Uždegimą jaučiantys katalazę imituojantys nanozimai palengvina ūminį inkstų pažeidimą, panaikindami vietinį oksidacinį stresą Ⅳ
Jun 19, 2024
Išvada
Ekologiškos žolės inkstų ligoms gydyti
Medžiagos ir metodai
Medžiagos
dMn3O4 nanodalelių sintezė ir apibūdinimas
TK linkerio, su TK linkeriu konjuguoto polietilenglikolio (PEG-TK) ir (PEG)-stearino (C18) konjugato (PTC) sintezė buvo atlikta pagal mūsų ankstesnį leidinį [15]. Kaip kontrolę mes taip pat paruošėme ROS nejautrų polimerą (PC), konjuguodami stearino rūgštį su PEG-AM. Trumpai tariant, 200 mg m-PEG amino buvo reaguojama su 160 mg stearino rūgšties su 160 µl TEA, 480 mg EDC ir 290 mg NHS 20 ml DMF 37 laipsnių temperatūroje per naktį, maišant, prapūtus N2. Tada mėginys vieną dieną buvo valomas dializės būdu (MWCO=12–14 KDa) prieš DW, po to džiovinamas šalčiu. Sintetintų PTC ir PC cheminės struktūros buvo nustatytos naudojant protonų branduolinio magnetinio rezonanso (1H BMR) spektroskopiją (400 Hz, Bruker: Billerica, MA, JAV) chloroforme (CHCl3). ROS jautrios PTC ir ROS nejautrios PC tuščios micelės buvo paruoštos PTC ir PC savaime surenkant ultragarsu ir dializuojant.
ROS jautraus fermento (PTC-M) paruošimas ir apibūdinimas
PTC-M buvo paruoštas dializės metodu. Trumpai tariant, 2 mg dMn3O4 ir 10 mg PTC buvo ištirpinti 1 ml bevandenio dimetilsulfoksido (DMSO). Tada mišinys buvo lašinamas į 20 ml DW naudojant zondą ultragarsu (30% amplitudė, 5 s ĮJUNGTA/IŠJUNGTA, 5 min.). Tada tirpalas vieną dieną buvo dializuojamas (MWCO=12–14 KDa) prieš DW, po to džiovinamas šalčiu. Panašiai dMn3O4 NP pakrautos ROS nejautrios nano micelės (PC-M) taip pat buvo paruoštos kaip kontrolinė grupė. Paruoštų tuščių nano micelių (PTC ir PC) ir dMn3O4 NP pakrautų nano micelių (PTC-M ir PC-M) hidrodinaminiai skersmenys ir zeta potencialas buvo įvertinti dinamine šviesos sklaida (Zetasizer Nano Z instrumentas, Malvern, JK). Paruoštų PTC ir PTC-M morfologija buvo vizualizuota naudojant FE-TEM. ROS jautrus destabilizavimas dėl PTC-M TK jungties skilimo buvo pastebėtas DLS ir FE-TEM analize po mėginių apdorojimo 1 mM H2O2. DMn3O4 įkrovos kiekis galutiniame PTC-M buvo analizuojamas naudojant termogravimetrinį analizatorių (TGA N-1000, Scinco, Seulas, Korėja) ir ICP-MS (820 ICPMS Varian Bruker, Billerica, MA, JAV) analizę. .
H2O2 skilimas į vandenį ir deguonį taip pat buvo patvirtintas naudojant Ru (DDP) kaip deguonies generavimo zondą. Trumpai tariant, į mėginius buvo pridėta 1 mM H2O2pridedant 1 µM Ru(dDDP(DMF). Mėginiaibuvo kruopščiai sumaišyti ir fluorescencijos intensyvumasprie sužadinimo 440 nm ir emisijos 530 – 730 nm buvoįrašytas. Vėliau buvo patvirtinta ir deguonies gamybanustatant ištirpusio deguonies koncentraciją naudojantištirpusio deguonies jutiklis (RDO Optical Dissolved Senar, Thermo Scientific).
Ląstelių kultūra ir reagentai
In vitro tyrimai buvo atlikti taip, kaip aprašyta anksčiau [37]. Trumpai tariant, i vitro tyrimams buvo naudojamos žmogaus inkstų proksimalinės kanalėlių epitelio ląstelės (HK-2 ląstelės, American Type Culture Collection, Manassas, VA, JAV). HK-2 ląstelės buvo kultivuojamos ir pasėjamos kas 3–4 dienas 100-mm lėkštelėse, kuriose yra Dulbecco modifikuotos Eagle's (DMEM) ir Hams F-12 terpės derinys (Welgene, Daegu, Korėja). papildytas 10% galvijų vaisiaus serumu (FBS; Welgene), 100 V/ml penicilinoir 100 mg/ml streptomicino (Sigma-Aldrich). TeTada HK-2 ląstelės buvo inkubuojamos drėgnoje atmosferoje5% CO sfera2ir 95 % oro 37 laipsnių temperatūroje 24 valandas, ir subauginami iki 70 – 80 % susiliejimo. Te HK-2 ląstelės buvodedamas ant 60- mm lėkštelių terpėje, kurioje yra 10 proc.FBS ir inkubuojamas 24 valandas. Tada ląstelės buvo patirtos
Ląstelių gyvybingumas
Ląstelinis įsisavinimas
Srauto citometrija
Srauto citometrijos analizė buvo atlikta, kaip aprašyta anksčiau [38]. Aneksino V FLUOS dažymo rinkinys (SigmaAldrich) buvo naudojamas aneksino V surišimo lygiui išmatuoti pagal gamintojo instrukcijas. Trumpai tariant, po 24 valandų apdorojimo 0 arba 1 mM H2O2 su 2 µg PTC-M išankstiniu apdorojimu arba be jo, HK-2 ląstelės buvo surinktos ir du kartus plaunamos iš anksto atšaldytu fosfatu buferiniu tirpalu ir pakartotinai suspenduotos. rišamajame buferyje, kuriame yra aneksino V. Po inkubacijos tamsoje 15 min., ląstelės buvo analizuojamos srauto citometrija (Becton–Dickinson, San Chosė, CA, JAV). Buvo naudojami keli valdikliai, siekiant optimizuoti prietaiso nustatymus ir nustatyti „Windows“ platformos blokavimą. Apoptotinės ląstelės buvo apibrėžtos kaip PI neigiamos ir aneksino V-FITC teigiamos.
Intraląstelinės ROS susidarymo nustatymas
Norėdami nustatyti ROS susidarymą, naudojome fluoroforą DCF-DA (Molecular Probes, Eugene, OR, JAV), kaip aprašyta anksčiau [38]. HK-2 ląstelės buvo inkubuojamos su 0 arba 1 mM H2O2 24 valandas su 2 ug PTC-M išankstiniu apdorojimu arba be jo, du kartus plaunamos Hanko subalansuotos druskos tirpalu, tada inkubuojamos su Hanko subalansuota druska. tirpalas (be fenolio raudonojo), kuriame yra DCF-DA, 30 minučių 37 laipsnių tamsoje. Vaizdai buvo gauti naudojant fluorescencinį mikroskopą (Nikon, Tokijas, Japonija).
Eksperimentiniai gyvūnai ir protokolai
Biologinis pasiskirstymas in vivo
Norint patikrinti terapinį PTC-M poveikį in vivo, gydymo grupei po operacijos buvo skirta vienkartinė 0,5 mg/kg PTC-M dozė, švirkščiant į uodegos veną. Pelėsbuvo užmigdyti po 48 valandų reperfuzijos. Kraujo mėginiaibuvo surinkti iš širdies, irkairysis inkstasbuvogreitai pašalinami ir apdorojami Western blotting arbafiksuotas 4% paraformaldehido tirpale imunohistochemija (IHC). Thedešinysis inkstasbuvo sustingęs−80 laipsniųrealaus laiko polimerazės grandininės reakcijos (PGR) analizei.
Plazmos NGAL matavimas
Pusiau kiekybinis imunoblotingas
Western blot analizė buvo atlikta, kaip aprašyta anksčiau [37]. Inkstų audiniai buvo homogenizuoti lediniame izoliaciniame tirpale, kuriame yra 0,3 M sacharozės, 25 mM imidazolo, 1 mM etilendiaminotetraacto rūgšties (EDTA), 8,5 mM leupeptino ir 1 mM fenilmetilsulfonilfluorido (pH 7,2). Homogenatai buvo centrifuguojami esant 4000 × g 15 minučių 4 laipsnių kampu, kad būtų pašalintos visos ląstelės, branduoliai ir mitochondrijos. Bendra baltymų koncentracija buvo matuojama bicinchonino rūgšties (BCA) tyrimo rinkiniu (Pierce; Rockford, IL, JAV). Visi mėginiai buvo pakoreguoti, kad būtų pasiekta tokia pati galutinė baltymų koncentracija. Tada jie buvo ištirpinti 65 laipsnių temperatūroje 15 minučių natrio dodecilsulfato (SDS) turinčiame mėginio buferyje ir laikomi -20 laipsnių temperatūroje. Norint patvirtinti vienodą baltymų apkrovą, pradinis gelis buvo nudažytas Coomassie mėlyna spalva. SDS-poliakrilamido gelio elektroforezė (PAGE) buvo atlikta su 9 arba 12% poliakrilamido geliais. Baltymai buvo elektroforetiškai perkelti ant nitroceliuliozės membranų (Hybond ECL RPN3032D; Amersham Pharmacia Biotech; Little Chalfont, JK), naudojant Bio-Rad Mini Protean II aparatą (Bio-Rad; Hercules, CA, JAV). Blotai buvo blokuojami 5 % pieno tirpalu PBS-T (80 mM Na2HPO4, 20 mM NaH2PO4, 100 mM NaCl ir 0,1 % Tween-20, esant pH 7,5) 1 val.; inkubuojamas per naktį 4 laipsnių temperatūroje su pirminiais antikūnais; ir po to inkubuojamas su antriniais anti-triušių, antipelių ar anti-ožkų krienų peroksidaze konjuguotais antikūnais. Tada imunoblotai buvo vizualizuoti naudojant patobulintą chemiliuminescencijos sistemą. Baltymų kiekis buvo kiekybiškai įvertintas naudojant densitometriją. Santykinis imunoblotų signalų intensyvumas buvo išmatuotas densitometrijos metodu, naudojant Scion Image for Windows programinę įrangą (Scion Corporation, 2000–2001. versija Alpha 4.0.3.2. MD, JAV) ir išreikštas lenkimo pokyčiais, palyginti su kontrolinėmis medžiagomis. Pirminiai ir antriniai antikūnai, naudojami imunoblotavimui, yra išvardyti S1 lentelėje.
Realaus laiko polimerazės grandininė reakcija (realaus laiko PGR)
Polimerazės grandininės reakcijos analizė buvo atlikta, kaip aprašyta anksčiau [37]. Inkstų žievės buvo homogenizuotos Trizol reagentu (Invitrogen, Carlsbad, CA, JAV). RNR buvo ekstrahuota chloroformu, nusodinta izopropanoliu, plaunama 75% etanoliu ir ištirpinta DW. RNR koncentracija buvo nustatyta pagal absorbciją esant 260 nm (Ultraspec 2000; PharMacia Biotech, Kembridžas, JK). Uždegiminių citokinų ir adhezijos molekulių mRNR ekspresija buvo nustatyta realaus laiko PGR. cDNR buvo pagaminta atvirkštiniu būdu transkribuojant 5 ug visos RNR, naudojant oligo (dT) pradžią ir viršutinį indeksą atvirkštinę transkriptazę II (InvitRogen, Carlsbad, CA, JAV). cDNR buvo kiekybiškai įvertinta naudojant Smart Cycler II sistemą (Cepheid, Sunnyvale, CA, JAV), o aptikimui buvo naudojama SYBR Green. Kiekviena PGR reakcija buvo atlikta naudojant 10 pM priekinį pradmenį, 10 pM atvirkštinį pradmenį, 2X SYBR Green Premix Ex Taq (TAKARA BIO INC, Seta 3-4-1, Japonija), 0,5 ul cDNR ir H2O, kad galutinis tūris būtų 20 ul. Santykiniai mRNR lygiai buvo nustatyti realaus laiko PGR, naudojant Rotor-GeneTM 3000 detektoriaus sistemą (Corbette Research, Mortlake, NSW, Australija). Pradmenų sekos išvardytos 1 papildomame faile: S2 lentelėje. PGR buvo atlikta pagal šiuos veiksmus: 1) 95 laipsnių 5 min.; 2) 95 laipsnių 20 s; 3) 58–60 laipsnių 20 s (optimizuota kiekvienai pradmenų porai) ir 4) 72 laipsnių 30 s, kad aptiktų SYBR Green. 2–4 žingsniai buvo kartojami dar 40 ciklų, o paskutinio ciklo pabaigoje temperatūra buvo padidinta nuo 60 iki 95 laipsnių, kad susidarytų lydymosi kreivė. Reakcijos duomenys buvo surinkti ir analizuojami naudojant Corbett Research Software. Genų ekspresijai apskaičiuoti buvo naudojamos lyginamosios kritinės slenkstinės vertės, gautos iš keturių kartotinių matavimų, normalizuojant į GAPDH kaip vidinę kontrolę. Lydymosi kreivės analizė buvo atlikta siekiant padidinti amplifikacijos reakcijos specifiškumą.
Histologija
Inkstų audinio paruošimas vyko taip, kaip aprašyta anksčiau [37]. Inkstų audiniai buvo fiksuoti 4% paraformaldehidu, įterpti į parafiną ir supjaustyti į 3- μm storio dalis. Periodinis dažymas rūgštimi-Schif buvo atliktas pagal gamintojo instrukcijas (Abcam, Cambridge, MA, JAV). Imunohistochemijai deparafinuotų audinių pjūvių antigenas buvo paimtas kaitinant 1{{10}}0 laipsnių temperatūroje 15 min citratiniame buferyje, pH 6.0 (Sigma- Aldrichas). Pjūviai buvo inkubuojami per naktį 4 laipsnių temperatūroje su pirminiais antikūnais, praskiestais blokuojančiu buferiu (1 % [m/t] galvijų serumo albumino, ištirpinto 0,3 % [v/v] Triton X-100, paruošto PBS [0,3 % PBS- T]). Po to, kai sekcijos buvo trumpai plaunamos tris kartus 0, 3% PBS-T, jos buvo inkubuojamos 1 valandą kambario temperatūroje su antriniais antikūnais, praskiestas blokuojančiu buferiu. Vamzdelių pažeidimo balai buvo apskaičiuoti anksčiau aprašytu metodu [39, 40]. Vamzdelių pažeidimo balas buvo išmatuotas ištyrus daugiau nei 10 HPF kortikomeduliarinės jungties (x 200 padidinimas) PAS dažytose pjūviuose (n=5–7). Pirminiai ir antriniai antikūnai, naudojami atliekant imunohistochemines analizes, yra išvardyti S3 lentelėje. Vamzdelių epitelio ląstelių apoptozė buvo aptikta TUNEL dažant ApopTag Plus Peroxidase In Situ Apoptosis Kit (Sigma-Aldrich), pagal gamintojo instrukcijas. Visų pagrindinių organų audinių sekcijos buvo surinktos įterptos į parafiną ir nudažytos hematoksilinu / eozinu (H&E), kad būtų galima palyginti histologinius pokyčius.
Statistinė analizė
Rezultatai išreiškiami kaip vidutinė standartinė vidurkio paklaida (SEM). Keletas trijų grupių palyginimų buvo atliktas naudojant vienpusę dispersijos analizę (ANOVA) ir post hoc Tukey sąžiningai reikšmingų skirtumų testą. Skirtumai, kurių p reikšmės mažesnės nei 0.05, buvo laikomi reikšmingais.
