Sitoglusido, kaip potencialaus odos pigmentaciją mažinančio agento, identifikavimas per tinklo farmakologiją

Susisiekite: ali.ma@wecistanche.com

Haoran Guo, 1 Hongliang Zeng, 2 Chuhan Fu, 1 Jinhua Huang, 1 Jianyun Lu, 1 Yibo Hu, 1 Ying Zhou, 1 Liping Luo, 1 Yushan Zhang, 1 Lan Zhang, 1 Jing Chen, 1 ir Qinghai Zeng 1

Daugelis tradicinių kinų vaistų (TCM) suodos balinimassavybės buvo įrašytos Ben-Cao-Gang-Mu ir infolk receptuose, o kai kuri literatūra patvirtina, kad jų ekstraktai gali slopinti.pigmentacija. Tačiau jokie sisteminiai tyrimai nenustatė specifinių galimų veikliųjų medžiagų reguliavimo mechanizmų. Šio tyrimo tikslas buvo ištirti TCM sudedamąsias dalis, kurios slopina odąpigmentacijaper tinklo farmakologijos sistemą ir ištirti pagrindinius mechanizmus. Mes nustatėme 148 galimas veikliąsias medžiagas iš 14 TCM ir, remdamiesi vidutiniu topologinių parametrų „laipsniu“, nustatėme penkis geriausius TCM (Fructus Ligustri Lucidi, Hedysarum multijugum Maxim., Ampelopsis japonica, Pseudobulbus Cremastrae Seu Pleiones ir Paeoniae Radix). greičiausiai sukėlėodos balinimasbuvo atrinkti per priešuždegiminius procesus. Sitoglusidas, labiausiai paplitęs penkių geriausių TCM ingredientas, slopina melanogenezę žmogaus melanomos ląsteles (MNT1) ir pelių melanomos ląsteles (B16F0) ir mažina odos būklę.pigmentacijazebrafish. Be to, mechaniniai tyrimai atskleidė, kad sitoglusidas gali sumažinti reguliavimątirozinazė(TYR) ekspresija, slopindama ERK ir p38 kelius ir slopindama TYR aktyvumą. Šie rezultatai rodo, kad tinklo farmakologija yra veiksminga priemonė natūraliems junginiams, turintiems odą balinančių savybių, atrasti ir galimiems jų mechanizmams nustatyti. Sitoglusidas yra nauja odą balinanti veiklioji medžiaga, turinti dvigubą reguliuojantį poveikį, kuris slopinaTYRišraiška ir veikla.

Spustelėkite norėdamiCistanche DHT ekstraktas skirtas odos balinimui

Įvadas

Melaninas ne tik lemia žmogaus odos, akių ir plaukų spalvą, bet ir vaidina pagrindinį vaidmenį maskuojant, mimikoje, socialiniame bendravime ir apsaugant nuo ultravioletinių spindulių. Tačiau kai melaninas per daug gaminamas ir nenormaliai pasiskirsto epidermyje, jis sukelia įvairovę. ligų, tokių kaip strazdanos ir melasma, kurios gali neigiamai paveikti grožį ir socialinį pasitikėjimą [1]. Melaninas yra galutinis L-tirozino produktas po kelių fermentinių reakcijų etapų ir sintetinamas melanocitų melanosomose [2]. Odoje melanocitai yra epidermio baziniame sluoksnyje ir gali gaminti bei perkelti subrendusias melanosomas į keratinocitus, taip sukeldami odą.pigmentacija [3]. TYRyra pagrindinis melanino gamybos greitį ribojantis fermentas [4], o su mikroftalmija susijęs transkripcijos faktorius (MITF) yra pagrindinis transkripcijos faktorius, reguliuojantis TYR transkripcijos ekspresiją [5].

Neseniai atlikti tyrimai parodė, kad uždegiminiai atsakai vaidina svarbų vaidmenį reguliuojant melanogenezę [6]. Pavyzdžiui, IL-18, kurį gamina Langerhanso ląstelės, dendritinės ląstelės ir keratinocitai epidermyje, gali reguliuoti TRP{{2 ekspresiją. }} (su tirozinaze susijęs baltymas 1) ir TRP-2 (su tirozinaze susijęs baltymas 2), aktyvindami p38/MAPK (mitogenu aktyvuota proteinkinazės) ir PKA (baltymų kinazės A) kelius, taip skatindami melanogenezę[7, 8 ]. TNF sumažina B16 melanino gamybą daugiausia aktyvuodamas NF-κB [9]. Nustatyta, kad PGe2 (prostaglandinas e2), kurį išskiria fibroblastai ir keratinocitai, stimuliuoja dendritinių ląstelių diferenciaciją ir inicijuoja TYR aktyvumą melanocituose per cAMP (ciklinis adenozino monofosfatas) ir Plc (fosfolipazės c) signalizacijos kelius [10]. PIH (použdegiminė hiperpigmentacija) yra reaktyviosios odos melanizacijos rūšis [11]. Įvairios odos ligos, traumos ar kosmetinės operacijos dažnai sukeliapigmentacijapaveiktos vietos, ypač spalvotų žmonių [12]. Pacientai, sergantys PIH, paprastai patiria didžiulį psichologinį stresą, kuris sunkiais atvejais neigiamai veikia jų gyvenimo kokybę. Todėl tam tikri uždegimą reguliuojantys vaistai yra naudojami PIH ir kitoms ligoms, sukeliančioms hiperpigmentaciją, gydyti. Pavyzdžiui, nustatyta, kad resveratrolis, sumažinęs uždegiminį HaCaT ląstelių pažeidimą [13], slopina melanino sintezę reguliuodamas ekstraląstelinį kinazės1/2 signalą ir signalizuodamas. fosfoinozitido 3-kinazės/Akt [14].

BalinimasPigmentacijai gydyti tradiciškai naudojami agentai, tokie kaip hidrochinonas (HQ) ir vitaminas C [15]. HQ yra hidroksifenolis, kuris stipriai slopina melanogenezę. Tačiau dėl įvairių šalutinių poveikių, pvz., dirginančio ar alerginio kontaktinio dermatito, nagų spalvos pakitimo ir pablogėjusio žaizdų gijimo, HQ naudojimas yra ribojamas [16, 17]. Vitaminas C slopinaTYRsąveikaudamas su vario junginiais TYR aktyviosiose vietose, taip mažindamas melanogenezę. Tačiau gatavuose produktuose vitaminas C yra nestabilus. Be to, jei vitamino C koncentracija didesnė nei 20 procentų, tai gali sukelti odos dirginimą [18]. Todėl natūralūs ingredientai iš įvairių šaltinių, kurie yra saugūs, veiksmingi, labai stabilūs ir lengvai laikomi, yra labai paklausūs.

Pastaruoju metu buvo nustatyta, kad daugiau TCM ingredientų veiksmingai slopina odąpigmentacija, pavyzdžiui, apigeninas ir paeoniflorinas [19–21]. TCM su balinimo aktyvumu, aprašytu Ben-Cao-Gang-Mu, yra plačiai naudojami kaip slaptieji receptai Kinijoje, ir šiais laikais patvirtinta, kad jie slopina pigmentaciją. Pavyzdžiui, Hedysarum multijugum Maxim (Astragalus membranaceus (Fisch.) Bunge šakniastiebio) ekstraktas, slopindamas ERK kelią, sukelia odos balinimą [22]. Sausas Typhonii Rhizoma (Sauromatum gigan-teum (angl.) Cusimano ir Hett. šakniastiebis) ekstraktas gali veiksmingai slopintitirozinazėaktyvumas in vitro [23]. Įrodymais pagrįsta medicina taip pat patvirtino, kad SapindiMukorossi Semen (Sapindus mukorossi Gaertn. vaisiaus) ekstraktas, kuris slopina tirozinazės aktyvumą, gali būti naudojamas kaip vaistų ir kosmetikos priedas [24]. Kai kurie tradiciniai liaudies receptai, nors ir nesudaryti į sąvadą, taip pat plačiai naudojami. San-Bai-Tang (SBT) yra tipiškas pavyzdys. Ye ir kt. parodė, kad SBT gali sumažinti melanino gamybą slopindamas p38 / MAPK signalizacijos kelią ir TYR aktyvumą [25]. Taip pat buvo įrodyta, kad turi kitus TCM, aprašytus kai kuriuose receptuoseodos balinimasefektai. Coicis Semen (Coix AquaticaRoxb. sėklos) ekstraktas slopina melanino gamybą, sumažindamas MITF, TYR, TRP-1 ir TRP-2 reguliavimą [26]. Be to, ląstelių tyrimasTYRparodė, kad Ampelopsis japonica (Ampelopsis japonica (Thunb.) Makino šakniastiebis) slopino grybų TYR aktyvumą daugiau nei 50 procentų [27]. Šiuolaikiniuose eksperimentiniuose metoduose buvo įrodyta, kad šiuose senoviniuose receptuose įrašytos balinančios TCM yra veiksmingos, tačiau dauguma jų yra patikrintos ekstraktų pavidalu, o veikliosios medžiagos, kurios veikia, nėra aiškios. Tai sukėlė mūsų susidomėjimą aktyviosiomis TCM medžiagomis, turinčiomis užfiksuotą balinamąjį poveikį. senoviniuose receptuose.

Be to, TCM arba receptai turi sudėtingų ingredientų, įvairių veikimo būdų ir nežinomų veikliųjų medžiagų. Be to, tokių veiksnių kaip žaliavų kokybė, perdirbimo metodai, paruošimo būdai, kompozicijoje naudojamų ingredientų suderinamumas ir dozavimo formos turi didesnį poveikį TCM veiksmingumui [19, 28]. Todėl tam tikrų TCM naudojimas suodos balinimaspoveikis yra ribojamas. Todėl būtina skubiai nustatyti veikliąsias medžiagas, galinčias balinti odą, sistemingai tikrinant, kad būtų užtikrintas šių ingredientų saugumas, veiksmingumas ir stabilumas.

Pastaraisiais metais sisteminės biologijos taikymas TCM srityje padarė didelę pažangą. TCM tinklo farmakologija yra nauja tarpdisciplininė disciplina, jungianti TCM farmakologiją su tinklo mokslu, sistemos biologija, skaičiavimo mokslu ir bioinformatika [29]. Jis visiškai supranta vaistų, ligų ir biologinių sistemų sudėtingumą „sudėtingo baltymo/geno ligos“ tinklo požiūriu [30]. Tinklo farmakologija yra veiksminga ir sisteminga priemonė, skirta tirti vaistinių augalų, ypač TCM, farmakologinį poveikį, mechanizmą, saugą ir kitus aspektus, ir suteikia vertingų įžvalgų apie dabartinį vaistų atradimą [31, 32].

odą balinančių ingredientų

2. Medžiagos ir metodai

2.1. Tinklo farmakologinis procesas

2.1.1. Cheminių ingredientų duomenų bazės kūrimas

Ištirtos eksperimentinės programos schema pavaizduota 1 paveiksle. TCM su antipigmentaciniu poveikiu, aprašyti Ben-Cao-Gang-Mu ir liaudies receptuose, buvo naudojami tinklinei farmakologinei analizei. Typhonii Rhizoma, Ricini Semen, Hedysarum multijugum Maxim., Pseudobulbus Cremastrae Seu Pleiones ir Sapindi MukorossiSemen, aprašyti Ben-Cao-Gang-Mu, turibalinimasir geltonas mažinančias savybes bei gali pašalinti veido dėmes ir apgamus. Poria cocos (Schw.) Wolf (Smilax china L. sklerotiumas), Paeoniae Radix Alba ir Atractylodes macrocephala Koidz (Atractylodes macrocephalaKoidz. šakniastiebis), kurie yra SBT sudedamosios dalys, yra žinomi kaip odos tekstūros gerinimo ir chloazmos mažinimo priemonės.pigmentacija. Kitos tradiciškai užrašytos žolelės, tokios kaip Bletilla striata (Thunb. Murray) Rchb.F. (Bletilla striata(Thunb.) Rchb.F.), Ampelopsis japonica, A. dahurica (Fisch.)Benth. Et Hook (Angelica dahurica (Hoffm.)Benth. ir Hook.f. ex Franch. ir Sav. šakniastiebis), Atractylodes lancea (Thunb.) Dc. (Atractylodes lancea (Thunb.)DC, Fructus Ligustri Lucidi ir Coicis Semen šakniastiebiai taip pat buvo įtraukti į šį tyrimą. Dėl daugybės šiame tyrime įtrauktų TCM, daugybė kinų medicinos duomenų bazių patikrinimų sukels duomenų apdorojimo painiavą. Tolesniam patikrinimui naudojame tik tradicinės kinų medicinos sistemų farmakologijos (TCMSP) duomenų bazę, dažniau naudojamą duomenų bazę. Šių TCM cheminių sudedamųjų dalių buvo ieškoma TCMSP (atnaujinta balandžio 24 d., 2{5}}20) [33]. Panašumas į vaistus (DL) ir oralinis biologinis prieinamumas (OB) yra dažniausiai naudojami atrankos parametrai. Vietiniai arba sisteminiai vaistai yra įprasti odos pigmentacijos ligų gydymo būdai; todėl kaip atrankos kriterijų naudojome tik DL. Buvo pasirinkti puikūs kompleksai, kurių DL > 0:18, siekiant padidinti vaistų kandidatų pataikymo rodiklį.

2.1.2. TCM tikslinių genų ir su pigmentacija susijusių genų sankirta.

Genų rinkinys, susijęs supigmentacijabuvo atrinkta remiantis GeneCards duomenų baze (atnaujinta 2020 m. balandžio 24 d.), iš kurios buvo atrinkti taikiniai, kurių agene-disase balas > 1. Galiausiai buvo nustatyta 6180 su pigmentacija susijusių taikinių. TCM tikslinių genų ir su pigmentacija susijusių genų sankirta buvo iliustruota naudojant Venno diagramą [34].

2.1.3. Aktyvaus junginio tikslinio kelio tinklo kūrimas.

Veikliosios medžiagos ir reguliuojami tiksliniai genai buvo patikrinti pagal Venno diagramos rezultatus. Tada tinklas buvo sukurtas naudojant „Cytoscape“ programinę įrangą [35] ir buvo naudojamas nustatyti ryšį tarp aktyvių TCM junginių ir tikslinių genų.pigmentacija.Kiekvienas tikslinis genas, reguliuojamas veikliosios aTCM sudedamosios dalies, buvo laikomas vienu "laipsniu". Vidutiniai kiekvieno TCM "laipsnio" topologiniai parametrai buvo naudojami siekiant įvertinti pasirinktų TCM svarbą. Junginiai buvo reitinguojami, o pagrindinėms analizėms buvo atrinkti penki geriausi TCM. Be to, buvo išanalizuota išsami informacija apie galimas veikliąsias medžiagas, kurios reguliuoja pigmentaciją.

2.1.4. Kioto genų ir genomo enciklopedija (KEGG) Potencialiai veiksmingų TCM reguliuojamų tikslinių genų praturtinimo analizė.

Tiksliniai genai, reguliuojami penkių geriausių TCM, buvo atrinkti siekiant nustatyti KEGG tikslinius kelius ir ištirti galimus potencialiai veiksmingų šių TCM ingredientų mechanizmus.pigmentacijaDAVID bioinformatikos ištekliai 6.8 buvo naudojami KEGG tikslinių takų praturtinimo analizei. Buvo įkelti veiksmingų veikliųjų medžiagų galimų taikinių genų simboliai. Tada gauti genų identifikatoriai buvo atsisiųsti ir įvesti KOBAS3. Pasirinktas genas, kuris pakoregavo p reikšmes mažesnes nei 0.05.

2.1.5. Molekulinio prijungimo modeliavimas.

Sitoglusido, arbutino, nikotinamido, HQ, kojinės rūgšties ir askorbo rūgšties 2D struktūros buvo gautos iš PubChem duomenų bazės. Mažų molekulių temos struktūros buvo optimizuotos naudojant ChemBio3D Ultra 14.0. Grybų 3D kristalų struktūraTYR(PBP ID: 2Y9X, prijungimo koordinatės: X =−8:87, Y=−30:74 ir Z=−41:52) buvo gautas iš baltymų duomenų banko ( PBP) duomenų bazė [36]. Šešių membraninių receptorių (opioidų u receptorių, PDB ID: 4DKI; melanokortino 1 receptorių, PDB ID: 2L1J; endotelino B receptorių, PDB ID: 5GLI; adrenerginių receptorių, PDB ID: 4GBR; prostaglandinų receptorių, PDB ID: 6D26) 3D kristalų struktūros ; kamieninių ląstelių faktoriaus receptorius, PBP ID: 2EC8) buvo gauti iš PBP duomenų bazės. Baltymų struktūros buvo paruoštos naudojant „AutoDock Tools“, pašalinant vandens molekules, pridedant vandenilio ir sukuriant nulinės eilės ryšius su metalais ir disulfidiniais ryšiais. Galiausiai molekulinio prijungimo modeliavimas buvo atliktas naudojant AutoDock Vina 1.1.2 [37], o rezultatai buvo analizuojami naudojant PyMoL 1.7.2.1.

2.2. Eksperimentinis patvirtinimas

2.2.1. Cheminės medžiagos ir antikūnai.

Sitoglusidas (grynumas didesnis arba lygus 98 proc.) buvo įsigytas iš ChemFaces (#CFN98, 713, Chem Faces). Dimetilsulfoksidas (DMSO) buvo įsigytas iš Sigma-Aldrich. Neutralus paraformaldehidas (4 procentai) buvo įsigytas iš Biosharp (Hefėjus, Kinija). Kojic rūgštis, Fontana-Masson dėmių rinkinys, natrio deoksicholatas ir L DOPA buvo įsigyti iš Solarbio (Pekinas, Kinija). Dulbecco modifikuota Eagle terpė (DMEM) buvo įsigyta iš Gibco (#C11995500BT, Gibco). Jaučio vaisiaus serumas (FBS) ir ląstelių skaičiavimo rinkinys{7}} (CCK8) buvo įsigyti iš BI (Kibbutz Beit-Haemek, Izraelis). PMA (12-O-tetradekanoilforbol-13-acetatas, ERK/MAPK aktyvatorius) buvo įsigytas iš APExBIO (#N2060, APExBIO). Anisomicinas (p38 / MAPK aktyvatorius) buvo įsigytas iš MedChem Express (HY{15}}, MedChemExpress). Pirminiai antikūnai prieš su ras susijusį baltymą Rab-27A (RAB27A) (#69295, CST), ekstraląstelinio signalo reguliuojamą kinazę (ERK) (#4695, CST), p-ERK (#4370, CST), c- Jun N-galo kinazė JNK (#9252, CST), p-JNK (#4668, CST), p38 (#8690, CST), p38 (#4511, CST), cAMP atsako elementą surišantis baltymasCREB ( #9107, CST) ir p-CREB (#9198, CST) buvo įsigyti iš Cell Signaling Technology. Pirminiai antikūnai prieš TRP1 (ab235447, Abcam), TRP2 (NBP1-56058, Novusbio), MITF (STJ94134, Šv. Jono laboratorija),TYR(BS1484, Bioworld) ir GAPDH (#AP0066, Bioworld) buvo įsigyti atitinkamai iš Abcam, Novusbio, St. John's Laboratory ir Bioworld.

2.2.2. Ląstelių kultūra ir gydymas.

MNT1 ir B16F0, kuriuose gausu melanosomų, plačiai naudojami melanogenezei tirti [38]. Todėl šios dvi ląstelių linijos buvo pasirinktos tolesniems eksperimentams. MNT1 ir B16F0 ląstelės buvo auginamos 20 ar 10 procentų galvijų vaisiaus serume (BiologicalIndustries, Izraelis) ir 1 procente penicilino-streptomicino (Gibco) DMEM. Visos ląstelės buvo auginamos drėgname inkubatoriuje 37 laipsnių ir 5 procentų CO2. Sitoglusidas buvo ištirpintas DMSO, o galutinė DMSO koncentracija buvo<0.1%. pma="" and="" anisomycin="" were="" separately="" dissolved="" in="" dmso,="" and="" the="" final="" concentration="" of="" dmso="" was=""><>

2.2.3. Zebrafish auginimas ir gydymas.

Zebrafish embrionai ir auginimo terpė buvo įsigyti iš EzeRinka Biotech (Nanjing, Kinija). Eksperimentinį protokolą patvirtino Centrinio Pietų universiteto Trečiosios Xiangya ligoninės etikos komitetas (Nr. 2021-S137). Pirmą dieną po išsiritimo zebražuvės buvo auginamos 12-šulinėlių plokštelėje (10 šulinėlių), apsaugotoje nuo šviesos ir kultivuojamos 37 laipsnių temperatūroje. Zebrafish buvo apdorotas skirtingomis sitoglusido koncentracijomis, o nuotraukos buvo padarytos naudojant apverstą mikroskopą 24 valandų intervalais, kad būtų užfiksuoti melanino pokyčiai zebražuvės uodegose. Padarius nuotraukas, buvo nuskaityti skirtingų koncentracijų sitoglusido tirpalai ir nepertraukiamai registruojami vieną savaitę.

2.2.4. Ląstelių gyvybingumas.

Ląstelių gyvybingumas buvo įvertintas naudojant CCK8.MNT1 ir B16F0 ląstelės buvo dedamos į 96-šulinėlių plokšteles, kurių tankis buvo 2000 ląstelių/šulinėlių arba 500 ląstelių/šulinėlyje. Ląstelės buvo apdorotos skirtingomis sitoglusido koncentracijomis (25, 50, 100, 200, 400, 600 ir 800 μM). Po 24 valandų arba 48 valandų į kiekvieną šulinėlį buvo pridėta 10 μLof CCK8 reagento ir ląstelės buvo inkubuojamos 37 laipsnių temperatūroje 1 valandą. Kai terpės spalva pasidarė oranžinė, kultūra buvo nutraukta, o absorbcijai 490 nm bangos ilgio bangos ilgiui matuoti buvo naudojamas mikroplokštelės skaitytuvas (PerkinElmer EnVision Xcite, JK).

2.2.5. Fontana-Masson Melanino dažymas.

Ląstelės buvo kultivuojamos 6-šulinėlių plokštelėje ir 2 dienas apdorojamos skirtingomis koncentracijomis sitoglusidu, o kojinės rūgšties kaip teigiamos kontrolės buvo pridėta 200 μM. Tada ląstelės 15 minučių buvo dedamos į 4 procentų paraformaldehidą. Nuplovus vandeniu, ląstelės buvo inkubuojamos su Fontana amoniako ir sidabro tirpalu 24 valandas tamsioje kameroje, nuplaunamos vandeniu ir dar 5 minutes dedamos į hiposulfitą. Melaninui stebėti buvo naudojamas apverstas mikroskopas.

2.2.6. Funkcijų atkūrimo eksperimentas.

PMA, kaip pripažintas ERK/MAPK aktyvatorius [39, 40], buvo tiriamas dėl citotoksiškumo atliekant CCK8 eksperimentą, esant skirtingoms koncentracijoms (6,25, 12,5, 25, 50, 100, 200, 400 ir 800 ng/mL) 24 valandas. Ir po to, kai MNT1 ir B16F0 ląstelės buvo apdorotos skirtingos koncentracijos (25, 50 ir 100 ng/mL) PMA 2 valandas, ERK fosforilinimo lygis buvo aptiktas Westernblot eksperimentu. Esant pasirinktai koncentracijai, ląstelės buvo apdorotos 0, 1, 2, 4, 6 ir 8 valandas, kad būtų nustatytas efektyvus aktyvacijos laikas. Po to, kai ląstelės buvo apdorotos sitoglusidu (200 μM) ir PMA (25 ng/ml) 48 valandas (pakartotinai kas 8 valandas), baltymų kiekisTYRbuvo aptikti andp-ERK. Fontana-Masson melanino dažymas aptiko melanino kiekį. Anisomicinas [41] yra p38/MAPK aktyvatorius, kurio tiriamoji koncentracija yra 4, 8, 16, 32, 64, 128, 256 ir 512 nM, o kiti eksperimentiniai metodai yra tokie patys kaip PMA.

2.2.7. TYR aktyvumo matavimai.

Ląstelės buvo apdorotos skirtingomis sitoglusido koncentracijomis 2 dienas. Po virškinimo ir centrifugavimo ląstelės buvo suskaičiuotos ir du kartus resuspenduotos fosfatiniu buferiniu tirpalu (PBS). Tada į kiekvieną mėginį buvo įpilta 500 μl 0,5 procento natrio deoksicholato tirpalo. Mėginiai buvo inkubuojami 4 laipsnių temperatūroje 10 minučių, o po to 37 laipsnių temperatūroje 15 minučių. Buvo pridėta 1 ml 1 procento L-DOPA tirpalo, po to 200 μL iš karto pipete įpilta į 96-šulinėlių plokštelę. Vėliau buvo naudojamas daugiamodis plokščių skaitytuvas, skirtas išmatuoti absorbcijos vertes (A0) esant 475 nm, ir matavimas buvo pakartotas po 30 min (A30).TYRaktyvumas buvo apskaičiuotas kaip (A{{0}}A0)/ląstelių skaičius.

2.2.8. TYR veiklos zondas.

Beveik infraraudonųjų spindulių fluorescencinis zondas, skirtasTYRaktyvumas, pagrįstas resorufinu, buvo naudojamas gyvų ląstelių aktyvumui vizualizuoti, kaip aprašyta anksčiau [42]. Trumpai tariant, MNT1 ir B16F0 ląstelės buvo kultivuojamos 6-šulinėlių plokštelėje ir 2 dienas apdorotos skirtingomis sitogluzido koncentracijomis. . Buvo pridėtas 10 μM fluorescencinis zondas, o po 4 valandų ląstelės buvo pakeistos PBS. Kai raudona šviesa jaudina, fotografuoti buvo nedelsiant naudojamas fluorescencinis apverstas mikroskopas.

2.2.9. Baltymų ekstrahavimas ir Western Blotting.

Po to, kai ląstelės 2 dienas buvo apdorotos skirtingomis sitoglusido koncentracijomis, visas ląstelių baltymas buvo ekstrahuotas naudojant RIPA lizės buferį (Thermo Fisher) ir proteazės inhibitorių ir fosfatazės inhibitorių kokteilius (Roche). Baltymų koncentracija buvo nustatyta naudojant BCA baltymų tyrimo rinkinį (KeyGEN Biotec). Užblokavus 1 procentu BSA, pirminiai antikūnai priešTYR, MITF, TRP1, TRP2, RAB27A, CREB, p-CREB, ERK, p-ERK, JUK, p-JUK, p38 ir p-p38 buvo inkubuojami su membranomis per naktį 4 laipsnių temperatūroje 1:1000 ir GAPDH 1:3000 Membranos buvo plaunamos TBS-T ir inkubuojamos su antriniu ožkos anti-triušio antikūnu santykiu 1:3000 1 valandą. Surišantis antikūnas buvo aptiktas elektrochemiliuminescencija (ECL).

2.2.10. Statistinė analizė.

Statistinei analizei buvo naudojama SPSS22.{1}} programinė įranga, o kelių grupių palyginimui buvo naudojamas Stjudento t testas arba vienpusė dispersinė analizė (ANOVA). Neparametriniams duomenims buvo naudojamas Mann-Whitney U testas. p < 0:05="" visais="" atvejais="" buvo="" laikomi="" statistiškai="" reikšmingais.="" ∗∗∗p="">< 0:001,="" ∗∗p="">< 0:01="" ir="" ∗p=""><>

3. Rezultatai

3.1. Sudėtiniai TCM ingredientai.

Buvo ištirta keturiolika TCM, įrašytų į Ben-Cao-Gang-Mu ir liaudies receptus, turinčių antipigmentacijos poveikį. Iš viso 372 kinų medicinos ingredientai iš 14 TCM buvo gauti iš TCMSP duomenų bazės (papildoma S1 lentelė).

3.2. Tiksliniai genai, reguliuojami TCM ir susijusių pigmentacijos genų.

Pagal tikslinę prognozavimo sistemą TCMSP duomenų bazėje iš viso buvo gauti 834 tiksliniai genai iš 14 TCM. Iš viso 9431 genas, susijęs supigmentacijabuvo gauti iš „GeneCards“ duomenų bazės, iš kurių buvo atrinkti 6180 ir kurių tinkamumo balas buvo > 1.

3.3. 14 TCM ir ligos junginio tikslinio tinklo reitingas.

Naudodami „Cytoscape“ programinę įrangą, mes nustatėme kiekvieno TCM ir su pigmentacija susijusių genų reguliavimo genų sankirtą ir gavome potencialius aktyvius ingredientus bei bendrus tikslinius genus. Toliau – ligos junginio tikslinis tinklas tarp TCM irpigmentacijabuvo pastatytas. Remdamiesi tuo, mes gavome vidutinį kiekvienos veikliosios medžiagos "laipsnį" ir suskirstėme TCM pagal jų balus. Pagal reitingų balus 5 geriausios žolelės buvo Fructus Ligustri Lucidi, Hedysarum multijugum Maxim., Ampelopsis japonica, Pseudobulbus Cremastrae Seu Pleiones ir Paeoniae Radix Alba (2 pav. a)). Atlikus 220 5 geriausių TCM tikslinių genų KEGG analizę, 19,3 procento genų buvo daug PI3K-Akt signalizacijos kelio, 13,6 procento genų buvo susiję su TNF signalizacijos keliu, o apie 12,3 procento genų buvo susiję su IL{{ 12}}. Be to, 37 genai buvo įtraukti į MAPK kelią ir 28 genai buvo įtraukti į HIF{15}} kelią. Šie keliai yra glaudžiai susiję su melanino metabolizmo reguliavimu ir odos fotosenėjimu. Tarp 20 geriausių praturtintų signalizacijos kelių ketvirtadalį jų sudarė su uždegimu susiję keliai (2 pav. c). 2(d)–2(h) paveiksluose pavaizduotas ligos junginio tikslinis tinklas tarp Fructus Ligustri Lucidi, Hedysarum multijugum Maxim., Ampelopsis japonica, Pseudobulbus Cremastrae Seu Pleiones, Paeoniae Radix Alba ir pigmentacijos, atitinkamai. Remiantis penkių geriausių TCM sudedamųjų dalių Venno diagrama, mes nustatėme, kad keturiuose TCM buvo sitoglusido ir beta-sitosterolio (2 paveikslas (b), papildoma S2 lentelė).

3.4. Galimos pigmentacijos slopinimo veikliosios medžiagos.

Pagal ligos junginių tikslinį tinklą 148 ingredientai, susiję supigmentacijabuvo gauti iš 14TCM. Literatūros paieškos metu buvo pranešta, kad 25 iš 148 ingredientų slopina melanogenezę. Buvo pranešta apie keturias veikliąsias medžiagas kaip augalų ekstraktus, kurie slopina melanogenezę. Buvo ištirta keturiolika veikliųjų ingredientų ir pranešta, kad jų dariniai reguliuoja pigmentaciją. Įdomu tai, kad keturi ingredientai skatina melanogenezę, o šešių ingredientų mechanizmas, reguliuojantis melanogenezę, vis dar neaiškus. Likę 95 galimi Kinijos vaistiniai ingredientai pigmentacijos reguliavimui dar nebuvo ištirti. Išsami informacija apie šias sudedamąsias dalis pateikta papildomoje S3 lentelėje.

3.5. Sitoglusido poveikis melanogenezei in vitro ir in vivo.

Po pirmiau nurodyto atrankos proceso nustatėme, kad keturiuose TCM viršutiniuose TCM buvo sitoglusido ir -sitosterolio. -Pranešta, kad sitosterolis slopina alfa-melanocitus stimuliuojantį hormoną (-MSH), stimuliuodamas melanogenezę per p38 signalizacijos kelią B16F10 melanomos ląstelėse [43]. Tačiau apie sitoglusido antipigmentinį poveikį ir specifinį jo mechanizmą nepranešta. Todėl šiems tyrimams pasirinkome sitoglusidą kaip kandidatą į vaistą. CCK8 tyrimas buvo atliktas siekiant ištirti galimas toksines sitoglusido koncentracijas MNT1 ir B16F0 ląstelėse. Rezultatai parodė, kad sitoglusidas neturėjo akivaizdaus poveikio ląstelių dauginimuisi (3 (a) ir 3 (b) pav.), kai koncentracija mažesnė nei 400 μM. Melanino dažymas, atliktas naudojant 25, 50, 100 ir 200 μMsitoglusidą, parodė, kad sitoglusidas gali sumažinti. melanino kiekis MNT1 ir B16F0 ląstelėse priklausomai nuo dozės (3 pav. c). Be to, gydymas sitoglusidu žymiai slopino odąpigmentacijazebrafijoje priklausomai nuo laiko ir dozės (3 pav. d). Šie rezultatai rodo, kad sitoglusidas slopino melanogenezę in vitro ir in vivo.

3.6. Sitoglusido poveikis TYR ekspresijai.

Remiantis ankstesniais rezultatais, sitoglusidas gali veiksmingai sumažinti melanino kiekį, tačiau vis dar nežinoma, kaip jis reguliuoja šį procesą, todėl įdomu. Western blot buvo atliktas siekiant aptikti su melanogeneze susijusių genų (TYR, MITF, TRP1, TRP2 ir RAB27A) ekspresiją baltymų lygiu. Analizės rezultatai parodė, kad po gydymo sitoglusidais TYR ekspresija buvo žymiai sumažinta, o MITF ir TRP1 ekspresija buvo šiek tiek sumažinta. (4 paveikslas (a)). Kadangi MAPK ir PKA yra pagrindiniai signalizacijos keliai, reguliuojantys TYR, toliau tyrinėjome pagrindinių baltymų pokyčius šiuose dviejuose keliuose. Po to, kai MNT1 ir B16F0 ląstelės buvo apdorotos sitoglusidu 2 dienas, ERK ir P38 fosforilinimo lygiai buvo žymiai sumažinti. , kadangi nebuvo reikšmingų pokyčių bendruose CREB, ERK, JNK ir p38 baltymų lygiuose arba JNK ir CREB fosforilinimo lygiuose (4 (b) pav., S1A pav.). Remiantis CCK8 eksperimento rezultatais, mes nustatėme, kad mažesnis nei 100 ng/mL PMA nėra toksiškas abiem ląstelėms (S1B pav.), o 25 ng/mL PMA gali akivaizdžiai padidinti ERK fosforilinimo lygį. ERK fosforilinimo lygis palaipsniui sumažėjo po 4 valandų (S1C-D pav.). Atlikdami Fontana-Masson melanininą, nustatėme, kad PMA gali žymiai padidinti MNT1 ir B16F0 ląstelių temelanino kiekį. „Westernblot“ rezultatai taip pat rodo, kad PMA gali padidinti ERK fosforilinimo lygį, o sitoglusidas gali sumažinti PMA reguliuojamą ERK fosforilinimo lygį. Slopindamas ERK fosforilinimo lygį ir sumažindamas baltymų kiekįTYR, sitoglusidas sumažina melanino kiekį, padidintą PMA (4 (c) ir 4 (e) pav., S2A pav.). Tuo pačiu metu mes nustatėme, kad anisomicinas turi panašius rezultatus. Anizomicinas, mažesnis nei 8 nM, nėra toksiškas abiem ląstelėms, o 2 nM anizomicinas gali žymiai padidinti p38 fosforilinimo lygį. Po 8 valandų p38 fosforilinimo lygis vis dar yra aukštas (S1B pav., S1E-F pav.). Fontana-Masson melaninin dažymo ir Western blot rezultatai taip pat rodo, kad sitoglusidanas slopina p38 fosforilinimo lygį, kurį padidina anizomicinas, sumažindamas TYR baltymo kiekį ir slopindamas.pigmentacija(4(d) ir 4(f) pav., S2B paveikslas). Todėl sitoglusidas gali sumažinti TYR ekspresiją, slopindamas ERK/MAPK ir p38/MAPK kelius. Tačiau mechanizmas, kuriuo sitoglisidas slopina šiuos signalizacijos kelius, lieka neaiškus. Mes atsekėme šių signalizacijos takų membraninius receptorius ir panaudojome molekulinį prijungimą, kad ištirtume pasroviui skirtų takų reguliavimo mechanizmą. Sitogluzido ir šešių membraninių receptorių, ty opioidų u, melanokortino 1, kamieninių ląstelių faktoriaus, endotelino B, adrenerginių ir prostaglandinų receptorių, jungimosi energija buvo -7.8,-5.8, {{9 }}.5, -5.4, -3.4 ir 0 kal/mol atitinkamai. Molekulinio prijungimo metu nustatėme, kad tarp šešių membranų receptorių sitoglusidas turėjo labai didelį afinitetą su opioidų u, melanokortino 1 ir kamieninių ląstelių augimo faktoriaus receptoriais (4 pav. (g)). Mes spėliojame, kad sitoglusides gali slopinti ERK / MAPK ir p38 / MAPK kelius, prisijungdamas prie anksčiau minėtų membraninių receptorių, taip sumažindamas TYR ekspresiją.

3.7. Sitoglusido poveikis TYR aktyvumui.

NuoTYRyra pagrindinis melanino sintezės fermentas, jis yra ryškiausias melanogenezės slopinimo tikslas. Dauguma komerciškai prieinamų kosmetikos arba odą šviesinančių medžiagų, tokių kaip HQ, arbutinas ir kojic rūgštis, yra TYR inhibitoriai. Mes naudojome sitoglusidą ir kai kuriuos kliniškai naudojamusodos balinimasagentai (arbutinas, nikotinamidas, kojinė rūgštis, HQ ir askorbo rūgštis), kad atliktų molekulinį prijungimą prie TYR. Išsamią sitoglusido ir aukščiau paminėtų medžiagų sąveiką suTYRparodytos 5 paveiksle (a). Šių šešių junginių surišimo energijos buvo -6.2, -6.4, -5.6, -5.7, -5.4 ir{{ 11}},4 kcal/mol atitinkamai. Paprastai manoma, kad kai afiniteto energija yra -4, tai rodo surišimo jėgą, o kai ji yra didesnė arba lygi -7.0, tai rodo stiprią surišimo jėgą. Sitoglu pusė užėmė antrąją vietą pagal giminingumą, šiek tiek silpnesnė už arbutiną, pasižyminti palyginti išskirtiniu derinimo gebėjimu.

Tuo pačiu metu TYR aktyvumui nustatyti buvo naudojamas L-DOPA konversijos eksperimentas, naudojant kojinę rūgštį kaip teigiamą kontrolę. Rezultatai parodė, kad sitoglusidas slopina TYR aktyvumą MNT1 ir B16F0 ląstelėse priklausomai nuo koncentracijos, o didelės koncentracijos grupė (200 μM) parodė lygiavertį slopinamąjį poveikį, kaip parodyta 200 μM kojic. rūgštis (5(b) ir 5(c) pav.). Be to, TYR zondo eksperimento rezultatai parodė, kad, padidėjus sitoglusido koncentracijai, ląstelėse palaipsniui mažėjo fluorescencijos intensyvumas, o didelės koncentracijos grupės fluorescencijos intensyvumas buvo artimas 200 μM kojinės rūgšties MNT1 ir B16F0 ląstelėse (5 pav. d). S2C pav.). Šie rezultatai rodo, kad sitoglusidas gali veiksmingai slopintiTYRaktyvumą MNT1 ir B16F0 ląstelėse. Be to, mes spėliojame, kad sitoglusidas, kaip natūralus sterolio junginys, gali tiesiogiai prasiskverbti į ląstelės membraną ir prisijungti prie TYR ir slopinti jo aktyvumą, taip slopindamas melanogenezę.

4. Diskusija

Šiame tyrime mes naudojome tinklo farmakologiją, kad ištirtume potencialo mechanizmusodos balinimasIngredientai, esantys 14 TCM, dokumentuoti Ben-Cao-Gang-Mu ir infolk receptuose, slopinapigmentacija. Tyrime taip pat buvo pasiūlytas naujoviškas metodas, pagal kurį naudojamas vidutinis "laipsnio" topologinis kiekvienos veikliosios medžiagos parametras, siekiant įvertinti galimą žolelių veiksmingumą. Pagal vidutinį "laipsnį" buvo atrinkti Fructus Ligustri Lucidi, Hedysarummultijugum Maxim., Ampelopsis japonica, PseudobulbusCremastrae Seu Pleiones ir Paeoniae Radix Alba, o atliekant netikėtą KEGG sodrinimo analizę genams, reguliuojamiems pagal šiuos penkis TCM2 procentus, buvo atrinkta. signalizacijos keliai buvo susiję su uždegimu, įskaitant IL-17, TNF, HIF-1, PI3K-Akt ir MAPK signalizacijos kelius.

Neseniai buvo įrodyta, kad įvairūs uždegiminiai mediatoriai aktyvuoja arba slopina su melanogeneze susijusius signalizacijos kelius, kurie skatina arba slopina odą.pigmentacija[6]. Kultivuojamos B16F10 melanomos ląstelės, TNF sumažino ekspresijąTYRir TRP1 bei TYR aktyvumas priklauso nuo dozės [44]. IL-17 ir TNF- gali sumažinti su melanogeneze susijusių genų raišką melanocituose, o IL-17 gali žymiai sustiprinti slopinamąjį TNF poveikį melanogenezei. Po gydymo etanerceptu (anti-TNF), su melanogeneze susiję genai buvo žymiai sureguliuoti psoriaze sergančių pacientų odos pažeidimuose[45]. Buvo pranešta, kad HIF-1, galingas transkripcijos faktorius, reguliuojantis uždegiminį atsaką, dalyvauja reguliuojant tokius veiksnius kaip IL-17 ir TNF- [46–48]. Todėl tikėtina, kad HIF-1 dalyvauja reguliuojant melanogenezę, paveikdamas uždegimą. Kiti citokinai, tokie kaip IL-18, IL-33, GM-CSF ir IL-1 gali skatinti melanogenezę aktyvindami PKA, MAPK ar kitus signalizacijos kelius, o IFN-, IL-1, IL-4 ir IL-6 mažina melanogenezę slopindami STAT1, NF-κB, ir JAK2-STAT6 signalizacijos keliai [6]. Mūsų išvados rodo, kad penki pagrindiniai TCM (Fructus Ligustri Lucidi, Hedysarum multijugum Maxim., Ampelopsis japonica, Pseudobulbus Cremastrae Seu Pleiones ir Paeoniae Radix Alba) gali turėti pigmentacijos slopinimo poveikį daugiausia per priešuždegiminius kelius. Ankstesnėje literatūroje taip pat buvo paminėta, kad šie penki geriausi TCM turi stiprų priešuždegiminį ir senėjimą stabdantį poveikį [49, 50]. Tai taip pat patvirtina mūsų spėjimą, kad TCM gali atlikti nereikšmingą vaidmenį použdegiminėje pigmentacijoje.

Peržiūrėdami literatūrą apie 148 ingredientus, rastus 14 TCM, taip pat nustatėme, kad iš 35 nurodytų sudedamųjų dalių beveik 70 procentų buvo patvirtinta, kad jie arba sumažina melanino kiekį, arba slopina TYR aktyvumą. Tai ne tik patvirtina, kad senovinėse knygose esantys odos balinimo receptai yra iš esmės patikimi, bet taip pat rodo, kad nuoroda į senovės literatūrą yra patikimas būdas gauti žinių apie TCM. Vis dar yra 95 neištirti junginiai, kurie gali atsispirtipigmentacija. Išanalizavus penkių geriausių TCM Venno diagramas, buvo gauta 13 bendrų sudedamųjų dalių. Tarp jų, eksperimentai in vitro patvirtino, kad daidzeinas, rutinas ir (plius)-katechinas gali sumažinti melanino kiekį [51–53]. Sacharozė sutrikdo tinkamą melanosomų brendimą. sukeldamas osmosinį stresą ir slopindamas PI3 kinazės kelią, taip trukdydamas melanogenezei [54]. Kvercetinas mažina oksidacinio streso sukeltą melanogenezę [55]. Be to, cheminiai ir fiziniai metodai, tokie kaip spektroskopinė ir struktūros aktyvumo analizė, patvirtino, kad lupeoland kaempferolis gali slopintiTYRir sumažinti melanogenezę[56, 57]. Tai rodo, kad tinklo farmakologija gali būti tinkamas būdas išsiaiškintibalinimasingridientai. Keturiuose penkiuose geriausiuose TCM buvo sitoglusidas, todėl nėra pranešimų apie tai, ar sitoglusidas reguliuoja pigmentaciją ar su juo susijusį mechanizmą. Todėl šiems tyrimams pasirinkome sitoglusidą.

Buvo pranešta, kad sitoglusidas, sterolių glikozidas, plačiai paplitęs augaluose, turi priešnavikinį, antioksidacinį ir neuroprotekcinį poveikį [58–60]. Šiame tyrime mes nustatėme, kad sitoglusidas veiksmingai sumažino melanino kiekį in vitro ir in vivo. Vėlesni eksperimentai įrodė, kad tai gali žymiai sumažinti TYR ekspresiją. Kojic rūgštis buvo naudojama kaip teigiama kontrolė, ji taip pat gali slopinti su melanogeneze susijusių genų, tokių kaip TYR, MITF ir TYRP1, baltymų kiekį stimuliuojant -MSH, apie kurį pranešė Jeon ir kt. [61]. Atsižvelgiant į tai, kad nėra egzogeninės stimuliacijos, 200 μM kojic rūgšties mūsų tyrime turėjo tik vidutinį slopinamąjį poveikį genų ekspresijai, tačiau kadangi kojicacidas turi didelį tirozinazę slopinantį aktyvumą, šiame tyrime mes vis dar naudojame ją kaip teigiamą kontrolę. Buvo pranešta, kad TYR ekspresija tiesiogiai arba netiesiogiai reguliuojama atitinkamai MAPKor PKA keliais. Buvo patvirtinta, kad vis daugiau sudedamųjų dalių balina odą, nes slopina MAPK signalizacijos kelią. Pavyzdžiui, fargezinas sumažinaTYRslopindamas P38/MAPK kelią [62]. Ganoderma lucidum polisacharidai gali atsispirti UVB sukeltai melanogenezei, sumažindami MAPK kelią [63]. Mūsų tyrimas parodė, kad sitoglusidas, kurio koncentracija yra 200 μM, turėjo galimybę sumažinti TYR ekspresiją, slopindamas ERK / -MAPK ir P38 / MAPK signalizacijos kelius. Tai buvo pranešta per molekulinį prijungimą tarp MAPK takų membranos receptorių [64] ir sitogluzido. Mes nustatėme, kad sitoglusidas stipriai jungiasi prie opioidų u, melanokortino 1 ir kamieninių ląstelių augimo faktoriaus receptorių. Todėl mes spėliojame, kad sitoglusidas gali sąveikauti su šiais membranos receptoriais, slopinti ERK / MAPK ir P38 / MAPK signalizacijos kelius ir sumažinti TYR ekspresiją.

Kadangi TYR yra pagrindinis melanocitų melanino dalelių sintezės fermentas, norint sumažinti odos būklę būtina slopinti TYR katalizinės vietos aktyvumą.pigmentacija[65]. Daugelis rinkoje esančių odą šviesinančių medžiagų yra TYRaktyvumo inhibitoriai, pvz., HQ, arbutinas ir kojinė rūgštis. Šiame tyrime mes panaudojome molekulinį prijungimą, kad ištirtume sitoglusido ir penkių bendrų surišimo poveikįodos balinimasveikliosios medžiagos (arbutinas, nikotinamidas, kojo rūgštis, HQ, andaskorbo rūgštis) [66] suTYR. Rezultatai parodė, kad sitoglusidas turėjo stiprų jungimosi afinitetą su TYR, silpnesniu nei arbutinu, bet stipresnį nei kojo rūgštis, nikotinamidas, HQ ir askorbo rūgštis. Arbutinas yra HQ provaistas ir natūralus produktas, galintis sumažinti arba slopinti melanino sintezę slopindamas TYR. Tačiau natūrali arbutino forma išemiškai nestabili ir gali virsti HQ, kuri katalizuojama ir metabolizuojama į benzeno metabolitus, galinčius turėti toksinį poveikį kaulų čiulpams [67]. Kojinės rūgšties kosmetikos naudojimas yra ribojamas dėl jos kancerogeniškumo ir nestabilumo laikant [68]. Todėl tikimasi, kad sitoglusidas, natūralus sterolių junginys, gaunamas iš įvairių augalų, veiks kaip stipri odą šviesinanti priemonė. Tačiau sitoglusido tirpumas DMSO yra mažas, o tai taip pat yra šio natūralaus ingrediento trūkumas. Vėlesnis eksperimentinis patikrinimas parodė, kad sitoglusidas yra saugus MNT1 ir B16F0 ląstelių linijose, o mažos koncentracijos grupė turėjo gerą slopinamąjį poveikį TYR aktyvumui, o didelės koncentracijos grupė turėjo tokį patį poveikį kaip ir ta pati kojinės rūgšties koncentracija. Todėl sitoglusidas gali būti terapiškai naudojamas kaip odos balinimo reguliatorius, kuris ne tik sumažina TYR ekspresiją, bet ir slopina jo aktyvumą (6 pav.).

5. Išvados

Tinklinė farmakologija galbūt yra veiksminga priemonė atrasti natūralias odos pigmentaciją mažinančias veikliąsias medžiagas ir galimus jų mechanizmus. Fructus LigustriLucidi, Hedysarum multijugum maxim., Ampelopsis japonica, Pseudobulbus Cremastrae Seu Pleiones ir PaeoniaeRadix Alba turi potencialoodos balinimassavybių ir gali slopintipigmentacijareguliuojant uždegimą. Sitogluside yra romanasodos balinimasveiklioji medžiaga, turinti dvigubą reguliavimo poveikį, t. slopinantisTYRišraiška ir veikla.

cistanche tabletės