Uždegimą jaučiantys katalazę imituojantys nanozimai palengvina ūminį inkstų pažeidimą, panaikindami vietinį oksidacinį stresą
Jun 18, 2024
Abstraktus
Fonas:reaktyviosios deguonies rūšys (ROS)o uždegimas, labai svarbus audinių pažeidimo veiksnys, yra gerai žinomas kaip susijęs su įvairiomis ligomis. Inkstai yra jautrūs hipoksijai ir pažeidžiami ROS. Taigi, užburtas ratas tarpoksidacinis stresasir inkstųlabai prisideda hipoksijaį progresavimąlėtinė inkstų ligair galiausiai,galutinės stadijos inkstų liga. Taigi terapinių medžiagų tiekimas į uždegimo vietą, kurioje gausu ROS, ir terapinių medžiagų išleidimas yra įmanomas sprendimas.
Rezultatai: Sukūrėme ilgiau cirkuliuojančią, uždegimą jaučiančią, ROS šalinančią universalią nano platformą, stabiliai įkeldami katalazę imituojančią 1-dodekanetioliu stabilizuotą Mn3O4 (dMn).3O4) nanodalelės ROS jautrioje nanomi-ląstelėse (PTC), todėl susidaro ROS jautrus nanozimas (PTC-M). Hidrofobinis dMn3O4į vidų buvo įdėtos nanodalelėsPTC micelės apsaugo nuo ankstyvo išsiskyrimo cirkuliacijos metu ir veikia kaip terapinis agentas, reaguojantis į ROSpakrauto dMn išleidimas3O4kai jis pasiekė uždegimo vietą.
Raktiniai žodžiai:Mn3O4 nanodalelės, nanozimai, uždegimas,Išemija-reperfuzija, Inkstai
Fonas
Acute kidney injury (AKI) is the term that covers a broad spectrum of renal function deterioration ranging from small changes in serum creatinine level to conditions requiring renal replacement therapy [1]. The KDIGO (Kidney disease: improving global outcomes) guidelines define AKI as an increase in serum creatinine of either>0.3 mg/dL within 48 h,>1,5 karto nuo pradinio lygio per septynias dienas arba sumažėjus šlapimo kiekiui<0.5 ml/kg/hour for six hours [1]. AKI is one of the rising global health problems that cause high morbidity and mortality and economic burden [2]. The incidence of AKI defined by the KDIGO guidelines was 21.6% in adults in in-hospital settings [3]. AKI may lead to several complications, including metabolic acidosis, hyperkalemia, uremia, volume overload, and damage to other organ systems, including death. Despite advances in medicine, mortality from AKI is still high. According to a meta-analysis of studies in in-hospital settings, AKI-associated mortality was reported to be 23.9% in adults [3]. The mortality rate of dialysis-requiring AKI patients exceeds 50% [4]. AKI increases the long-term risk of subsequent AKI, progressive chronic kidney disease (CKD), and end-stage renal disease (ESRD) [5]. Eventually, AKI increases socioeconomic and healthcare burdens. Nevertheless, there is no clear treatment for AKI to date. When AKI occurs, conservative treatments such as removing the causative factors, controlling water and electrolyte imbalances, performing renal replacement therapy, if necessary, and waiting for renal function to recover are applied.
Išemijos-reperfuzijos pažeidimas (IRI)yra organų sužalojimas, kurį sukelia laikinas kraujo tėkmės sumažėjimas arba nutraukimas, po kurio vyksta reperfuzija, ir gali pasireikšti įvairiose klinikinėse situacijose, tokiose kaip šokas, miokardo infarktas, išeminis insultas, didelės apimties chirurgija ir organų transplantacija. Inkstų IRI yra viena iš pagrindinių AKI priežasčių, dėl kurios greitai susilpnėja inkstų funkcija. Inkstai yra organas, kuris yra ypač jautrus išeminiams pažeidimams, o sužalotos kanalėlių epitelio ląstelės sukelia atliekų šalinimo sutrikimus ir vandens, elektrolitų bei rūgščių ir šarmų pusiausvyros kontrolę [6]. Žinoma, kad inkstų kanalėlių ląstelių pažeidimo mechanizmas IRI yra susijęs su uždegimu, kurį sukelia reperfuzijos metu susidarančios reaktyviosios deguonies rūšys (ROS) [6–8]. Todėl buvo bandoma taikyti ROS šalinimą IRI gydymui. Tačiau realus jo klinikinis panaudojimas buvo ribotas dėl susirūpinimo dėl sisteminio šalutinio poveikio, įskaitant padidėjusio jautrumo reakcijas [9]. Antioksidantų, tokių kaip edaravonas, skyrimas jau buvo naudojamas ROS pašalinti IRI. Tačiau jį lydėjo keletas šalutinių poveikių, todėl buvo reikalaujama naujų ir veiksmingų antioksidantų, tokių kaip nanozimai (nanomedžiagos, pasižyminčios natūraliu fermentu panašiu aktyvumu) [9–13]. Yao ir kt. nustatė, kad Mn3O4 nan dalelės pasižymėjo daugybe fermentus imituojančių veiklų, ty superoksido dismutazę ir katalazę imituojančią veiklą, taip pat hidroksilo radikalus sugeriančią veiklą [11]. Buvo parodyta, kad Mn3O4 pasižymėjo stipresniu ROS pašalinimo gebėjimu nei kiti fermentai, tokie kaip V2O5, CeO2, Co3O4, MnFe2O4 ir Fe3O4, ir buvo geresnis už kitų tipų mangano oksidų (MnOx (MnO2, MnO ir Mn2O3).
1 pav. Scheminė iliustracija, rodanti PTC-M paruošimą ir veikimo būdą A PTC-M sintezė, B PTC-M veikimo mechanizmas (1) PTC-M injekcija į veną (2) suleista PTC-M cirkuliuoja kraujyje ir kaupiasi uždegimo vietoje (3) PTC-M destabilizacija dėl vidinės ROS, esančios uždegimo vietoje (4) pakrauto dMn 3O4 išsiskyrimas uždegimo vietoje (5) išsiskyręs dMn3O4 katalizuoja ROS pašalinimą, dėl kurio atsiranda ROS. (6) sumažinti uždegimą, apoptozę ir fibrozę (7) palengvinti inkstų pažeidimą ir (8) pagerinti inkstų funkciją
Rezultatai
dMn3O4 nanodalelių ir polimerų konjugatų sintezė ir apibūdinimas
Te dMn3O4 NP buvo susintetinti naudojant koprecipitacijos metodą ir stabilizuoti naudojant 1-dodekanetiolio tiolio grupes (2A pav.). Lauko emisijos perdavimo elektronų mikroskopijos (FE-TEM) analizė parodė, kad dMn3O4 NP vidutinis dydis buvo mažesnis nei 2{{10}} nm (18.0±0,6 nm) (2B pav. ). 1 papildomas failas: S1A ir S1B paveiksluose parodyti paruošto dMn3O4 vaizdai ir schema. Energijos dispersinės rentgeno spektroskopijos (EDS) duomenys parodė Mn iš Mn3O4 ir sieros bei anglies iš SH-C12 (2C pav. ir 1 papildoma byla: S1C pav.). Rentgeno fotonų spektroskopijos (XPS) analizės rezultatai pavaizdavo Mn 2p XPS spektrą, kurį sudarė dvi smailės, esančios ties 641,42 eV ir 653,23 eV, ir šios smailės buvo priskirtos atitinkamai Mn 2p3/2 ir Mn 2p1/2 (pav. 2D ir 1 papildomas failas: S2 pav.). Energijos skirtumas tarp šių dviejų smailių buvo 11, 81 eV, o tai gerai sutapo su Mn3O4 literatūra. Remiantis dMn3O4 NP rentgeno miltelinės difrakcijos (XRD) modeliu, kaip parodyta 2E pav., visos išmatuotos difrakcijos smailės gerai atitiko standartinį hausmanito Mn3O4 modelį [ICDD: #001–1127] ir patvirtina jų labai kristališkumą. gamta. Į ROS reaguojantis PTC konjugatas buvo paruoštas laipsniškomis cheminėmis reakcijomis, kai tioketalio (TK) jungties su galine karboksilato grupe dydis buvo nustatytas iš pradžių. Tada TK linkerio karboksilo grupė buvo konjuguota su metoksi-PEG amino (PEG-AM) aminogrupe, naudojant EDC/NHS reakciją, kad susidarytų PEG-TK. Galiausiai, kita PEG-TK karboksilo grupė vėl buvo konjuguota su stearamino aminogrupe per EDC/NHS reakciją [15]. ROS nereaguojantis PC konjugatas buvo paruoštas konjuguojant stearino rūgštį su PEG-AM. PTC ir PC sudėtis buvo analizuojama 1H branduolinio magnetinio rezonanso (BMR) spektroskopija (1 papildoma byla: S3 pav.). BMR spektrai parodė būdingas smailes ties δ 0,83 ir 1,23 ppm, atitinkančias C18 metilo ir metileno protonus. Smailė ties δ 3,6 atitiko PEG O–CH2–CH2-. C18 pakeitimo laipsnis (DS %) PTC ir PC buvo apskaičiuotas atitinkamai 78% ir 46%.
PTC-M fermento paruošimas ir apibūdinimas
ROS jautrios nano micelės (PTC) buvo pakrautos dMn3O4, todėl susidaro PTC-M. PTC-M paruošimui buvo panaudotas PTC dMn3O4 padavimo santykis (20%). Paruoštų PTC ir PTC-M hidrodinaminis skersmuo, zeta potencialas ir FE-TEM vaizdai parodyti 3A pav. ir 1 papildomame faile: S4A pav. PTC FE-TEM vaizdai parodė sferines nano miceles, kurių dalelių dydis yra vienodas. PTC-M hidrodinaminis skersmuo buvo šiek tiek padidintas po dMn3O4 pakrovimo dėl dMn3O4 pakavimo hidrofobinėje erdvėje, o zeta potencialas išliko neigiamas abiejose nano micelėse dėl PEG ekranavimo. PTC ir PTC-M FE-TEM vaizdai parodė tolygiai paskirstytas daleles. Pakrovimo kiekis ir kapsuliavimo efektyvumas buvo apskaičiuoti naudojant masės spektrometrinę analizę ir buvo atitinkamai 10±3% ir 17±6%. DMn3O4 buvimas buvo matomas PTC-M FE-TEM vaizduose (3A pav.), o tai dar labiau patvirtino PTC-M EDS analizė, rodanti Mn iš Mn3O4, sierą ir anglį iš SH-C12 ir anglį. , azotas ir deguonis iš PEG (1 papildomas failas: S5 pav.). Buvo atlikta termogravimetrinė (TGA) analizė ir apskaičiuota, kad dMn3O4 įkrova yra 12% (1 papildomas failas: S6B pav.). ROS nejautrios micelės, pakrautos dMn3O4 (PC-M), taip pat buvo paruoštos kaip kontrolė tuo pačiu metodu.
Norint patvirtinti TK ryšio vaidmenį į ROS reaguojančiame PTC-M destabilizavime ir dMn3O4 išsiskyrime, PTC-M buvo veikiamas ROS sąlygomis, pridedant H2O2. Kaip valdiklius naudojome ROS nejautrų PC-M. Tiek PTC-M, tiek PC-M pasižymėjo sferine morfologija su sandariai supakuotu dMn3O4 nano micelėse, tačiau po apdorojimo H2O2 PTC-M viršus surinkimas buvo iškraipytas, o po to išsiskyrė dMn3O4, kuris vėliau buvo agreguoti, kaip parodyta FE-TEM vaizduose, o PC-M rodė stabilias struktūras net ir po poveikio H2O2 (3B pav. ir 1 papildomas failas: S4B pav.). PTC-M ROS jautrumas buvo toliau patvirtintas lyginant hidrodinaminio skersmens ir zeta potencialo pokyčius su PC-M, kaip parodyta 1 papildomame faile: S7 paveikslas. ROS nejautrios PC-M hidrodinaminis skersmuo ir zeta potencialas neparodė jokio pastebimo skirtumo po H2O2 pridėjimo. Tačiau ROS jautrus PTC-M parodė mažesnius hidrodinaminius dydžius, tikriausiai dėl to, kad per TK lūžį buvo pašalintas PEG ekranas, dėl kurio struktūra destabilizavosi. Pridėjus H2O2, zeta potencialas grįžo iš neigiamo į teigiamą krūvį, o tai galėjo būti dėl PEG pašalinimo ir garų poveikio. Toliau tyrėme dydžio kitimą, tikrindami stabilumą laikui bėgant, stebėdami hidrodinaminius skersmenis, kai yra H2O2 arba jo nėra (3C pav.). Pridėjus H2O2, hidrodinaminiai skersmenys žymiai sumažėjo per 10 s, be jokių tolesnių pokyčių per laikotarpį iki šešių dienų, tuo tarpu vien PTC-M eksperimento metu buvo stabilūs dydžiai, o tai rodo gerą PTC-M koloidinį stabilumą. Taip pat patikrinome stabilumą 10% FBS ir pastebėjome, kad PTC-M buvo geras stabilumas iki 4 dienų (1 papildomas failas: S9 pav.). Hidroksidinaminiai skersmenys ir zeta potencialo kitimas taip pat buvo suderinti su ROS jautriomis ir nejautriomis tuščiomis nano micelėmis (PTC ir PC) (1 papildomas failas: S8 pav.). Visi šie lyginamieji tyrimai, kai yra arba nėra ROS, parodė paruoštų nanomolių arba galutinio dMn3O4 PTC-M fermento stabilumą ir ROS jautrumą.
2 pav. dMn3O4 sintezė ir apibūdinimas Scheminė dMn 3O4 sintezės iliustracija, B FE-TEM vaizdai, C EDS analizė, D XPS spektras ir dMn3O4 NP E XRD modeliai
Toliau patikrinome galutinio PTC-M fermento H2O2 pašalinimo savybę dėl dMn3O4 NP įkrovos. Tai buvo išbandyta naudojant tereftalio rūgštį (TA) kaip ateities cento zondą. TA sureagavo su H2O2 ir susidarė 2-hidroksitero ftalio rūgštis, kurios fluorescencinė smailė 425 nm. dMn3O4 pavers H2O2 vandeniu ir deguonimi, todėl fluorescencijos intensyvumas mažėja, patvirtindamas katalazės aktyvumą, kaip parodyta 3D pav. Te PTC-M parodė stiprų fluorescencijos intensyvumo sumažėjimą, palyginti su tuščia micele PTC, esant H2O2 laikui bėgant. Į katalazę panašus PTC-M aktyvumas taip pat priklausė nuo koncentracijos, kaip parodyta 1 papildomame faile: S10 pav. PTC-M deguonies gamybos pajėgumas toliau buvo patvirtintas naudojant O2-specifinį fluorescencinį zondą Ru(DDP) esant H2O2. Dešimtyje Ru (DDP) miestų fluorescencija mažėja esant O2, o tai rodo efektyvią O2 gamybą. Kaip parodyta 3E pav., Ru(DDP) fluorescencijos intensyvumas sumažėjo esant H2O2 PTC-M grupėje, o H2O2 vien tik PTC grupėje fluorescencija sumažėjo nedaug (3F pav.). patvirtinantis katalazės aktyvumą, dėl kurio susidaro deguonis PTC-M. Galiausiai, naudodami deguonies aptikimo matuoklį, patvirtinome PTC-M H2O2 pašalinimo savybę. Kaip parodyta 3G pav., deguonies gamyba PTC-M buvo padidinta per pradinį laiką, po to lėtai padidėjo, o tuščios micelės PTC neparodė deguonies gamybos. H2O2 disproporcija buvo pastebėta dėl deguonies burbulų susidarymo PTC-M grupėje, kaip parodyta 1 papildomame faile: S11A pav. Taip pat buvo pastebėta, kad PTC-M gamina didesnį deguonies kiekį, palyginti su vien dMn3O4, tikriausiai dėl to, kad dMn3O4 PTC-M buvo glaudžiai supakuotas, todėl jis buvo labiau prieinamas reakcijai, palyginti su laisvu dMn3O4 (1 papildomas failas: pav. S11B). Nors nano micelės atsipalaidavo dėl apdorojimo H2O2, kaip parodyta FE-TEM, dMn3O4 vis tiek galėjo būti PTC-M viduje, todėl katalazės aktyvumas buvo didelis, palyginti su laisvu dMn3O4. Visi šie rezultatai kartu patvirtino puikų PTC-M katalazę imituojantį aktyvumą.
Ląstelių gyvybingumas in vitro ir ląstelių įsisavinimas
Norėdami patvirtinti ląstelių įsisavinimą ir ROS jautrų ląstelėje paskirstyto ROS jautraus PTC miestą bei naudingojo krovinio išsiskyrimo modelį, palyginome PTC su PC in vitro sąlygomis. Pirmiausia patikrinome paruoštų PTC, PC, PTC-M ir PC-M ląstelių gyvybingumą HK-2 ląstelėse, taikydami WST-1 tyrimą (1 papildomas failas: S12 pav.). Tuščios micelės mažai žuvo, tačiau po dMn3O4-pakrovimo ląstelių gyvybingumas sumažėjo, tačiau pokytis nebuvo statistiškai reikšmingas. Kadangi tuščios micelės nebuvo citotoksinės, nedidelis ląstelių gyvybingumo pokytis gali būti dėl paviršiuje adsorbuoto dMn3O4. Nustatyta, kad PTC-M ir PC-M IC50 vertė yra atitinkamai 130,41 ir 247,17 ug/ml (4A pav.). Norint toliau tirti nano micelių įsisavinimą ir pasiskirstymą ląstelėse, IR780 buvo naudojamas kaip pavyzdinis vaistas ir paruoštos IR780 pakrautos PTC nanomicelės, PTC-IR780, kad būtų galima vizualizuoti IR780 fluorescencijos intensyvumą, naudojant smagią buvimo mikroskopiją (Evos FL Auto 2, Thermo Fisher Scientific). , JAV) (4B pav.). Kaip kontrolinė grupė, mes taip pat išanalizavome ROS nejautrio PC-IR780 įsisavinimą. Palyginti su PC-IR780, PTC-IR780 buvo didesnis įsisavinimas HK-2 ląstelėse (1 papildomas failas: S13 pav.). Tiksli priežastis, kodėl padidėjo PTC-IR780 įsisavinimas ne ROS sąlygomis, nėra aiški, tačiau taip gali būti dėl to, kad PTC gali parodyti nedidelį jautrumą normaliam ROS lygiui ląstelių kultūros sąlygomis, dėl kurių PEG pašalinamas ekranas, paliekant paviršių. įkrovimas šiek tiek teigiamas. PC-IR780 pasisavinimo modelis buvo panašus, neatsižvelgiant į ROS, sukeltą gydymo H2O2 arba hipoksijos sukeltų ROS sąlygų dėl nejautrumo pobūdžio, tuo tarpu PTC-IR780 pasiskirstymo ląstelėse modelis buvo skirtingas, o tai gali būti dėl sustiprinto IR780 išsiskyrimo. ląstelių viduje. Ankstesni ląstelių gyvybingumo duomenys (1 papildomas failas: S11 paveikslas), rodantys padidėjusią ląstelių mirtį PTC-M, taip pat būtų dėl padidėjusio PTC įsisavinimo ląstelių, palyginti su PC. IR780 jodidas yra labai hidrofobinis dažiklis, kuris gali rodyti didelį afinitetą ląstelės membranai ir rodo labai ryškų signalą, nepaisant ROS poveikio. Ląstelių įsisavinimas buvo toliau analizuojamas tikrinant vidutinį fluorescencijos intensyvumą (MFI) naudojant fluorescencijos aktyvuotų ląstelių rūšiavimo (FACS) analizę (4C pav.), kuri patvirtino fluorescencinės mikroskopijos duomenis. Kaip parodyta, MFI buvo didžiausias ROS jautrioje PTC IR780 grupėje, palyginti su kitomis grupėmis, patvirtindamas didesnį IR780 išsiskyrimą ląstelėse. Mes toliau Quan susiejome PFI iš įvairių grupių (4D pav.), kurios patvirtino mikroskopijos duomenis, rodančius, kad PC-IR780 neparodė jokio reikšmingo ląstelių įsisavinimo skirtumo net ir ROS sukeltomis sąlygomis, o PTC IR780 parodė reikšmingą ląstelių padidėjimą. pasisavinimas, kai gydoma ROS sukeltomis sąlygomis. PTC įsisavinimas ląstelėse taip pat buvo nustatytas tikrinant likutinį Mn ląstelėse po apdorojimo PTC-M. Kaip parodyta 4E pav., PTC-M rodė nuo koncentracijos priklausomą įsisavinimą HK-2 ląstelėse. Taigi šie rezultatai apibendrina padidėjusį nanomicelių internalizavimą ir pagreitintą išsiskyrimą ląstelėse, tikriausiai dėl ROS sukelto nanomicelių išardymo.
Atlikome tyrimus in vitro su HK{0}} ląstelėmis, siekdami toliau tirti PTC-M poveikį oksidacinio streso sąlygoms ląstelių lygiu. HK-2 ląstelės buvo stimuliuojamos H2O2, tipiška ROS (5A pav.). H2O2 sustiprinta hemo oksigenazės (HO)-1 ekspresija, kuri buvo pagerinta kartu taikant PTC-M gydymą (5A pav.). Te 2′,7′-dichlorodihidrofluoresceino diacetato (DCF DA) tyrimas buvo atliktas siekiant patikrinti tarpląstelinio ROS pasikeitimo modelį. Te HK-2 ląstelės, stimuliuojamos H2O2, pasižymėjo dideliu fluorescencijos intensyvumu, tačiau kartu apdorojus PTC-M, fluorescencijos intensyvumas sumažėjo (5B pav.). Te BAX/BCL-2 santykis padidėjo gydant H2O2, kuris taip pat buvo atkurtas kartu gydant PTC-M, o tai rodo apsaugą nuo apoptozės (5C pav.). HK-2 ląstelės, apdorotos H2O2, rodė reikšmingą laipsnišką aneksino V+/PI− dažymo padidėjimą, o tai užkirto kelią PTC-M (5D pav.). H2O2- sukeltas ERK, JNK ir p38 fosforilinimas taip pat buvo slopinamas kartu gydant PTC-M, nors reikšmingo fosforilinto P38 sumažėjimo nepastebėta (5C pav.). Šie duomenys rodo, kad PTC-M slopino ROS sukeltus apoptozinius procesus inkstų kanalėlių epitelio ląstelėse.
