimas pakartotinio stimuliavimo metu buvo atmestas. Pažymėtina, kad šis atradimas rodo T ląstelių citokinų atmintį indukuojamam IL-1. Atlikome transkriptominį IL-1 + ir IL-1 – TH17 ląstelių palyginimą ir pastebėjome dar didesnį proliferacijos genų rinkinių praturtėjimą IL-1 +, palyginti su IL-1 – TH17 ląstelėmis. klonai (7g pav.). Vienos ląstelės transkriptominis IL1A+ ir IL1A–TH17 ląstelių palyginimas patvirtino transkriptominį proliferacijos praturtėjimą. Taip buvo ir palyginus Leideno 1 klasterį, kuris buvo praturtintas IL1A ekspresuojančiomis TH17 ląstelėmis ir uždegiminiais požymiais, su visais kitais klasteriais (7h pav.). IL-1 + TH17 ląstelės rodė didesnę Ki67 ekspresiją pagal srauto citometrinę analizę nei jų IL-1 – atitikmenys po 5 dienų polikloninės stimuliacijos (7i pav.), dar kartą patvirtinant mintį, kad žmogaus TH17 ląstelėse IL{ {96}} išėjimas nėra susijęs su ląstelių mirtimi, skirtingai nei įgimtose ląstelėse. Bendrai šie duomenys atmeta ryšį tarp IL-1 gamybos ir (piroptotinės) ląstelių mirties net ir vienos ląstelės lygmenyje ir rodo, kad žmogaus T ląstelės turi citokinų atmintį IL-1 gamybai, kai pakartotinai stimuliuojama TCR. .

T ląstelių kilmės IL-1 prisideda prie šeimininko priešgrybelinės gynybos

Mūsų atradimas, kad žmogaus TH17 ląstelės gamina įgimtą pavojaus signalą IL-1 ir perskiria įgimtą signalizacijos mechanizmą jo ekstraląsteliniam išsiskyrimui, sujaukia adaptacinio ir įgimto imuninio atsako skirtumą ir taip praplečia bendrą funkcinį T ląstelių repertuarą. Kritinė savybė, kuri išlieka būdinga prisitaikantiems atminties atsakams, yra TCR suteiktas antigeno specifiškumas. Todėl ištyrėme, ar žmogaus TH17 ląstelių gebėjimas gaminti IL-1 apsiriboja specifiniais antigeno ypatumais. Anksčiau buvo įrodyta, kad TH17 ląstelės yra labai praturtintos ląstelėse, kurios yra specifinės C. albicans ir Staphylococcus aureus antigenams15. Įdomu tai, kad mes pastebėjome žymiai didesnę IL-1 ekspresiją ir sekreciją C. albicans specifiniais nei S. aureus specifiniais TH17 ląstelių klonais (8a pav.). Toliau ištyrėme, ar naivios T ląstelės, atpažįstančios C. albicans, o ne S. aureus, būtų sukurtos jų giminingo antigeno, kad selektyviai gamintų IL-1. Naivios (CD45RA+ CCR7+ ) TH ląstelės buvo kultivuojamos kartu su autologiniais monocitais, pulsuojančiais termiškai inaktyvuotais C. albicans arba S. aureus antigenais arba stimuliuojamos polikloniškai anti-CD3 ir anti-CD28 monokloniniais antikūnais, o po to klonuotos 7 dieną. su alogeninėmis maitinančiomis ląstelėmis. Visi klonai buvo pakartotinai stimuliuojami 14 dieną anti-CD3 ir anti-CD28 monokloniniais antikūnais 5 dienas jų supernatantų ELISA tyrimui. Stebėtina, kad C. albicans, bet ne S. aureus ar polikloninis TCR aktyvinimas, sukėlė de novo IL-1 gamybą žmogaus diferencijuojančiose TH17 ląstelėse (8b pav.). Todėl mūsų kombinuotas ex vivo atšaukimas ir in vitro pradinis metodas rodo, kad gebėjimas gaminti IL-1 apsiriboja T ląstelėmis, turinčiomis TCR specifiškumą C. albicans. Galiausiai išbandėme, ar išskirtinis C. albicans specifinių TH17 ląstelių gebėjimas gaminti IL-1 yra susijęs su fiziologiniu vaidmeniu priešgrybelinėje šeimininko gynyboje. Tam mes kartu kultivavome žmogaus monocitus su supernatantais iš žmogaus TH17 ląstelių po jų polikloninio pakartotinio stimuliavimo anti-CD3 ir anti-CD28 monokloniniais antikūnais 5 dienas. Naudodami srauto citometriją, stebėjome, kad monocitai žymiai padidino FITC pažymėto C. albicans fagocitozę. Svarbu tai, kad padidėjusi C. albicans fagocitozė dėl TH17 ląstelių supernatantų buvo priklausoma nuo IL-1, kaip rodo reikšmingas C. albicans fagocitozės panaikinimas, jei TH17 ląstelių supernatantuose nebuvo IL-1 po imuninės absorbcijos arba {CRISPR–Cas {46}}tikslinis IL-1 išeikvojimas TH17 ląstelėse (8c pav.). Gyvų ląstelių in vitro vaizdavimas dar labiau patvirtino padidėjusį C. albicans įsisavinimą ir pašalinimą iš monocitų, kai yra IL{50}}turinčių TH17 ląstelių supernatantų (8d pav., vaizdo įrašo duomenys). Apibendrinant galima teigti, kad TH17 ląstelės išvalo C. albicans infekcijas ne tik gamindamos IL -17, kaip buvo manyta anksčiau38, bet ir didžiąja dalimi dėl unikalaus TH17 ląstelių pogrupio gebėjimo gaminti IL-1 . Apskritai išvados, pagal kurias GSDME porų susidarymas T ląstelėse yra priešuždegiminio IL{58}} pasitraukimo strategija, ir GSDME reguliavimas pagal NLRP3 uždegiminės-kaspazės{60}}-kaspazės-3 ašį atskleidžia naują T ląstelių citokinų sekrecijos būdas, susijęs su priešuždegiminiu TH17 ląstelių pogrupiu, turinčiu priešgrybelinio TCR specifiškumo. Tai suteikia naujų terapinių tikslų žmogaus TH17 ląstelių moduliavimui, kurie yra svarbūs priešgrybelinei šeimininko apsaugai ir taip pat gali dalyvauti lėtinių uždegiminių ligų patogenezėje.

cistanche tubulosa - stiprina imuninę sistemą

Diskusija

Apibendrinant, mūsų išvados atskleidžia anksčiau nežinomą biologinį kelią ir citokinų sekrecijos būdą žmogaus T ląstelėse, kuris paįvairina bendrą T ląstelių populiacijos funkcionalumą. Mes nustatėme, kad IL-1 ekspresija unikaliai apsiribojo TH17 ląstelių likimu, kaip rodo jos koekspresija su IL-17A, reguliavimas ROR-t, indukcija TH17 ląsteles pirmaujančių citokinų IL{{ 6}} ir TGF- bei jo su TH17 ląstelėmis susieto chemokino receptorių ekspresijos profilis. Šie radiniai atitinka ROR-t ir ROR- surišimo vietų buvimą IL1Α stipriklio ir promotoriaus regionuose, kaip aprašyta šiame tyrime, ir su anksčiau praneštomis ROR-t surišimo vietomis NLRP3 promotoriaus srityje39. Be to, pastebėjome, kad TH17 ląsteles papildantys citokinai padidino NLRP3 ir GSDME ekspresiją. Atitinkamai, pagrindiniai TH17 ląstelių likimo reguliatoriai, tokie kaip ROR- ir BATF, taip pat keli TCR indukuojami transkripcijos faktoriai, parodė galimas surišimo vietas GSDME stipriklio regionuose. Todėl TH17 ląstelių poliarizacija skatino ne tik IL-1 ekspresiją, bet ir jos ekstraląstelinį išėjimą (Išplėstinių duomenų 10 pav., grafinė santrauka). Netikėtai pastebėjome, kad NLRP3 uždegimas yra aktyvus ir yra pakartotinai skirtas IL-1, o ne IL-1, atpalaidavimui TCR aktyvuotose TH17 ląstelėse. Skirtingai nuo įgimtų ląstelių, T ląstelės nėra specializuotos įgimtam pavojaus jutimui, kuris, kaip žinoma, sukelia NLRP3 uždegiminių komponentų surinkimą. Tačiau anksčiau buvo įrodyta, kad padidėjęs citoplazminis Ca2+ apeina įgimtą NLRP3 uždegiminio aktyvinimo pavojaus signalą16, 40. Tai atitinka mūsų išvadą, kad TCR aktyvacija, kurią lydi kalcio srautas, yra būtinas žmogaus TH17 ląstelių IL-1 išsiskyrimui. Pastebėjome, kad TH17 ląstelės įtraukė alternatyvią NLRP3 signalizacijos kaskadą pasroviui per kaspazę-8. Tai galėjo palengvinti kaspazės-1 skilimo nebuvimas, nes konkurencinis kaspazės-1 ir kaspazės-8 uždegiminis prisitraukimas buvo įrodytas anksčiau34,41. Žmogaus TH17 ląstelėse taip pat aptikome prokaspazės-1 ir nesuskaidyto GSDMD, bet nėra įrodymų, kad jų NLRP3 uždegimas reguliuojamas skilimas arba IL{51}} gamyba. Jų pirmtakų ekspresija kelia klausimą, ar klasikinis NLRP3 uždegimo signalizavimas ir IL-1 išsiskyrimas taip pat gali veikti žmogaus TH17 ląstelėse, jei bus taikomi alternatyvūs dar nenustatyti dirgikliai. Tai reiškia, kad nuo kaspazės -8- ir kaspazės-1- priklausomi priešreguliavimo mechanizmai gali kontroliuoti T ląstelių IL-1 ir IL-1 gamybos dichotomiją, sutvirtindami anksčiau pasiūlytus NLRP3 uždegimo vaidmenis. IL-1 išsiskyrime žmogaus TH1 ląstelėse42 ir pelių TH17 ląstelėse43. Įdomus mūsų tyrimo stebėjimas buvo GSDME ekspresijos ir skilimo T ląstelėse nustatymas. Tai atskleidė, kad T ląstelėse gali atsirasti netradicinė citokinų sekrecija per membranos poras. Kai kurios neseniai GSDME priskirtos funkcijos buvo susijusios su piroptoze ir vėlesniu naviko ląstelių mirties bei uždegiminės mikroaplinkos padidėjimu 32, 44. Keista, bet mes nustatėme, kad GSDME ekspresuojančios TH17 ląstelės, palyginti su GSDME trūkumo T ląstelėmis, parodė išsaugotą gyvybingumą ir nuolatinį proliferaciją, kai stimuliuoja TCR. Tie patys rezultatai buvo pastebėti naudojant IL-1 +, palyginti su IL-1 – T ląstelėmis. Šie atradimai buvo netikėti, turint omenyje, kad IL-1 gamyba iki šiol buvo laikoma senėjimo, taigi ir replikacijos sustabdytų arba mirštančių ląstelių požymiu45. Tai sukelia mintį, kad pavojaus signalas IL-1 gali būti su T ląstelėmis susietos citokinų atminties dalis, kuri vėl sužadinama atpažįstant giminingą antigeną46. Be to, GSDME poros gali atlikti fiziologinę funkciją, leidžiančią TH17 ląstelėms išleisti papildomas dar neatpažintas molekules už IL-1, kurios apibrėžiamos pagal jų dydį arba krūvį47. Tai atitiktų mūsų nešališko transkriptominio GSDME nepažeistų arba CRISPR-Cas sukurtų, GSDME trūkumo TH17 ląstelių palyginimo rezultatus, kurie atskleidė daugybę GSDME vaidmenų transportuojant per membraną, bet ne ląstelių mirtį. Ateityje dar reikia ištirti mechanizmą, kuriuo išsaugomas gyvybingumas ir ilgalaikė IL-1 citokinų atmintis T ląstelėse su GSDME poromis. IL-1 prieinamumas iš skirtingų ląstelių šaltinių, ypač iš įgimtų APC, kelia klausimą apie santykinį T ląstelių kilmės IL-1 indėlį į žmonių sveikatą ir ligas. Nors IL-1 + T ląstelės sudaro tik nedidelį pogrupį T ląstelių linijoje, jų gebėjimas gaminti IL-1 buvo kiekybiškai panašus į LPS stimuliuojamų monocitų gebėjimą, o tai patvirtina naują koncepciją, kad T ląstelės gali tarnauti. kaip atitinkamas uždegiminio IL šaltinis-1. Mūsų išvados iš transkriptominės ir funkcinės analizės rodo, kad IL{100}} yra susijęs su priešuždegiminiu TH17 ląstelių likimu. Žmogaus TH17 ląstelių IL{102}} subpopuliacija parodė transkriptinius padidėjusio uždegiminio patogeniškumo požymius ir sąsajas su lėtinėmis uždegiminėmis ligomis. Žymiai sustiprinta IL{104}} ekspresija, kurią sukelia JIA sergančių pacientų TH17 ląstelės, ir gausi jų lokalizacija uždegiminiame sinoviniame skystyje palaiko šį patogeninį TH17 ląstelių IL-1 + pogrupio potencialą. Griežtas priežastinis ryšys tarp IL-1 -gaminančių TH17 ląstelių ir JIA patogenezės dar turi būti nustatytas, o santykinis IL-1 + TH17 ląstelių poveikis patvirtintas būsimuose klinikiniuose tyrimuose. Įspūdingas pastebėjimas buvo tas, kad IL{112}} gamyba T ląstelėse yra susijusi su jų TCR specifiškumu. Nors IL-1 gamybą iš įgimtų ląstelių šaltinių sukelia nespecifiniai streso dirgikliai16, mes nustatėme, kad žmogaus TH17 ląstelių IL-1 gamyba yra susijusi su TCR specifiškumu C. albicans. Vietoj to, S. aureus specifinės TH17 ląstelės žymiai sumažino IL-1 gamybą. Šie radiniai atitinka skirtingą IL-1 poreikį generuoti C. albicans, bet ne S. aureus specifines TH17 ląsteles, kaip buvo pranešta anksčiau4, ir, atitinkamai, lemiamą IL vaidmenį{126} } IL-1 išraiškos indukcijai, kaip nurodyta čia. Be to, nustatėme, kad IL-1 sekrecija priklauso nuo TCR stimuliacijos ir kalcio signalų, pabrėždami glaudų jos ryšį su specifiniu adaptyviu imuniniu signalizavimu per TCR. Yra žinoma, kad TH17 ląstelės yra pagrindinės C. albicans infekcijų šalinimo veikėjos, nes jos išskiria IL{130}}, o tai yra C. albicans disbiozės pavyzdys esant genetiniams arba terapiniams IL-17 trūkumams38. Mes nustatėme, kad TH17 ląstelių produktas IL-1 yra susijęs su C. albicans klirensu, nes jo nebuvimas TH17 ląstelių supernatantuose žymiai sumažino monocitų sukeliamą C. albicans fagocitozę. Tai rodo, kad priešgrybelinės TH17 ląstelių efektoriaus funkcijos veikia ne tik per IL-17A/F, kaip buvo pasiūlyta anksčiau, bet ir per IL-1 specifiniu TCR būdu. Todėl ateityje reikės patikrinti, ar nenormalus molekulinio kelio, vedančio į IL-1 gamybą TH17 ląstelėse, reguliavimas gali lemti priešgrybelinio šeimininko gynybos pažeidimą. Apskritai, mūsų išvados sudaro sąlygas sistemingam IL{142}}produktų, gaminančių TH17 ląstelių, indėlio į įvairias uždegimines ligas ir priešgrybelinės šeimininko gynybos tyrimus. TCR–NLRP3 uždegiminė–kaspazė-8–kaspazė-3–GSDME ašis ne tik atspindi anksčiau nepastebėtą imuninės sistemos signalizacijos ir likimo nurodymų TH ląstelėse būdą, bet ir suteikia molekulinius taikinius, kurie gali sutrikdyti patogeninės TH17 ląstelės veiklą. tapatybę arba panaudoti ją šeimininko gynybai.

7 pav.|TH17 ląstelės yra atsparios piroptozei, nepaisant GSDME plazmos membranos porų.

8 pav.|TCR specifiškumas kontroliuoja IL-1 gamybą, prisidedančią prie C. albicans klirenso

Nuorodos

1. Ivanovas, II ir kt. Našlieji branduolio receptoriai RORgammat vadovauja priešuždegiminių IL-17+ T pagalbinių ląstelių diferenciacijos programai. Cell 126, 1121–1133 (2006).

2. Zwicky, P., Unger, S. & Becher, B. Interleukino{1}} taikymas sergant lėtinėmis uždegiminėmis ligomis: klinikinė perspektyva. J. Exp. Med. 217, e20191123 (2020).

3. Stockinger, B. & Omenetti, S. T helper 17 ląstelių dichotominė prigimtis. Nat. Rev. Immunol. 17, 535–544 (2017).

4. Zielinski, CE ir kt. Patogeno sukeltos žmogaus TH17 ląstelės gamina gama IFN arba IL-10 ir yra reguliuojamos IL-1beta. Nature 484, 514–518 (2012).

5. Ghoreschi, K. ir kt. Patogeninių TH17 ląstelių generavimas nesant TGF-beta signalizacijos. Nature 467, 967–971 (2010).

6. Noster, R. ir kt. Priešuždegiminių ir priešuždegiminių žmogaus TH17 ląstelių funkcijų reguliavimas esant autouždegiminiam Schnitzlerio sindromui. J. Allergy Clin. Immunol. 138, 1161–1169.e1166 (2016).

7. Aschenbrenner, D. ir kt. Imunoreguliacinė ir audinių rezidentūros programa, moduliuojama c-MAF žmogaus TH17 ląstelėse. Nat. Immunol. 19, 1126–1136 (2018).

8. Wu, C. ir kt. Patogeninių TH17 ląstelių indukcija indukuojama druskos jutimo kinaze SGK1. Nature 496, 513–517 (2013).

9. Matthias, J. ir kt. Druska generuoja priešuždegimines Th17 ląsteles, bet sustiprina patogeniškumą priešuždegiminėje citokinų mikroaplinkoje. J. Clin. Investuoti. 130, 4587–4600 (2020).

10. Cavalli, G. ir kt. Interleukinas 1alfa: išsami IL-1alfa vaidmens autoimuninių ir uždegiminių ligų patogenezėje ir gydyme apžvalga. Autoimuninė. Rev. 20, 102763 (2021).

11. Acosta-Rodriguez, EV, Napolitani, G., Lanzavecchia, A. ir Sallusto, F. Interleukins 1-beta ir 6, bet ne transformuojantis augimo faktorius-beta, yra būtini norint diferencijuoti interleukiną 17-gaminančias žmogaus T pagalbines ląsteles . Nat. Immunol. 8, 942–949 (2007).

12. Latz, E., Xiao, TS ir Stutz, A. Uždegimų aktyvinimas ir reguliavimas. Nat. Rev. Immunol. 13, 397–411 (2013).

13. Shi, J. ir kt. GSDMD skilimas uždegiminėmis kaspazėmis lemia piroptotinę ląstelių mirtį. Nature 526, 660–665 (2015).

14. Liu, X. ir kt. Uždegimo suaktyvintas derminas D sukelia piroptozę, sudarydamas membranos poras. Gamta 535, 153–158 (2016).

15. Acosta-Rodriguez, EV ir kt. Žmogaus interleukiną 17- gaminančių T pagalbinių atminties ląstelių paviršiaus fenotipas ir antigeninis specifiškumas. Nat. Immunol. 8, 639–646 (2007).

16. Gross, O. ir kt. Uždegiminiai aktyvatoriai sukelia interleukino- 1alfa sekreciją skirtingais būdais ir skirtingais reikalavimais kaspazės proteazės funkcijai-1. Imunitetas 36, 388–400 (2012).

17. Malik, A. & Kanneganti, TD IL-1alfa funkcija ir reguliavimas sergant uždegiminėmis ligomis ir vėžiu. Immunol. Rev. 281, 124–137 (2018).

18. Cimaz, R. Sisteminis jaunatvinis idiopatinis artritas. Autoimuninė. Rev. 15, 931–934 (2016).

19. Fong, KY, Boey, ML, Koh, WH ir Feng, PH Citokinų koncentracijos reumatoidiniu artritu sergančių pacientų sinoviniame skystyje ir plazmoje: koreliacija su kaulų erozija. Clin. Exp. Reumatolis. 12, 55–58 (1994).

20. Eyerich, S. & Zielinski, CE Th-ląstelių pogrupių apibrėžimas klasikiniu ir specifiniu audiniui būdu: odos pavyzdžiai. Euras. J. Immunol. 44, 3475–3483 (2014).

21. Monteleone, M., Stow, JL ir Schroder, K. Netradicinės IL-1 šeimos citokinų sekrecijos mechanizmai. Cytokinas, 74, 213–218 (2015).

22. Keller, M., Ruegg, A., Werner, S. & Beer, HD Aktyvi kaspazė-1 yra netradicinės baltymų sekrecijos reguliatorius. Cell 132, 818–831 (2008).

23. Kurt-Jones, EA, Beller, DI, Mizel, SB ir Unanue, ER Su membrana susieto interleukino 1 identifikavimas makrofaguose. Proc. Natl Akad. Sci. USA 82, 1204–1208 (1985).

24. Mosley, B. ir kt. Interleukino-1 receptorius jungiasi su žmogaus interleukino-1 alfa pirmtaku, bet ne su interleukino-1 beta pirmtaku. J. Biol. Chem. 262, 2941–2944 (1987).

25. Carruth, LM, Demczuk, S. & Mizel, SB. Į kalpainą panašios proteazės įtraukimas į pelių interleukino 1alfa pirmtaką. J. Biol. Chem. 266, 12162–12167 (1991).

26. Kobayashi, Y. ir kt. Kalciu aktyvuotos neutralios proteazės, kaip žmogaus interleukino 1 alfa perdirbimo fermento, identifikavimas. Proc. Natl Akad. Sci. USA 87, 5548–5552 (1990).

27. Fettelschoss, A. ir kt. Uždegiminis aktyvinimas ir IL-1beta tikslinė IL-1alfa sekrecijai, o ne paviršiaus ekspresijai. Proc. Natl Akad. Sci. USA 108, 18055–18060 (2011).

28. Franklin, BS, Latz, E. ir Schmidt, FI ASC dėmių intra- ir ekstraląstelinės funkcijos. Immunol. Rev. 281, 74–87 (2018).

29. Nagar, A., DeMarco, RA & Harton, JA. Uždegimo ir kaspazės{1}} aktyvumo apibūdinimas ir įvertinimas: vaizdų srauto citometru pagrįstas uždegiminių dėmių ir kaspazės -1 aktyvacijos aptikimas ir įvertinimas. J. Immunol. 202, 1003–1015 (2019).

30. Rathinam, VA & Fitzgerald, KA Uždegiminiai kompleksai: atsirandantys mechanizmai ir efektoriaus funkcijos. Cell 165, 792–800 (2016).

31. Broz, P., Pelegrin, P. & Shao, F. The Mastermind yra baltymų šeima, vykdanti ląstelių mirtį ir uždegimą. Nat. Rev. Immunol. 20, 143–157 (2020).

32. Zhang, Z. ir kt. Gasdermin E slopina naviko augimą aktyvindamas priešnavikinį imunitetą. Nature 579, 415–420 (2020).

33. Schraml, BU ir kt. AP-1 transkripcijos faktorius BATF kontroliuoja TH17 diferenciaciją. Nature 460, 405–409 (2009).

34. Antonopoulos, C. ir kt. Kaspazė-8 kaip NLRP3 uždegimo signalizacijos efektorius ir reguliatorius. J. Biol. Chem. 290, 20167–20184 (2015).

35. Vajjhala, PR ir kt. Uždegiminis adapteris ASC sukelia procaspazės{1}} mirties efektoriaus domeno gijas. J. Biol. Chem. 290, 29217–29230 (2015).

36. Stennicke, HR ir kt. Pro-kaspazė-3 yra pagrindinis fiziologinis kaspazės-8 taikinys. J. Biol. Chem. 273, 27084–27090 (1998).

37. Deng, W. ir kt. Streptokokinis pirogeninis egzotoksinas B skaldo GSDMA ir sukelia piroptozę. Gamta 602, 496–502 (2022).

38. Puel, A. ir kt. Lėtinė gleivinės ir odos kandidozė žmonėms, turintiems įgimtų interleukino -17 imuniteto sutrikimų. Mokslas 332, 65–68 (2011).

39. Billon, C., Murray, MH, Avdagic, A. & Burris, TP RORgamma reguliuoja NLRP3 uždegimą. J. Biol. Chem. 294, 10–19 (2019).

40. Lee, GS ir kt. Kalcio jautrumo receptorius reguliuoja NLRP3 uždegimą per Ca2+ ir cAMP. Nature 492, 123–127 (2012).

41. Gao, Y. ir kt. Transkripcijos profiliavimas identifikuoja kaspazę-1 kaip T ląstelėms būdingą Th17 diferenciacijos reguliatorių. J. Exp. Med. 217, e20190476 (2020).

42. Arbore, G. ir kt. T pagalbininko 1 imunitetui reikalingas komplemento skatinamas NLRP3 uždegiminis aktyvumas CD4+ T ląstelėse. Science 352, aad1210 (2016).

43. Martin, BN ir kt. T ląstelėms būdingas ASC kritiškai skatina TH17-sukeliamą eksperimentinį autoimuninį encefalomielitą. Nat. Immunol. 17, 583–592 (2016).

44. Wang, Y. ir kt. Chemoterapiniai vaistai sukelia piroptozę per kaspazės{1}} skilimą. Nature 547, 99–103 (2017).

45. Wiggins, KA ir kt. IL-1 skilimas nekanoninės uždegimo uždegiminėmis kaspazėmis kontroliuoja su senėjimu susijusį sekrecinį fenotipą. Aging Cell 18, e12946–e12946 (2019).

46. ​​Helmstetter, C. ir kt. Atskiros T pagalbinės ląstelės turi kiekybinę citokinų atmintį. Imunitetas 42, 108–122 (2015).

47. Xia, S. ir kt. Gasdermin D porų struktūra atskleidžia pirmenybę subrendusio interleukino -1 išsiskyrimui. Nature 593, 607–611 (2021).