Cistanche Tubulosa feniletanoidinių glikozidų trikdžiai su MTT tyrimu

1. Įvadas

Parazitinis augalasCistanche tubulosa(Schrenk) R. Wightas (Orobanchaceaešeima) yra plačiai paplitęs Šiaurės Afrikos, arabų ir Azijos šalyse [1]. Išplaukia išC. tubulosairC. deserticolayra svarbūs tradicinėje kinų medicinoje, nes buvo naudojami impotencijai, sterilumui, lumbago ir vidurių užkietėjimui dėl storosios žarnos inercijos gydyti [2]. Be to, etanolinis ekstraktas išC. tubulosabuvo įrodyta, kad pelėms turi reikšmingą apsauginį poveikį nuo smegenų hipoksijos [3].

Endotelio ląstelės vaidina lemiamą vaidmenį hipoksinės plautinės hipertenzijos patogenezėje. EA.hy926 endotelio ląstelių linija yra labai panaši į pirmines endotelio ląsteles. Tirdami antihipoksinį C. tubulosa etanolinio ekstrakto poveikį EA.hy926 endotelio ląstelėms, pastebėjome, kad 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il){{7 }},5-difeniltetrazolio bromido (MTT) tyrimas, kuris dažniausiai naudojamas ląstelių gyvybingumui įvertinti atliekant citotoksiškumo ir citostatinio aktyvumo tyrimus, davė prieštaringų rezultatų, nes po gydymo padidėjo EA.hy926 ląstelių gyvybingumas.

Norint nustatyti galimą citotoksinį arba citoprotekcinį vaistinio preparato poveikį, būtina tiksliai įvertinti ląstelių gyvybingumą. Todėl mes ištyrėme, kurie komponentai, esantys C. tubulosa etanoliniame ekstrakte, gali būti atsakingi už prieštaringus rezultatus, pastebėtus atliekant MTT tyrimą. Išskyrėme du pagrindiniusfeniletanoidiniai glikozidai (PhG)iš C. tubulosa etanolinio ekstrakto,echinakozidas (toliau 1 junginys) ir akteozidas (toliau 2 junginys). Mes nustatėme jų poveikį EA.hy926 ląstelių gyvybingumui, naudodami įvairius metodus. Be to, norėdami dar labiau išsiaiškinti, kuris 1 ir 2 junginių pakaitas gali būti atsakingas už prieštaringus rezultatus, išbandėme jų aglikonus, kavos rūgštį (toliau 3 junginys) ir 3, 4-dihidroksilfeniletanolį (toliau 4 junginys) EA. .hy926 ląstelių gyvybingumas naudojant tuos pačius metodus.

NATŪRALŪS CISTANCHE TUBULOSA, Slopina APOPTOZĖ PHGS75% ECH 30% ACT 12%

2. Rezultatai ir aptarimas

2.1. Junginių identifikavimas

Dviejų junginių, išskirtų išC. tubulosa etanolinis ekstraktasbuvo identifikuoti atliekant branduolinio magnetinio rezonanso (BMR) ir masės spektrometrijos (MS) analizes, kaip parodyta 1 paveiksle. 1 junginys buvo identifikuotas kaip echinakozidas, lyginant su anksčiau praneštais BMR (1 lentelė) ir MS (m/z 785 [M-H). ]− ) duomenys [4]. 2 junginio BMR spektrai buvo labai panašūs į 1 junginio, išskyrus -D-gliukopiranozilo grupės nebuvimą (1 lentelė). 2 junginys (m/z 623 [M−H]−) buvo identifikuotas kaipakteozido[5]. Svarbu tai, kad abu junginiai turi tą patį aglikoną, į kurį įeina kavos rūgštis (3 junginys) ir 3, 4-dihidroksilfeniletanolis (4 junginys).

2.2. Ląstelių gyvybingumo tyrimai

MTT ir CCK{{0}} tyrimai buvo naudojami 1–4 junginių poveikiui EA.hy926 ląstelių gyvybingumui analizuoti. MTT tyrimas parodė, kad EA.hy926 ląstelių gyvybingumas žymiai padidėjo po apdorojimo 25 ir 50 μM 1, 2 arba 3 junginiais (166,3 % ir 174,1 % junginio 1, 205,8 % ir 224,3 % junginio). 2 ir 164,8% ir 189,6% atitinkamai 3 junginiui, p < 0,05), lyginant su kontrolinėmis ląstelėmis (2A pav.). Be to, morfologinis ląstelių patikrinimas nustatė, kad gydymas 50 μM 1, 2 arba 3 junginiu padidino purpurinių formazano kristalų susidarymą, kurie tiesiogiai rodo gyvų ląstelių proporciją (3 pav.). Ir atvirkščiai, CCK-8 tyrimas parodė, kad ląstelių gyvybingumas žymiai sumažėjo po apdorojimo 12,5, 25 ir 50 μM 1, 2 arba 3 junginiu (75,5%, 45,1% ir 43,7% 1 junginiu, 85,5%. 51,8% ir 34,3% 2 junginiui ir 64,5%, 48,2% ir 36,4% 3 junginiui, atitinkamai, p < 0,05, palyginti su kontrolinėmis ląstelėmis (2B pav.). 4 junginys neturėjo įtakos ląstelių gyvybingumui nei MTT, nei CCK-8 tyrime. Dviejų tyrimų metu gautų rezultatų neatitikimas rodo, kad vienas iš dviejų tyrimų gali tiksliai neatspindėti 1 ir 2 junginių poveikio EA.hy926 ląstelių gyvybingumui.

2.3. Hoechst atliktas apoptozės įvertinimas

Dažymas Hoechst 33342 yra ląstelėms pralaidi DNR dėmė, kurią sužadina ultravioletinė šviesa ir skleidžia mėlyną fluorescenciją, esant 460–490 nm. Apoptozinių ląstelių kondensuotas chromatinas nusidažo ryškiau nei normalių ląstelių chromatinas [6]. Nors kontrolinėse ląstelėse buvo tolygiai išsklaidytas chromatinas, normalios organelės ir nepažeistos ląstelių membranos, ląstelės, inkubuotos su 50 μM junginiais 1, 2 arba 3 48 valandas, parodė tipišką apoptozinių ląstelių dažymą (4A pav.). Priešingai, ląstelių ekspozicija 50 μM 4 junginio nepadidino apoptozinių branduolių skaičiaus, palyginti su kontroliniu gydymu.

2.4. Apoptozinių ląstelių srauto citometrinė analizė

Aneksino V-FITC/PI dvigubo dažymo testas identifikuoja apoptozines ląsteles pagal didelio afiniteto aneksino V-FITC prisijungimą prie fosfatidilserino, kuris išsiskiria ląstelėse, kuriose vyksta apoptozė [7]. Šiame tyrime gyvybingos ląstelės neprisijungia nei prie aneksino V, nei su PI, todėl nėra nudažytos (apatinis kairysis kvadrantas), ankstyvosios apoptozinės ląstelės nudažomos žaliai, prisijungus prie aneksino V-FITC (apatinis dešinysis kvadrantas) ir vėlyvosios apoptotinės ląstelės. yra nudažyti žaliai ir raudonai aneksinui V-FITC prisijungus atitinkamai prie fosfatidilserino ir PI su nekrozinėmis ląstelėmis (viršutinis dešinysis kvadrantas). Kaip parodyta 4B paveiksle, ląstelės buvo inkubuojamos su 50 μM junginiais 1, 2 arba 3 48 valandas, apoptozinių ląstelių procentas padidėjo atitinkamai nuo 3,74% (kontrolinės ląstelės) iki 10,32%, 12,95% ir 11,30%. Palyginti su kontrolinėmis ląstelėmis, 4 junginys nepadidino apoptozinių EA.hy926 ląstelių procento.

Remiantis rezultatais, gautais atliekant CCK-8 tyrimą ir dažant Hoechst 33342, srauto citometrijos tyrimas parodė, kad 1, 2 ir 3 junginiai sukėlė apoptozę EA.hy926 ląstelėse. Iš viso šie stebėjimai rodo, kad EA.hy926 ląstelių gyvybingumo padidėjimas, pastebėtas atliekant MTT tyrimą po apdorojimo 1–3 junginiais, buvo klaidingai teigiamas rezultatas.

NATŪRALUS CISTANCHE TUBULOSA, SUSTIPRINANTIS IMUNITETĄ PHGS75% ECH 30% ACT 12%

2.5. Diskusija

1983 m. Mosmann sukūrė kolorimetrinį MTT mikroplokštelių tyrimą, skirtą ląstelių proliferacijai ir citotoksiškumui matuoti [8]. Šis paprastas tyrimas ir jo modifikacijos dabar plačiai naudojami ląstelių biologijos laboratorijose visame pasaulyje. Frakcionavimo tyrimai su žinduolių ląstelėmis parodė, kad sumažintas piridino nukleotidų kofaktorius NADH yra atsakingas už didžiąją MTT sumažėjimą. Tai patvirtino tyrimai, kuriuose buvo naudojamos visos ląstelės [9]. Todėl MTT mažinimas yra susijęs su metaboliškai aktyviomis ląstelėmis ir yra ne tik susijęs su mitochondrijų kvėpavimu, bet ir su citoplazma bei nemitochondrinėmis membranomis, įskaitant endosomų / lizosomų skyrių ir plazmos membraną [10]. Grynasis teigiamas MTT molekulės krūvis yra pagrindinis veiksnys, lemiantis jos įsisavinimą ląstelėse per plazmos membranos potencialą.

Pažymėtina, kad MTT tyrimas kartais gali tiksliai neatspindėti tikrojo tiriamo junginio poveikio konkrečioms ląstelėms. Tačiau cheminės struktūros ar grupės, galinčios sukelti prieštaringus MTT tyrimo rezultatus, nebuvo nustatytos. Naujausi tyrimai parodė, kad MTT tyrimas gali nepakankamai įvertinti (-)-epigallocatechin-3-galato, gausiausio polifenolio žaliojoje arbatoje, antiproliferacinį poveikį [11]. Tyrimuose, kuriuose buvo naudojamas MTT tyrimas siekiant nustatyti naviko cheminį jautrumą, priešvėžiniai chemoterapiniai vaistai, tokie kaip epirubicinas, paklitakselis, docetakselis ir imatinibo mezilatas (Gleevec), padidino ląstelių gyvybingumą [12, 13]. Be to, keli tyrimai parodė, kad tam tikri augalų ekstraktai ir redokso aktyvūs polifenoliai gali trukdyti MTT tyrimui, nes jie tiesiogiai sumažina MTT tetrazolio druską, jei nėra ląstelių [14].

Poreikis ištirpinti MTT formazano kristalus prieš spektrofotometrinę analizę mikroplokštelių skaitytuve ir būdingas reakcijos baigties pobūdis riboja MTT tyrimo naudojimą tam tikrose srityse. Dėl to buvo sukurti tetrazolio analogai, kuriuose fenilo dalys buvo dekoruotos neigiamo krūvio sulfonato grupėmis, tokiomis kaip 2,3-bis-(2-metoksi-4-nitro- 5- sulfofenilas)-2H-tetrazolio-5-karboksanilidas (XTT), neigiamo krūvio vidinė druska [15] ir 3-(4,5-dimetiltiazol-2-ilas) -5-(3-karboksimetoksifenilas)-2-(4-sulfofenilas)-2H-tetrazolis (MTS), silpnai rūgšti vidinė druska, glaudžiai susijusi su MTT [16] . Dėl šių modifikacijų buvo pagaminti auginimo terpėje tirpūs formazano produktai, dėl kurių prieš kiekybinį nustatymą nereikėjo atlikti tirpinimo etapo. Atitinkamai, kadangi padidėjęs neigiamas šių molekulių krūvis sumažino jų gebėjimą judėti per ląstelių membranas [17], tarpinius elektronų akceptorius (IEA), tokius kaip 1-metoksi-5-metilfenazino metilsulfatas ({{25). }}metoksi PMS) buvo reikalingi norint palengvinti tetrazolo dažų mažinimą arba padidinti redukcijos greitį.

Visai neseniai buvo sukurtos naujos kartos vandenyje tirpios tetrazolio druskos, kurių prototipas yra WST-1 [18]. WST-1, neigiamo krūvio disulfonuota vidinė druska, turinti jodo liekanų, yra stabilesnė nei XTT ir MTS, esant 1-metoksi PMS, tai yra privaloma IEA. Tai paskatino WST{5}}/1-metoksi PMS kaip patogų vieno reagento ląstelių proliferacijos rinkinį. Buvo sukurtos kelios kitos WST serijos tetrazolio druskos, iš kurių naudingiausia galbūt yra WST-8 [19]. Atrodo, kad WST-8 turi labai panašias ląstelių mažinimo savybes kaip WST{10}} ir yra parduodamas atskirai kaip CCK-8 tyrimas. WST-8 yra nepralaidus ląstelėms, todėl sumažėja tarpląsteliniu būdu, per elektronų transportavimą iš intraląstelinio NADH į WST-8 per plazmos membraną, tarpininkaujant 1-metoksi PMS. Nors ir MTT, ir WST{15}}/1-metoksi PMS mažinimą skatina tarpląstelinis NADH, atrodo, kad NADH šaltinis taikant šiuos du metodus skiriasi. WST-8/1-metoksido PMS mažinimas labiau priklauso nuo malato/aspartato maršruto, kuris susieja mitochondrijų trikarboksirūgšties ciklą-NADH su ekstramitochondrine erdve [20].

Preliminariais eksperimentais patvirtinome, kad 1, 2, 3 ir 4 junginiai negalėjo tiesiogiai sumažinti MTT tetrazolio druskos (neparodyta). Šiame tyrime tiesioginė pačių junginių įtaka reagentui buvo pašalinta kruopščiai nuplaunant mikroplokštes fosfatiniu buferiniu tirpalu (PBS), prieš įpilant MTT arba CCK-8 tirpalo, kaip nurodyta gamintojo protokoluose. Nepaisant to, rezultatai, gauti taikant abu metodus, vis tiek buvo prieštaringi (2 pav.). Kaip ir tikėtasi, ląstelių inkubavimas su 1, 2 ir 3 junginiais padidino tetrazolio druskos redukciją į purpurinį formazaną, palyginti su kontroline grupe (3 pav.), o tai rodo, kad vien tetrazolio druskos redukcija, esant konkrečiam junginiui. nepakanka norint įvertinti junginio gebėjimą trukdyti MTT tyrimui.

Norint nustatyti, ar 1, 2, 3 ir 4 junginiai gali sukelti apoptozę EA.hy926 ląstelėse, buvo įvertinti ląstelių morfologiniai pokyčiai ir fosfatidilserino eksternalizacija. Atsižvelgiant į ląstelių gyvybingumo sumažėjimą, pastebėtą atliekant CCK-8 tyrimą, Hoechst dažymo ir srauto citometrijos analizės, naudojant aneksiną V-FITC/PI, rezultatai rodo, kad augimo slopinimas, pastebėtas po gydymo 1, 2 ir 3 junginiais bent iš dalies dėl EA.hy926 ląstelių apoptozės. Mūsų rezultatai taip pat patvirtino idėją, kad kofeilo grupė, esanti tiek 1, tiek 2 junginiuose, buvo atsakinga už prieštaringus rezultatus, gautus atliekant MTT tyrimą.

Panašiai kaip ir mūsų išvadose, Rottlerin, stiprus didelio laidumo kalio kanalų atidarytuvas, nerodė reaktyvumo MTT in vitro. Tačiau jis stipriai sustiprino formazano kristalų susidarymą ląstelėse, o tai akivaizdžiai prieštarauja Rottlerino NF-κB slopinimui ir ląstelių proliferacijai, pastebėtai analizuojant [3H]-timidino įtraukimą į DNR [21]. Mechanizmas, kuriuo Rottlerinas sustiprino MTT mažinimą, buvo priskirtas jo mitochondrijų atsiejimo efektui [22]. Rottlerinas turi cinamoilo rūgšties pakaitų grupę. Palyginti su cinamoilo rūgštimi, 3 junginys turi dvi papildomas hidroksilo liekanas, kurios yra C-3 ir C-4. Todėl mes spėliojame, kad mechanizmas, kuriuo 1 ir 2 junginiai sukelia prieštaringus rezultatus MTT tyrime, taip pat gali būti susijęs su jų mitochondrijų atsiejimo poveikiu. Norint patikrinti šią hipotezę, reikalingi lyginamieji 1 ir 2 junginių tyrimai ir cheminis atjungiklis, pvz., trifluorkarbonilcianido fenilhidrazonas (FCCP).

 NATŪRALUS CISTANCHE TUBULOSA LYTINEI FUNKCIJAI GERINTI PHGS75% ECH 30% ACT 12%

3. Eksperimentinė dalis

3.1. Reagentai ir chemikalai

3 junginys (kavos rūgštis – milteliai, grynumas=98,6 %) buvo įsigytas iš Chengdu Push Bio-Technology Co., Ltd. (Čengdu, Kinija). 4 junginys (3, 4-dihidroksifeniletanolis – aliejus, grynumas=98,5 %) buvo gautas iš Chengdu Must Bio-Technology Co., Ltd. (Čengdu, Kinija). MTT ir dimetilsulfoksidas (DMSO) buvo gauti iš Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, JAV). CCK{11}} tyrimas buvo įsigytas iš Dojin Laboratories (Kumamoto, Japonija). Hoechst 33342 ir aneksino V-FITC / PI apoptozės aptikimo rinkiniai buvo įsigyti iš Beyotime Biotechnologijos instituto (Haimen, Kinija).

3.2. Augalinė medžiaga

C. tubulosastiebai buvo surinkti iš Yutian prefektūros, Sindziango Uigūrų autonominio regiono, Kinijoje. Kuponų pavyzdžiai buvo deponuoti Trečiojo karo medicinos universiteto (Chongqing, Kinija) pagrindinėje didelio aukščio medicinos laboratorijoje ir patvirtinti Yi Zhang iš Čengdu tradicinės kinų medicinos universiteto (Čengdu, Kinija).

3.3. Augalinės medžiagos gavyba ir išskyrimas

Oru išdžiovinti C. tubulosa (0,6 kg) stiebai buvo sumalti į miltelius ir ekstrahuoti 50% etanoliu 2 valandas 70 laipsnių temperatūroje. Pašalinus tirpiklį sumažintame slėgyje, etanolinis ekstraktas (212,5 g) buvo ištirpintas ir suspenduotas vandenyje (2 l) ir ekstrahuotas n-butanoliu (2 L × 3). N-butanolio ekstraktas (110 g) chromatografuojamas poliamido kolonėlėje ir eliuuojamas etanoliu/vandeniu (0:100, 5:95, 15:85, 30:70, 50:50), gaunant penkias frakcijas (A-E). . Frakcija B (65 g) buvo frakcionuota ODS kolonėlėje; eliuuojant etanoliu: vandeniu (1:9), atskirtas 1 junginys (3 g). D frakcija (10,5 g) buvo frakcionuota ODS kolonėlėje; eliuuojant etanoliu/vandeniu (1:4), atskiriamas 2 junginys (1 g).

BMR spektrai buvo įrašyti Bruker Avance 600 spektrometru CD3OD, naudojant tetrametilsilaną (TMS) kaip vidinį etaloną. Masės spektrai buvo atlikti naudojant BioTOF-Q masės spektrometrą.

3.4. Ląstelių kultūros

EA.hy926 ląstelių linijos buvo gautos iš Amerikos tipo kultūrų kolekcijos (Manassas, VA, JAV). Ląstelės buvo kultivuojamos RPMI 1640 terpėje, papildytoje 10% (t/v) galvijų vaisiaus serumu ir 1% (t/v) penicilino-streptomicino drėgnoje aplinkoje su 5% CO2 37 laipsnių temperatūroje.

3.5. Ląstelių gyvybingumas

Ląstelių gyvybingumas buvo įvertintas naudojant MTT ir CCK{{0}} tyrimus. 1 ir 2 junginiai ir jų aglikonai, kavos rūgštis (3) ir 3, 4-dihidroksifeniletanolis (4) buvo ištirpinti DMSO iki galutinės DMSO koncentracijos < 0,1 % (v/v) auginimo terpėje.

EA.hy926 ląstelės buvo pasėtos į 96-šulinėlių plokšteles 4 × 103 ląstelių/šulinėlių kiekiu. Po 24 valandų inkubacijos ląstelės 24 valandas buvo apdorotos 6, 25–50 μM 1, 2, 3 arba 4 junginiu. Auginimo terpė buvo pašalinta ir ląstelės du kartus plaunamos fosfatiniu buferiniu tirpalu (PBS). Alikvotinės dalys (10 μL) pradinio MTT tirpalo (5 mg · ml-1) buvo įpiltos į kiekvieną šulinėlį, kuriame yra 100 μL terpės, ir inkubuojami su ląstelėmis 4 valandas. Po inkubacijos terpė buvo pašalinta ir į kiekvieną šulinėlį įpilta 150 μL DMSO alikvotinių dalių, kad ištirptų formazano kristalai. Absorbcija buvo matuojama esant 490 nm, naudojant mikroplokštelių skaitytuvą (Bio-Tek Synergy HT, Winooski, VT, JAV). Ląstelių gyvybingumas buvo išreikštas kaip MTT sumažėjimo procentas, priskiriant 100% vertę kontrolinių ląstelių absorbcijai. Visi eksperimentai buvo atlikti tris kartus ir pateikti kaip vidurkis ± standartinis nuokrypis (SD).

CCK-8 tyrimas buvo atliktas remiantis literatūra su nedideliais pakeitimais [23]. Tiksliau, ląstelės buvo apdorotos 6,25–50 μM 1, 2, 3 arba 4 junginiais 24 valandas ir du kartus plaunamos PBS, prieš pridedant 10 μL CCK-8 tirpalo ir 100 μL auginimo terpės. 2 valandas inkubavus mikroplokštelę 37 laipsnių temperatūroje, absorbcija buvo išmatuota esant 450 nm, naudojant mikroplokštelių skaitytuvą. Ląstelių gyvybingumas buvo išreikštas kaip gyvybingų ląstelių procentas, palyginti su kontrolinėmis ląstelėmis (100%). Visi eksperimentai buvo atlikti tris kartus ir išreikšti kaip vidurkis ± SD.

3.6. Apoptozės įvertinimas pagal Hoechst 33342 dažymą

Apoptotiniai morfologiniai pokyčiai buvo pastebėti dažant Hoechst 33342. Trumpai tariant, EA.hy926 ląstelės buvo pasėtos į 48- šulinėlių plokšteles (2 × 104 ląstelės / duobutėje) ir apdorotos 50 μM junginiu 1, 2, 3 arba 4 48 valandas 37 laipsnių temperatūroje, du kartus plaunamos PBS, ir fiksuojamas 4 % (v/v) paraformaldehidu 15 min. kambario temperatūroje. Du kartus nuplovus PBS, ląstelės buvo dažytos Hoechst 33342 (10 ug·mL-1) 5 minutes kambario temperatūroje ir du kartus plaunamos PBS. Hoechst dažyti branduoliai buvo vizualizuoti naudojant fluorescencinį mikroskopą (Olympus, Tokijas, Japonija).

3.7. Apoptozės analizė naudojant srauto citometriją

Apoptotinės ląstelės buvo aptiktos aneksino V-FITC / PI dvigubo dažymo ir srauto citometrijos analize. Trumpai tariant, po apdorojimo 50 μM junginiu 1, 2, 3 arba 4 48 valandas, ląstelės buvo surinktos ir resuspenduojamos PBS 1 × 105 ląstelių · ml-1. Po centrifugavimo 500 × g 5 minutes 25 laipsnių temperatūroje, buvo pridėta 195 μL aneksino V-FITC surišimo buferio ir 5 μL aneksino V-FITC. Po švelnaus sūkurinio maišymo mišinys buvo inkubuojamas 10 minučių kambario temperatūroje tamsoje. Po centrifugavimo 500 × g 5 minutes 25 laipsnių temperatūroje, buvo pridėta 190 μL FITC konjuguoto aneksino V surišimo buferio ir 10 μL PI. Po švelnaus sūkurinio maišymo mėginiai buvo analizuojami naudojant FACSCalibur srauto citometrą (Becton Dickinson, San Chosė, CA, JAV) per 30 min.

3.8. Statistinė analizė

Visi eksperimentiniai duomenys buvo išreikšti kaip vidurkis ± SD. Skirtumų tarp eksperimentinių mėginių ir atitinkamos kontrolės reikšmingumas buvo įvertintas vienpuse dispersijos analize (ANOVA), naudojant SPSS programinę įrangą (11.5 versija). Statistinis reikšmingumas nustatytas ties p < 0.05.

4. Išvados

Mūsų rezultatai rodo, kad MTT tyrime pastebėtas gyvybingų ląstelių skaičiaus pervertinimas gali užmaskuoti tam tikrų junginių citotoksiškumą. Todėl vaistų atrankos procesų metu rekomenduojame naudoti įvairius metodus konkretaus junginio poveikiui ląstelių gyvybingumui nustatyti (pvz., CCK-8 ir 3 H-TdR tyrimus), kad būtų išvengta klaidinančių rezultatų.

NATŪRALUS CISTANCHE TUBULOSA, SKINTAS TESTOTERONO SEKRECIJĄ PHGS75% ECH 30% ACT 12%