Inkstų vaizdavimas: nuo šviesos iki itin didelės raiškos mikroskopijos

Susisiekite: ali.ma@wecistanche.com

Maria Lucia Angelotti^1,2, Giulia Antonelli^1,2 Karolina Conte^1,2ir Paola Romagnani^1,2

SANTRAUKA

Svarbiausi pasiekimaiinkstasfiziologiniai ir patofiziologiniai mechanizmai daugiausia gali būti siejami su mikroskopijos technologijos pažanga. Daug ką mes žinome apie architektūrąinkstasyra pagrįstas pagrindiniais anatominių mikroskopų aprašymais, naudojant šviesos mikroskopiją, o vėliau ir ultrastruktūrine analize, pateikta elektronine mikroskopija. Šie du metodai buvo naudojami pirmiesiems inkstų ligų klasifikavimo sistemoms ir nuolatiniam jų atnaujinimui. Visai neseniai keletas naujų vaizdo gavimo metodų papildė analizę tolesniais laiko ir erdvės aspektais. Konfokalinė mikroskopija leido mums nuosekliai vizualizuoti optines pjūvius išilgai z ašies, o specialios analizės programinės įrangos prieinamumas suteikė trimačius storesnius audinių mėginius. Daugiafotoninė mikroskopija leido mums vienu metu tirtiinkstasfunkcija ir struktūra realiuoju laiku. Fluorescencijos trukmės vaizdo mikroskopija leido mums ištirti metabolitų erdvinį pasiskirstymą. Didelės skiriamosios gebos mikroskopija padidino jautrumą ir skiriamąją gebą iki nano skalės lygio. Naudodami krioelektroninę mikroskopiją, mokslininkai galėjo vizualizuoti atskiras biomolekules atominiame lygyje tiesiai audiniuose ir suprasti jų sąveiką tarpląsteliniame lygyje. Galiausiai, matricos pagalba lazerinė desorbcijos / jonizacijos vaizdo masės spektrometrija leido tuo pačiu metu išmatuoti šimtus skirtingų molekulių didelės skiriamosios gebos audinių pjūviuose. Šioje apžvalgoje pateikiama galimųinkstasvaizdavimo strategijas, daugiausia dėmesio skiriant galimam naujausių technologinių patobulinimų poveikiui.

Raktiniai žodžiai:imunohistochemija,inkstasbiopsija, podocitai,proksimaliniskanalėlis, kamieninės ląstelės

Cistanche herba inkstų ligai, spustelėkite čia, kad gautumėte pavyzdį

ĮVADAS

TheinkstųNorint atlikti įvairias fiziologines funkcijas, reikalingas įspūdingas struktūrinis sudėtingumas. Pradžioje studijuodamasinkstasapsiribojo makroskopiniais stebėjimais, o jų indėlis diagnozuojant inkstų ligas buvo neabejotinai ribotas. Aprašytos klinikinės apraiškos, tačiau pagrindiniai patogenetiniai mechanizmai nežinomi. Inkstų fiziologijos ir patofiziologijos supratimo pasiekimai daugiausia gali būti siejami su nuolatine pažanga mikroskopijos srityje. Bandymai atinkstasvaizdavimas prasidėjo seniai [1]. 1666 metais anatomas Malpighi ištyrėinkstasaudinys su šviesos mikroskopu, kurio galia buvo 25–30 ir kuris pirmą kartą apibūdino glomerulą kaip „liauką, kurioje šlapimas buvo atskirtas nuo kraujo“ [2]. Šis indėlis buvo ignoruojamas iki 1842 m., kai seras Williamas Bowmanas 10 kartų galingesniu šviesos mikroskopu išardė nefrono struktūras. Bowmanas atrado periglomerulinę kapsulę (vėliau pavadintą Bowmano kapsule), kuri yra anatomiškai sujungta su pirmąja kanalėlio dalimi [3]. 1862 m. Jacobas Henle aprašė į kilpą panašią kanalėlių segmentą, pavadintą jo vardu, jungiantį žievės kanalėlį ir inkstų papilę.

Dėl šviesos mikroskopijos įdiegimo histomorfologinė klasifikacijainkstasligųtapo įmanoma [1]. Galimybė stebėti, kas vyksta sergant inkstais, leido suprasti, kad patologiniai pokyčiai pacientams, turintiems panašių klinikinių apraiškų, labai skiriasi. Tačiau pirmieji inkstų audinio patologinių pokyčių tyrimai buvo atlikti su skrodimo mėginiais, daugiausia dėl lėtinių ligų apibūdinimo. Informacijos apie inkstų patologijų raidą ir autolitinių reiškinių technines problemas, susijusias su pomirtinių audinių naudojimu, trūkumas apribojo žinias apie žmonių ligas. 1951 m., įvedimasinkstasbiopsija leido tiesiogiai stebėti ir tirti ne tik lėtines, bet ir ūmias inkstų ligas. Tuo tarpu mikroskopija palaipsniui tapo sudėtingesnė, o jautrumas ir skiriamoji geba palaipsniui didėjo iki nanoskalės lygių. Šioje apžvalgoje pateiksime pagrindinių inkstų atradimų, kuriuos padarė pažanga mikroskopijos technologijose, apžvalgą, daugiausia dėmesio skirdami galimybėms, atsirandančioms dėl naujausių techninių pokyčių.

INKSTU IMUNOPATOLOGIJA VIZUALIZUOJAMAS

Imuninis žymėjimas ir fluorescencinė mikroskopija

Galimybė gauti reprezentatyvų gyvo audinio fragmentą leido taikyti naujus metodus, reikalaujančius maksimalaus audinių išsaugojimo, pavyzdžiui, imunohistocheminius metodus (pirmiausia fluorescencinis, paskui fermentinis). Tiesą sakant, 1950 m. Coonsas sukūrė antikūnų žymėjimo fluoresceino izocianatu metodą, ty imunofluorescenciją, nepanaikindamas gebėjimo specifiškai reaguoti su jų audinių antigenais. Nuo tada imunofluorescencija buvo įtraukta į diagnostinę procedūrą, skirtą užšaldytų inkstų biopsijos mėginių įvertinimui. Pirmą kartą šie metodai leido stebėti intrarenalinius imunoglobulinus (Ig) ir komplemento nuosėdas pacientams, sergantiems glomerulonefritu, o tai padėjo atskirti įvairias patofiziologijas, kurios yra tam tikrų nespecifinių audinių pažeidimų pagrindas, pavyzdžiui, pusmėnulio glomerulonefrito atveju [4]. Be to, galimybė stebėti būdingą dažymosi modelį ir fluoresceino susiejimą su kitais antikūnais nei imunoglobulinas G (IgG) leido atpažinti imunoglobulino A (IgA) nuosėdas sergant IgA nefropatija, taip pat komplemento nuosėdas sergant poinfekciniu glomerulonefritu. ir membranoproliferacinis glomerulonefritas [4].

Konfokalinė mikroskopija

Devintojo dešimtmečio pabaigoje pradėjus naudoti konfokalinę mikroskopiją, fluorescencinė mikroskopija buvo gerokai patobulinta. Pagrindiniai konfokalinės mikroskopijos elementai yra taškinis apšvietimas, sufokusuotas ir nuskaitytas ant bandinio, ir kintama konfokalinė diafragma (smeigtukas) prieš detektorių, leidžianti surinkti šviesą tik iš plonos dalies aplink židinio plokštumą (vadinamą optine sekcija). Konfokalinė mikroskopija leido atlikti pirmuosius inkstų tyrimus in vivo eksperimentiniuose modeliuose ir stebėti fluorescencinių molekulių įsisavinimą ir transportavimą per nepažeistus kanalėlius.inkstuspo mikropunktūros. Tai leido tirti kanalėlių funkciją fiziologinėmis ir patologinėmis sąlygomis [5].

The possibility to sequentially image optical sections along the z-axis and the availability of specific analysis software permitted a three-dimensional (3D) rendering of thicker tissue specimens, showing the frequent inconsistency and misrepresentations provided by 2D analyses [6, 7] (Figure 1A and a'). In addition, the introduction of genetically encoded fluorescent proteins in transgenic mice permitted the labeling of specific cells and tracing them directly within tissues without immunostaining (lineage tracing strategy) [6, 7, 8]. However, confocal microscopy still did not resolve details >200 nm, dėl matomos šviesos difrakcijos ribos, fotobalinimo ir fototoksiškumo.

GLOMERULIŲ FILTRACIJOS KLIŪTO SUPRATIMAS: ELEKTRONINĖ MIKROSKOPIJA

Pirmasis bandymas įveikti šviesos ir fluorescencinių mikroskopų skiriamosios gebos ribą buvo 1931 m., kai Ernstas Ruska ir Maxas Knollas išrado elektronų mikroskopą (EM), kuris naudoja pagreitintų elektronų pluoštą, o ne šviesos pluoštą, kaip sužadinimo šaltinį. ir turi didesnę skiriamąją gebą nei šviesos mikroskopai (iki 0,2 nm). Už šią naujovę 1986 metais Ernstas Ruska buvo apdovanotas Nobelio fizikos premija. Dėl padidėjusios skiriamosios gebos greitai tapo akivaizdu, kad glomerulas yra ne tik mechaninis filtras, o itin sudėtingas organas, sudarytas iš trijų sluoksnių: endotelio ląstelių, glomerulų bazinės membranos (GBM) ir podocitų [9]. Transmisijos EM (TEM) leido vizualizuoti glomerulų ląsteles iš vidaus [10] ir atskleidė, kad endotelio ląstelės turi plonus, aptemptus ląstelių kūnus, o podocitai turėjo didelius ląstelių kūnus ir išplečia pirminius ir antrinius „pėdos“ procesus, pritvirtintus prie GBM ir tarpusavyje sujungtus. tiesinės jungtys (nedidelė diafragma) (1B pav.). Be to, nuskaitant EM (SEM), fiksuojant atgal išsklaidytus elektronus, buvo galima vizualizuoti glomerulų ląsteles nuo jų išorinio paviršiaus [10] ir atskleidė, kad kaimyninių podocitų pėdos procesai susikirto ir apėmė GBM (1C pav.). EM išliko galinga priemonė ne tik suprasti normalią glomerulų ultrastruktūrą, bet ir suprastiinkstasfiziologija ir patofiziologija [11]. Daugybė tyrimų, atliktų su žmonių mėginiais arba eksperimentiniais modeliais, atskleidė, kad skirtingi ligų procesai yra susiję su išskirtiniais ultrastruktūrinių pakitimų modeliais, o tai reiškia tolesnius besivystančios klasifikavimo sistemos atnaujinimus.inkstasligų. Techninis gebėjimas vizualizuoti tolesnį inkstų ultrastruktūros sudėtingumą patvirtino „nefropatologų“ specializaciją.

Naujausias SEM metodas, pagrįstas labai jautriu detektoriumi, leido ištirti giliausią plyšinės diafragmos dalį ir atskleidė, kad jai būdingos įvairaus dydžio poros [12]. Žiurkėms proteinurija buvo susijusi su didelėmis poromis, todėl padidėja tikimybė, kad plyšinės diafragmos ultrastruktūriniai pokyčiai gali sukelti glomerulų pralaidumo pokyčius [12]. Kaip papildoma techninė pažanga, blokinio paviršiaus SEM leido pereiti iš glomerulų filtracijos barjero 2D į 3D vaizdą, kurio skiriamoji geba buvo pakankama sekti ploniausių ląstelių procesų nanostruktūrą sveikose, sergančiose pelėse irinkstasplėtra [13, 14].

Galiausiai, EM prijungimas prie rentgeno mikroanalizės sistemos (rentgeno mikroskopija) leido atlikti elementinę ląstelių ar ląstelių dalių analizę ultrastruktūriniu lygiu. Rentgeno mikroskopijoje mėginiui sužadinti naudojamas skenuojantis TEM siauru elektronų pluoštu. Didelės energijos elektronų iš pluošto smūgis su bandiniuose esančiais atomais gamina energiją rentgeno fotonų pavidalu. Šis rentgeno signalas, surinktas naudojant energiją dispersinį puslaidininkių detektorių, naudojamas elementams, esantiems bandinyje, identifikuoti, geriausiu atveju 30 nm skiriamąja geba. VidujeinkstasBeck ir Thurau sėkmingai panaudojo rentgeno mikroanalizę, tirdami transepitelinių kanalėlių jonų transportavimą [15] ir tarpląstelinių elementų koncentraciją kanalėlių ląstelėse [16].

INKSTU FIZIOLOGIJOS VIZUALIZAVIMAS MULTIFOTONINĖS MIKROSKOPIJA

Daugiafotoninė mikroskopija (MPM) suteikė tolesnę pažangąinkstastyrimai, tai yra galimybė vienu metu tirti inkstų funkcijos ir struktūros ryšius realiu laiku [17]. Skirtingai nuo įprastų šviesos mikroskopų, dviejų fotonų sužadinimas priklauso nuo dviejų fotonų, turinčių dvigubą sužadinimo bangos ilgį, reikalingą fluoroforui sužadinti klasikinio vieno fotono sužadinimo metu, tuo pačiu metu sugertos (1D pav.). Komerciškai prieinamų impulsinių infraraudonųjų spindulių, mažos energijos sužadinimo lazerių naudojimas padidino giliųjų audinių įsiskverbimą ir sumažino fototoksiškumą (1D pav.). Tai leido mokslininkams vizualizuoti dinamiškus ląstelių procesus tiesiogiai gyvuose gyvūnuose, o tai anksčiau nebuvo pasiekta naudojant jokią kitą techniką. MPM leidžia kiekybiškai įvertinti pagrindines inkstų funkcijas ir patologinius pokyčius, tokius kaip glomerulų pralaidumas, kraujagyslių kraujotaka, vieno nefrono glomerulų filtracijos greitis ir kanalėlių srautas [17] (1E ir F pav.). Be to, MPM leidžia tirti tarpląstelinius procesus reaguojant į sužalojimą, įskaitant ląstelių mirtį ir išsiskyrimą, leukocitų slinkimą ir GBM įdarbinimą bei sutrikimus [17]. Tolesni techniniai patobulinimai leido ilgesnį intravitalinį vaizdą per kelias dienas ar savaites [18], kurie kartu su transgeninėmis pelėmis, ekspresuojančiomis fluorescencinius baltymus, buvo naudojami atskirų ląstelių likimui tiesiogiai in vivo sekti sveikuose ir pažeistuose inkstuose [19] ir geriau suprasti inkstų ląstelių apykaitos ir regeneracijos mechanizmus.

MPM taip pat buvo įmanomi vaizdo gavimo be etikečių metodai, naudojant natūralią nikotinamido adenino dinukleotido hidrato (NADH) autofluorescenciją, siekiant ištirti kanalėlių ląstelių redoksinę būseną po sužalojimo [20]. Be to, kolageno, inkstų fibrozės žymeklio, nusėdimui kiekybiškai įvertinti buvo naudojama antroji harmonikų generacija iš fibrilinio kolageno [21]. Antroji harmonikų generacija yra netiesinis optinis procesas, kurio metu du vienodo bangos ilgio sužadinimo fotonai sąveikauja su necentrosimetrinemis struktūromis biologiniuose audiniuose, pvz., kolagenu ar mikrotubuliais, ir sukuria naują fotoną, kurio bangos ilgis yra perpus mažesnis.

Naujausia intravitalinės mikroskopijos naujovė buvo miniatiūrinio daugiafotoninio endoskopo, sėkmingai naudojamo gyvų anestezuotų pelių inkstams vaizduoti, įdiegimas [22]. Šis minimaliai invazinis MPM gali sudaryti sąlygas realaus laiko diagnozei in vivo, nepašalinant audinių ir per labai trumpą laiką.

3D INKSTAI: AUDINIŲ VALYMO TECHNIKA IR IŠPLĖTIMO MIKROSKOPIJA

Nepaisant technologinių patobulinimų, viena iš pagrindinių gilesnio tūrinio vaizdo gavimo apribojimų yra inkstų audinio neskaidrumas, dėl kurioinkstasvienas iš optiškai sudėtingiausių organų. Dėl šios priežasties audinių valymo metodai sukėlė didelį susidomėjimą [23]. Šių metodų tikslas – nepermatomą audinį paversti skaidriu, išsaugant baltymus ir galiausiai fluorescencinius žymenis, kad būtų galima atvaizduoti storus audinio gabalėlius. Optinio valymo ir moderniausios mikroskopijos derinys suteikia galimybę atlikti morfometrinę analizę, pavyzdžiui, kiekybiškai nustatyti glomerulų tūrį ir skaičių storuose audiniuose ar net nepažeistame inkste [24]. Kitos programos apima atskirų kanalėlių segmentų analizę [25], jų funkcijas [26] ir podocitų praradimo kiekybinį įvertinimą [27].

Norint atvaizduoti didelius audinių kiekius ir tuo pat metu išspręsti smulkias struktūrines detales, neseniai buvo pristatytas naujas techninis metodas, ty plėtimosi mikroskopija (ExM). Idėja yra fiziškai išplėsti visą organą 4- iki 5-sulankstyti, išsaugant bendrą architektūrą ir 3D proteomo turinį. Naudojant besiplečiantį polimerą, tiesiogiai susintetintą bandinyje, molekulės, esančios arčiau nei šviesos difrakcijos riba, erdvėje yra išotropiškai atskiriamos iki didesnių atstumų, todėl gali būti optiškai atskirtos net naudojant įprastą fluorescencinį mikroskopą. Be to, ExM užtikrina didesnį optinį skaidrumą ir sumažina šviesos sklaidą, todėl galima vizualizuoti didesnį audinio tūrį. Naudojant šį metodą, kelių baltymų lokalizaciją plyšinėje diafragmoje ir GBM galima išardyti net naudojant įprastą konfokalinį mikroskopą [28]. Pavyzdžiui, jis gali atskleisti proteinurinių pelių pėdų išbėrimą tiek 2D, tiek 3D formatu, esant nanometro skiriamajai gebai, kuri niekada nebuvo pasiekta [29]. Neseniai ExM buvo naudojamas klinikiniam histopatologiniam į parafiną įterptų mėginių, jau nudažytų hematoksilinu ir eozinu, įvertinimui [30]. Šis metodas gali vizualizuoti pėdos proceso išbėrimą nanoskalės lygiu, kuris anksčiau buvo įmanomas tik naudojant EM. Tūrinio vaizdavimo pažanga leidžia atlikti didelės raiškos 3D viso organo analizę taip, kad pagrindinis giluminio vaizdo gavimo apribojimas dabar yra antikūnų gebėjimas prasiskverbti į audinį.

METABOLINIO PROFILIŲ TYRIMAS: DAŽNIO DOMENŲ FLUORESCENCIJOS GYVENIMO VAIZDO MIKROSKOPIJA

Theinkstasyra medžiagų apykaitos organas, kuriame yra daug mitochondrijų. Sumažėjusi NADH forma ir kiti metabolitai natūraliai fluorescuoja ir ši autofluorescencija gali būti naudojama kaip redokso būsenos indeksas [20]. Tačiau šių endogeninių fluoroforų emisijos spektrai sutampa, todėl buvo neįmanoma jų identifikuoti atskirai. Tačiau buvo nustatyta, kad fluorescencijos trukmė (ty fluorescencijos mažėjimo laikas) labai skiriasi. Taigi fluorescencinė vaizdo mikroskopija (FLIM) leidžia ištirti medžiagų apykaitos profilius [31]. Neseniai, naudojant MPM ir FLIM derinį, tapo įmanoma apibūdinti ląstelėms būdingus metabolinius parašus ir stebėti metabolinius pokyčius in vivo metu.inkstasliga [32]. Tikimasi, kad FLIM pateiks daugiau įžvalgųinkstasmetabolizmas in vivo sveikatai ir ligoms.

SKYRIAUS VEIKIMAS PER RIBĄ: Ypatingos skyros INKSTU VAIZDAVIMAS

Standartinės šviesos mikroskopijos optinė skiriamoji geba yra didesnė nei 200 nm. Naujos technologijos, vadinamos didelės skiriamosios gebos vaizdavimu, dabar leidžia fluorescencinei mikroskopijai vaizduoti virš difrakcijos ribos, nes tai yra nanoskopijos eros pradžios taškas [33]. Šie metodai sujungia nanoskopinę skiriamąją gebą su daugiaspalvio fluorescencinio ženklinimo pranašumais. Pripažįstant galimą šių naujovių poveikį, 2014 m. Nobelio chemijos premija buvo skirta Ericui Betzigui, Stefanui Hellui ir Williamui Moerneriui „už itin didelės skiriamosios gebos fluorescencinės mikroskopijos sukūrimą“. Skirtingiems biologiniams klausimams spręsti gali būti taikomos skirtingos didelės skiriamosios gebos vaizdavimo strategijos. Šiuos metodus galima suskirstyti į dvi pagrindines kategorijas, atsižvelgiant į tai, ar didelė skiriamoji geba naudojama atskirų molekulių ar ansamblių lygmeniu [33].

Ansamblinės technikos

Ansambliniai metodai pažeidžia difrakcijos ribą, laikinai ir erdviškai moduliuodami sužadinimo šviesos spindulį. Be to, didelės skiriamosios gebos stimuliuotos emisijos mažinimo (STED) vaizdavimui naudojami du lazeriai: sužadinimo lazeris ir vienas ant kito esantis raudonai poslinkis išeikvojamas lazeris (STED lazeris), turintis spurgos formą, kad būtų slopinama fluorescencinė spinduliuotė iš fluoroforų, esančių šalia. sužadinimo centras. Šis slopinimas pasiekiamas naudojant stimuliuojamą emisiją ir leidžia rinkti tik signalą, kilusį iš židinio taško, kurio matmuo yra mažesnis už difrakcijos ribą (2A pav.). STED vaizdavimas buvo naudojamas plyšinei diafragmai atvaizduoti optiškai švariaiinkstasaudiniuose (2B–c pav.) ir leido lokalizuoti podocino ir nefrino erdvinį pasiskirstymą nanometrų skalėje iki mažiausiai 30 lm gylio [34]. Be to, galimybė stebėti ir kiekybiškai įvertinti pėdos proceso išnykimą eksperimentiniame modelyje gali padaryti STED vaizdą naudingu glomerulų filtracijos barjero tyrimams [34].

STED mikroskopijai reikalingi specialūs mėginių paruošimo protokolai, specialūs fluoroforai ir techninis mokymas. Dėl šios priežasties per pastaruosius kelerius metus daugiau dėmesio buvo skiriama kitai didelės skiriamosios gebos technologijai – struktūrinei apšvietimo mikroskopijai (SIM), kuri gali 2 kartus padidinti difrakcijos ribą tiek iš šono, tiek į ašį. SIM naudoja plataus lauko mikroskopo sąranką su smulkiai dryžuotu apšvietimo modeliu, leidžiančiu užfiksuoti aukšto dažnio informaciją (atitinkančią smulkias pavyzdžio detales) žemesniais erdviniais dažniais. Gavus kelis vaizdus su skirtingų fazių ir orientacijų apšvietimo modeliais, galima atkurti didelės raiškos vaizdą (3A pav.). SIM yra suderinama su standartiniais fluoroforais, nereikalauja specialaus mėginio paruošimo ir leidžia 3D vizualizuoti. Atsižvelgiant į visus šiuos pranašumus, buvo atlikti įvairūs tyrimai, siekiant įvertinti galimybę naudoti SIM kaip greitos diagnostikos įrankį [35], pavyzdžiui, su galimu trumpesniu apyvartos laiku nei EM. Pastaruoju metu 3D SIM kortelė ir automatizuotas vaizdo apdorojimas buvo naudojami kaip greitas pėdos proceso išvalymo diagnostikos įrankis, naudojant įprastines parafino pjūvius iš pacientų, sergančių minimalių pokyčių liga, biopsijų [36] (3B ir C pav.). Šis gebėjimas sėkmingai nustatyti ligų, kurioms būdinga nanoskalės patologija, pokyčius patvirtino, kad SIM yra perspektyvi įprastos diagnostikos priemonė.

Vienos molekulės lokalizacija pagrįsti vaizdavimo metodai

Šie metodai remiasi galimybe cikliškai įjungti ir išjungti atskiras fluorescencines molekules, kurios yra per arti, kad jas būtų galima išspręsti. Taikant šiuos metodus, molekulės, esančios ribotoje difrakcijos srityje, gali būti aktyvuojamos skirtingais laiko taškais, kad jas būtų galima atskirai atvaizduoti ir vėliau lokalizuoti nanometro tikslumu, skaičiavimo būdu surandant jų centrus (3D pav.). Tarp šių metodų pirmą kartą buvo pristatyta stochastinė optinės rekonstrukcijos mikroskopija (STORM).inkstas2013 m. atliktas tyrimas su tyrimu, kuris atskleidė sudėtingą GBM molekulinę struktūrą nanometro tikslumu, įskaitant molekulių orientaciją [37]. Reto įgimto nefrozinio sindromo pelės modelyje STORM atskleidė laminino 521 integraciją ir teisingą orientaciją GBM po injekcijos į veną, atverdama pacientams pažangias gydymo galimybes [38]. Kitas tyrimas aprašė aktino citoskeleto podocituose organizavimą molekulinės skalės skiriamąja geba [39] (3E–I pav.). Kaip naujas atradimas, podocituose pėdos procesuose yra susitraukiančių aktino ryšulių, susijusių su nesusitraukiančiais aktino ryšuliais. Podocitų pažeidimo modeliuose pėdos procesų aktino struktūra buvo išardyta, o tai lėmė pagrindinio kūno susitraukimo struktūros žlugimą [39].

PAGRINDINIŲ BIOMOLEKULIŲ 3D STRUKTŪRŲ VIZUALIZAVIMAS ATOMO LYGMENIU: KRIOELEKTRONINĖ MIKROSKOPIJA

Dar visai neseniai galimybė ištirti pagrindinių biomolekulių struktūrą apsiribojo elektronine mikroskopija, kurios skiriamoji geba buvo keli nanometrai. Techninės kliūtys, pvz., mėginio pažeidimas dėl intensyvaus elektronų pluošto, mažas vaizdo kontrastas ir molekulių judėjimas po sąveikos su elektronais arba sunkumai išsaugant vandenį biologiniuose mėginiuose EM kameros viduje esančiame vakuume, todėl neįmanoma atskirti mažesnio dydžio molekulių. . Mėginio aušinimas gali sumažinti vandens išgaravimą ir elektronų sukeltą žalą [40]. Remiantis šia idėja, šeštajame dešimtmetyje buvo pristatytas krio-EM. Prieš kelerius metus pristatytas naujas vieno elektrono skaičiavimo detektorius pagaliau padidino skiriamąją gebą už ankstesnes ribas. 2017 m. Nobelio chemijos premija buvo skirta Jacques'ui Dubochetui, Joachimui Frankui ir Richardui Hendersonui už „krioelektroninės mikroskopijos kūrimą, skirtą didelės raiškos biomolekulių struktūrai nustatyti tirpale“. Ši pažanga dabar leidžia struktūriškai nustatyti biomolekules tirpale [41].

Įinkstastyrimais, buvo nustatytos pagrindinių baltymų struktūros atominiame lygmenyje [42, 43]. Tarp jų – žmogaus policistino struktūra-2, kurios mutacijos yra atsakingos už autosominę dominuojančią policistinęinkstasliga [44] ir trumpalaikių receptorių potencialo kanoninių 6 jonų kanalų, kurių mutacijos sukelia FSGS žmonėms [43], struktūra buvo nustatyta kelių angstremų skiriamąja geba [44].

MOLEKULINIS INKSTU LIGŲ PAGRINDAS: INTEGRACINĖ INKSKTŲ MIKROSKOPIJA

Per pastaruosius kelerius metus išaugo susidomėjimas metodais be etikečių, galinčių konkrečiai ir vienu metu nustatyti bendrą audinių molekulių spektrą [45]. Tarp jų, matricos pagalba lazerinė desorbcijos / jonizacijos vaizdo masės spektrometrija (MALDI-IMS) leidžia išmatuoti šimtus skirtingų molekulių tuo pačiu metu tiesiai ant audinių pjūvių su didele skiriamąja geba. MALDI-IMS eksperimento metu plona audinio dalis, užšaldyta arba įterpta į parafiną, yra padengta matrica, kuri sugeria lazerio energiją ir skatina audinių analičių jonizaciją. Masės spektrometro analizė sukuria spektrą kiekvienai x/y koordinatei. Po MALDI matavimo ta pati audinio dalis gali būti nudažyta tradicinėmis histocheminėmis ir imunohistocheminėmis procedūromis, siekiant integruoti molekulinį modelį su histologinėmis detalėmis. Inkstų tyrimuose MALDI-IMS naudojamas vaistams, metabolitams, lipidams, peptidams ir baltymams tirti normaliuose ir ligotuose audiniuose [45].

Vienas iš dažniausiai naudojamų MALDI-IMS pritaikymų yra molekulinių žymenų identifikavimas, siekiant klasifikuoti inkstų ląstelių karcinomą [46] ir nustatyti tikrąją ribą tarp vėžinio ir normalaus audinio molekuliniu ir histologiniu lygiu [47]. MALDI-IMS taip pat buvo sėkmingai naudojamas tiriant toksinį poveikį inkstams, kad būtų galima anksti nustatyti toksiškumąinkstasvaistų kandidatų sukeliami žalos mechanizmai [48]. Be to, MALDI-IMS naudojamas tiriant lipidus ir jų vaidmenį sergant inkstų patologijomis, tokiomis kaip diabetinė nefropatija [49], ūminis inkstų pažeidimas [50] ir policistinė liga.inkstasliga [51], taip pat atskleisti endogeninius metabolinius profilius, kad būtų galima geriau suprasti su liga susijusius mechanizmus [52]. Taip pat buvo baigtas molekulinių profilių nustatymas galimiems biomarkeriams, kurie galėtų būti nauji galimi diagnostiniai ir prognostiniai biomarkeriai [53, 54].

IŠVADOS IR ATEITIES PERSPEKTYVOS

Nuolatinis vaizdo gavimo metodų tobulinimas laipsniškai pašalino daug svarbių techninių kliūčiųinkstastyrimais ir leido dinamiškai pavaizduoti normalių ir sergančių inkstų struktūrą ir funkciją. Iš tiesų, naujų mikroskopijos technologijų atsiradimas leido atlikti esminius mokslinius atradimus ir vėliau pakeitė mūsų požiūrį į inkstų fiziologiją ir patofiziologiją, kurią dabar galima vizualizuoti 3D formatu ir netgi filmuoti vaizdo įrašuose, kur laikas yra ketvirtoji dimensija. Dėl naujausių technologinių naujovių, susijusių su didelės skiriamosios gebos mikroskopija ir molekulinio vaizdo gavimo metodų pažanga, mokslininkai dabar gali vizualizuoti atskiras biomolekules tiesiai audiniuose ir nustatyti, kaip jos sąveikauja ląstelių ir tarpląsteliniame lygmenyje.

Galimybė taikyti šias priemones patologinėmsinkstasMėginiai, sutelkiant dėmesį į molekulines ir tarpląstelines klinikinių biopsijų detales, turėtų padėti iš naujo klasifikuoti ligas. Ar ir kada tai turės įtakos inkstų ligos diagnozei ar net paciento valdymui, šiuo metu neaišku.

FINANSAVIMAS

Finansavimą skyrė Europos mokslinių tyrimų taryba pagal Europos Sąjungos mokslinių tyrimų ir inovacijų programą „Horizontas 2020“ (dotacijos sutartis 648274).

NUORODOS

1. Weening JJ, Jennette JC. Istoriniai inkstų patologijos etapai. Virchows Arch 2012; 461: 3–11

2. Malpighi M. De Viscerum Structura exercitatio anatomica. Bolonija1666 m

3. Bowman W. Apie Malpigijos kūnų struktūrą ir naudojimąinkstas, su stebėjimais apie kraujotaką per tą liauką. Philos Trans R Soc A 1842;132:57–80

4. D'Agati VD, Mengel M. Inkstų patologijos atsiradimas nefrologijoje: struktūra apšviečia funkciją. Aš esu JInkstasDis 2013; 61: 1016–1025

5. Ohno Y, Birn H, Christensen EI. In vivo konfokalinė lazerinė skenavimo mikroskopija ir mikropunkcija nepažeistoms žiurkėms. Nephron Exp Nephrol 2005; 99: e17–e25

6. Romoli S, Angelotti ML, Antonelli G. CXCL12 blokada pirmiausia regeneruoja prarastus podocitus žievės nefronuose, nukreipdama į vidinį podocitų ir pirmtakų grįžtamojo ryšio mechanizmą.InkstasInt 2018; 94:1111–1126

7. Lazzeri E, Angelotti ML, Paired A ir kt. Su endociklu susijusi kanalėlių ląstelių hipertrofija ir progenitorių proliferacija atkuria inkstų funkciją po ūminioinkstassužalojimas. Nat Commun 2018; 9: 1344

8. LeHir M, Kriz W. Naujos įžvalgos apie struktūrinius glomerulosklerozės modelius. Curr Opin Nephrol Hypertens 2007; 16: 184–191 9. Tisher CC. Funkcinė anatomijainkstas. Hosp Pract 1978; 13

10. Liapis H. Elektroninė mikroskopija ininkstastyrimas: matyti – tai tikėti. Ultrastruct Pathol 2013; 37: 340–345

11. Stiprus ML, Evers P. Trečiasis inkstų diagnostikos aspektas. Normalių ir nenormalių inkstų nuskaitomoji elektroninė mikroskopija. S Afr Med J 1979; 55:174–177

12. Gagliardini E, Conti S, Benigni A ir kt. Glomerulinio epitelio filtravimo plyšio porėtos ultrastruktūros vaizdavimas. J Am Soc Nephrol 2010; 21:2081–2089

13. Lausecker F, Tian X, Inoue K ir kt. Vinculinas reikalingas glomerulų barjero vientisumui palaikyti.InkstasInt 2018; 93: 643–655

14. Ichimura K, Kakuta S, Kawasaki Y ir kt. Morfologinis podocitų vystymosi procesas, atskleistas bloko veido skenavimo elektronų mikroskopu. J Cell Sci 2017; 130: 132–142

15. Rickas R, Dorge A, Beck FX ir kt. Transepitelinio jonų pernešimo elektronų zondo rentgeno mikroanalizė. Ann N YAcad Sci 1986; 483: 245–259

16. Thurau K, Dorge A, Mason J ir kt. Tarpląstelinių elementų koncentracija inkstų kanalėlių ląstelėse. Elektronų mikrozondo analizė. Klin Wochenschr 1979;57: 993–999

17. Peti-Peterdi J, Kidokoro K, Riquier-Brison A. Nauji in vivo būdai vizualizuotiinkstasanatomija ir funkcija. Kidney Int 2015; 88: 44–51

18. Schuh CD, Haenni D, Craigie E ir kt. Ilgo bangos ilgio daugiafotoninis sužadinimas yra naudingas intravitaliniam gydymuiinkstasvaizdavimas.InkstasInt 2016; 89: 712–719

19. Hackl MJ, Burford JL, Villanueva K ir kt. Glomerulinių epitelio ląstelių likimo stebėjimas in vivo naudojant serijinį daugiafotoninį vaizdą naujuose pelių modeliuose su fluorescencinėmis linijos žymėmis. Nat Med 2013; 19: 1661–1666

20. Hall AM, Unwin RJ, Parker N ir kt. Daugiafotoninis vaizdas atskleidžia mitochondrijų funkcijos skirtumus tarp nefrono segmentų. J Am Soc Nephrol 2009; 20: 1293–1302