Imunitetą stimuliuojantys antikūnų konjugatai sukelia tvirtą mieloidinį aktyvumą ir ilgalaikį priešnavikinį imunitetą (2 dalis)

Norėdami sužinoti daugiau informacijos, susisiekitedavid.wan@wecistanche.com

Diskusija:

Čia pateikti rezultatai pateikia įtikinamų įrodymų, patvirtinančių ISAC kaip naują naviko imunoterapijos technologiją. ISAC modeliavimas in vitro parodė jų gebėjimą aktyvuoti pirminius žmogaus mieloidinius APC priklausomai nuo Fc R ir TLR ir sustiprinti kryžminį antigenų pateikimą naudojant pelių OVA modelio sistemą. Aktyvinimas padidinus kostimuliacinės molekulės CD40 reguliavimą buvo pastebėtas ne tik in vitro, bet ir ant naviko esančių mieloidinių APC tiek ksenografinių, tiek singeninių navikų modeliuose. Vienas iš stulbinančių šio tyrimo išvadų buvo tai, kad kovalentinis TLR agonisto prisijungimas prie į naviką nukreiptas monokloninis antikūnas ISAC pavidalu pakeitė imunostimuliacinį rezultatą ir bendrą veiksmingumą, kurio paprastai tikimasi naudojant TLR agonistus. Vietinio trastuzumabo tiekimo kartu su T785 palyginimas su sisteminiu T785-ISAC tiekimu parodė, kad tik ISAC pavyko sumažinti naviko naštą. Vietinis mišinio tiekimas nedavė naudos HCC1954 naviko ksenografijos modeliui, o poveikis buvo panašus į vieno trastuzumabo poveikį. Ši išvada patvirtina, kad ne tik vietinis, bet ir vienu metu antikūno bei TLR agonisto tiekimas yra būtinas terapiniam veiksmingumui, stebimam naudojant ISAC. Mechaniniai duomenys, gauti naudojant HCC1954 naviko ksenografo modelį, parodė, kad in vivo reikalingas Fc R ir TLR įsitraukimas veiksmingumui, nes tiek TLRnull-ISAC, tiek Fc neaktyvus ISAC nesugebėjo kontroliuoti naviko augimo. Be to, sisteminis ISAC vartojimas lėmė ilgalaikį priešnavikinį veiksmingumą žiurkės HER2 ir singeninio naviko modeliuose bei žmogaus HER2 ir krūties vėžio ksenografuose, kurie buvo atsparūs gydymui nekonjuguotu antikūnu. HER2 buvo pasirinktas kaip tikslinis antigenas ikiklinikiniams in vivo tyrimams, nes neoadjuvantinis, adjuvantinis ir pirmosios eilės gydymas pacientams, sergantiems lokaliai išplitusiu ar metastazavusiu krūties vėžiu, dominuoja HER{16}}nukreipti antikūnai, kurie nėra skirti imuninei sistemai stimuliuoti. sistema ir patvirtinti T ląstelių kontrolinio taško inhibitoriai, blokuojantys antikūnus, šiems pacientams buvo minimalūs. Šiems pacientams gali būti naudingi ISAC, kurie išlaiko pirminių antikūnų funkcionalumą ir suteikia reikšmingą imunostimuliacinį potencialą. Kaip ir vartojant bet kurį imunoterapinį preparatą, galimybė generuoti arba sustiprinti antikūnus prieš vaistus egzistuoja ir, ISAC atveju, galiausiai gali priklausyti nuo pirminio antikūno imunogeniškumo. Šiuos vertinimus geriausia atlikti kliniškai, o trastuzumabas gali būti idealiai tinkamas tyrimui, nes pranešta, kad Herceptin™ imunogeniškumas pacientams yra mažesnis nei 1 proc. In vivo duomenys, įrodantys, kad reikia vienu metu tiekti antikūną ir adjuvantą, yra dar labiau patvirtinti darbu, kuriame išsamiai aprašomas intracelulinis signalizavimas, valdantis ISAC aktyvumą vienu metu perduodant Fc R ir TLR. Nors papildomi tyrimai gali dar labiau išaiškinti tarpląstelinio ISAC signalizacijos dinamiką, čia aprašyti tyrimai išryškina galimus signalizacijos pranašumus, kai TLR agonistas konjuguojamas su antikūnu, kaip paprastai pastebima, kai antikūnai paveikia patogenus apsauginio imuniteto metu. CyTOF pagrįsta intracelulinio signalizacijos analizė žmogaus PBMC buvo naudojami toliausuprasti ir atskirti mišinio ir ISAC aktyvumą. Rezultatai atskleidė sustiprintą parašą po ISAC stimuliacijos, palyginti su tuo, kurį sukėlė atskirų komponentų mišinys, o tai dar labiau patvirtina aktyvumo didinimo potencialą cheminiu antikūno ir TLR agonisto konjugavimu. Nors TLR7 ir TLR8-specifinio ISAC stiprumo negalima išmatuoti naudojant HEK293 reporterio ląsteles, demonstracijaISAC sukeltas IRF-7 fosforilinimas rodo aktyvų TLR7/8 agonizmą, nes žinoma, kad IRF-7 yra pasroviui nuo TLR7 ir TLR8 MyD88-varomos signalizacijos 30. Duomenys rodo, kad ISAC ne tik padidina kanoninių kelių, susijusių su TLR ir Fc R keliais, signalizaciją, bet ir sumažina porinį aktyvavimo slenkstį, reikalingą signalinių baltymų, tokių kaip ribosominis baltymas S6, pagrindinis baltymų transliacijos ląstelėje reguliatorius, fosforilinimas. Aukšti DREMI balai, ypač išmatuotimonocituose, taip pat DC, palaiko stiprią sąlyginę priklausomybę, kurią sukelia stimuliacija ISAC, kuri nėra matoma naudojant mišinį. Šis reiškinys galigali palengvinti intraląsteliniai receptorių gausos, lokalizacijos ir (arba) prisitraukimo pokyčiai endosomoje, tačiau norint patvirtinti tikslų mechanizmą, reikia atlikti tolesnius tyrimus. Svarbu tai, kad DREMI analizė nustatė ryšius, atitinkančius žinomus signalizacijos partnerius dėl ISAC stimuliacijos. Dėl žinomo slopinimovaidmenį kanoniniame NF-κB signalizacijoje 49, stebėjome sumažėjusią priklausomybę (ty DREMI balą)tarp pIRF7 ir kappa B (IκB) inhibitoriaus, kai mieloidinės ląstelės buvo stimuliuojamos ISAC. Kartu šie rezultatai palaiko sustiprintą ir ilgalaikį tarpląstelinį atsaką per atitinkamas signalo perdavimo kelio molekules, esančias pasroviui nuo ISAC stimuliacijos, be sinergijos tarp TLR ir su Fc R susijusių signalizacijos takų.

Spustelėkite čia, kad sužinotumėte daugiau apie Cistanche

Mūsų rezultatai atskleidė, kad funkcinės Fc-Fc R sąveikos yra būtinos ISAC sukeltam mieloidinių APC aktyvavimui. Natūralus IgG1 Fc, turintis didžiausią afinitetą aktyvuojantiems Fc Rs iš natūraliai egzistuojančių IgG izotipų, buvo pranašesnis už kitus IgG izotipus, turinčius mažesnį afinitetą aktyvuojantiems Fc Rs. Tolesnis Fc-Fc R sąveikos stiprinimas per fukozilinimą padidino stiprumą, o Fc-Fc R sąveikos sumažėjimas dėl glikozilinimo sumažino stiprumą. Kaip ir tikėtasi, Syk signalizacija pasroviui nuo Fc R įsitraukimo, be vėlesnio TLR agonizmo, buvo reikalinga, kad ISAC sukeltų maksimalią stimuliaciją. Šias išvadas patvirtina tyrimai, įrodantys dramatišką mieloidinės stimuliacijos sustiprėjimą po kostimuliacijos su plokštele susietu IgG ir TLR agonistu PAM3CSK 50. Jie taip pat rodo, kad tikslinės ląstelės paviršiuje arba in vitro plokštelės aplinkoje vyksta platesnis Fc kryžminis ryšys. , gali atsirasti arba diferentinių signalų tinklai įsijungia po ISAC stimuliacijos, o ne komponentų mišinio. ISAC platformos vertimas in vivo pirmą kartą buvo įvertintas naudojant žmogaus HER2 ir naviko ląstelių linijas pelėms, kurioms trūksta visiškai funkcionalių B, T ir NK ląstelių. Pažymėtina, kad trastuzumabo ISAC buvo žymiai veiksmingesnis už trastuzumabą daugeliui navikų, turinčių skirtingą HER2 ekspresijos lygį. Be to, duomenys parodė, kad ISAC priešnavikinis poveikis priklauso nuo nukreipimo į naviką, nes izotipas-ISAC negalėjo sukelti naviko regresijos ir klirenso. Nors in vitro modeliavimas parodė, kad TLR ir Fc R aktyvumas yra būtinas, kad būtų įgalintas ISAC stiprumas, tokie modeliai nebuvo sėkmingi matuojant priklausomybę nuo ISAC antigeno taikymo. Nebuvo išmatuota skirtumų tarp tikslinių ir izotipo T785-ISAC atliekant plokštelinius tyrimus, kai kartu buvo auginami sveiki žmogaus mieloidiniai APC.su naviko ląstelėmis (duomenys nerodomi).Priklausomybės nuo tikslo nebuvimas, išmatuotas in vitro, gali būti siejamas su keliais veiksniais: nustatyta, kad mieloidiniai APC padidina Fc R reguliavimą ląstelės paviršiuje po kultivavimo in vitro, o tai gali sustiprinti tirpaus IgG gebėjimą prisijungti prie Fc R, o tai lemia sustiprintas signalas iš izotipo ISAC.Be to, kultūringisistemai trūksta endogeninio IgG ir papildomų serumo faktorių, esančių in vivo, kurie gali konkuruoti dėl FcR in vivo ir slopinti poveikį, pastebėtą naudojant ISAC izotipu.Nepaisant to, in vivo modeliai parodė, kad ISAC yra priklausomas nuo nukreipimo į naviką, kad būtų užtikrintas priešnavikinis veiksmingumas.ISAC izotipas ne tik parodė nedidelį poveikį naviko augimui veiksmingumo tyrimuose, bet taip pat buvo nustatyta, kad jie neturi įtakos navikų genetiniam lygiui, kaip parodyta ksenografinių ir singeninių navikų modeliuose.Be to, kad in vivo parodė nuo tikslo priklausomą veiksmingumą, T785-ISAC buvo toleruojamas gyvūnų ir sukėlė minimalų svorio kritimą, o tai parodė mažai pašalinių poveikių ir nepageidaujamų reiškinių pelėms.Šie duomenys dar labiau patvirtina sisteminio į naviką nukreipto ISAC gebėjimą nukeliauti iki naviko ir sukelti vietinį priešuždegiminį priešnavikinį atsaką.

Mieloidinių ląstelių sukeltų efektorių funkcijų svarba buvo įrodyta atliekant ląstelių ardymo tyrimus, kurių metu fagocitų klodronato išeikvojimas sumažino ISAC gebėjimą sukelti naviko klirensą.Įdomu tai, kad nors navikai iš pradžių regresavo po Gr1 teigiamų ląstelių išeikvojimo, vėliau augliai išaugo.Šis reiškinys galėjo atsirasti dėl fagocitų pirmtakų, tokių kaip monocitai, išeikvojimo, kurie vėliau galėjo diferencijuotis į funkcines ir subrendusias fagocitines ląsteles 51.Daugiau molekulinių ir ląstelių įžvalgų buvo gauta kiekybiškai įvertinus mRNR lygį ir pokyčius po gydymo ISAC.Šiuos duomenis dar labiau patvirtino imunohistochemija, taip pat baltymų kiekybinis nustatymas, rodantis mieloidinių ląstelių infiltraciją į naviką.gaminant uždegimą skatinantį citokiną TNF ir mieloidinius chemoatraktantus CCL2 (MCP-1) ir CCL4 (Mip1b).

2 pav. ISACS sukelia skirtingus signalizacijos modelius mieloidiniuose APC. (ad) Šviežiai izoliuoti žmogaus PBMC buvo stimuliuojami 1 μM rituksimabo-ISAC arba ekvimoliniu mišinio ekvivalentu, esant CD20 ir Toledo naviko ląstelėms santykiu 1:1 santykiu 15 minučių. a ) Vidutinis ISAC ir signalizacijos santykis buvo išmatuotas po įvairių fosfoproteinų mišinio stimuliavimo, kaip parodyta šilumos žemėlapyje, o geltona spalva rodo padidėjusį signalizavimą, o mėlyna - sumažėjusį signalą. b ) reprezentatyvūs srauto citometrijos brėžiniai pIRF7 ir pRPS6 monocituose ir cDC. (c) Sukelto signalizacijos pokytis buvo apskaičiuotas kaip arcsinh santykis, palyginti su nestimuliuojančia kontrole. IRF7 ir ERK1 / 2 fosforilinimas buvo matuojamas monocituose ir cDC po ISAC arba mišinio stimuliacijos. Duomenys yra iš vieno eksperimento su šešiais donorais (vidurkis ir SEM); *P<0.05,><0.01,><0.001,><0.0001. (d)="" representative="" drevi="" plots="" following="" dremi="" analysis="" with="" the="" area="" under="" the="" curve="" (auc)="" and="" inflection="" point="" (ip)="" denoted.="" drevi="" plots="" were="" visually="" inspected="" for="" curve="" fit="" and="" signal-to-noise,="" and="" inflection="" points="" were="" calculated="" for="" those="" with="" proper="" sigmoidal="" curve="" fits="" (n/a="" indicates="" no="" curve="">

CCL2 ir CCL4, CCR2 ir CCR5 receptoriai yra ekspresuojami atitinkamai monocituose ir makrofaguose, o tai rodo, kad šie ląstelių tipai gali būti įtraukti į ISAC gydomus navikus.Be to, Cxcl9 ir Cxcl11 mRNR, kurios koduoja T ląstelėms specifinius chemokinus ir yra ekspresuojamos DC TME, taip pat buvo sureguliuotos gydant trastuzumabu ISAC (papildomas 23 paveikslas) 52, 53.Padidinto stiprumo trastuzumabo ISAC, naudojant agonistą CL264, buvo veiksmingesnis auglių modeliuose, kurie išreiškia mažiau HER2.Tai svarbu, nes pacientams, kurių navikai išreiškia mažą HER2, gydymo galimybės yra ribotos ir jiems negalima skirti trastuzumabo ar kito gydymo, kurio sudėtyje yra trastuzumabo.Gyvūnams, gydytiems tiek tiksliniais, tiek izotipo CL264-ISAC, buvo pastebėtas laikinas maždaug 5-10 proc. svorio netekimas ir padidėjusi sisteminė TNF sekrecija, o tai rodo galimą netikslinį poveikį, be stipraus anti- pastebėtas naviko aktyvumas.Ksenografijos modeliuose pateikti kolektyviniai duomenys rodo, kad ISAC sukelta fagocitozė yra veiksmingas navikų pašalinimo mechanizmas, tačiau šis mechanizmas gali sustiprėti po to, kai imunokompetentingų šeimininkų T ląstelėms pateikiami antigenai naviko neoantigenai.Siekiant šio tikslo, ISAC gebėjimas skatinti priešnavikinį imunitetą laukinio tipo pelėms buvo tiriamas naudojant anti-rHER2 ISAC dviejose skirtingose.rHER2-išreiškiantys singeninius modelius (MMC ir CT26-rHER2). Tiek T785, tiek CL264 turintys ISAC buvo įvertinti singeniniame MMC modelyje, atsižvelgiant į didelę rHER2 antigeno ekspresiją, nes buvo teigiama, kad tiek mažesnio, tiek didesnio stiprumo ISAC yra veiksmingi esant dideliam antigeno tankiui naviko ląstelėje. Abu rHER2 ISAC lėmė visišką naviko klirensą gyvūnams, turintiems didelius navikus (350-950 mm3) pagal MMC modelį, o nekonjuguotas antikūnas nesugebėjo kontroliuoti naviko augimo. MRNR transkripto lygių analizė MMC modelyje atskleidė dramatišką reguliavimo pokytįdaug genų praėjus 24 valandoms po gydymo tiksliniu rHER2 T785-ISAC, palyginti su rHER2 antikūnu arba izotipu ISAC, įskaitant genus, susijusius su mieloidinių ląstelių biologija, TLR biologija ir adaptyviu imuniniu atsaku. Imunohistochemijos metodu buvo pastebėtas padidėjęs CD11c ir F4/80- ekspresuojančių ląstelių infiltratas, panašus į HCC1954 ksenografinio naviko modelio tendenciją. Be to, buvo pastebėta CD8 T ląstelių infiltracijaimunohistochemija, palaikanti adaptyvaus imuninio atsako susidarymą po gydymo ISAC.

Be įrodytos fagocitų svarbos ksenografo modelyje, MMC singeninio naviko modelio išeikvojimo tyrimai atskleidė didelę priklausomybę nuo fagocitų, nes išeikvojimas naudojant klodronato pakrautas liposomas sustabdė ISAC sukeltą priešnavikinį poveikį. Be to, singeniniai tyrimai parodė lemiamą T ląstelių vaidmenį ISAC veiksmingumui. ISAC skatinamas naviko klirensas labai priklausė nuo CD8 T ląstelių aktyvumo, nes CD8 T ląstelių išeikvojimas slopino priešnavikinį veiksmingumą. Duomenys rodo, kad T ląstelių aktyvumą lemia TLR sukeltas ISAC stimuliuojamų mieloidinių ląstelių aktyvavimas. Toks reikalavimas T ląstelėms, tikriausiai susijęs su ISAC stimuliuojamų mieloidinių ląstelių su naviku susijusių antigenų pateikimu, patvirtina, kad ISAC greičiausiai tarpininkauja jų priešnavikiniam aktyvumui per mažiausiai du mechanizmus: fagocitozę ir antigeno pateikimą. Nors fagocitai suteikia ankstyvą priešnavikinį atsaką po gydymo ISAC, T ląstelių antigenų pradėjimas galiausiai užtikrina naviko klirensą ir ilgalaikį poveikį, išmatuotą visiškai imunokompetentinguose modeliuose. Šis derinys būtų labai pageidautinas vėžiu sergantiems pacientams, nes gydymas ISAC gali sukelti tvirtą ir patvarų priešnavikinį imunitetą. Siekiant toliau tirti ISAC sukeltos T ląstelių aktyvacijos svarbą, pelėms po rHER2 CL buvo išgydyti CT26- rHER2 navikai. 264-Gydymas ISAC buvo pakartotinai išbandytas po 30 dienų, kai auglio nebuvo, naudojant ne rHER2 ekspresuojančią CT26 tėvų ląstelių liniją. rHER2-CT26 išgydyti gyvūnai buvo apsaugoti nuo užkrėtimo CT26, o auglio negydyti gyvūnai negalėjo atmesti naviko augimo. Be to, siekiant parodyti, kad apsauga buvo specifinė CT26 naviko ląstelių linijai, 4T1 tuo pačiu metu buvo implantuotas į priešingą šoną tėvų CT26 užkrėstų pelių. Nors jos CT26 išgydytose pelėse CT26 navikų augti nepavyko, 4T1 naviko augimas nebuvo apsunkintas, todėl yra įrodymų, kad imunitetas yra specifinis antigenui ir priklauso nuo adaptyvaus imuninio atsako. Be to, šie tyrimai rodo, kad į naviką nukreipti ISAC tarpininkauja imunologinei atminčiai ne tik iš pradžių nukreiptam naviko antigenui, bet ir netiksliniams antigenams. Šie duomenys taip pat rodo, kad mieloidinėse ląstelėse gali būti su naviku susijusių antigenų, kurie skatina papildomus CTL atsakus. Šių išvadų pasekmės rodo, kad net jei tikslinis naviko antigenas vėliau yra sumažintas arba negali prisijungti prie ISAC, imunologinė atmintis jau buvo panaudota ir gali palaikyti ilgalaikį atsaką. Šis atsakymas nėratik antigenas, į kurį nukreiptas ISAC, bet ir papildomi, nenustatyti, naviko ekspresuojami antigenai.Visi šie duomenys rodo, kad ISAC sukelia kokybiškai ir kiekybiškai skirtingą biologiją, susijusią su ląstelių aktyvavimu ir antigenų pateikimu, T ląstelių proliferacija ir patvariu priešnavikiniu imunitetu.

Methods and Materials: Antibody Conjugation & Characterization For conjugation of adjuvants to the antibody, adjuvants were first synthesized to include a linker flanked by a reactive group. Conjugates produced using two-step methods were first synthesized through the modification of mAb lysine residues with a heterobifunctional crosslinker SATA. Deprotection of the acetylated thiol exposed a reactive thiol which was then reacted at room temperature for 2-4 hours with an adjuvant-linker flanked by a thio-reactive maleimide. For constructs produced using a single-step conjugation method, TFP esters were then conjugated to an IgG1 antibody. The TFP esters were dissolved in anhydrous DMSO to make a 20 mM stock solution and 5-10 molar equivalents (relative to the antibody) were added to the IgG antibody at 10 mg/mL in PBS. The conjugation reaction was performed at 4-40°C for 2-12 hours. The resulting immunoconjugates were buffer exchanged into PBS (pH 7.4) through desalting (Zeba Columns, Thermo Fisher Scientific) or dialysis to remove excess small molecular weight impurities. The final protein concentration was determined by measuring the absorbance at 280 nm on a Nanodrop 1000 spectrophotometer (Thermo Fisher Scientific). The yields were >75 proc., remiantis regeneruotu baltymu. SEC analizė aptiko minimalų agregato buvimą, o DAR buvo nustatytas LC/MS analize. Išgryninti ISAC buvo filtruojami per 0,2 μm sterilų filtrą ir iki naudojimo laikomi –20 laipsnių temperatūroje. HEK Reporter AssayHEK293 reporterio ląstelės, ekspresuojančios žmogaus TLR7 arba žmogaus TLR8, buvo įsigytos iš Invivogen (hub-htlr7 arba hub-htlr8). ir pardavėjo protokolai buvo laikomasi ląstelių dauginimo ir eksperimentavimo. Trumpai tariant, ląstelės buvo auginamos iki 80-85 procentų susiliejimo esant 5 procentams CO2 DMEM, papildytu 10 procentų FBS, zeocinu ir blasticidinu. Tada ląstelės buvo pasėtos į 96-šulinėlių plokščias plokšteles 4 x 104 ląstelių/šulinėlių kiekiu su substratu, kuriame buvo HEK aptikimo terpė ir imunostimuliuojančios molekulės. Aktyvumas buvo matuojamas naudojant plokštelių skaitytuvą, esant 620-655 nm bangos ilgiui. Biacore AnalysisHis-žymėti Fc gama receptorių (FCGR) baltymai buvo gauti iš R&D Systems (FCGR1 (CD64, cat# 1257-FC{{23}). }), FCGR2A (CD32a, cat# 1257-FC-050), FCGR2B (CD32b, cat# 1875-FC-050), FCGR3A (CD16a, cat# {{34) }}FC-050). Surišimo analizė atlikta Biacore T200 instrumentu HBS-EP plus buferyje (GE BR100669), naudojant CM5 lustą (GE BR100530), kuriame yra imobilizuotas anti-HIS antikūnas (HIS Capture rinkinys, GE 28995056). ). Rituksimabas arba Rituximab-ISAC suleido per srautą į ląsteles, kuriose yra tik užfiksuotų FCGR arba etaloninio paviršiaus anti-His antikūnų. Duomenys buvo du kartus susieti suAnti-His paviršius ir tik buferio injekcija. Naudotas kinetinio titravimo metodas ir paviršiai regeneruojami tarp ciklų įpurškiant 10 mM glicino, pH 1,5. Duomenys buvo suderinti naudojant Biacore T200 vertinimo programinę įrangą (V3.1), naudojant kinetinį pritaikymą (1:1) FCGR1 ir FCGR3A (6 paleidimų vidurkis) ir pastovios būsenos afinitetą (1:1) FCGR2A ir FCGR2B (3 paleidimų vidurkis) ).

Human Myeloid APC Isolation Myeloid APCs, which predominantly consisted of monocytes (>95%), were isolated from the whole blood of healthy donors (Stanford Blood Center) by density gradient centrifugation using a RosetteSep Human Monocyte Enrichment Cocktail (Stem Cell Technologies). Myeloid APCs were further isolated using a negative selection Human Monocyte Enrichment Kit without CD16 depletion (Stem Cell Technologies) to a final purity of >90 procentų, kaip nustatyta srauto citometrija, pagrįsta CD14, CD16, CD11c ir HLA-DR ekspresija. Toledo naviko ląstelių paruošimas Toledo ląstelės (ATCC) buvo kultivuojamos pardavėjo rekomenduojamoje terpėje ir palaikomos pardavėjo rekomenduojamu ląstelių tankiu (ATCC). Ląstelės buvo pašalintos iš kultūros, plaunamos ir resuspenduojamos PBS su 2 procentais FBS ir 2 mM EDTA, esant 1-10x106 ląstelių/ml. Kai kuriais atvejais ląstelės vėliau 2 minutes buvo ženklinamos 2 μM CFSE, o po to vieną kartą plaunamos RPMI -1640 (Lonza), papildytu 10 procentų FBS (Atlanta Biologicals) ir 100 V/mL Pen/Strep (Lonza). Tada ląstelės buvo fiksuotos 2 procentų paraformaldehidu ir prieš tolesnį naudojimą tris kartus plaunamos PBS. Ląstelių aktyvinimo tyrimai PBMC arba izoliuoti monocitai buvo dedami atitinkamai 3x105 arba 2x105 ląstelių viename duobutėje plokščiadugnėse 96-šulinėlių plokštelėse IMDM. papildyta 10 procentų FBS (Atlanta Biologicals), 1 mM natrio piruvatu (Lonza), 100 μM nepakeičiamų aminorūgščių (Lonza) ir 100 U/mL Pen/Strep (Lonza). Monocitų ir naviko bendros kultūros eksperimentams monocitai buvo kultivuojami su fiksuotomis alogeninėmis naviko ląstelėmis santykiu 3:1. Vėliau ląstelės buvo inkubuojamos su imunostimuliuojančiomis medžiagomis arba kontrolinėmis medžiagomis 18-36 valandas 37 laipsnių temperatūroje su 10 procentų CO2. Ląstelių aktyvacija buvo matuojama naudojant aktyvacijos žymenų ekspresiją ląstelės paviršiuje ir citokinų gamybą. Paviršiaus žymenų ekspresijos lygiai buvo išmatuoti srauto citometrija naudojant antikūnus prieš CD40 (5C3, BD), CD86 (IT2.2, BD), HLA-DR (L243, BD) ir CD16 (3G8, BD), CD14 (MΦP9, BD) ir CD123 (7G3, BD). PBMC buvo analizuojami srauto citometrija naudojant antikūnus prieš minėtus aktyvacijos žymenis, taip pat linijos žymenis CD19 (HIB19, BD), CD56 (B159, BD), CD3 (SK7, BD), CD4 (OKT4, BioLegend), CD8 (SK1, BD) ir CD69 (FN50, BD). Visais atvejais ląstelių kultūros supernatantas buvo renkamas po 18 ar 36- valandų inkubacijos, o citokinų gamyba buvo matuojama naudojant citokinų granulių rinkinius (Human Inflammatory Cytokine Kit, BD Biosciences) ir ELISA (TNF Human ELISA rinkinys, eBiosciences). .Masės citometrija PBMC buvo išskirti iš sveiko donoro kraujo ir stimuliuojami ISAC, antikūnų ir adjuvanto mišiniu, arba be dirgiklio 5-15 minutes 37 laipsnių temperatūroje. Po stimuliacijos ląstelėsbuvo fiksuoti pridedant 16 procentų PFA (elektroninės mikroskopijos mokslai) iki galutinės 1,6 procento koncentracijos ir inkubuojami 1 0 minutes kambario temperatūroje (RT). Fiksuotos ląstelės buvo plaunamos ląstelių dažymo terpe (CSM; PBS su 0,5 procento BSA ir 0,02 procento natrio azido (visa Sigma) ir pažymėtos brūkšniniu kodu, naudojant paladžio metodą, kaip aprašyta anksčiau 54. Brūkšniniu kodu pažymėti mėginiai buvo sujungti į vieną sudėtinis mėginys paviršiaus dažymui.

Paviršiaus dažymas buvo atliktas pridedant antikūnų (2 papildoma lentelė) į CSM ir inkubuojant 3{{10}} minutes kambario temperatūroje. Antikūnai prieš žmones buvo įsigyti konjuguoti (Fluidigm) arba konjuguoti su sunkiųjų metalų izotopais, naudojant MaxPar X8 antikūnų žymėjimo rinkinį (Fluidigm) pagal gamintojo rekomendacijas. Paviršiaus dažytos ląstelės vieną kartą buvo plaunamos CSM ir 10 minučių permeabilizuojamos MeOH ant ledo. Permeabilizuotos ląstelės du kartus plaunamos CSM ir 30 minučių buvo pridėta antikūnų prieš intracelulinius antigenus kambario temperatūroje. Ląstelės buvo plaunamos CSM ir galiausiai resuspenduojamos interkalacijos tirpale (1,6 proc. PFA PBS, 0,02 proc. saponino (Sigma) ir 0,5 μM iridžio interkalatoriaus (Fluidigm)) per naktį 4 laipsnių temperatūroje. Prieš renkant duomenis, mėginiai vieną kartą buvo plaunami CSM ir du kartus ddH2O. Visi mėginiai buvo filtruojami per ląstelių sietelį (Falcon) ir resuspenduojami 1x106 ląstelių/ml ddH2O, papildytu 1x EQ keturių elementų kalibravimo granulėmis (Fluidigm) ir duomenimis, gautais naudojant CyTOF2 masės citometrą (Fluidigm). Signalizacijos atsakai buvo įvertinti naudojant SPADE įgyvendinimą Citibank 29. Analizės buvo atliktos visose ląstelėse (be atrankos), pasirenkant nurodytą klasterių skaičių ir naudojant visus atitinkamus paviršiaus žymenis, bet ne tarpląstelinių žymenų klasterizavimui. Imuninių ląstelių linijos buvo anotuotos pagal jų didelio matmens paviršiaus baltymų ekspresijos modelius. Statistinės analizės buvo atliktos R, atvirojo kodo statistinės programinės įrangos aplinkoje. Kiekviename ląstelių pogrupyje, gydymo grupėje ir donore buvo apskaičiuotas šių dvidešimties fosfobaltymų žymenų vidutinis kartotinis pokytis: p-Src, p-STAT5, p-cMET, p-AKT, p-MAPKAPK2, p-SHP2, p. -SLP76, p-IRF-7, p-ZAP70/SYK, p-CREB, p-NFKB, p-PI3K, IKB (iš viso), p-PLCG1, p-ERK1/2, p-p38, p -BTK/ITK, p-S6, p-STAT3 ir p-JNK/SAPK. Vidutinis kartos pokytis buvo pasvertas pagal bendrą ląstelių skaičių kiekviename klasteryje, kaip apibrėžta po SPADE klasterizacijos. Suporuoti t testai buvo atlikti siekiant įvertinti vidutinio kartos pokyčio skirtumą ir patikrinti nulinę hipotezę, kad kiekvieno žymens vidutinis kartos pokytis gydymo ir kontrolės sąlygomis nesiskyrė.

Ksenografinio naviko modelio eksperimentinė procedūraNaviko ląstelių linijos buvo įsigytos iš ATCC (NCI-N87, HCC1954 ir COLO205) arba AddexBio (JIMT-1) ir auginamos pagal gamintojo gaires. Ląstelės buvo paimtos, kai jos pasiekė 80-90 procentų susiliejimą, atskiriant Accutase (Stemcell), plaunamos PBS, resuspenduojamos 40 x 106 ląstelių/ml PBS ir dedamos ant ledo ne ilgiau kaip dviem valandoms. Prieš pat implantavimą suspenduotos ląstelės buvo sumaišytos su tokiu pat kiekiu Cultrex PathClear BME, 3 tipo (R&D Systems), ir 100 μl mišinio (2 x 106 ląstelės) buvo implantuota po oda į dešinįjį šoną 6-8-savaitę. -senos pelių patelės: NCI-N87 ir COLO205 ląstelės buvo implantuotos į NSG peles (Jackson Laboratory), HCC1954 ir JIMT{18}} ląstelės buvo implantuotos į Rag2/IL2rg dvigubą išmušimą (Taconic) ir HCC1954 (vertinant su T785-ISAC) buvo implantuoti į NSG arbaSCID/smėlio spalvos pelės (Jackson Laboratory arba Taconic ir Envigo). Naviko dydis buvo registruojamas du kartus per savaitę ir buvo įvertintas pagal šią formulę: (ilgis x plotis2)/2. Kai navikai pasiekė 50-100 mm3, paprastai per savaitę nuo naviko implantacijos, gydymas buvo pradėtas. Prieš pradinį gydymą pelės buvo atsitiktinai suskirstytos į gydymo grupes pagal naviko dydį. Trastuzumabas (EirGenix; EG12014), Trastuzumab ISAC arba izotipas ISAC buvo paruoštas 1 mg / ml PBS ir buvo skiriamas 5 mg / kg į pilvaplėvės ertmę kas penkias dienas (Q5D), iš viso šešias dozes. Pelės, kurių navikai viršijo 2000 mm3, buvo numarintos.

HCC1954 ir MMC ląstelių išeikvojimo eksperimentinė procedūra Norint išeikvoti makrofagus ir kitas fagocitines ląsteles, pelės, turinčios HCC1954 arba MMC navikus, buvo gydomos intraperitonine injekcija likus dviem dienoms iki pradinio gydymo ISAC klodronato liposomomis arba kontrolinėmis liposomomis, kurių sudėtyje nėra kontrolinio klodronato (kaip neigiamas klodronatas # CLD-8901) ir po to buvo gydomi du kartus per savaitę iš viso tris savaites. Kad išeikvotų neutrofilus, pelės buvo gydomos mažėjančiais antikūnais 1A8, kad išeikvotų tik Ly6G ir neutrofilus (BioXCell katalogo Nr. BE0075-1) arba RB6-8C5, kad išeikvotų Gr1 plius ląsteles, įskaitant Ly6G plius neutrofilus ir Ly6C plus. ląstelės (BioXCell katalogo Nr. BE0075) arba izotipo kontroliniai 2A3 ir LTF-2 (atitinkamai BioXCell katalogo Nr. BE0089 ir BE0090) likus dviem dienoms iki pradinio gydymo ISAC, po to tris savaites buvo gydomi du kartus per savaitę. Ląstelių išeikvojimas kraujyje buvo patvirtintas srauto citometrija (papildomas 24 paveikslas). Naviko citokinų ir mRNR analizės procedūra Navikai buvo implantuoti, kaip aprašyta anksčiau, ir surinkti analizei nurodytais laiko momentais po gydymo. Imunohistochemijos ir mRNR analizei navikai buvo suskaidyti, o mRNR buvo analizuojama naudojant NanoString pelės vėžio imuninio profiliavimo skydelį. Duomenų analizė atlikta su nSolver Advanced Analysis Software pagal gamintojo rekomendacijas. Vulkanų brėžiniai buvo nubraižyti naudojant ggplot2 pakuotę R. Norint gauti naviko lizatus citokinų analizei, naviko fragmentai buvo laikomi iš anksto paruoštame buferyje (1 Pierce proteazės inhibitorių tabletė (Thermo Fisher, katalogas Nr. A32965), ištirpinta 20 ml T- PER audinių baltymų ekstrahavimo reagentas, Thermo Fisher, katalogas Nr. 78510) GentleMACS M mėgintuvėliuose (Miltenyi, katalogo Nr. 130-093-236) iškart po skrodimo. Tada naviko mėginiai buvo atskirti naudojant GentleMACS Octo Dissociator. Visi mėginiai buvo sukami 5 minutes po 300 g. Tada supernatantai buvo surinkti į mikrofūgų mėgintuvėlius ir vėl nusukti mikrocentrifuga. MSD supernatantuose buvo atlikta citokinų analizė. Imunohistochemija buvo atlikta naudojant hematoksiliną ir eoziną, siekiant nustatyti audinių architektūrą, taip pat šiuos žymenis, kai buvo nurodyta tyrimuose: CD11c (CST katalogas Nr. 87585) ir CD8 (CST katalogas Nr. 98941).

4 pav. T785-ISAC sukelia stiprų priešnavikinį imunitetą trastuzumabui atsparių naviko ksenografų modeliuose.(ad) SCID/Beige arba NSG pelėms buvo implantuota naviko ląstelių linija HCC1954 ir buvo atsitiktinai suskirstytos, kai naviko tūris pasiekė 50 – 75 mm3. (a) Pelės buvo gydomos vieną kartą intraperitoniniu būdu (IP) 5 mg/kg trastuzumabo T785- ISAC arba trastuzumabu arba moliniu lygiaverčiu dozavimu trastuzumabo ir T785 mišiniu į ISAC intratumoraline (IT) injekcija. Duomenys gauti iš vieno eksperimento su n=3-5 pelių vienoje grupėje. b) Pelės buvo gydomos intraperitonine injekcija 5 mg/kg trastuzumabo, trastuzumabo-ISAC,rituksimabas arba rituksimabas-ISAC Q5DX6 (n= 5 pelių grupėje). (c) Pelės buvo gydomos intraperitonine injekcija 5 mg/kg trastuzumabo, trastuzumabo T785-ISAC, trastuzumabo N297A-ISAC arba trastuzumabo TLRnull-ISAC (n =5 pelių grupėje). (d) HCC1954 naviko ląstelės buvo implantuotos į SCID/Beige peles, o dominančios ląstelės buvo išeikvotos prieš gydymą trastuzumabu T785- ir jo metu (5 mg/kg, Q5DX3), naudojant anti-Ly6G antikūnus (žiurkės IgG2a kontrolė). , klodronato liposomos (kontrolinės liposomos kaip kontrolė) arba anti-Gr1 antikūnai (žiurkės IgG2b kontrolė). Duomenys gauti iš vieno eksperimento su n=4-6 pelių grupėje. (e, f) NSG arba Rag2/IL2rg dvigubo išmušimo pelėms buvo implantuota JIMT-1 naviko ląstelių linija ir atsitiktinės atrankos būdu, kai naviko tūris pasiekė 50–75 mm3. Vėliau pelės buvo gydomos nurodytu gydymu 5 mg/kg į pilvaplėvės ertmę, dažnis (e) Q5DX6arba (f) Q5DX5 (n =3-6 pelių grupėje). (bf) Rodomi duomenys reprezentuoja bent du eksperimentus. (gj) HCC-1954 navikai buvo paimti iš pelių grupių nurodytais laiko momentais po gydymo viena 5 mg/kg ISAC doze arba kontroliniais antikūnais. Navikai buvo apdoroti srauto citometrijos analizei, NanoString mRNR kiekybiniam įvertinimui arba formalinu fiksuoti ir parafinu įterpti imunohistochemijai. (g) Vulkano diagramos vaizduoja genų ekspresijos pokytį log2 kartus gydytų ir izotipo kontrolinių navikų atžvilgiu, išmatuotą NanoString 24 valandas (n=5 pelių grupėje). Pakeitimai, kurių pakoreguota p reikšmė < 0.05,="" rodomi="" raudonai.="" (h)="" genų="" parašo="" balai,="" įvertinti="" pagal="" nsolver="" advanced="" analysis="" pathway="" score="" navikams,="" analizuotiems="" praėjus="" 24="" valandoms="" po="" gydymo="" (n="5" pelių="" grupėje).="" (i)="" naviko="" ląstelių="" sudėties="" srauto="" citometrinė="" analizė="" praėjus="" 24="" valandoms="" ir="" 7="" dienoms="" po="" gydymo="" (n="2-4" pelių="" grupėje).="" duomenys="" reprezentuoja="" mažiausiai="" 2="" eksperimentus.="" (j)="" reprezentatyvūs="" vaizdai,="" taip="" pat="" f4/80="" ir="" cd11c="" ihc="" auglių,="" surinktų="" praėjus="" 9="" dienoms="" po="" kiekvieno="" nurodyto="" gydymo,="" kiekybinis="" įvertinimas.="" mastelio="" juostos="" yra="" 50="" μm.="" (aj)="" duomenys="" rodomi="" kaip="" vidurkis="" naudojant="" sem,="" o="" statistika="" rodoma=""><0.05,><0.01,><0.001,><>

Singeninio naviko modelio eksperimentinė procedūra MMC ląstelės buvo gautos iš Dr. Disis (Vašingtono universitetas) ir buvo kultivuojamos RPMI 1640, papildytu 20 % FBS, 1 % penicilino-streptomicino ir L-glutaminu 37 laipsnių temperatūroje ir 5 % CO2 iki {{8 }} procentai susilieja. CT26 ląstelės (ATCC), transfekuotos, kad stabiliai ekspresuotų žiurkės HER2 baltymą, buvo auginamos RPMI 1640, papildytu 10 procentų FBS ir 600 ug/mL selektyvaus G418 antibiotiko (Thermo), esant 37 laipsnių temperatūrai ir 5 procentams CO2, kol susiliejo 80-90 procentai. Pakankamai susiliejusios ląstelės buvo surenkamos atimant Accutase (Stemcell) ir plaunant PBS. Surinktos ląstelės buvo resuspenduojamos esant 20 x 106 ląstelių/ml (MMC)arba 5 x 106 ląstelių/mL (CT26-rHER2) PBS ir iki naudojimo laikomi 4 laipsnių temperatūroje / ant ledo. 100 μlsuspenduotų ląstelių buvo implantuota po oda į 6-8-savaičių senumo FVB/N-TgN(MMTV-Erbb2)NK1Mul/Jmice (MMC modelis, The Jackson Laboratory) arba BALB/c pelių pateles (CT26 modelis, The Jackson Laboratory) . Auglio dydis buvo matuojamas ir užregistruotas du kartusper savaitę tyrimo metu. Naviko tūris buvo įvertintas pagal šią formulę: (ilgis x plotis2)/2. Kai navikai pasiekė 200-500 mm3 (MMC) arba 50-100 mm3 (CT26-rHER2), paprastai per savaitę nuo naviko implantacijos, gydymas buvo pradėtas. Prieš pradėdami, pelės buvo atsitiktinai suskirstytos į gydymo grupes pagal naviko dydįgydymas. Tyrimo metu anti-rHER2 mAb (BioXCell; 7.16.4) arba anti-rHER2-ISAC buvo švirkščiamas į pilvaplėvės ertmę (dažnis nurodytas paveikslėlių legendose).Pelės, kurių navikai viršijo 2000 mm3, buvo numarintos. Buvo įvertintas T ląstelių išeikvojimasgyvūnams naudojant CD4 (BioXCell; GK1.5) arba CD8 (BioXCell; YTS 169.4) ląsteles ardančius antikūnus. Išeikvojimas buvo pradėtas prieš naviko implantavimą ir tęsiamas du kartus per savaitę vartojant 200 ug vienam antikūnui. Norint atkurti naviką, CT26 ir 4T1 ląstelių linijos buvo implantuotos po 5 x 106 ląsteles vienoje naviko linijoje, o pelėms, kurios anksčiau nebuvo auglio, buvo tiriamos abi ląstelių linijos kaip kontrolinės.

Papildoma medžiaga Norėdami gauti papildomos medžiagos, žr. žiniatinklio versiją PubMed Central. Padėka: Autoriai nori padėkoti P. Basto, NE Reticker-Flynn, T. Prestwood ir B. Mallet už naudingą diskusiją. Taip pat dėkojame Stanfordo kraujo centro srauto citometrijos branduoliui, ypač L. Tolentino, O. Choi ir N. Wu. Taip pat dėkojame dr. Mary L. (Nora) Disis ir Denise Cecil iš Vašingtono universiteto, kurios suteikė MMC naviko ląstelių liniją.

Finansavimas: SE Ackerman parėmė Stanfordo BioX Bowes stipendija.

Literatūra:1. Davis TA ir kt. Rituksimabo anti-CD20 monokloninių antikūnų gydymas ne Hodžkino limfoma: pakartotinio gydymo saugumas ir veiksmingumas. J Clin Oncol 18, 3135–3143, doi: 10.1200/JCO.2000.18.17.3135 (2000). [PubMed: 10963642]2. Grillo-Lopez AJ ir kt. Rituksimabas: pirmasis monokloninis antikūnas, patvirtintas limfomai gydyti. Curr Pharm Biotechnol 1, 1–9 (2000). [PubMed: 11467356]3. Lizotte PH ir kt. Daugiaparametrinis nesmulkialąstelinių plaučių vėžio profiliavimas atskleidžia skirtingus imunofenotipus. JCI Insight 1, e89014, doi:10.1172/jci.insight.89014 (2016). [PubMed: 27699239]4. Sprangeris S ir kt. Imunogeninių antigenų tankis nepaaiškina T-ląstelių uždegimo naviko mikroaplinkos buvimo ar nebuvimo melanomos atveju. Proc Natl Acad Sci USA 113, E7759–E7768, doi: 10.1073/pnas.1609376113 (2016). [PubMed: 27837020]5. Beatty GL & Gladney WL Imuninio pabėgimo mechanizmai kaip vėžio imunoterapijos vadovas. Clin Cancer Res 21, 687–692, doi: 10.1158/1078-0432.CCR-14-1860 (2015). [PubMed: 25501578]6. Fridman WH, Puslapiai F, Salutes-Fridman C ir Galon J. Žmogaus navikų imuninis kontekstas: poveikis klinikiniams rezultatams. Nat Rev Cancer 12, 298–306, doi: 10.1038/nrc3245 (2012). [Pubmed: 22419253]

7. Galon J & Bruni D Imuninių karštų, pakitusių ir šaltų navikų gydymo metodai taikant kombinuotą imunoterapiją. Nat Rev Drug Discov 18, 197–218, doi: 10.1038/s41573-018-0007-y (2019). [PubMed: 30610226]8. Gabrilovich DI, Ostrand-Rosenberg S & Bronte V Koordinuotas mieloidinių ląstelių reguliavimas augliais. Nat Rev Immunol 12, 253–268, doi: 10.1038/nri3175 (2012). [PubMed: 22437938]9. Joyce JA ir Fearon DT T ląstelių išskyrimas, imuninės privilegijos ir naviko mikroaplinka. Science 348, 74–80, doi: 10.1126/science.aaa6204 (2015). [PubMed: 25838376]10.Carmi Y ir kt. Akt ir SHP-1 yra DC būdingi naviko imuniteto kontroliniai taškai. JCI Insight 1, e89020, doi:10.1172/jci.insight.89020 (2016). [PubMed: 27812544]11. Carmi Y ir kt. Alogeninis IgG kartu su dendritinių ląstelių dirgikliais sukelia priešnavikinį T-ląstelių imunitetą. Nature 521, 99–104, doi: 10.1038/nature14424 (2015). [PubMed: 25924063]12. Allenas BM ir kt. Sisteminė disfunkcija ir imuninės mikroaplinkos plastiškumas vėžio modeliuose. Nat Med 26, 1125–1134, doi: 10.1038/s41591-020-0892-6 (2020). [PubMed: 32451499]13. Sagiv-Barfi I ir kt. Spontaninio piktybinio naviko naikinimas vietine imunoterapija. Sci Transl Med 10, doi: 10.1126/scitranslmed.aan4488 (2018).14. Spitzer MH ir kt. Veiksmingai vėžio imunoterapijai reikalingas sisteminis imunitetas. Cell 168, 487–502 e415, doi:10.1016/j.cell.2016.12.022 (2017). [PubMed: 28111070]15. Milhem Mohammed M., Theresa Medina RG, Kirkwood John M., Buchbinder Elizabeth, Mehmi Inderjit, Niu Jiaxin, Shaheen Montaser, Weight Ryan, Margolin Kim, Luke Jason, Morris Aaron, Mauro David, Krieg Arthur M., Ribas Antoni CT{ {77}}Intratumoralinio į rinkliavą panašių receptorių (TLR9) agonistas CMP-001 kartu su pembrolizumabu gali pakeisti atsparumą PD-1 slopinimui 1b fazės tyrime pacientams, sergantiems pažengusia melanoma (AACR metinis susirinkimas). 2018, 2018).16. Rook AH TLR agonistų grožis CTCL. Blood 119, 321–322, doi: 10.1182 / kraujas-2011-11-391243 (2012). [PubMed: 22247516]17. Singhas M ir kt. Veiksmingas įgimtas ir prisitaikantis imunitetas nuo melanomos per lokalizuotą TLR7/8 aktyvavimą. J Immunol 193, 4722–4731, doi: 10.4049 / J Immunol.1401160 (2014). [PubMed:25252955]18. Zhao BG, Vasilakos JP, Tross D, Smirnov D ir Klinman DM Kombinuotas gydymas, nukreiptas į rinkliavą primenančius 7, 8 ir 9 receptorius, pašalina didelius nustatytus navikus. J Immunother Cancer 2, 12, doi: 10.1186 / 2051-1426-2-12 (2014). [PubMed: 24982761]19. Jurk M ir kt. Žmogaus TLR7 arba TLR8 nepriklausomai suteikia reakciją į antivirusinį junginį R-848. Nat Immunol 3, 499, doi: 10.1038/ni{126}} (2002). [PubMed: 12032557]20. Chattergoon MA ir kt. ŽIV ir HCV suaktyvina monocitų ir makrofagų uždegimą per endosominius Toll tipo receptorius, nesukeldami 1 tipo interferono. PLoS Pathog 10, e1004082, doi:10.1371/journal.bat.1004082 (2014). [PubMed: 24788318]21. Eigenbrod T, Pelka K, Latz E, Kreikemeyer B & Dalpke AH TLR8 jaučia bakterinę RNR žmogaus monocituose ir atlieka nereikalingą Streptococcus pyogenes atpažinimo vaidmenį. J Immunol 195, 1092–1099, doi: 10.4049 / J Immunol.1403173 (2015). [PubMed: 26101323]22. Mattsonas G ir kt. Praktinis požiūris į kryžminį ryšį. Mol Biol Rep 17, 167-183 (1993). [PubMed: 8326953]23. Gabay C, Ben-Bassat H, Schlesinger M & Laskov R Somatinės mutacijos ir intrakloniniai B-ne Hodžkino limfomos ląstelių linijų Vkappa genų pokyčiai. Eur J Haematol 63, 180–191, doi:10.1111/j.{164}}.1999.tb01766.x (1999). [PubMed: 10485273]24. Alonso MN ir kt. T(H)1, T(H)2 ir T(H)17 ląstelės nurodo monocitams diferencijuotis į specializuotus dendritinių ląstelių pogrupius. Blood 118, 3311–3320, doi: 10.1182/blood-2011-03-341065 (2011). [PubMed: 21813450]25. Clarke SR ir kt. Oalbuminui specifinės TCR transgeninės linijos OT-I apibūdinimas: MHC elementai teigiamai ir neigiamai atrankai. Immunol Cell Biol 78, 110–117, doi: 10.1046/j.{189}}.2000.00889.x (2000). [PubMed: 10762410]26. Zehn D, Lee SY ir Bevan MJ Visiškas, bet sumažintas T ląstelių atsakas į labai mažo afiniteto antigeną. Nature 458, 211–214, doi: 10.1038/nature07657 (2009). [PubMed: 19182777]27. Kondratova M ir kt. Įgimto imuninio atsako vėžiu daugialypis signalizacijos tinklo žemėlapis atskleidžia ląstelių heterogeniškumo parašus. Nat Commun 10, 4808, doi: 10.1038/s41467-019-12270-x (2019). [Pubmed: 31641119]

28. Bendall SC ir kt. Skirtingų imuninių ir vaistų atsakų vienos ląstelės masės citometrija per žmogaus kraujodaros tęstinumą. Science 332, 687–696, doi: 10.1126/science.1198704 (2011).[PubMed: 21551058]29. Qiu P ir kt. Ląstelių hierarchijos ištraukimas iš didelės apimties citometrijos duomenų naudojant SPADE. Nat Biotechnol 29, 886–891, doi: 10.1038/nbt.1991 (2011). [PubMed: 21964415]30.Kawai T & Akira S TLR signalizacija. Ląstelių mirties skirtumas 13, 816–825, doi: 10.1038/sj.cdd.4401850 (2006). [PubMed: 16410796]31. Sanchez-Mejorada G & Rosales C Signalo perdavimas imunoglobulino Fc receptoriais. J Leukoc Biol 63, 521-533 (1998). [PubMed: 9581795]32. Krishnaswamy S ir kt. Sistemų biologija. Sąlyginė tankiu pagrįsta T ląstelių signalizacijos analizė vienos ląstelės duomenyse. Science 346, 1250689, doi: 10.1126/science.1250689 (2014). [PubMed: 25342659]33. Kiefer F ir kt. Syk baltymo tirozino kinazė yra būtina Fcgamma receptorių signalizacijai makrofaguose ir neutrofiluose. Mol Cell Biol. 18, 4209-4220 (1998). [PubMed: 9632805]34. Braselmann S ir kt. R406, geriamas blužnies tirozino kinazės inhibitorius, blokuoja Fc receptorių signalizaciją ir sumažina imuninio komplekso sukeltą uždegimą. J Pharmacol Exp Ther 319, 998–1008, doi: 10.1124/jpet.106.109058 (2006). [PubMed: 16946104]35. Bruhns P ir kt. Žmogaus Fcgama receptorių ir jų polimorfinių variantų specifiškumas ir afinitetas žmogaus IgG poklasiams. Blood 113, 3716–3725, doi: 10.1182/kraujas-2008-09-179754 (2009). [PubMed: 19018092]36. Nimmerjahn F & Ravetch JV Skirtingas imunoglobulino poklasio aktyvumas per selektyvų Fc receptorių prisijungimą. Science 310, 1510–1512, doi: 10.1126/science.1118948 (2005). [PubMed: 16322460]37. Jefferis R Rekombinantinių antikūnų terapija: glikozilinimo įtaka veikimo mechanizmams. Trends Pharmacol Sci 30, 356–362, doi: 10.1016/j.tips.2009.04.007 (2009). [PubMed: 19552968]38. Tanji H, Ohajas U, Shibata T, Miyake K & Shimizu T Struktūrinis Toll tipo receptorių 8 dimerų pertvarkymas, kurį sukelia agonistiniai ligandai. Science 339, 1426–1429, doi: 10.1126/ science.1229159 (2013). [PubMed: 23520111]39. Shultz LD ir kt. Žmogaus limfoidinių ir mieloidinių ląstelių vystymasis NOD / LtSz, sakė IL2R gama nulinės pelės, įskiepytos mobilizuotomis žmogaus hemopoetinėmis kamieninėmis ląstelėmis. J Immunol 174, 6477–6489, doi: 10.4049 / J Immunol.174.10.6477 (2005). [PubMed: 15879151]40. Xia Z ir kt. Įgimtas imuninis atsakas į žmogaus kaulų čiulpų fibroblastinių ląstelių implantaciją CB17 SCID / smėlio spalvos pelėms. J Cell Biochem 98, 966–980, doi: 10.1002/jcb.20730 (2006). [PubMed: 16795075]41. Tanner M ir kt. Naujos ląstelių linijos, sukurtos iš paciento, sergančio Herceptinui atspariu krūties vėžiu, apibūdinimas. Mol Cancer Ther 3, 1585–1592 (2004). [PubMed: 15634652]42. Luque-Cabal M, Garcia-Teijido P, Fernandez-Perez Y, Sanchez-Lorenzo L ir Palacio-Vazquez I mechanizmai, lemiantys HER atsparumą trastuzumabui{140}}Sustiprėjęs krūties vėžys ir susirgimas Tai. Clin Med Insights Oncol 10, 21–30, doi: 10.4137/CMO.S34537 (2016). [PubMed: 27042153]43. Li JY ir kt. Biparatopinis HER{150}}Taikinio antikūnų ir vaistų konjugatas sukelia naviko regresiją pirminiuose modeliuose, kurie yra atsparūs HER{152}}tikslinei terapijai arba netinkami jai. Cancer Cell 29, 117–129, doi: 10.1016/j.ccell.2015.12.008 (2016). [PubMed: 26766593]44. Ning S, Pagano JS & Barber GN IRF7: aktyvinimas, reguliavimas, modifikavimas ir funkcija. Genes Immun 12, 399–414, doi: 10.1038/gene.2011.21 (2011). [PubMed: 21490621]45. Cao Q ir kt. Inkstų F4/80 plius CD11c ir mononukleariniai fagocitai pasižymi fenotipinėmis ir funkcinėmis makrofagų charakteristikomis sergant sveikata ir adriamicino nefropatija. J Am Soc Nephrol 26, 349–363, doi: 10.1681/ASN.2013121336 (2015). [PubMed: 25012165]46. Sheng J ir kt. Atskiras monocitų kilmės ląstelių pogrupis tarp tipiškų įprastinių 2 tipo dendritinių ląstelių gali veiksmingai kryžmiškai atsirasti. Cell Rep 21, 1203–1214, doi: 10.1016/ j.celrep.2017.10.024 (2017). [Pubmed: 29091760]

47. Knutson KL, Almand B, Dang Y & Disis ML Neu antigenams neigiami variantai gali būti sukurti po neu specifinių antikūnų terapijos neu transgeninėse pelėse. Cancer Res 64, 1146–1151 (2004). [PubMed: 14871850]48. Moynihan KD ir kt. Didelių nusistovėjusių pelių navikų naikinimas kombinuota imunoterapija, kuri apima įgimtą ir adaptyvų imuninį atsaką. Nat Med 22, 1402–1410, doi: 10.1038/nm.4200 (2016). [PubMed: 27775706]49.Siebenlist U, Franzoso G & Brown K NF-kappa B struktūra, reguliavimas ir funkcija. Annu Rev Cell Biol 10, 405–455, doi: 10.1146/annurev.cb.10.1102941. . [Pubmed: 7888182]

6 pav. CL264-turintys ISAC sukelia naviko klirensą HER2 terpėje, ekspresuojančioje ksenografus, ir T ląstelių sukeltą naviko klirensą, imunologinę atmintį ir epitopo plitimą singeniniame naviko modelyje. a) ISAC generavimui naudojamų T785 ir CL264 adjuvantų cheminės struktūros. (b) NSG pelės, implantuotos su HCC1954 naviko ląstelių linija, buvo atsitiktinai suskirstytos, kai naviko tūris pasiekė 50–75 mm3. Pelės buvo gydomos vieną kartą intraperitonine 5 mg/kg trastuzumabo, trastuzumabo T785-ISAC arba trastuzumabo CL264-ISAC injekcija. Navikai buvo surinkti praėjus 20 valandų po vartojimo, apdoroti iki vienos ląstelės suspensijos ir išanalizuoti srauto citometrija, siekiant įvertinti naviką infiltruojančių mieloidinių APC aktyvaciją. (cd) NSG arba Rag2/IL2rg dvigubo išmušimo pelėms buvo implantuota nurodyta žmogaus naviko ląstelių linija ir atsitiktinės atrankos būdu, kai auglio tūris pasiekė 50–75 mm3 (HCC1954) arba 75–150 mm3 (JIMT-1). Pelės buvo gydomos intraperitonine injekcija 5 mg/kg rituksimabo, trastuzumabo, trastuzumabo T785-ISAC, trastuzumabo CL264-ISAC arba atitinkamo izotipoISAC, kas 5 dienas, iš viso 6 procedūros. (e) rHER2 ekspresija buvo išmatuota naudojant CT26-rHER2 naviko ląsteles kultūroje prieš implantaciją (kairiojo srauto diagrama) ir navikuose praėjus devynioms dienoms po implantacijos (dešinėje srauto diagramoje), naudojant srauto citometriją su fluorescenciniu būdu konjuguotu anti-rHER2 antikūnu. (raudona) arba izotipo kontrolė (mėlyna). (f) Balb/c pelėms buvo implantuota CT26-rHER2 naviko ląstelių linija ir atsitiktinės atrankos būdu, kai auglio tūris pasiekė 50mm3. Tada pelės buvo gydomos intraperitonine injekcija 10 mg / kg pelių anti-žiurkėsHER2 arba pelių anti-žiurkės HER2 CL264-ISAC kas 5 dienas, iš viso 6 gydymo būdai. Rodomi duomenys yra iš 1 eksperimento su 8 pelėmis vienoje rankoje ir reprezentuoja 3 eksperimentus.

(g) Anti-rat HER2 CL264-ISAC treated mice that experienced complete tumor regression for >Praėjus 21 dienai po paskutinio gydymo, jie buvo užkrėsti tėvų CT26 (kairėje pusėje) ir 4T1 ląstelių linijomis (dešiniuoju šonu), su CD4 ir CD8 T ląstelių išeikvojimu arba be jo (kiekviena n =3). Pelės, kurios nebuvo auglios (n=6), užkrėstos tėvų CT26 ir 4T1 ląstelių linijomis, buvo įtrauktos kaip kontrolė. (ai) Duomenys rodomi iš atskirų eksperimentų su 3-6 pelių vienoje grupėje ir reprezentuoja 1-4 eksperimentus, kurių kiekvienoje grupėje buvo mažiausiai 3 pelės. Duomenys rodomi kaip vidutiniai naudojant SEM, o statistika rodoma *P<><0.01,><0.001, and=""><>

50. Vogelpoel LT ir kt. FcgammaRIIa kryžminis pokalbis su TLR, IL-1R ir IFNgammaR selektyviai moduliuoja citokinų gamybą žmogaus mieloidinėse ląstelėse. Immunobiology 220, 193–199, doi: 10.1016/j.imbio.2014.07.016 (2015). [PubMed: 25108563]51. Daley JM, Thomas AA, Connolly MD, Reichner JS ir Albina JE Ly6G specifinio monokloninio antikūno naudojimas pelių neutrofilams mažinti. J Leukoc Biol 83, 64–70, doi: 10.1189/jlb.0407247 (2008). [PubMed: 17884993]52. Brozas ML ir kt. Išpjaustant naviko mieloidinį skyrių atskleidžiamos retos aktyvuojančios antigeną pristatančios ląstelės, būtinos T ląstelių imunitetui. Cancer Cell 26, 938, doi: 10.1016/ j.ccell.2014.11.010 (2014).53. Spranger S, Dai D, Horton B ir Gajewski TF navikuose gyvenančios Batf3 dendritinės ląstelės reikalingos neteisėtai prekybai efektorinėmis T ląstelėmis ir adaptacinei T ląstelių terapijai. Cancer Cell 31, 711–723 e714, doi: 10.1016/j.ccell.2017.04.003 (2017). [PubMed: 28486109]54. Zunder ER ir kt. Paladžio pagrindo masės žymos ląstelių brūkšninis kodavimas su dvigubo filtravimo schema ir vienos ląstelės dekonvoliucijos algoritmu. Nat Protoc 10, 316–333, doi:10.1038/nprot.2015.020 (2015). [Pubmed: 25612231]